Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Abstract

Bu protokolü nasıl düzgün 13C, 15N etiketli mantar malzemeleri gösterir üretilen ve deneyler nasıl bu yumuşak malzeme solid-state NMR ve duyarlılık gelişmiş DNP için devam. Örnek işleme yordamı bitki biyolojik kütle Ayrıca ayrıntılı. Bu yöntem, bir dizi 1 D ve 2D 13C -13C ölçüm sağlar / yerli onların durumunda, en az pertürbasyon ile karmaşık Biyomalzeme yüksek çözünürlüklü yapısal aydınlatma sağlar15N korelasyon spectra. İzotop etiketleme 1 D spectra şiddeti ve 2D korelasyon spectra polarizasyon transfer verimi miktarının tarafından incelenebilir. Dinamik nükleer polarizasyon (DNP) numune hazırlama başarısı duyarlılık geliştirme faktörüyle değerlendirilebilir. Daha fazla deney polisakkaritler ve proteinler yapısal açılardan incelenmesi üç boyutlu mimari modeli için yol açacaktır. Bu yöntemler değiştirilebilir ve karbonhidrat açısından zengin malzemeler, bitkiler, mantarlar, algler ve bakteri, doğal hücre duvarları da dahil olmak üzere hem de sentez veya karbonhidrat polimerler ve onların karmaşık diğer tasarlanmış bir yelpazede araştırmak için uyarlanmış molekülleri.

Introduction

Karbonhidratlar enerji depolama, yapısal bina ve hücresel tanıma ve yapışma gibi çeşitli biyolojik süreçlerin merkezi bir rol oynamaktadır. Onlar hücre duvarı zenginleştirilmiş olan bitkiler, mantarlar, algler ve bakteri1,2,3temel bir bileşenidir. Hücre duvarı biyoyakıt ve biyomalzeme üretiminde için merkezi bir kaynak yanı sıra antimikrobiyal tedaviler4,5,6,7,8 için umut verici bir hedef olarak hizmet vermektedir , 9.

Bu karmaşık malzemelerin çağdaş anlayış önemli ölçüde dört önemli biyokimyasal veya genetik yöntemlerle yapısal karakterizasyon adamış çabaları onlarca tarafından ileri. İlk büyük Yöntem sıralı tedavileri farklı bölümleri, içine hücre duvarları yıkmak için kuvvetli kimyasallar veya enzimler kullanarak kompozisyon tarafından takip kullanır ve bağlantı analizi her Kesir10şekerler. Bu yöntem polimerlerin etki alanı dağıtım ışık tutuyor ama yorumu biomolecules kimyasal ve fiziksel özellikleri nedeniyle yanıltıcı olabilir. Örneğin, alkali ekstrakte kesir daha az yapılandırılmış moleküllerin tek bir etki alanı veya dağınık şekilde ayrılmış molekülleri ile karşılaştırılabilir çözünürlük gelmektedir olup olmadığını belirlemek zordur. İkinci olarak, ayıklanan bölümleri veya tüm hücre duvarları da farklı molekül11,12,13, arasında çapraz olarak da adlandırılan kovalent bağları belirlemek için çözüm NMR kullanarak ölçülebilir 14,15. Bu şekilde ayrıntılı yapısı, kovalent çapa probed ancak sınırlamaları nedeniyle polisakkaritler, crosslinking sitelerin nispeten az sayıda ve stabilize kovalent olmayan etkileri cehalet çözünürlük düşük var olabilir polisakkarit ambalaj, hidrojen bağı, van der Waals kuvvetleri, elektrostatik etkileşim ve polimer dolanması gibi. Üçüncü olarak, bağlama benzeşme kararlı vitro izole polisakkaritler16,17,18,19ama yordamlar önemli ölçüde değiştirebilir arıtma kullanarak oldu yapısı ve özellikleri bu biomolecules. Bu yöntem aynı zamanda karmaşık ifade ve oluştururlar Meclisi biyosentezi sonra çoğaltmak başarısız olur. Son olarak, fenotip, hücre morfolojisi ve genetik mutantlar mekanik özellikleri belirli hücre duvarı bileşeni zayıflatılmış üretimi ile polisakkaritler yapısal işlevleri ışıkları döken, ama daha moleküler kanıtlar bunlar köprü için gereklidir protein makineleri20makroskopik gözlemleri ile mühendislik görev.

Geliştirilmesi ve çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi son gelişmeler bu yapısal bulmaca çözme için eşsiz bir fırsat girmiştik. 2D/3D solid-state NMR deneyler kompozisyon yüksek çözünürlüklü incelenmesi ve karbonhidrat açısından zengin malzemeler büyük pertürbasyon olmadan yerel devlet mimarisini etkinleştirin. Yapısal başarıyla yürütülen çalışmalar hem birincil hem de ikincil hücre duvarları bitkiler, catalytically tedavi biyokütle bakteriyel biyofilm, pigment hayaletler mantar ve son zamanlarda yazarların, patojenik bir mantar sağlam hücre duvarları Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. dinamik nükleer polarizasyon (DNP)32,33,34,35,36,37,38 gelişimi , 39 , 40 , 41 , DNP tarafından duyarlılık geliştirme belirgin bu karmaşık Biyomalzeme deneysel zamanı kısaltır gibi 42 NMR yapısal aydınlatma önemli ölçüde kolaylaştırır. Burada açıklanan protokol için izotop etiketleme-mantar A. fumigatus ve mantar hazırlama yordamları ve bitki örnekleri solid-state NMR ve DNP karakterizasyonu için ayrıntıları. Benzer etiketleme yordamlar değişmiş orta ile diğer mantarlar için geçerli olmalı ve örnek hazırlama yordamları genellikle diğer karbonhidrat açısından zengin Biyomalzeme uygulanabilir olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. büyüme 13C, 15N etiketli Aspergillus fumigatus sıvı orta

  1. Etiketlenmemiş hazırlanması ve 13C, 15N etiketli büyüme orta
    Not: Her ikisi de Maya Extract pepton dekstroz Orta (YPD) ve geliştirilmiş en az orta43 mantar kültür bakımı için kullanılmıştır. Isıyla sonra tüm adımlar bir laminar akış hood kontaminasyon en aza indirmek için gerçekleştirilir.
    1. Etiketlenmemiş sıvı orta hazırlanması: 6.5 g YPD tozu 100 ml distile su ve sonra 25 dakika 134 ° C'de otoklav dağıtılması
    2. Etiketlenmemiş katı orta hazırlanması
      1. 1.5 g agar ve 6.5 g YPD tozu 100 mL distile su ekleyin.
      2. Otoklav ortamı için 121 ° C, sonra serin aşağı yaklaşık 50 ° c 25 dk
      3. 13-15 mL orta her öncesi steril plastik Petri kabına aktarın ve hemen bir kapak kullanarak çanak kapağı.
    3. 13C, 15N etiketli sıvı orta hazırlanması
      Not: büyüme çözüm için izotop etiketleme, 13içeren en az bir ortam hazırlamak için C-glikoz ve 15N sodyum nitrat ve bir trace öğe çözüm ayrı ayrı hazırlanan ve kullanmadan önce karışık.
      1. 100 mL izotop içeren en az orta Tablo 1' de listelenen olarak hazırlamak. PH NaOH (1 M) veya HCl (1 M) bir çözüm kullanarak 6,6 için ayarlayın.
      2. Otoklav 121 ° C'de 25 min için en az orta
      3. 100 mL hazırlamak (1, 000 x) eser elementler çözümü, Tablo 2 distile su içinde listelenen tuzları geçiyoruz. Otoklav 134 ° C'de 25 min için çözüm Sakinleş ve çözüm kısa süreli kullanım için 4 ° C'de depolayın. PH yaklaşık 6.5 olacak ve pH metre kullanarak kontrol edilebilir.
      4. Eser elementler çözüm 0.1 mL 100 mL 13C, 15N etiketli en az orta kullanmadan önce Tablo 2 ' de listelenen gibi ekleyin.
  2. Büyüme mantar malzemelerin
    1. Mantar az miktarda depolama laminar akış mahallede inoculating bir döngü kullanarak bir YPD plaka üzerine aktarın. Kültür 30 ° C'de bir kuluçka 2 gün boyunca tutun.
    2. İnoculating bir döngü bir aktif büyüyen mantar kenar 13C,15N etiketleme çözüm laminar akış başlıklı aktarmak için kullanın. Kültür 30 ° C'de 3-5 gün titreyen bir kuluçka 220 rpm'de tutun.
    3. 4000 x g 20 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet toplamak.
    4. ~0.5 g iyi sulu Pelet toplamak için bir cımbız kullanın (> 50 wt % hidrasyon) NMR çalışmalar için. Herhangi bir noktada hidrasyon kaybı önemli ölçüde spektral çözünürlüklü kötüleşeceğini.
      Not: gerekirse, küçük bir miktar (0,1 g) sulu mycelia getirilebilir ayrılmış ve tam olarak N2 gaz akışı bir başlık veya hidrasyon düzeyi tahmin ve kuru kitle yüzdeyi hesaplamak için bir lyophilizer altında kurutulmuş. Genellikle, bir Pelet ~0.3 g içeren kuru kitle 3 gün sonra elde edilebilir. Yapılacak NMR deney uzun ise (> 7 gün) ve/veya mantarlar durumunun düzeltilmesi gerekiyorsa, mantar malzeme derinden sıvı N2 için 10-20 dk daha fazla işleme önce donmuş olabilir. Deneme kısa olması durumunda örnek taze kalabilmeniz (3-6 gün),-ebilmek var olmak kaptan donma.
    5. % 20'si (v/v) gliserol santrifüj tüpü içinde kalan fazladan malzemeleri karıştırın ve uzun süreli depolama için bir-80 ᵒC dondurucuda saklayın.

2. Solid-state NMR ve DNP çalışmaları için A. fumigatus hazırlanması

  1. A. fumigatus hazırlanması solid-state NMR deneyler için
    1. 13C, 15N etiketli mantar örnek (adım 1.2.4.) 10 mM fosfat tampon (pH 7,0) küçük moleküller büyüme ortamından bir toplam 3 gün boyunca kaldırmak için bir 3,5 kDa molekül ağırlığı ile kesme bir diyaliz çanta kullanma 4 ° C'de 1 L karşı diyaliz. Arabellek günde iki kez değiştirin.
      Not: Alternatif olarak, örnek için var olmak yıkamak 6 - 10 kat deiyonize suyla kalan küçük moleküller kaldırmak için kullanma.
    2. Örnek bir 15 mL tüp ve benchtop santrifüj kullanarak santrifüj 5 min (10.000 x g) için aktarın. Süpernatant kaldırmak ve kalan mantar malzemeleri toplamak.
    3. 70-80 mg paketi düzgün 13C harfiyle ve iyi sulu örnek hamur içine 4-mm ZrO2 rotor veya 30-50 mg 3.2 mm rotor NMR deneyler için için. Hkr yavaşça bir metal çubuk kullanarak örnek sıkmak ve kağıt kullanarak aşırı su emer.
    4. Sıkı bir şekilde rotor kap ve Spektrometre solid-state NMR karakterizasyonu için örnek yerleştirin.
      Not: Yepyeni rotor rotor kilitlenme olasılığını en aza indirmek ve NMR spektrometresi sızıntısı örnek için önerilmektedir. Gerekirse, vida mühürleme ile tek kullanımlık bir Kel-F eklemek rotor ikincil bir kapsayıcı olarak hizmet etmek için kullanılabilir.
  2. DNP deneyler için A. fumigatus örnekleri hazırlanması
    1. DNP çözücüler29,44 (DNP matris olarak da bilinir) 100 µL 13için C,15N etiketli mantar örnekleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüpü hazırlayın. Bu DNP matris d8karışımı içerir-gliserol/D2O/H2O (Vol % 60/30/10).
      Not: Eğer etiketlenmemiş örnekleri araştırılması için o zaman 13C tükenmiş d8kullanarak DNP matris hazırlamak-gliserol (12C3, %99,95; D8, % 98) ve D2O ve H2O 13C önlemek için sinyal katkı maddeleri.
    2. AMUPol45 $ 100 µL DNP çözücüler formu 10 mM radikal hisse senedi çözüm için 0.7 mg geçiyoruz. Radikaller tam çözüm içinde çözünmüş emin olmak 2-3 dakika için girdap.
    3. 10 mg diyaliz 13C, 15N etiketli mantar malzemeleri AMUPol çözüm 50 µL (adım 2.1.1 ve 2.1.2) önceki adımlarda açıklandığı gibi emmek ve hafif radikaller nüfuz sağlamak için bir havaneli ve bir havan topu kullanarak karışımı eziyet gözenekli hücre duvarları.
      Not: hidrasyon kayıp oranını azaltmak için taşlama da bir micropestle kullanarak microcentrifuge tüp içinde gerçekleşebilir.
    4. Başka bir 30 µL radikal çözüm için daha fazla hidrat öğütülmüş Pelet mantar örnek ekleyin.
    5. Pelet 3.2 mm Safir rotor topla, hafif sıkmak ve aşırı DNP solvent kaldırın. Nem kaybını önlemek için 3,2 mm silikon tak ekleyin. Tipik olarak, örnek 5-30 mg için rotor paketlenebilir. Tam miktarı yapılacak duyarlılık şartı NMR deneyler tarafından belirlenecektir gerekir.
    6. Ekle ve DNP Spektrometre örnek'e kadar DNP gelişmiş bir spektrum mikrodalga ışınlama altında ölçmek ve mikrodalga-off spektrum ile karşılaştırın. Bu bir geliştirme faktör εaçma/kapamaiçin hangi-meli var olmak 20-40 karmaşık bu malzemeler için yol açacaktır. Hücre duvar yapısını belirlemek için tasarlanmış deneyler çalıştırın.

3. bitki biyolojik kütle NMR ve hazırlık DNP çalışmaları

  1. Bitki malzeme solid-state NMR için hazırlanması
    1. Aynı şekilde 13C harfiyle bitki46,47 daha önce açıklandığı gibi bir büyüme odası veya 13C-glikoz ortamda 13CO2 malzemeleri kullanarak kurum içi üretmek veya doğrudan etiketli malzeme satın almak izotop etiketleme şirketler.
      Not: 13C-glikoz yalnızca karanlık büyüme 12C giriş önlemek için fotosentez tarafından kullanılabilir.
    2. Kesme düzgün 13C etiketli bitki materyali küçük parçalara (genellikle 1-2 mm içinde boyut) laboratuvar jilet kullanarak.
      Not: amaç bağlı olarak, ayıklanan hücre duvarları bazen yapısal karakterizasyon için kullanılır ve detaylı iletişim kuralları önceki çalışmaları21,46de raporlanır.
    3. Örnek daha önce kurudu, su 100 µL bitki malzemeler 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 30 mg ekleyin girdap, oda sıcaklığında 1 gün için equilibrate. 4000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve aşırı su bir pipet kullanarak kaldırın.
    4. Hiçbir zaman herhangi bir noktada kurutulmuş örnek, doğrudan örnek daha ileri tedavi olmadan kullanın.
    5. 3.2 mm veya 4 mm ZrO2 rotor solid-state NMR deneyler için içine elde edilen bitki malzeme paketi.
  2. DNP çalışmaları için bitki malzeme hazırlanması
    1. 60 µL hisse senedi çözüm 10 mm AMUPol olarak açıklanan adımları 2.2.1 ve 2.2.2 radikal hazırlayın.
    2. Kesme düzgün 13C bitki materyali (1-2 mm içinde boyut) küçük parçalara incelenecektir için etiketli bir laboratuvar jilet kullanarak ve bitki malzemelerin 20 mg tartmak.
    3. El-bitki parçaları küçük parçacıklar (~ 1-2 mm boyutunda) eziyet bir harç ve havaneli kullanarak. Son tozlar homojen bir görünüme sahip.
    4. Bitki materyali için önceki adımda (adım 2.2.2) 40 µL DNP hisse senedi çözüm hazırlanan ekleyin ve hafif radikal ile karıştırma homojen sağlamak 5 min için eziyet.
    5. Başka bir 20 µL daha fazla bitki materyali taşlama sonra hidrat için hisse senedi çözüm ekleyin.
    6. DNP deneyler için 3,2 mm Safir rotor içine dengelenmiş bitki örnek paketi. Hidrasyon kayıplarını önlemek için silikon tak takın.

4. Standart Solid-State NMR deneyler için karbonhidrat açısından zengin Biyomalzeme ilk karakterizasyonu

Not: Bu bölümde NMR deneyler kısa bir genel bakış sağlanmaktadır. Ancak, yapısal aydınlatma genellikle geniş uzmanlık gerektirir. Bu nedenle, NMR spectroscopists ile ortak çalışmaları tavsiye edilir.

  1. Ölçü birimi 1D 13C çapraz polarizasyon (CP), 13C doğrudan polarizasyon (DP) 2-s ve 35-s ile geri dönüşüm gecikmeler ve dinamik bir genel iyi anlamak için 1H -13C BECERİKSİZ48,49 spectra Dağıtım hücre bileşenleri (Şekil 1a). Hücre duvarlarının genellikle nispeten sert bölümüdür ve CP spektrumda baskın sinyalleri sergilemek.
  2. Bir dizi standart 2D 13C -13C korelasyon deney 13C sinyallerin rezonans atamaların ölçmek. Başlatmak, karbon bağlantısı almak için yetersiz refocused50,51 ile hangi aracılığıyla uzay deneyleri 1.5-ms RFDR52 (Şekil 1b) ve 50-ms kablosu gibi bir dizi yardımcı olabilir gerek/DARR53 deneyler.
    Not: ilgi belirli bir bileşen, örneğin, zengin bir örnek bulmak için birincil veya ikincil hücre duvarları, Eğer o zaman birden çok kesimi ya da birden çok bitki optimal bileşimi ile örnek bulmak için ayrı olarak ölçülecek gerekebilir.
  3. Rezonans atamaları kattım karbonhidratlar ve proteinler kolaylaştırmak için ölçülen 2D 15N -13C korelasyon deneyler.
    Not: Rezonans atama genellikle zaman alır. Bir yöntem şu anda bilimadamlarından deneyiminiz olmadan için karbonhidrat sinyallerin rezonans atama kolaylaştırmak için geliştirilmektedir.
  4. Kayma proximities (Şekil 1 c, d), hidrasyon ve karbonhidrat açısından zengin malzemesi olarak üç boyutlu yapısını belirlemek için karmaşık biomolecules mobilities belirlemek için daha özel deneyler ölçmek sistematik olarak daha önce açıklanan22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İzotop etiketleme önemli ölçüde NMR hassasiyeti artırır ve bir dizi 2D 13C -13C ve 13C -15N kompozisyon, hidrasyon, hareketlilik analiz etmek için korelasyon spectra ölçme ve ambalaj için mümkün kılar Polimerler, hücre duvarı mimarisi (Şekil 1) üç boyutlu bir model oluşturmak için entegre edilecek. Tek tip etiketleme işlemi başarılı olursa, 1D 13C ve 15N spectra tam bir set içinde 1 h toplanabilir ve her standart 2D spektrum ölçüm 24 saat uzun sürer.

İyi hazırlanmış örnekler genellikle her iki yüksek NMR yoğunluklarda bekliyoruz ve satırları keskin. Her iki parametre ödün un en iyi duruma getirilmiş numune hazırlama gösterir. Mantar örnekleri hiç kuru bir şekilde hazırlanmalı ve ambalaj adımları sırasında kısmi su kaybı önemli linewidth genişletilmesi için neden olabilir. Deneysel saat önemli ölçüde tam olarak paketlenmiş NMR örnek için beklenenden daha uzun ise, etiketleme düzeyi azalmış olabilir. Kapalı-çapraz sinyalleri 2D 13C -13C korelasyon spektrumunda elde etmek zordur, istatistiksel etiketleme (Şekil 1b) oluşmuş olabilir. İmza karbon 1 sinyalleri glikoz5496 ve 92 ppm, iki 13C tepeler vardır, bu nedenle, onların güçlü yoğunluklarda nicel 13C 35 uzun geri dönüşüm gecikmeler ile ölçülen polarizasyon (DP) spectra doğrudan s genellikle gösterir eksik diyaliz veya (Şekil 1a) yıkama nedeniyle küçük moleküller hakimiyeti. İyi etiketli örnekleri ile uzun mesafeli ilişkiler daha da biomolecules (Şekil 1 c) kayma proximities algılamak ve sağlam hücre duvarları (Şekil 1 d) yapısal model oluşturmak için ölçülebilir.

Kimyasal adı Kimyasal formülü Konsantrasyonu (g/L)
Dipotassium fosfat K2HPO4 1.045 g
Magnezyum sülfat Heptahydrate MgSO4·7H2O 0.52 g
Monopotassium fosfat KH2PO4 0,815 g
15 N - sodyum nitrat 15 NaNO3 6.0 g
Potasyum klorür KCl 0.52 g
U -13C-glikoz 13 C6H12O6 10.0 g

Tablo 1. En az orta bileşimi.

Kimyasal adı Kimyasal formülü Konsantrasyonu (g/L)
Amonyum molibdat Tetrahydrate (NH4) 6 Mo7O24·4H2O 11 g
Borik asit H3BO3 11 g
Kobalt klorür hekzahidrat CoCl2·6H2O 16 g
Kuprik sülfat Pentahydrate CuSO4·5H2O 16 g
Demir çelik sülfat Heptahydrate FeSO4·7H2O 5 g
Manganous klorür Tetrahydrate MnCl2·4H2O 5 g
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Na4EDTA·4H2O 60 g
Çinko sülfat Heptahydrate ZnSO4·7H2O 22 g

Tablo 2. Kompozisyon (konsantre) trace öğe çözüm. Etiketlenmemiş mantarlar hazırlamak için etiketlenmemiş glikoz ve etiketsiz sodyum nitrat kullanılabileceğini unutmayın.

Figure 1
Şekil 1. Mantar hücre duvar yapısı solid-state NMR kullanarak karakterize için akış çizelgesi. (bir) 1 D spectra ilk örnek tarama için. INEPT, 13C DP 2-s geri dönüşüm ile tepeden tırnağa gelmektedir gecikmeler, 13C DP 35-s geri dönüşüm gecikmeler ve hareketlilik tespit edilen molekülleri azalan ile 13C CP spectra ile. (b) 2D 13C -13C korelasyon spektrum 1.5-ms RFDR recoupling kullanılarak ölçülür. (c) temsilcisi cins çapraz en yüksek 15-ms PAR spektrumu kullanılarak algıladı. (d) yapısal model NMR verilerden elde. Panelleri bir, c ve d değiştirilmiş Kang vd., NAT'ın Tem. 9, 2747 adet (2018). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biyokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, solid-state NMR bir non-yıkıcı ve yüksek çözünürlüklü Teknik olarak avantajları vardır. NMR da kompozisyon analizde nicel ve çoğu diğer analitik yöntemler aksine, değil belirsizlikler tanıttı biyopolimer sınırlı çözünürlük tarafından. Geçerli protokol kurulması karbonhidrat açısından zengin Biyomalzeme ve functionalized polimerler gelecek çalışmalar kolaylaştırır. Ancak, rezonans atama ve veri analizi zaman alıcı olması ve genellikle sistematik eğitim gerektiren unutulmamalıdır. Yazarlar Şu anda araçlar ve veritabanları bu engeli aşmak için bilim adamları deneyiminiz olmadan yardım geliştiriyoruz.

13C doğal izotopu bolluğu sadece %1.1 olduğundan, en yüksek malzeme etiketsiz kullanarak çapraz bir 13C -13C gözlem için sadece %0.012 (% 1,1 x % 1,1) düzgün örnekleri etiketli o kullanarak olasılığıdır. Bu nedenle, önemli ölçüde bu iletişim kuralını kullanan elde izotop zenginleştirme dört büyüklük NMR hassasiyeti artırır ve 2D korelasyon deneyler için yapısal kararlılık sağlar.

En iyi duruma getirilmiş, iyi sulu örnekleri 2D 13C -13C korelasyon spectra keskin çizgiler göstermelidir. β-glukan A. fumigatus içinde ve bitkilerde Pektinler gibi mobil bileşenleri tam genişlikte yarı-maksimum (FWHM) linewidth 0,3-0,5 göstermelidir 600-800 MHz NMR Spektrometreler29,31ppm. Katı bileşenleri oluşturan, tekrarlayan şeker birimlerinin konformasyon heterojenite ve hızlı moleküler hareketleri eksikliği nedeniyle biraz daha geniş tepeler vardır. Tipik 13C linewidth 0,7-1,0 edilmiştir ppm için selüloz microfibrils bitkiler ve 0.5-0.7 ppm kitin mantarlar55yılında için. Selüloz ve kitin keskin linewidth esas olarak polimer crystallinity tarafından neden olduğu, böylece kısmen su kaybı ve ortam sıcaklığı, örneğin, kriyojenik sıcaklık DNP deney56,57dayanıklıdır. Matris polimerlerin en yüksek netlik ancak, son derece hassas polimer hareketlilik etkileyen örnek koşulları değiştirmek için, bu nedenle, bu örnek hidrasyon bir göstergesi olarak kullanılabilir. Matris polimerlerin geniş hatları genellikle tamamen veya kısmen su58yeniden ekleyerek kurtarılabilir örnek hidrasyon eksikliği belirleyin. Genellikle, wt % 50-80 nem düzeyini iyi linewidth bitki ve mantar örnekleri sağlamak için yeterli.

DNP kez bu zorlu bütün hücreli sistemler soruşturma için gereklidir. Genellikle, bir 20-40 kat geliştirmesi hassasiyeti 600 MHz/395 GHz DNP spektrometre üzerinde en iyi duruma getirilmiş bir örnek üzerinde elde edilebilir ve bu değer alan, örneğin, neredeyse bir 400 MHz/263 GHz DNP26,59 tarihinde iki katına azaltılarak artırır . DNP verimliliği etkileyen çeşitli faktörler vardır. İlk olarak, radikaller penetrasyon hücre duvarları gözenekli ağ içine çok önemlidir ve bu süreç önemli ölçüde radikal içeren DNP matris Biyomalzeme hafif zımpara tarafından kolaylaştırılabilir. İkinci olarak, fiziksel özellikleri, sertliği Örneğin, örnek mikrodalga gücünü DNP matris 1H rezonanslar hangi ağır bitki için bir sorun değildi netlik tarafından kanıtlanan altında 12 W ışınlama erir"seçim etkiler 60kaynaklanıyor. Sonuç olarak, 1H solvent tepe daha izotropik bir desen görülmektedir, alt ile önemli ölçüde iplik sidebands ve zayıflatılmış DNP geliştirme. Bu nedenle, zayıf güç daha yumuşak materyaller için önerilir. Üçüncü olarak, DNP matris bileşimi optimize edilmelidir. Görünüşe göre o d8-gliserol/D2O/H2O olduğunu genellikle en iyi çözücüler yumuşak malzeme için şekerler sistemde çünkü D2O/H2O daha basit ve ucuz bir seçim de bazı durumlarda etkili olabileceği gibi bir dereceye kadar cryoprotectants olarak hizmet vermektedir. Buna karşılık, d6-DMSO/D2O/H2O çözüm başarısız bitki ve mantar örnekleri, ile 10 kat daha az duyarlılık geliştirme, böylece bu kullanım için sürece tavsiye edilmez özel amaçlar için. Bir matris-Alerjik protokol son zamanlarda daha fazla malzeme34,56,61gerçekleştirmek için ek alan oluşturur solvent tükenmesi nedeniyle son derece etkili olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hidrasyon kaybı biomolecules yapısına büyük bir pertürbasyon sunar, böylece bu yöntem biyolojik sistemleri için uygun olmayabilir. Etiketlenmemiş hücre duvarları olması, okudu 13d8C tükenmiş olup olmadığını-gliserol/D2O/H2O olduğunu herhangi bir doğal bereket 13C sinyalleri katkı sağlamamaktadır ne de herhangi bir duyarlılık kurban en iyi çözücü ayný ölçüde geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

İfşa etmek yok.

Acknowledgments

Bu eser NSF OIA-1833040 Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ulusal yüksek manyetik alan Laboratuarı (NHMFL) DMR-1157490 ve Florida eyaletinde Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir. MAS-DNP sistem NHMFL, kısmen NIH S10 OD018519 ve NSF CHE-1229170 tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Biyokimya sayı: 144 Solid-state NMR dinamik nükleer polarizasyon (DNP) karbonhidrat hücre duvarları Biyomalzemeler bitki mantar
Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter