Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Beredning av svamp och växtmaterial för strukturella klarläggande använder dynamisk nukleära polarisering Solid-State NMR

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll för att förbereda 13C,15N-märkt svamp och växt prover för flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi och dynamiska nukleära polarisering (DNP) undersökningar presenteras.

Abstract

Detta protokoll visar hur jämnt 13C, 15N-märkt svamp material kan produceras och hur dessa mjuka material bör fortsättas för solid-state NMR och utökad känslighet DNP experiment. Till exempel förädling av växtbiomassa är också detaljerade. Denna metod tillåter mätning av en rad 1D och 2D 13C -13C /15N korrelationer spectra, som möjliggör högupplöst strukturella förtydligandet av komplexa biomaterial i sitt ursprungliga tillstånd, med minimal störning. Isotop-märkning kan granskas av kvantifiera intensiteten i 1D spectra och polarisering spruttryck i 2D korrelation spectra. Framgången för dynamisk nukleära polarisering (DNP) provberedning kan utvärderas av den känslighet enhancement faktorn. Ytterligare experiment att undersöka de strukturella aspekterna av polysackarider och proteiner leder till en modell av den tredimensionella arkitekturen. Dessa metoder kan ändras och anpassas för att undersöka en rad olika kolhydratrika material, inklusive naturliga cellväggarna i växter, svampar, alger och bakterier, samt syntetiserade eller utformade kolhydratpolymerer och deras komplex med andra molekyler.

Introduction

Kolhydrater har en central roll i olika biologiska processer som energilagring, strukturella byggnad, och cellulära erkännande och vidhäftning. De är berikade i cellväggen, som är en grundläggande komponent i växter, svampar, alger och bakterier1,2,3. Cellväggen fungerar som en central källa för produktion av biobränsle och biomaterial, samt en lovande måltavla för antimikrobiella terapier4,5,6,7,8 , 9.

Den samtida förståelsen av dessa komplexa material har tidigarelagts väsentligen av decenniers ansträngningar som ägnades åt strukturella karakterisering med fyra stora biokemiska eller genetiska metoder. Den första stora metoden bygger på sekventiella behandlingar med starka kemikalier eller enzymer bryta ner cellväggarna i olika delar, som följs av sammansättning och länkage analys av socker i varje bråkdel10. Denna metod belyser domän fördelningen av polymerer, men tolkningen kan vara missvisande på grund av de kemiska och fysikaliska egenskaperna av biomolekyler. Exempelvis är det svårt att avgöra huruvida den alkali-extraherbara fraktionen härstammar från en enda domän av mindre strukturerade molekyler eller rumsligt separerade molekyler med jämförbara löslighet. Andra, den extraherade delar eller hela cellväggar kan också mätas med hjälp av lösning NMR för att bestämma kovalenta kopplingarna, också betecknas som crosslinking, mellan olika molekyler11,12,13, 14,15. På detta sätt kovalent ankare detaljerad struktur kunde bli utforskad, men begränsningar kan finnas på grund av den låga lösligheten av polysackarider, det relativt lilla antalet crosslinking platser och okunnighet om icke-kovalenta effekter som stabiliserar polysackarid packning, inklusive väte-limning, van der Waals kraften, elektrostatiska växelverkan och polymer entanglement. Tredje, affinitet har varit beslutsam i vitro med isolerade polysackarider16,17,18,19, men rening förfaranden kan väsentligt förändra struktur och egenskaper hos dessa biomolekyler. Denna metod underlåter också att replikera den sofistikerade nedfall och sammansättningen av makromolekyler efter biosyntes. Slutligen den fenotyp, cellmorfologi och mekaniska egenskaper av genetiska mutanter med försvagat produktion av vissa cellväggen komponent kasta ljus på de strukturella funktionerna av polysackarider, men mer molekylära bevis behövs för att överbrygga dessa makroskopiska observationer med funktionen konstruerad av protein maskinerier20.

Senaste framstegen inom utveckling och tillämpning av flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi har infört en unik möjlighet för att lösa dessa strukturella pussel. 2D/3D solid-state NMR-experimenten aktivera högupplösta utredning av sammansättningen och arkitekturen av kolhydratrika material i native staten utan större störningar. Strukturella studier har genomförts framgångsrikt på både primära och sekundära cellväggar av växter, katalytiskt behandlade biomassa, bakteriell biofilm, pigmentet spöken i svampar och nyligen av författarna, intakta cellväggar i en patogen svamp Aspergillusfumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. utvecklingen av dynamiska nukleära polarisering (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 underlättar väsentligt NMR strukturella förtydligandet som känslighet förbättrande av DNP förkortar markant experimentella tiden på dessa komplexa biomaterial. Protokollet beskrivs här information om förfarandena för isotopen-märkning svampen A. fumigatus och förbereda svamp och växtprover för solid-state NMR och DNP karakterisering. Liknande märkning förfaranden bör vara tillämplig på andra svampar med förändrad medium, och prov förberedelse förfarandena bör vara allmänt tillämpliga på andra kolhydratrika biomaterial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tillväxt av 13C, 15N-märkt Aspergillusfumigatus flytande Medium

  1. Beredning av omärkta och 13C, 15N-märkt odlingsmedium
    Obs: Både jäst extrakt pepton dextros medium (YPD) och den förbättra minimal medium43 användes för underhåll av svamp kultur. Alla steg efter autoklavering utförs i en LAF att minimera kontaminering.
    1. Beredning av omärkta flytande medium: lös 6,5 g YPD pulver i 100 mL destillerat vatten och sedan autoklav för 25 min på 134 ° C.
    2. Beredning av omärkta fast medium
      1. Tillsätt 1,5 g agar och 6,5 g YPD pulver i 100 mL destillerat vatten.
      2. Autoklav mediet under 25 minuter vid 121 ° C och sedan svalna till cirka 50 ° C.
      3. Över 13-15 mL medium till varje pre sterila plast petriskål och täck skålen med lock omedelbart.
    3. Beredning av 13C, 15N-märkt flytande medium
      Obs: För att förbereda tillväxt lösningen för isotopen märkning, ett minimalmedium innehåller 13C-glukos och 15N-natrium nitrat och en spårämnen lösning tillagas separat och sedan blandas före användning.
      1. Bereda 100 mL innehållande isotopen minimal medium som anges i tabell 1. Justera pH till 6,6 med hjälp av NaOH (1 M) eller HCl (1M) lösning.
      2. Autoklav minimal mediet i 25 minuter vid 121 ° C.
      3. Bereda 100 mL (1, 000 x) spårelement lösning, lös upp salterna som anges i tabell 2 i destillerat vatten. Autoklav lösningen för 25 min på 134 ° C. Svalna och förvara lösningen vid 4 ° C för kortvarig användning. PH blir ca 6,5 och kan kontrolleras med hjälp av en pH-mätare.
      4. Tillsätt 0,1 mL av spårämnen lösning till 100 mL 13C, 15N-märkt minimalmedium som förtecknas i tabell 2 före användning.
  2. Tillväxt av svamp material
    1. Överföra en liten mängd svampar från lagring på YPD plåt med en inoculating loop i en LAF. Hålla kulturen vid 30 ° C i 2 dagar i en inkubator.
    2. Använda en inoculating loop för att överföra en aktiv växande svamp kanten till 13C,15N-märkning lösning i en LAF. Förvara odlingen vid 30 ° C för 3-5 dagar på 220 rpm i en skakande inkubator.
    3. Centrifugera vid 4000 x g i 20 min. ta bort supernatanten och samla pelleten.
    4. Använd en pincett för att samla ~0.5 g väl hydrerad pellet (> 50 wt % fukt) för NMR studier. Förlust av återfuktning när som helst kommer väsentligen att förvärra den spektrala upplösningen.
      Obs: Om det behövs en liten mängd (0,1 g) av de hydrerade mycelia separeras och helt torkat under N2 gasflödet i en huva eller en lyophilizer att uppskatta nivån återfuktning och beräkna torr massa. Vanligtvis, en pellet som innehåller ~0.3 g torrvikt kan erhållas efter 3 dagar. Om det NMR experimentet skall utföras är lång (> 7 dagar) eller om staten av svampar behöver fixas, svamp materialet kan djupt frysas i vätska N2 för 10-20 min före vidare bearbetning. Om experimentet kommer att vara kort (3-6 dagar), frysning förs.cykeletapper så att provet kan förbli frisk.
    5. Blanda överflödigt material med 20% (v/v) av glycerol i ett centrifugrör och hålla den i en-80 ᵒC frys för långsiktig lagring.

2. beredning av A. fumigatus för Solid-state NMR och DNP studier

  1. Beredning av A. fumigatus för solid-state NMR-experimenten
    1. Dialyze 13C, 15N-märkt svamp prov (steg 1.2.4.) mot 1 L 10 mM fosfatbuffert (pH 7,0) vid 4 ° C med en dialys väska med en 3,5 kDa molekylvikt cutoff ta bort små molekyler från odlingsmedium för en total period om 3 dagar. Ändra bufferten två gånger dagligen.
      Obs: Alternativt provet kunde tvättas för 6 - 10 gånger med avjoniserat vatten för att ta bort kvarvarande små molekyler.
    2. Över provet till en 15 mL rör och Centrifugera under 5 minuter (10 000 x g) använder en bänkmonterade centrifug. Avlägsna supernatanten och samla de resterande svamp material.
    3. Pack 70-80 mg den jämnt 13C-märkta och väl hydrerad prov klistra in en 4 mm ZrO2 rotor eller 30-50 mg till 3,2 mm rotorer för NMR experiment. Upprepande pressa provet försiktigt med en metallstav och absorbera överflödigt vatten använder papper.
    4. Tätt tak rotorn och infoga provet i spektrometern för solid-state NMR karakterisering.
      Obs: De helt nya rotorerna föreslås att minimera risken för rotor krasch och prov utsläppet i den NMR spectrometeren. Om det behövs kan en disponibel Kel-F infoga med tätande skruvar användas att fungera som en sekundär behållare inuti rotorn.
  2. Beredning av A. fumigatus prover för DNP experiment
    1. Förbereda 100 µL av DNP lösningsmedel29,44 (även känd som DNP matrix) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör 13C,15N-märkt svamp prover. Denna DNP matris innehåller en blandning av d8-glycerol/D2O/H2O (60/30/10 vol.%).
      Obs: Om omärkta prover skall undersökas, sedan förbereda DNP matris använder 13C-utarmat d8-glycerol (12C3, 99,95%. D8, 98%) och D2O och H2O för att undvika 13C signal bidrag från lösningsmedel.
    2. Lös upp 0,7 mg AMUPol45 i 100 µL av DNP lösningsmedel till formulär 10 mM radikala stamlösning. Virvel för 2-3 min att säkerställa att radikaler är helt upplöst i lösningen.
    3. Blötlägg 10 mg av dialyzed 13C, 15N-märkt svamp material som beskrivs i föregående steg (steg 2.1.1 och 2.1.2) till 50 µL AMUPol lösning och milt slipa blandningen med en mortelstöt och en mortel för att säkerställa penetration av radikaler i porösa cellväggarna.
      Obs: För att minska graden av fukt förlust, slipningen kan också ske i en mikrocentrifug rör med en micropestle.
    4. Lägga till en annan 30 µL av den radikala lösningen slipade pelleten till ytterligare hydrat svamp provet.
    5. Packa pelleten i en 3.2-mm safir rotor, pressa milt och ta bort överflödig DNP lösningsmedlet. Lägga till en 3.2-mm silikon plugg för att förhindra förlust av återfuktning. Vanligtvis kan 5-30 mg prov packas till rotorn. Det exakta beloppet måste bestämmas genom kravet på känslighet i de NMR experiment skall utföras.
    6. Infoga och snurra upp provet i en DNP-spektrometer, mäta ett DNP-förbättrade spektrum under mikrovågsugn bestrålning och jämföra det med mikrovågsugn-off spektrumet. Detta kommer att leda till en förbättring faktor εpå/av, som bör vara 20-40 för dessa komplexa material. Kör de designade experiment för att fastställa väggkonstruktion cell.

3. beredning av växtbiomassa för NMR och DNP studier

  1. Beredning av växtmaterial för solid-state NMR
    1. Producera jämnt 13C-märkta växter in-house med 13CO2 leveranser i en kammare eller 13C-glukos odlingsmedium som tidigare beskrivits46,47 eller direkt köpa märkt material från isotop-märkning företag.
      Obs: 13C-glukos kan endast användas i mörka tillväxt för att undvika införandet av 12C av fotosyntes.
    2. Skär den jämnt 13C märkt växtmaterial i små bitar (vanligtvis 1-2 mm i dimension) använder ett laboratorium rakblad.
      Obs: Beroende på syftet, extraherade cellväggar används ibland för strukturell karaktärisering och de detaljerade protokollen redovisas i tidigare studier21,46.
    3. Om provet var tidigare torkade, tillsätt 100 µL av vatten till 30 mg av växtmaterial i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, vortex, låt jämvikta i rumstemperatur i 1 dag. Centrifugera vid 4000 x g i 10 minuter och ta bort överflödigt vatten med pipett.
    4. Om provet var aldrig orkat när som helst, direkt använda provet utan ytterligare behandling.
    5. Packa de resulterande växtmaterial i 3.2-mm eller 4 mm ZrO2 rotorer för solid-state NMR-experimenten.
  2. Beredning av växtmaterial för DNP studier
    1. Laga 60 µL stamlösning av 10 mM AMUPol radikala som beskrivs steg 2.2.1 och 2.2.2.
    2. Skär den jämnt 13C märkt växtmaterial studeras i små bitar (1-2 mm i dimension) använder ett laboratorium rakblad och väga 20 mg av växtmaterial.
    3. Hand-grind växt bitar till små partiklar (~ 1-2 mm i storlek) med hjälp av en mortel och stöt. De slutliga pulver har ett homogent utseende.
    4. Tillsätt 40 µL DNP stamlösning bereddes i föregående steg (steg 2.2.2) växtmaterial och slipa milt för 5 min att säkerställa homogen blandning med radikalen.
    5. Lägga till en annan 20 µL av stamlösning till ytterligare återfukta växtmaterialet efter slipning.
    6. Packa provet skakad växt i en 3.2-mm safir rotor för DNP experiment. Infoga en silikon plugg för att undvika förlust av återfuktning.

4. standarden Solid-State NMR experiment för inledande karaktärisering av kolhydratrika biomaterial

Observera: En kort översikt över de NMR experiment finns i detta avsnitt. Strukturella klargörande kräver dock normalt omfattande expertis. Samarbeten med NMR spectroscopists rekommenderas därför.

  1. Åtgärd 1D 13C Cross polarisering (CP), 13C direkt polarisering (DP) med 2-s och 35 återvinna förseningar och 1H -13C olämplig48,49 spectra att få en allmän förståelse för den dynamiska distribution av cell komponenter (figur 1a). Cellväggarna är oftast relativt styva portion och uppvisar dominerande signaler i CP spektrumet.
  2. Mäta en serie standard 2D 13C -13C korrelation experiment för resonans tilldelningar av 13C signaler. Börja med omfokusering otillräcklig50,51 att få kol anslutning, som behöver att biträdas av en serie genom-space experiment som 1.5-ms RFDR52 (figur 1b) och 50-ms sladd/DARR53 experiment.
    Obs: Om det är av intresse att hitta ett urval rik på en viss komponent, till exempel den primära eller sekundära cellväggar, sedan flera segment eller flera växter kan behöva mätas separat för att hitta provet med optimal sammansättning.
  3. Genomföra 2D 15N -13C korrelation experiment som kan mätas för att underlätta resonans tilldelningar av proteiner och nitrogenated kolhydrater.
    Obs: Resonans uppdraget är vanligtvis tidskrävande. En metod som för närvarande utvecklas för att underlätta resonans tilldelningen av kolhydrat signaler för dessa forskare utan tidigare erfarenhet.
  4. Mäta mer specialiserade experiment för att fastställa rumsliga anslutning (figur 1 c, d), återfuktning och mobiliteter komplexa Biomolekylers att avgöra den tredimensionella strukturen kolhydratrika material som tidigare beskrivits systematiskt22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isotopen märkning avsevärt förbättrar NMR känslighet och gör det möjligt för mäta en serie 2D 13C -13C och 13C -15N korrelation spectra att analysera den sammansättning, återfuktning, rörlighet och packning av polymerer, som kommer att integreras för att konstruera en tredimensionell modell av cellväggen arkitekturen (figur 1). Om enhetlig märkning lyckas, en komplett uppsättning 1D 13C och 15N spectra kan avhämtas inom 1 h och varje standard 2D spektrum bör inte ta längre tid än 24 h mätmetoder.

Väl förberedda prover brukar förvänta sig både hög NMR stödnivåer och skarpa linjer. Att kompromissa med antingen parametern anger un-optimerad provberedning. Svamp proverna bör utarbetas på ett sätt som aldrig orkat och partiell dehydratisering under packning stegen kan leda till en betydande breddning av linjebredd. Om experimentella tiden är avsevärt längre tid än väntat för en fullpackad NMR-prov, skulle märkning vara låg. Om off-diagonal signaler är svårt att få i 2D 13C -13C korrelation spektrum, kan statistiska märkning ha inträffat (figur 1b). De två 13C topparna på 96 och 92 ppm är signatur kol 1 signaler av glukos54, därför, deras starka stödnivåer i kvantitativa 13C direkt polarisering (DP) spektra mätt med lång återvinna förseningar 35 s vanligtvis ange herravälden av små molekyler på grund av ofullständig dialys eller tvätt (figur 1a). Med väl märkt prover mätas långväga korrelationer ytterligare för att upptäcka de rumsliga anslutning av biomolekyler (figur 1 c) och konstruera den strukturella modellen av intakta cellväggar (figur 1 d).

Kemiskt namn Kemisk formel Koncentration (g/L)
Dikaliumvätefosfat fosfat K2HPO4 1.045 g
Magnesiumsulfat heptahydrat MgSO4·7H2O 0,52 g
Monokaliumfosfat fosfat KH2PO4 0.815 g
15 N - natriumnitrat 15 NaNO3 6,0 g
Kalium klorid KCl 0,52 g
U -13C-glukos 13 C6H12O6 10,0 g

Tabell 1. Sammansättningen av minimalmedium.

Kemiskt namn Kemisk formel Koncentration (g/L)
Ammonium molybdat tetrahydrat (NH4) 6 Mo7O24·4H2O 11 g
Borsyra H3BO3 11 g
Kobolt klorid hexahydrat CoCl2·6H2O 16 g
Kopparförening sulfat pentahydrat CuSO4·5H2O 16 g
Järnsulfat heptahydrat FeSO4·7H2O 5 g
Mangan klorid tetrahydrat MnCl2·4H2O 5 g
Tetranatriumetylendiamintetraacetat Na4EDTA·4H2O 60 g
Zinksulfat heptahydrat ZnSO4·7H2O 22 g

Tabell 2. Sammansättningen av spårämnen lösningen (koncentrerad). Observera att för att förbereda omärkt svampar, omärkt glukos och omärkt natriumnitrat kan användas.

Figure 1
Figur 1. Flödesschema för kännetecknar svamp väggkonstruktion cell använder solid-state NMR. (en) 1 D spectra för utfallsprov screening. Från toppen till botten är INEPT, 13C DP med 2-s återvinna förseningar, 13C DP med 35-s återvinna förseningar och 13C CP spektra, med minskande rörlighet för de identifierade molekylerna. (b) 2D 13C -13C korrelation spektrum uppmätt med 1,5-ms RFDR återkoppling. (c), representativa intermolekylära cross peak upptäckt använder 15-ms PAR spektrum. (d) strukturella modellen erhålls från NMR data. Paneler en, c och d har ändrats från Kang et al., Nat. Commun. 9, 2747 (2018). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jämfört med de biokemiska metoderna, har solid-state NMR fördelar som en icke-förstörande och högupplösande teknik. NMR är också kvantitativa sammansättning analys, och till skillnad från de flesta andra analysmetoder, gör inte har osäkerheten introducerades av biopolymerer begränsad löslighet. Inrättandet av det nuvarande protokollet underlättar framtida studier på kolhydratrika biomaterial och functionalized polymerer. Det bör dock noteras att resonans tilldelning och dataanalys kan vara tidskrävande och kräver vanligtvis systematisk utbildning. Författarna utvecklar för närvarande verktyg och databaser att hjälpa forskare utan tidigare erfarenhet att övervinna detta hinder.

Eftersom det naturliga isotop överflödet av 13C är endast 1,1%, är sannolikheten för att observera en 13C -13C cross peak med omärkt material bara 0,012% (1,1% x 1,1%) av att använda enhetligt märkt prover. Därför isotopen anrikningen uppnås med detta protokoll avsevärt förbättrar NMR känsligheten genom fyra storleksordningar och möjliggör 2D korrelation experiment för strukturella bestämning.

