Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Подготовка грибковых и растительных материалов для структурной разяснения, используя динамический ядерной поляризации твердотельного ЯМР

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Протокол для подготовки 13C,15N-меченых грибковых и растений образцов для многомерных твердотельного ЯМР спектроскопии и динамических ядерных поляризации (DNP) расследований представил.

Abstract

Этот протокол показывает, как равномерно 13C, 15N-меченых грибковых материалы могут быть произведены и как эти мягкие материалы должны быть продолженным для твердотельного ЯМР и повышенной чувствительности DNP экспериментов. Процедура обработки образца биомассы растений также подробно. Этот метод позволяет измерение серии 1D и 2D 13C -13C /15N корреляции спектры, которые позволяет с высоким разрешением структурных разъяснения сложных биоматериалов в их родном государстве, с минимальными возмущений. Изотоп маркировки может быть проверен количественного определения интенсивности в 1D спектров и эффективность переноса поляризации в спектрах 2D корреляции. Успех динамического ядерной поляризации (DNP) пробоподготовки может оцениваться на коэффициент повышения чувствительности. Дальнейшие эксперименты, структурные аспекты белки и полисахариды приведет к модели трехмерный архитектуры. Эти методы могут быть модифицировать и адаптировать для изучения широкого спектра материалов богатых углеводами, включая природные стенки клеток растений, грибов, водорослей и бактерий, а также синтезируется или углеводов полимеров и их комплекс с другими молекул.

Introduction

Углеводы играть центральную роль в различных биологических процессах, таких как хранение энергии, структурной здание и клеточных признание и адгезии. Они обогащаются в клеточной стенки, который является основным компонентом в растений, грибов, водорослей и бактерий в1,2,3. Стены клетки служит центральным источником для производства биотоплива и биоматериалов, а также перспективные цели для антибактериальной терапии4,5,6,,78 , 9.

Современного понимания этих сложных материалов существенно продвинулась в течение десятилетий усилия, которые были посвящены структурных характеристик, используя четыре основных биохимических и генетических методов. Первый основной метод опирается на последовательные процедуры с использованием агрессивных химикатов или ферменты сломать стены клетки на различные части, которые следуют композиционные и связь анализ сахара в каждой фракции10. Этот метод проливает свет на домен распределения полимеров, но толкование может ввести в заблуждение из-за физических и химических свойств биомолекул. Например трудно определить ли щелочно извлекаемая часть происходит от одного домена менее структурированные молекул или пространственно разделенных молекул с сопоставимыми растворимость. Во-вторых, извлеченные части или всей клеточной стенки также может быть измерена с помощью решения ЯМР для определения ковалентных связей, также называются сшивки, между различными молекулами11,12,13, 14,15. Таким образом может быть исследован Подробная структура ковалентных якорей, но могут существовать ограничения из-за низкой растворимости полисахаридов, относительно небольшое количество сайтов сшивки и невежество non ковалентные эффектов, что стабилизирует полисахарид упаковка, включая водород склеивание, Ван дер Ваальса силы, электростатического взаимодействия и полимерные запутанности. В-третьих был сродство определяется в пробирке с помощью изолированных полисахариды16,,1718,19, но очистки, которые могут существенно изменить процедуры Структура и свойства этих биомолекул. Этот метод также не удается реплицировать сложные осаждения и Ассамблеи макромолекул после биосинтеза. Наконец фенотип, морфологию клеток и механических свойств генетических мутантов с ослабленной производства некоторых компонентов клеточной стенки пролить свет на структурных функций полисахаридов, но более Молекулярные доказательства необходимы для преодоления этих макроскопические наблюдения с функцией инженерии белка механизмов20.

Последние достижения в разработке и применении многомерных твердотельного ЯМР спектроскопии ввели уникальную возможность для решения этих структурных головоломок. 2D/3D твердотельного ЯМР эксперименты позволяют разрешением исследование состава и архитектуре богатых углеводами материалов в родном государстве без крупных возмущений. Структурные исследования были успешно проведены на начальных и средних клеточной стенки растений, каталитически обработанной биомассы, бактериальные биопленки, пигмент призраков в грибов и, недавно, авторы, нетронутыми клеточной стенки в патогенных грибов Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. Разработка динамических ядерной поляризации (DNP)32,33,34,,3536,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 существенно облегчает выяснение структурной ЯМР как повышение чувствительности, DNP заметно сокращает экспериментальной время на эти сложные биоматериалов. Протокол, описанные здесь подробности процедуры изотоп маркировки гриб A. fumigatus и подготовке грибковых и образцы растений для твердотельного ЯМР и ДНП характеристику. Аналогичные процедуры маркировки должны быть применимы для других грибов с измененной среднего, и процедуры подготовки образца должны быть вообще применимы для других богатых углеводами биоматериалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. рост 13C, 15N-меченых Aspergillus fumigatus жидкой среды

  1. Подготовка немеченого и 13C, 15N-меченых роста среднего
    Примечание: Оба дрожжевой экстракт Пептон Декстроза среднего (YPD) и улучшенная минимальный средний43 использовались для поддержания грибковые культуры. Все шаги после автоклавирования выполняются в Ламинарный шкаф для сведения к минимуму загрязнения.
    1. Подготовка немеченого жидкой среды: растворить 6.5 g YPD порошка в 100 мл дистиллированной воды и затем автоклав для 25 мин при 134 ° C.
    2. Подготовка немеченого сплошной среды
      1. Добавьте 1,5 g агар и 6.5 g YPD порошка в 100 мл дистиллированной воды.
      2. Автоклав среднего за 25 мин при температуре 121 ° C, а затем остыть примерно 50 ° C.
      3. Передача 13-15 мл среды в каждой предварительно стерильных пластиковых Петри и обложка блюдо с крышкой немедленно.
    3. Подготовка 13C, 15N-меченых жидкой среды
      Примечание: Для подготовки решения роста изотоп, маркировки, минимальный средний, содержащий 13C-глюкоза и 15N-натрия нитрат и раствором микроэлементов готовятся отдельно и затем перемешать перед использованием.
      1. Подготовка 100 мл изотоп содержащих минимальные средства, перечисленные в таблице 1. Отрегулируйте пэ-аш до 6,6, с использованием NaOH (1 М) или раствор HCl (1 М).
      2. Автоклав минимальный средний за 25 мин при температуре 121 ° C.
      3. Подготовка 100 мл (1, 000 x) прослеживающие элементы решения, распустить солей, перечисленные в таблице 2 в дистиллированной воде. Автоклав решение для 25 мин при 134 ° C. Охладить и хранить раствор при температуре 4 ° C для краткосрочного использования. РН будет около 6.5 и могут быть проверены с помощью рН метр.
      4. Добавьте 0,1 мл раствора прослеживающие элементы 100 мл 13C, 15N-меченых минимальный средний, перечисленные в таблице 2 перед использованием.
  2. Рост грибковой материалов
    1. Передача небольшое количество грибов из хранилища на YPD пластину с помощью пересевать цикла в Ламинарный шкаф. Держите культуры при 30 ° C в течение 2 дней в инкубаторе.
    2. Используйте пересевать цикл для передачи активного растущего грибковых края 13C,15N-маркировки раствор в Ламинарный шкаф. Держите культуры при 30 ° C для 3-5 дней на 220 rpm в тряску инкубатора.
    3. Центрифуга на 4000 x g 20 мин удалить супернатант и собирать гранулы.
    4. Использовать пинцет для сбора ~0.5 g хорошо гидратированных Пелле (> 50 wt % гидратации) для исследования ЯМР. Потеря гидратации в любой точке будет существенно ухудшить спектральное разрешение.
      Примечание: В случае необходимости, небольшое количество гидратированных мицелия (0,1 г) можно отделить и полностью высушить под N2 потока газа в капот или лиофилизатор оценить уровень гидратации и вычислить процент сухой массы. Обычно, гранулы, содержащие ~0.3 г сухой массы могут быть получены после 3 дней. Если длинная NMR эксперимент проводиться (> 7 дней) или если состояние грибы нужно быть зафиксированным, грибковых материал может быть глубоко заморожено в жидкости N2 по 10-20 минут перед дальнейшей обработкой. Если эксперимент будет коротким (3-6 дней), замораживание может быть пропущен таким образом, чтобы образец может оставаться свежим.
    5. Сочетание избыточного материала с 20% (v/v) глицерина в пластиковых пробирок и держать его в морозильник-80 ᵒC для длительного хранения.

2. Подготовка A. fumigatus твердотельного ЯМР и ДНП исследований

  1. Подготовка A. fumigatus для твердотельного ЯМР экспериментов
    1. Dialyze 13C, 15N-меченых грибковых образца (шаг 1.2.4.) против 1 Л 10 мм фосфатного буфера (рН 7,0) при 4 ° C, с помощью диализа мешок с 3,5 кДа молекулярной массой отсечки для удаления мелких молекул из среднего роста общей продолжительностью 3 дня. Измените содержимое буфера два раза в день.
      Примечание: Кроме того, образец можно мыть для 6 - 10 раз с использованием дейонизированной водой для удаления остатков малых молекул.
    2. Перенесите образца в 15 мл трубки и центрифуги для 5 мин (10000 x g) с помощью настольная центрифуга. Удалить супернатант и собирать оставшихся грибковых материалы.
    3. 70-80 мг в упаковке равномерно 13C-меченых и хорошо гидратированных образца вставьте в ZrO2 Ротор 4-мм или 30-50 мг до 3,2 мм роторы для ЯМР экспериментов. Многократно Сожмите образца аккуратно с помощью металлического стержня и поглощают лишнюю воду с помощью бумаги.
    4. Плотно cap ротора и вставьте образец в спектрометр для твердотельного ЯМР характеристика.
      Примечание: Новый роторов, предлагается свести к минимуму возможность аварии ротора и образцы разлива в ЯМР-спектрометр. При необходимости, одноразовые Вставка Кель-F с сальниками винтов может использоваться в качестве вторичного контейнера внутри ротора.
  2. Подготовка A. fumigatus образцов для экспериментов DNP
    1. Подготовьте 100 мкл DNP растворителей29,44 (также известный как DNP матрица) в пробки microcentrifuge 1,5 мл для 13C,15N-меченых грибковых образцы. Эта матрица DNP содержит смесь d8-глицерин/D2O/H2O (60/30/10 Vol %).
      Примечание: Если немеченого образцы должны расследоваться, затем подготовить DNP матрицы с помощью 13C-истощены d8-глицерин (12C3, 99,95%; D8, 98%) и D2O и H2O, чтобы избежать 13C сигнала вклад от растворителей.
    2. Растворите 0,7 мг AMUPol45 в 100 мкл DNP растворителей в форме 10 мм радикальной Стоковый раствор. Вортекс для 2-3 мин для обеспечения, что радикалы полностью растворяются в решении.
    3. Замочите 10 мг dialyzed 13C, 15N-меченых грибковых материалы, как описано в предыдущих шагах (шаги 2.1.1 и 2.1.2) в 50 мкл раствора AMUPol и слегка растереть смесь с помощью пестика и раствором для обеспечения проникновения радикалов в пористые стенки клеток.
      Примечание: Для сокращения темпов утраты гидратации, шлифовка могут также проходить в пробки microcentrifuge, с помощью micropestle.
    4. Добавьте еще 30 мкл радикального решения измельченных гранул для дальнейшего гидрата грибковых образца.
    5. Упаковать гранулы в 3,2 мм Сапфир ротора, слегка сожмите и удалите избыток DNP растворителя. Добавление 3.2-мм силиконовыми колпачками для предотвращения потери гидратации. Как правило 5-30 мг образца могут быть упакованы в ротор. Точное количество необходимо определить чувствительность требованием ЯМР эксперименты проводить.
    6. Вставка и спин вверх образца в ДНП спектрометр, измерить DNP-расширение спектра при микроволновом и сравнить его с спектра Микроволновая печь off. Это приведет к укреплению фактор εвкл/выкл, которая должна быть 20-40 для этих сложных материалов. Запустите разработан экспериментов для определения структуры клеточной стенки.

3. Подготовка биомассы растений для ЯМР и ДНП исследований

  1. Подготовка материалов растений для твердотельного ЯМР
    1. Производить равномерно 13C-помечены растения доме с помощью 13CO2 поставок в рост палата или 13C-глюкозы среде как описано ранее46,47 или непосредственно приобрести помечены материалы от изотоп маркировки компаний.
      Примечание: 13C-глюкоза может использоваться только в темных роста чтобы избежать введения 12C фотосинтезом.
    2. Вырезать равномерно 13C меткой растительного материала на мелкие кусочки (обычно 1-2 мм в измерении) с помощью лезвия бритвы лаборатории.
      Примечание: В зависимости от цели, извлеченные клеточной стенки иногда используются для структурных характеристик и подробные протоколы представлены в предыдущих исследованиях21,46.
    3. Если образец был ранее сушеные, добавить 100 мкл воды до 30 мг растительных материалов в 1.5 мл microcentrifuge трубку, вихря, сбалансировать при комнатной температуре за 1 день. Центрифуга на 4000 x g 10 минут и Удалите лишнюю воду с помощью пипетки.
    4. Если образец был не сушат в любой точке, непосредственно Используйте образец без дальнейшего лечения.
    5. Упакуйте полученный завод материалов в 3,2 мм или 4 мм ZrO2 роторы для твердотельного ЯМР экспериментов.
  2. Подготовка растений материалов для исследований DNP
    1. Подготовка 60 мкл Стоковый раствор 10 мм AMUPol радикальным как описанные меры 2.2.1 и 2.2.2.
    2. Вырезать равномерно 13C меткой растительного материала для изучения на мелкие кусочки (1-2 мм в измерении) с помощью лезвия бритвы лаборатории и весят 20 мг растительных материалов.
    3. Рука молоть частей растений в мелких частиц (~ 1-2 мм в размер) используя ступку и пестик. Окончательный порошки имеют однородный вид.
    4. Добавить в предыдущих шаг (шаг 2.2.2) к заводе материал подготовлен 40 мкл DNP Стоковый раствор и шлифуют мягко в течение 5 мин для обеспечения однородного смешивания с радикалами.
    5. Добавьте еще 20 мкл Стоковый раствор для дальнейшего гидрата растительного материала после шлифования.
    6. Пакет образца уравновешенной завод в 3,2 мм Сапфир ротора для DNP экспериментов. Вставьте вилку силикона избежать потери гидратации.

4. стандартные твердотельного ЯМР эксперименты для первоначальных характеристик богатых углеводами биоматериалов

Примечание: В этом разделе приводится краткий обзор ЯМР экспериментов. Однако структурные разяснения обычно требуется обширный опыт. Поэтому рекомендуется использовать совместные усилия с ЯМР spectroscopists.

  1. Мера 1D 13C крест поляризации (CP), 13C прямым поляризации (DP) с 2-s и 35-s корзины задержки и 1H -13C НЕУМЕЛОЕ48,49 спектры для получения общего понимания динамических распространение компонентов клеток (рис. 1a). Стены клетки, как правило, относительно жесткая часть и выставку доминирующей сигналов в спектре CP.
  2. Измерьте серию стандартных 2D 13C -13C корреляции экспериментов для назначений резонанс 13C сигналов. Начните с51 Переориентированные неадекватной50,для получения соединения углерода, которые нуждаются в помощи серией экспериментов через пространство как 1,5 ms RFDR52 (рис. 1b) и 50-ms шнур/дар53 эксперименты.
    Примечание: Если она представляет интерес для найти образец богаты определенного компонента, например, начальной или средней клеточной стенки, затем несколько сегментов или несколько растений может потребоваться оцениваться отдельно найти образец с оптимальным составом.
  3. Проведение 2D 15N -13C корреляции экспериментов, которые могут быть измерены для облегчения назначений резонанс белков и углеводов азотосодержащих.
    Примечание: Резонанс назначения обычно много времени. В настоящее время разрабатывается метод для облегчения резонанс назначение сигналов углеводов для тех ученых, без предварительного опыта.
  4. Измерение более специализированные экспериментов для определения пространственной близости (рис. 1 c, d), гидратации и подвижности сложных биомолекул для определения трехмерной структуры материалов богатых углеводами, как систематически описано ранее22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изотоп маркировки существенно повышает чувствительность ЯМР и делает возможным для измерения серии 2D 13C -13C и 13C -15N корреляции спектры для анализа состава, гидратации, мобильность и упаковка Полимеры, которые будут интегрированы построить трехмерную модель архитектуры клеточной стенки (рис. 1). Если форма маркировки преуспевает, полный набор спектров 15N и 1D 13C могут быть собраны в течение 1 ч и каждый стандартные 2D спектра следует принять не больше чем 24 h измерения.

Хорошо подготовленных образцов обычно ожидают обоих высокой интенсивности ЯМР и резких линий. Ущерба либо параметра указывает ООН оптимизированный пробоподготовки. Грибковые образцов должен быть подготовлен в форме никогда не сушеные, и частично обезвоживание во время упаковки шагов может привести к заметным расширением linewidth. Если экспериментальные время значительно дольше, чем ожидалось для образца полностью упакован ЯМР, обозначая уровень может быть низкой. Если трудно получить в спектре корреляции 2D 13C -13C-Диагональ сигналы, статистические маркировки могли иметь место (рис. 1b). Две вершины 13C на 96 и 92 ppm сигналы подпись углерода 1 глюкозы54, поэтому их сильной интенсивности в количественных 13C прямой спектры поляризации (DP) измеряется с длиной корзины задержки 35 s, как правило, указывают преобладание малых молекул из-за неполной диализа или стирки (рис. 1a). С хорошо обозначенные образцов загрязнении корреляции может измеряться дальнейшего определения пространственной близости биомолекул (рис. 1 c) и построить структурная модель нетронутыми клеточной стенки (рис. 1 d).

Химическое название Химическая формула Концентрация (г/Л)
Калия фосфат K2HPO4 1.045 g
Магния сульфата гептогидрата MgSO4·7H2O 0.52 g
Дигидрофосфат калия KH2PO4 0.815 g
15 N - нитрат натрия 15 NaNO3 6,0 g
Хлорид калия KCl 0.52 g
U -13C-глюкоза 13 C6H12O6 10,0 г

Таблица 1. Состав минимальный средний.

Химическое название Химическая формула Концентрация (г/Л)
Аммония молибдата тетрагидрат (NH4) 6 Пн7O24·4H2O 11 g
Борная кислота H3Бо3 11 g
Гексагидрат хлорида кобальта CoCl2·6H2O 16 g
Меди сульфат пентагидрат O CuSO4·5H2 16 g
Гептогидрата сульфата железа FeSO4·7H2O 5 g
Марганцевые хлорид тетрагидрат НКД2·4H2O 5 g
Пирофосфат тетранатрия Na4EDTA·4H2O 60 g
Цинка сульфата гептогидрата ZnSO4·7H2O 22 g

В таблице 2. Состав раствора элемента trace (в основном). Обратите внимание, что для подготовки немеченого грибов, могут быть использованы немеченого глюкозы и непомеченного нитрата натрия.

Figure 1
Рисунок 1. Блок-схема характеризующие структуру грибковой клеточной стенки с использованием твердотельного ЯМР. () 1 D спектров для первоначальной выборки скрининга. От верхней до нижней являются INEPT, 13C DP с 2-s корзины задержки, 13C DP с 35-s корзины задержек и 13C CP спектров, с уменьшением подвижности для обнаруженных молекул. (b) 2D 13C -13C корреляции спектра измеряется с помощью сцепленный RFDR 1.5-ms. (c) представитель межмолекулярных крест пик обнаружен с помощью спектра пар 15-ms. (d) структурная модель полученные данные ЯМР. Панели , c и d были изменены от Кан et al., Nat. ЖК. 9, 2747 (2018). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По сравнению с биохимическими методами, твердотельного ЯМР имеет преимущества как метод неразрушающего и высоким разрешением. NMR также количественные композиционного анализа, и в отличие от большинства других аналитических методов, делает не имеют неопределенности представлен ограниченной растворимости биополимеры. Создание текущего протокола облегчает будущих исследований биоматериалов богатых углеводами и функционализированных полимеров. Однако следует отметить, что резонанс назначения и анализ данных может занять много времени и обычно требуют систематического обучения. Авторы в настоящее время разрабатывают инструменты и базы данных, чтобы помочь ученым без предварительного опыта преодолеть этот барьер.

Так как изобилие природных изотопов 13C только 1,1%, вероятность для наблюдения за 13C -13C крест пик с помощью без маркировки материалов имеет только 0,012% (1,1 x 1,1%), с помощью равномерно помечены образцы. Таким образом обогащения изотопов, с помощью этого протокола существенно повышает чувствительность ЯМР на четыре порядков и позволяет 2D корреляции экспериментов для определения структурных.

Оптимизированный, хорошо гидратированных образцы должны exhibit резких линий в 2D 13C -13C корреляции спектров. Мобильных компонентов, таких как β-глюканы в A. fumigatus и пектиновых веществ в растениях должны обладать полной ширины на половину максимум (FWHM) linewidth 0.3-0.5 ppm на 600-800 МГц NMR спектрометры29,31. Жесткая компоненты имеют несколько более широкое вершины вследствие конформационные неоднородность единиц сахар составляют, повторяющихся и отсутствие быстрых молекулярных движений. Типичный 13C linewidth является 0,7-1,0 ppm для целлюлозы microfibrils в растениях и 0.5-0.7 ppm для хитин грибов55. Резкое linewidth целлюлозы и хитин главным образом вызваны полимер кристалличности, таким образом частично устойчив к обезвоживанию и изменения температуры, например, криогенные температуры DNP эксперимент56,57. Пик резкость матрица полимеров, однако, являются весьма чувствительными к изменения примера условий, которые влияют на мобильность полимеров, поэтому он может использоваться в качестве показателя выборки гидратации. Широкие линии полимеров матрица обычно обозначают отсутствие гидратации в образце, который может быть полностью или частично восстановить путем повторного добавления воды58. Как правило уровень гидратации 50-80 wt % является достаточно для обеспечения хорошей linewidth как растений, так и грибковых образцы.

DNP часто бывает необходимо для расследования этих сложных систем поклеточного. Как правило на 20-40 раз повышение чувствительности может быть достигнуто на оптимизированной выборки на спектрометре DNP 600 МГц/395 ГГц и это значение увеличивается с уменьшением области, например, почти удвоилось на 400 МГц/263 ГГц DNP26,59 . Существует несколько факторов, которые могут повлиять на эффективность ДНП. Во-первых проникновение радикалов в пористых сеть стенок клеток имеет решающее значение, и этот процесс может быть существенно облегчено мягкая шлифование биоматериалов в матрице радикал содержащих ДНП. Во-вторых физические свойства, жесткость например, образца влияет на выбор микроволновой энергии, матрица ДНП «тает» под 12 W облучения, что подтверждается Заточка 1H резонансов, который не является проблемой для жестче завода стебли60. В результате наблюдается более изотропной шаблон 1час пик растворителей, с существенно ниже спиннинг боковых полосах и ослабленной DNP повышение. Таким образом более слабой мощности рекомендуется для мягкие материалы. В-третьих состав ДНП матрицы должны быть оптимизированы. Оно turn out что d8-глицерина/D2O/H2O, как правило, лучший растворителей для мягких материалов в то время как проще и дешевле выбор D2O/H2O также может быть эффективным в некоторых случаях, потому что сахар присутствующие в системе служит в качестве криопротекторов в некоторой степени. В отличие от d6-ДМСО/D2O/H2O решение завершается в растениях и грибковых образцы, менее чем в 10 раз повышения чувствительности, поэтому он не рекомендуется для использования если для специальных целей. Матрица свободный протокол недавно была продемонстрирована весьма эффективными из-за истощения растворителя, который создает дополнительное пространство для размещения более материалы34,,56-61. Однако потеря гидратации представляет основных возмущений в структуре биомолекул, таким образом, этот метод не может быть подходящим для биологических систем. Если немеченого клеточной стенки, чтобы быть изучены, 13C-обедненный d8-глицерин/D2O/H2O является оптимального растворителя, который не вносить любые сигналы 13C природных изобилия, ни жертвы любой чувствительности повышение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас есть ничего не разглашать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальный научный фонд через NSF OIA-1833040. Национальная Лаборатория высоких магнитного поля (NHMFL) поддерживается Национальный научный фонд через терминал DMR-1157490 и штата Флорида. MAS-DNP системы в NHMFL частично финансируется NIH S10 OD018519 и NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Биохимия выпуск 144 твердотельного ЯМР динамических ядерных поляризации (DNP) углеводов клеточной стенки биоматериалов растений грибов
Подготовка грибковых и растительных материалов для структурной разяснения, используя динамический ядерной поляризации твердотельного ЯМР
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter