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Biochemistry

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Abstract

Este protocolo mostra como uniformemente 13C, 15N-rotulado materiais fúngicos podem ser produzidos e como estes materiais macios devem ser procedeu para NMR Solid-State e DNP sensibilidade melhorada dos experimentos. O procedimento de processamento da amostra de biomassa de planta também é detalhado. Este método permite a medição de uma série de 1D e 2D 13C -13C / espectros de correlações15N, que permite a elucidação estrutural de alta resolução de biomateriais complexos em seu estado nativo, com mínima perturbação. O isótopo-rotulagem pode ser examinado através da quantificação da intensidade em espectros de 1D e a eficiência de transferência de polarização em espectros de correlação 2D. O sucesso da preparação da amostra de polarização nuclear dinâmica (DNP) pode ser avaliado pelo fator de aumento de sensibilidade. Novas experiências, examinando os aspectos estruturais dos polissacarídeos e proteínas conduzirá a um modelo da arquitetura tridimensional. Esses métodos podem ser modificados e adaptados para investigar uma ampla gama de materiais ricos em carboidratos, incluindo as paredes celulares naturais de plantas, fungos, algas e bactérias, bem como sintetizado ou projetado, polímeros de carboidratos e seus complexos com outros moléculas.

Introduction

Hidratos de carbono desempenham um papel central em vários processos biológicos, tais como armazenamento de energia, construção estrutural e reconhecimento celular e adesão. Eles são enriquecidos na parede celular, que é um componente fundamental em plantas, fungos, algas e bactérias1,2,3. Parede celular serve como uma fonte central para a produção de biocombustível e biomateriais, bem como um alvo promissor para terapias antimicrobiana4,5,6,7,8 , 9.

A compreensão contemporânea destes materiais complexos tem sido substancialmente avançada por décadas de esforços que foram dedicados à caracterização estrutural usando quatro principais métodos bioquímicos ou genéticos. O primeiro método principal se baseia em tratamentos sequenciais usando produtos químicos ou enzimas para quebrar as paredes celulares em porções diferentes, que é seguido por composição e análise de enlace de açúcares em cada fração de10. Este método lança luz sobre a distribuição de domínio de polímeros, mas a interpretação pode ser enganosa devido às propriedades físicas e químicas das biomoléculas. Por exemplo, é difícil determinar se a fração alcaloide extraíveis origina-se de um único domínio de moléculas menos estruturadas ou de moléculas espacialmente separadas com solubilidade comparável. Em segundo lugar, a porções extraídas ou paredes de célula inteira pode também ser medidas usando solução NMR para determinar as ligações covalentes, também denominadas como reticulação, entre diferentes moléculas11,12,13, 14,15. Desta forma, a estrutura detalhada das ligações covalentes âncoras poderia ser sondada, mas limitações podem existir devido a baixa solubilidade de polissacarídeos, o número relativamente pequeno de sites de reticulação e a ignorância dos efeitos não-covalente que estabiliza embalagem de polissacarídeo, incluindo a ligação do hidrogênio, força de van der Waals, interação eletrostática e entrelaçamento de polímero. Em terceiro lugar, a afinidade obrigatória tem sido determinada em vitro usando polissacarídeos isolados16,17,18,19, mas a purificação procedimentos podem alterar substancialmente a estrutura e propriedades destas biomoléculas. Esse método também não consegue replicar a deposição sofisticada e montagem de macromoléculas após a biossíntese. Finalmente, o fenótipo, morfologia celular e propriedades mecânicas dos mutantes genéticos com produção atenuada de determinado componente da parede celular lançar luzes sobre as funções estruturais dos polissacarídeos, mas evidências moleculares mais é necessário para colmatar estas observações macroscópicas com a função engenharia de proteína machineries20.

Recentes avanços no desenvolvimento e aplicação de espectroscopia NMR Solid-State multidimensional introduziram uma oportunidade única para resolver estes enigmas estruturais. 2D/3D Solid-State NMR experimentos permitem investigação high-resolution da composição e arquitetura de materiais ricos em carboidratos no estado nativo, sem grandes perturbações. Estudos estruturais têm sido realizados com sucesso no primário e paredes celulares secundárias de plantas, a biomassa tratada cataliticamente, biofilme bacteriano, o pigmento fantasmas em fungos e, recentemente pelos autores, as paredes celulares intactos em um fungo patogênico Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. o desenvolvimento da polarização nuclear dinâmica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 substancialmente facilita a elucidação estrutural de NMR como o aprimoramento da sensibilidade pela DNP marcadamente encurta o tempo experimental em biomateriais estes complexos. O protocolo descrito aqui detalha os procedimentos para o fungo a. fumigatus isótopo-rotulagem e preparando fúngicas e amostras da planta para a caracterização do estado sólida NMR e DNP. Procedimentos de rotulagem semelhantes devem ser aplicáveis a outros fungos com meio alterado, e os procedimentos de preparação de amostra devem ser geralmente aplicáveis a outros biomateriais ricos em carboidratos.

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Protocol

1. crescimento de 13C, 15N-rotulado Aspergillus fumigatus meio líquido

  1. Preparação de sem rótulo e 13C, meio de crescimento N-rotulado de 15
    Nota: Os dois meio de levedura extrato peptona Dextrose (YPD) e o melhor médio mínimo43 foram utilizados para a manutenção da cultura fúngica. Todas as etapas após a autoclavagem são executadas em uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação.
    1. Preparação de meio líquido sem rótulo: dissolver 6,5 g de pó YPD em 100 mL de água destilada e, em seguida, autoclave para 25 min a 134 ° C.
    2. Preparação de meio sólido sem rótulo
      1. Adicione 1,5 g de ágar-ágar e 6,5 g de pó YPD em 100 mL de água destilada.
      2. Autoclave a médio para 25 min a 121 ° C e, em seguida, cool até aproximadamente 50 ° C.
      3. 13-15 mL do meio de transferência em cada plástico pre-estéril de Petri e cubra o prato com uma tampa imediatamente.
    3. Preparação de 13C, 15N-rotulado de meio líquido
      Nota: Para preparar a solução de crescimento para o isótopo etiquetando, um meio mínimo contendo 13C-glicose e 15N-sódio nitrato e uma solução de oligoelementos são preparados separadamente e depois misturados antes do uso.
      1. Prepare 100 mL do meio mínimo contendo isótopos conforme listado na tabela 1. Ajuste o pH para 6.6 usando NaOH (1 M) ou uma solução de HCl (1M).
      2. Autoclave o meio mínimo para 25 min a 121 ° C.
      3. Preparar 100 mL (1, 000 x) da solução de oligoelementos, dissolver os sais listados na tabela 2 na água destilada. Autoclave a solução durante 25 minutos a 134 ° C. Esfriar e armazenar a solução a 4 ° C para uso a curto prazo. O pH será cerca de 6,5 e pode ser verificado utilizando um medidor de pH.
      4. Adicione 0,1 mL de solução de oligoelementos para 100 mL de 13C, 15N-rotulado meio mínimo conforme listado na tabela 2 , antes do uso.
  2. Crescimento dos fungos materiais
    1. Transferi uma pequena quantidade de fungos de armazenamento em um prato YPD usando um loop inoculando numa vizinhança de fluxo laminar. Manter a cultura a 30 ° C durante 2 dias na incubadora.
    2. Use um loop inoculando para transferir um ativa borda fúngica crescente para a 13C,15N-rotulagem solução em uma capa de fluxo laminar. Manter a cultura a 30 ° C por 3-5 dias a 220 rpm numa incubadora de agitação.
    3. Centrifugar a 4.000 x g por 20 min. remover o sobrenadante e coletar o sedimento.
    4. Use uma pinça para coletar ~0.5 g de pelota bem hidratada (> 50 hidratação de wt %) para estudos de NMR. Perda de hidratação em qualquer ponto agravarão substancialmente a resolução espectral.
      Nota: Se necessário, uma pequena quantidade (0,1 g) dos micélios hidratados pode ser separada e totalmente secas sob fluxo de gás de2 N em uma capa ou um Liofilizador para estimar o nível de hidratação e calcular a porcentagem de massa seca. Geralmente, um sedimento contendo ~0.3 g massa seca pode ser obtida após 3 dias. Se a experiência NMR para ser realizado é longa (> 7 dias) e/ou se o estado dos fungos precisa ser corrigido, o material fúngico pode ser profundamente congelado no líquido N2 por 10-20 min antes processamento adicional. Se o experimento será curto (3 a 6 dias), o congelamento pode ser ignorado para que a amostra pode permanecer fresca.
    5. Misturar o material em excesso com 20% (v/v) de glicerol num tubo de centrífuga e mantê-lo em um freezer-80 ᵒC para armazenamento a longo prazo.

2. preparação da . fumigatus de DNP estudos e NMR Solid-State

  1. Preparação da . fumigatus para experimentos de NMR Solid-State
    1. Dialize 13C, 15N-rotulado fungos amostra (etapa 1.2.4.) contra 1 L de 10 mM de tampão fosfato (pH 7.0) a 4 ° C, usando um saco de diálise com 3.5 peso molecular kDa corte para remover pequenas moléculas do meio de crescimento para um período total de 3 dias. Altere a reserva duas vezes por dia.
      Nota: Como alternativa, a amostra pode ser lavada para 6 - 10 vezes com água desionizada para remover residuais pequenas moléculas.
    2. Transferi a amostra para um tubo de 15 mL e centrifugar por 5 min (10.000 x g) utilizando uma centrífuga de bancada. Remover o sobrenadante e recolher os materiais restantes de fungos.
    3. Pacote de 70-80 mg do uniformemente 13C-etiquetado e bem hidratado amostra Cole um ZrO2 rotor de 4 mm ou 30-50 mg de rotores de 3,2 mm para experiências NMR. Repetidamente, espremer a amostra suavemente usando uma haste de metal e absorver o excesso de água usando papel.
    4. Firmemente a tampa do rotor e inserir a amostra no espectrómetro para caracterização de NMR Solid-State.
      Nota: Os novíssimo rotores são sugeridos para minimizar a possibilidade de travamento do rotor e vazamento no espectrómetro NMR da amostra. Se necessário, uma inserção de Kel-F descartável com parafusos de vedação pode ser usada para servir como um recipiente secundário dentro do rotor.
  2. Preparação de amostras da . fumigatus para experimentos DNP
    1. Prepare-se 100 µ l de DNP solventes29,44 (também conhecida como a matriz DNP) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para 13C,15amostras de fungos N-rotulados. Esta matriz DNP contém uma mistura de d8-glicerol/D2O/H2O (60/30/10% de Vol).
      Nota: Se amostras sem rótulo devem ser investigados, então prepare-se a matriz DNP usando 13d empobrecido C8-glicerol (12C3, 99,95%; D8, 98%) e D2O e H2O para evitar 13C sinal contribuição de solventes.
    2. Dissolva 0,7 mg de AMUPol45 em 100 µ l de solventes DNP para formulário 10mm radical solução-mãe. Vórtice para 2-3 minutos garantir que os radicais são totalmente dissolvidos na solução.
    3. Mergulhe 10mg dos dializados 13C, 15N-rotulado materiais fúngicos como descrito nos passos anteriores (etapas 2.1.1 e 2.1.2) em 50 µ l de solução de AMUPol e triture levemente a mistura usando um pilão e almofariz para garantir a penetração dos radicais em as paredes celulares porosas.
      Nota: Para reduzir a taxa de perda de hidratação, a moagem pode também ocorrer em um tubo de microcentrifugadora usando um micropestle.
    4. Adicione outro µ l 30 da solução radical ao pellet moído para hidratar mais a amostra fúngica.
    5. Embalar o pellet em um rotor de safira de 3,2 mm, aperte levemente e retire o solvente DNP em excesso. Adicione um plug de 3,2 mm do silicone para impedir a perda de hidratação. Normalmente, 5-30 mg da amostra pode ser embalado para o rotor. A quantia exata que precisa de ser determinado pela exigência das experiências NMR sensibilidade para ser conduzido.
    6. Inserir e girar a amostra em um espectrômetro DNP, medir um espectro DNP aprimorado sob irradiação de microondas e compará-lo com o espectro de microondas. Isto levará a um reforço fator εligar/desligar, que deve ser de 20-40 para estes materiais complexos. Execute os experimentos projetados para determinar a estrutura da parede celular.

3. preparação da planta de biomassa para NMR e estudos DNP

  1. Preparação de materiais vegetais para NMR Solid-State
    1. Produzir uniformemente 13C-rotulado plantas in-house usando 13CO2 suprimentos em uma câmara ou 13C-glicose meio crescimento conforme descrito anteriormente,,4647 ou aquisição directa de materiais rotulados de empresas de criação de etiquetas de isótopo.
      Nota: 13C-glicose pode somente ser usado em crescimento escuro para evitar a introdução de 12C pela fotossíntese.
    2. Cortar o uniformemente 13C rotulado material vegetal em pedaços pequenos (tipicamente 1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de laboratório.
      Nota: Dependendo da finalidade, as paredes celulares extraídas são por vezes utilizadas para caracterização estrutural e os protocolos detalhados são relatados em anteriores estudos21,46.
    3. Se a amostra foi previamente secos, adicionar 100 µ l de água a 30 mg de materiais vegetais em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, vórtice, equilibrar à temperatura ambiente por 1 dia. Centrifugar a 4.000 x g durante 10 minutos e remover o excesso de água com uma pipeta.
    4. Se a amostra era nunca seca em qualquer ponto, use diretamente a amostra sem tratamento adicional.
    5. Embale os materiais de planta resultante em 3,2 mm ou 4 mm ZrO2 rotores para experimentos de NMR Solid-State.
  2. Preparação de materiais vegetais para estudos DNP
    1. Prepare 60 µ l solução stock de 10mm AMUPol radical como descritos passos 2.2.1 e 2.2.2.
    2. Cortar o uniformemente 13C rotulado material vegetal a ser estudado em pedaços pequenos (1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de laboratório e pesar 20 mg dos materiais vegetais.
    3. Mão-moer os pedaços de planta em pequenas partículas (~ 1-2 mm de tamanho) usando um almofariz e um pilão. Os pós finais têm uma aparência homogênea.
    4. Adicionar 40 µ l da solução-mãe DNP preparado na etapa anterior (etapa 2.2.2) para o material de planta e triture levemente por 5 min garantir homogênea mistura-se com o radical.
    5. Adicione outro 20 µ l da solução estoque para hidratar mais o material vegetal após a moagem.
    6. Embale a amostra de planta equilibrada em um rotor de safira de 3,2 mm para experimentos DNP. Introduza um tampão de silicone para evitar a perda de hidratação.

4. padrão NMR Solid-State experimentos para caracterização inicial dos biomateriais ricos em carboidratos

Nota: Uma breve visão geral das experiências NMR é fornecida nesta seção. No entanto, a elucidação estrutural normalmente requer vastos conhecimentos. Portanto, recomenda-se esforços de colaboração com Rydberg NMR.

  1. Medida 1D 13C Cruz polarização (CP), 13C polarização direta (DP) com 2-s e 35-s reciclar atrasos e 1H -13C INEPTO48,49 espectros para obter uma compreensão geral do que os dinâmicos distribuição de componentes celulares (Figura 1a). As paredes celulares são tipicamente parte relativamente rígida e exibem sinais dominantes no espectro de CP.
  2. Medir uma série de experimentos de correlação 2D padrão 13C -13. C para atribuições de ressonância dos sinais de 13C. Comece com Recentrado inadequada50,51 para obter conectividade de carbono, que precisa ser assistido por uma série de experiências através do espaço como 1.5-ms RFDR52 (Figura 1b) e cabo de 50-ms/Marcos de Oliveira53 experiências.
    Nota: Se é de interesse para encontrar uma amostra rico em um componente específico, por exemplo, a primária ou paredes celulares secundárias, então vários segmentos ou várias plantas podem precisar de ser medidos separadamente para encontrar a amostra com a composição ideal.
  3. Conduza experimentos de correlação de13C 2D 15N - que podem ser medidos para facilitar as atribuições de ressonância de proteínas e carboidratos nitrogenados.
    Nota: A atribuição de ressonância é normalmente demorada. Atualmente está sendo desenvolvido um método para facilitar a atribuição de ressonância dos sinais de carboidrato para aqueles cientistas sem experiência prévia.
  4. Medir mais especializados experimentos para determinar as proximidades espaciais (Figura 1 c, d), hidratação e mobilidades de biomoléculas complexas para determinar a estrutura tridimensional dos materiais ricos em carboidratos como sistematicamente descrito anteriormente22,29.

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Representative Results

A rotulagem de isótopo substancialmente aumenta a sensibilidade de NMR e torna possível para medir uma série de 13C -15N correlação espectros para analisar a composição, hidratação, mobilidade e 2D 13C -13C e embalagem de polímeros, que serão integrados para construir um modelo tridimensional de arquitetura da parede celular (Figura 1). Se a rotulagem uniforme for bem-sucedido, um conjunto completo de espectros de 15N e 1D 13C pode ser coletado dentro de 1h e cada espectro 2D padrão deve tomar não mais de 24 h de medição.

Amostras bem preparadas geralmente espera que ambas as altas intensidades de NMR e linhas em ponto. Comprometimento de qualquer parâmetro indica a preparação da amostra não-otimizada. As amostras de fungosas devem ser preparadas de forma nunca secas, e desidratação parcial durante as etapas de embalagem poderia levar a uma notável ampliação do ' lineWidth '. Se o tempo experimental é substancialmente maior do que o esperado para uma amostra de NMR totalmente embalada, o nível de rotulagem pode ser baixo. Se os sinais fora-diagonal são difíceis de obter o espectro de correlação 2D 13C -13C, rotulagem estatísticos pode ter ocorrido (Figura 1b). Os dois picos de 13. C a 96 e 92 ppm são sinais de carbono 1 assinatura de glicose54, portanto, sua intensidade forte no quantitativo 13C direto espectros de polarização (DP), medidos com reciclar longos atrasos de 35 s normalmente indicam a predominância de pequenas moléculas devido a diálise incompleta ou lavagem (Figura 1a). Com exemplos bem marcados, correlações de longo alcance podem ser medidas mais para detectar proximidades espaciais de biomoléculas (Figura 1C) e construir o modelo estrutural das paredes de células intactas (Figura 1D).

Nome químico Fórmula química Concentração (g/L)
Fosfato dipotássico K2HPO4 1,045 g
Sulfato de magnésio hepta-hidratado O MgSO4·7H2 0,52 g
Fosfato monopotássico KH2PO4 0,815 g
15 N - nitrato de sódio 15 NaNO3 6,0 g
Cloreto de potássio KCl 0,52 g
U -13C-glicose 13 C6H12O6 10,0 g

Tabela 1. A composição do meio mínimo.

Nome químico Fórmula química Concentração (g/L)
Molibdato de amónio tetra-hidratado (NH4) 6 Mo,24·4H7O2O 11g
Ácido bórico H3BO3 11g
Cloreto cobaltoso hexaidratado O CoCl2·6H2 16 g
Sulfato cúprico pentahidratado O CuSO4·5H2 16 g
Sulfato ferroso hepta-hidratado O Filipa4·7H2 5 g
Cloreto manganoso Tetra O MnCl2·4H2 5 g
Etilenodiaminotetracético tetrassódico At4EDTA·4H2, O 60 g
Sulfato de zinco hepta-hidratado O ZnSO4·7H2 22 g

Tabela 2. A composição da solução de oligoelementos (concentrada). Observe que, para a preparação de fungos sem rótulo, glicose sem título e sem rótulo de nitrato de sódio podem ser usados.

Figure 1
Figura 1. Fluxograma para caracterizar a estrutura da parede de célula fúngica usando NMR Solid-State. (um) 1D espectros para a seleção da amostra inicial. De cima para baixo são INEPT, 13C DP com 2-s reciclagem atrasa, 13C DP com 35-s reciclar atrasos e espectros de CP C 13, com a diminuição de mobilidade para as moléculas detectadas. (b) 2D 13C -13C espectro de correlação calculados em 1.5-ms RFDR reassociação. (c) representante Cruz intermolecular pico detectado usando espectro PAR 15-ms. (d) modelo estrutural obtido de dados NMR. Painéis um, c e d foram modificados de Kang et al, NAT. Commun. 9, 2747 (2018). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Comparado com os métodos bioquímicos, NMR Solid-State tem vantagens como uma técnica não-destrutiva e em alta resolução. NMR também é quantitativa na análise composicional, e ao contrário da maioria dos outros métodos analíticos, não terá as incertezas introduzido pela solubilidade limitada de biopolímeros. Estabelecimento do protocolo atual facilita estudos futuros sobre biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. No entanto, deve notar-se que a análise de dados e atribuição de ressonância pode ser demorado e geralmente requer treinamento sistemático. Os autores estão actualmente a desenvolver ferramentas e bancos de dados para ajudar cientistas sem experiência prévia de ultrapassar tal barreira.

Desde que a abundância de isótopos naturais de 13C é apenas 1,1%, a probabilidade de observar um 13C -13C Cruz pico usando unlabeled materiais é apenas 0,012% (1,1% x 1,1%) de que o uso de uniformemente rotulado amostras. Portanto, o enriquecimento de isótopo alcançado usando esse protocolo substancialmente aumenta a sensibilidade de NMR de quatro ordens de magnitude e permite experimentos de correlação 2D para determinação estrutural.

As amostras otimizadas, bem hidratadas devem exibir linhas afiadas em espectros de correlação 2D 13C -13C. Os componentes móveis, como a β-glucanos na . fumigatus e as pectinas em plantas devem exibir uma largura total no metade-máximo (FWHM) linewidth de 0,3-0,5 ppm em 600-800 MHz NMR espectrômetros29,31. Os componentes rígidos têm picos ligeiramente mais amplas devido conformacional heterogeneidade das unidades de açúcar representativos, repetitivos e a falta de movimentos moleculares rápidas. O típico 13C linewidth é 0,7-1,0 ppm por microfibrilhas de celulose nas plantas e 0,5-0,7 ppm para quitina nos fungos55. O linewidth afiada de celulose e quitina são principalmente causadas por cristalinidade do polímero, assim é parcialmente resistente à desidratação e mudança de temperatura, por exemplo, a temperatura criogênica de DNP experimento56,57. A nitidez de pico de polímeros da matriz, no entanto, são altamente sensíveis à mudança de condições de amostra que afetam a mobilidade de polímero, portanto, ele pode ser usado como um indicador de hidratação de amostra. As grandes linhas de polímeros matriz normalmente designar a falta de hidratação na amostra, o que pode ser totalmente ou parcialmente recuperada, re-adicionando água58. Normalmente, um nível de hidratação de 50-80% em peso é suficiente para proporcionar um bom linewidth em planta e amostras fúngicas.

DNP é muitas vezes necessário para investigar estes sistemas de células inteiras desafiadoras. Normalmente, um aprimoramento de dobra de 20-40 de sensibilidade poderia ser alcançado em uma amostra otimizada em um espectrômetro DNP 600 MHz/395 GHz e esse valor aumenta com a diminuição de campo, por exemplo, quase dobrado em um 400 MHz/263 GHz DNP26,59 . Existem vários fatores que poderiam afetar a eficiência do DNP. Primeiro, a penetração dos radicais na rede porosa das paredes das células é crucial e este processo pode ser substancialmente facilitado pela moagem suave dos biomateriais na matriz DNP contendo radical. Em segundo lugar, as propriedades físicas, a rigidez, por exemplo, da amostra afeta a escolha da potência do microondas, a matriz DNP "derrete" abaixo dos 12 irradiação de W, como evidenciado pela nitidez de ressonâncias de 1H, que não era um problema para a planta mais dura hastes de60. Como resultado, observa-se um padrão mais isotrópico do pico do solvente de 1H, com substancialmente menor bandas laterais de fiação e realce de DNP atenuada. Portanto, recomenda-se mais fraco poder para materiais mais macios. Em terceiro lugar, a composição da matriz DNP deve ser otimizada. Verifica-se que d8-glicerol/D2O/H2O é geralmente o melhor solvente para materiais macios, enquanto uma escolha mais simples e mais barata de D2O/H2O também pode ser eficaz em alguns casos, porque os açúcares presentes no sistema serve como crioprotectores até certo ponto. Em contraste, o d6-DMSO/D2solução de2O O/H Falha em plantas e fungosas amostras, com menos de 10-fold de aprimoramento da sensibilidade, assim não se recomenda para uso a não ser para fins especiais. Um protocolo livre de matriz recentemente demonstrou ser altamente eficaz devido à depleção de solvente, que cria o espaço adicional para acomodar mais materiais34,56,61. No entanto, a perda de hidratação apresenta uma grande perturbação para a estrutura de biomoléculas, assim, esse método pode não ser apropriado para sistemas biológicos. Se sem rótulo paredes celulares estão a ser estudados, 13C-esgotada d8-glicerol/D2O/H2O é o solvente ideal que não contribui quaisquer sinais de 13C abundância natural nem sacrifica qualquer sensibilidade realce.

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Disclosures

Nós não temos nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através da NSF OIA-1833040. O laboratório nacional de campo magnético elevado (NHMFL) é suportado pela National Science Foundation através de DMR-1157490 e o estado da Flórida. O sistema MAS-DNP no NHMFL é financiado em parte pelo NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

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Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

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