Optimerad, väl hydrerad proverna bör uppvisa skarpa linjer i 2D 13C -13C korrelation spectra. De mobila komponenterna, till exempel de β-glukaner i A. fumigatus och pektiner i växter bör uppvisa en full bredd på halv-maximum (FWHM) linewidth av 0,3-0,5 ppm på 600-800 MHz NMR spectrometers29,31. De styva komponenterna har något bredare toppar på grund av konfirmerande heterogenitet som utgör, repetitiva socker enheter och bristen på snabba molekylära rörelser. Den typiska 13C linewidth är 0,7-1,0 ppm för cellulosa microfibrils i växter och 0,5-0,7 ppm för kitin i svampar55. Den skarpa linewidth av cellulosa och Chitinen orsakas främst av polymer kristallinitet, således är delvis resistenta mot uttorkning och temperaturändring, till exempel kryogen temperatur DNP experiment56,57. Topp skärpan i matrix polymerer, dock är mycket känsliga för ändringen av prov förhållanden som påverkar polymer rörlighet, därför det kan användas som en indikator på prov återfuktning. Huvuddragen för matrix polymerer utse vanligtvis bristen på fukt i urvalet, som helt eller delvis kan återvinnas genom att åter lägga vatten58. Vanligtvis räcker en återfuktning nivå på 50-80 wt % för att ge en bra linewidth både växt och svamp prover.

DNP är ofta nödvändigt för att utreda dessa utmanande hela-cell-system. Vanligtvis, en 20-40 gånger förbättring av känslighet kunde uppnås på en optimerad prov på en 600 MHz/395 GHz DNP spektrometer och detta värde ökar med minskande fält, exempelvis nästan fördubblats på en 400 MHz/263 GHz DNP26,59 . I området i närheten finns det flera faktorer som kunde påverka DNP effektivitet. Först genomträngningen av radikaler in i porösa nätverket av cellväggar är avgörande och denna process kan underlättas väsentligt genom mild slipning av biomaterial i matrisen radikal-innehållande DNP. Andra fysikaliska egenskaper, styvhet exempelvis av provet påverkar valet av mikrovågseffekt, DNP matrisen ”smälter” under 12 W bestrålning vilket framgår av slipning av 1H resonanser, vilket inte var ett problem för styvare anläggningen stammarna är60. Som ett resultat, ett mer isotropiskt mönster 1H lösningsmedel toppens observeras, med lägre väsentligt spinning sidebandsna och försvagat DNP förbättring. Svagare effekt rekommenderas därför för mjukare material. För det tredje, sammansättningen av DNP matris bör optimeras. Det visar sig att d8-glycerol/D2O/H2O är i allmänhet de bästa lösningsmedel för mjuka material medan ett enklare och billigare val D2O/H2O kan också vara effektiv i vissa fall eftersom sockren som finns i systemet fungerar som cryoprotectants i viss utsträckning. I kontrast, d6-DMSO/D2O/H2O lösning misslyckas i både växter och svamp prover, med mindre än 10-faldig känslighet förbättring, således det rekommenderas inte för användning såvida inte för speciella ändamål. Ett matrix-fritt protokoll har nyligen visat sig vara mycket effektiv på grund av lösningsmedel utarmning, vilket skapar ytterligare utrymme för att rymma mer material34,56,61. Men förlusten av återfuktning presenterar en större störning av Biomolekylers struktur, således denna metod kanske inte lämplig för biologiska system. Om omärkta cellväggar är att vara utstuderat, 13C-utarmat d8-glycerol/D2O/H2O är den optimala lösningsmedel som bidrar inte någon naturlig överflöd 13C signaler som inte offrar någon känslighet förbättring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att redovisa.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Science Foundation genom NSF OIA-1833040. Nationella laboratoriet för höga magnetfält (NHMFL) stöds av National Science Foundation genom DMR-1157490 och delstaten Florida. MAS-DNP systemet på NHMFL är delvis finansierad av NIH S10 OD018519 och NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Biokemi fråga 144 Solid-state NMR dynamisk nukleära polarisering (DNP) kolhydrater cellväggar biomaterial växt svampar
Beredning av svamp och växtmaterial för strukturella klarläggande använder dynamisk nukleära polarisering Solid-State NMR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter