Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

توزيع المياه Xylem في النباتات الخشبية تصور مع مجهر إلكترون المسح بالتبريد

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

مراقبة توزيع المياه داخل إكسيليم يوفر معلومات هامة فيما يتعلق بديناميات تدفق المياه في النباتات الخشبية. في هذه الدراسة، ونحن نبين النهج العملي لمراقبة توزيع المياه xylem في الموقع باستخدام كريوستات وcryo-SEM، الذي يلغي التغيرات الفنية في حالة المياه أثناء إعداد العينة.

Abstract

يسمح مجهر إلكترون المسح الضوئي المثبت باستخدام وحدة التبريد (cryo-SEM) بمراقبة العينات عند درجات حرارة دون الصفر، وقد استخدم لاستكشاف توزيع المياه في أنسجة النباتات بالاقتران مع تقنيات تثبيت التجميد باستخدام النيتروجين السائل (LN) 2). بالنسبة للأنواع الخشبية ، ومع ذلك ، فإن الاستعدادات لمراقبة سطح القطع العرضية xylem تنطوي على بعض الصعوبات بسبب اتجاه الألياف الخشبية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي التوتر العالي في عمود المياه في قنوات إكسيليم في بعض الأحيان إلى تغييرات في توزيع المياه، وخاصة أثناء تثبيت العينة وجمعها. في هذه الدراسة، ونحن نبرهن على إجراء فعال لمراقبة توزيع المياه داخل xylem من النباتات الخشبية في الموقع باستخدام كريوستات وCRYO-SEM. في البداية، خلال جمع العينات، يجب أن يقيس قياس إمكانات المياه إكسيليم ما إذا كان التوتر العالي موجود في قنوات إكسيليم. عندما تكون إمكانات المياه زيليم منخفضة (< ما هو ; 0.5 باسكال) ، هناك حاجة إلى إجراء تخفيف التوتر لتسهيل الحفاظ على أفضل من حالة المياه في قنوات xylem أثناء تثبيت العينات. بعد ذلك، يتم إرفاق طوق محكم حول جذع شجرة ومليئة LN2 لتثبيت تجميد حالة المياه من xylem. وبعد الحصاد، ينبغي الحرص على ضمان حفظ العينة المجمدة مع استكمال إجراءات إعداد العينات للمراقبة. يتم استخدام كريوستات لفضح بوضوح سطح القطع العرضي زيليم. في عمليات الملاحظات cryo-SEM، يلزم تعديل الوقت لتجميد الحفر لإزالة غبار الصقيع وإبراز حافة جدران الخلية على سطح المشاهدة. تظهر نتائجنا إمكانية تطبيق تقنيات cryo-SEM لمراقبة توزيع المياه داخل إكسيليم على المستويات الخلوية ودون الخلوية. ومن شأنه أن يحسن الجمع بين تقنيات الرصد في الموقع غير المدمرة بين نظام التبريد والتبريد والمياه في المياه بشكل عميق من استكشاف ديناميات تدفق المياه في النباتات الخشبية.

Introduction

إن توافر الموارد المائية (أي التهطال ومحتوى مياه التربة) يحدد بدقة معدل الوفيات والتوزيع الجغرافي لأنواع النباتات، حيث أنها تحتاج إلى امتصاص المياه من التربة ونقلها إلى أوراق إنتاج التمثيل الضوئي. يجب على النباتات الحفاظ على شبكة النقل المائي الخاصة بها تحت إمدادات المياه المتقلبة. وعلى وجه الخصوص، تولد النباتات الخشبية توترات عالية في قنواتها على طول مجاري الناحيات، حيث أنها تحتاج في بعض الحالات إلى الاحتفاظ بتاجها على ارتفاع يزيد عن 100 متر فوق سطح الأرض. للحفاظ على أعمدة المياه تحت هذا الضغط السلبي العالي، قنوات xylem تتكون من سلسلة متصلة من الخلايا الأنبوبية مع جدران الخلايا الصلبة ومحصنة المسعورة1. إن ضعف الضعف في ضعف القناة إكسيليم لقنوات إكسيليم في كل نوع هو عامل محدد جيد لبقاء الأنواع تحت إمدادات المياه المتقلبة2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن دراسة حالة المياه من قنوات xylem مهم لتقييم الحالة الصحية للأشجار الفردية التي تتعرض لضغوط لاأحيائية أو حيوية. قياس تدفق النسغ أو إمكانية المياه يمكن أن توفر تقديرات لحالة المياه مصنع خشبي بسبب وظيفة هيدروليكية متكاملة من قنوات xylem. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي تصور توزيع المياه في خلايا إكسيليم إلى توضيح حالة المكونات الفردية للنظام الهيدروليكي إكسيليم.

توجد عدة تقنيات لتصور حالة المياه من قنوات xylem3. الأساليب الكلاسيكية والمفيدة لمراقبة مسارات المياه في الأنسجة الخشبية تنطوي على تلطيخ عمود الماء عن طريق غمر نهايات قطع الفروع في صبغ أو عن طريق حقن صبغة في شجرة دائمة ينبع4. كما يسمح التصوير بالأشعة السينية اللينة بتصور توزيع المياه لشرائح الأقراص الخشبية بسبب شدة امتصاص الأشعة السينية التفاضلية للرطوبة في زيليم5و6. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا توفر سوى مسارات لحركة المياه أو تبين توزيعات للمياه. في الآونة الأخيرة، تقنيات المراقبة غير المدمرة، مثل التركيز الدقيق بالأشعة السينية التصوير المقطعي (μCT)7و8و9و10والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)11، 12, وقد تحسنت بشكل كبير للسماح لمراقبة المياه في قنوات xylem داخل الشتلات سليمة. هذه الأساليب غير المدمرة لها مزايا كبيرة في أننا يمكن أن نلاحظ حالة المياه xylem دون آثار قطع الاصطناعية، ويمكننا تتبع ديناميات تدفق المياه عن طريق التصوير متتابعة أو إدخال عامل التباين10. ومع ذلك، نحن بحاجة إلى استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مخصصة للتصوير النباتي أو منشأة متخصصة لميكروكت القائم على سينكروترون من أجل الحصول على الصور التي يمكن تحديد محتوى المياه على مستوى الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن نظام ميكروكت القائم على سينكروترون تمكين للحصول على صور دقيقة مع دقة عالية المكانية، والتي هي مماثلة للميكروسكوب الضوئي7،8،9، يمكن أن يصاب الخلايا الحية من قبل إشعاع من الطاقة العالية الأشعة السينية13،14. استخدام المجهر الإلكتروني المسح التي يتم فيها تثبيت وحدات التبريد (cryo-SEM) هو طريقة مفيدة جدا لتحديد بدقة المياه في إكسيليم على المستوى الخلوي، على الرغم من أن هذا يتطلب حصاد المدمرة العينة للمراقبة. لإصلاح المياه في قنوات xylem، يتم تجميد جزء من ينبع (أي الأغصان، فروع أو ينبع) في الموقععن طريق النيتروجين السائل (LN 2). ملاحظات سطح العينات المقصوصة والمجمدة من قبل cryo-SEM توفر صوراً مكبرة للغاية لهيكل إكسيليم الذي يمكننا من خلاله تحديد المياه في قنوات إكسيليم كجليد. ومن القيود الهامة على هذه الطريقة أن المراقبة المتتابعة لقابلية نقل المياه داخل نفس العينة مستحيلة. ومع ذلك، فإن تطبيق التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير بالرنين المغناطيسي للمراقبة المتتابعة للأشجار التي تعيش في حقل ما يشكل تحدياً كبيراً لأن هذه الأدوات ليست محمولة. وعلى النقيض من ذلك، فإن cryo-SEM لديه القدرة على استخدام هذه التقنية على الأشجار الكبيرة في التجارب الميدانية لتصور محتويات المياه بوضوح ليس فقط على المستوى الخلوي ولكن أيضا على مستوى بنية أدق، مثل المياه في الحفر بين الأوعية الدموية15،والمياه في المساحات بين الخلايا16، أو فقاعات في عمود المياه17.

وقد تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات مراقبة المياه إكسيليم بواسطة CRYO-SEM 5،12،18،19،20،21،23. وقد أنشأ أوتسومي وآخرون (1996) في البداية بروتوكول اعادة النظر في حالة الزلمة في الموقع عن طريق تجميد تثبيت جذع حي عن طريق ملء LN2 في حاوية توضع على الجذع21. وحافظت درجة حرارة العينة على أقل من -20 درجة مئوية أثناء جمع العينات وأثناء تحضير الكريو -SEM من أجل تجنب ذوبان الجليد داخل قنوات إكسيليم. وقد استخدمت هذه الطريقة لمراقبة المياه في إكسيليم من أجل توضيح توزيع المياه في ظل تغيير نظام المياه11,12,24,25,26, 27,28, التغير الموسمي لتوزيع المياه21,29,30, تأثير دورات التجميد الذوبان17,31, 32, توزيع المياه في الخشب الرطب5, التغيرات في توزيع المياه خلال الانتقال من خشب السابود إلى خشب القلب20, الموسمية دورة من النشاط الكامبيال وتمايز السفن33, والتجويف الناجم عن بعض الضغوط الحيوية23،34. كما تم التحقق من التوصيل الهيدروليكي والقنوات الضعف إلى التجويف باستخدام CRYO-SEM35،36. وقد استخدم نظام Cryo-SEM المجهز بمطياف الأشعة السينية المشتت للطاقة (EDX أو EDS) لدراسة توزيع العناصر على سطح عينة تحتوي على الماء37.

تجميد تثبيت الجذع الحية التي تحتوي على قنوات تحت التوتر الهيدروليكي العالي يسبب أحيانا التجويف الاصطناعي التي لوحظت من قبل CRYO-SEM كما كسر بلورات الجليد في تجويف من القنوات38،39. وعلى وجه الخصوص، فإن الأنواع ذات الأوراق العريضة ذات القنوات الأطول والأوسع معرضة للقطع الأثرية الناجمة عنالتوتر، مثل التجويف الناجم عن قطع العينات، حتى لو أجريت تحت الماء 3،40. التجويف القطع الأثرية تصبح واضحة بعد أخذ العينات من شجرة تُحدث (أي أخذ العينات خلال النهار) أو في ظل ظروف الجفاف الشديد ويمكن أن تضلل إلى المبالغة في تقدير حدوث التجويف3,38, 39. ولذلك، فإن التوتر العمل في القنوات يجب أن يطلق سراحه منأجل تجنب التجويف artifactual 3،12،39.

وغالبا ما تستخدم تقنية تجميد الكسر باستخدام سكين مثبت في غرفة عينة لفضح سطح العينة للمراقبة cryo-SEM. ومع ذلك، تجميد كسر الطائرات من الأنسجة النباتية الخشبية، وخاصة المقاطع المستعرضة من xylem الثانوية، هي خشنة جدا لمراقبة بوضوح المعالم التشريحية والمياه في الأنسجة6. تطبيق كريوستات لتقليم عينة يسمح إعداد سريع وعالي الجودة من السطوح عينة20،23. والهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم الأدلة مع دقة المجهر الإلكتروني لتوزيع المياه في أنواع مختلفة من خلايا إكسيليم في الموقع دون حدوث القطع الأثرية أخذ العينات. نحن نقدم لدينا إجراء تحديث، والتي تم تحسينها بشكل مطرد منذ اعتمدنا لأول مرة، فيما يتعلق بأخذ العينات، وتقليم وتنظيف سطح العينة للحصول على ميكروغرافات الإلكترون عالية الجودة من عينات cryo ثابت من xylem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: مخطط تخطيطي لهذا البروتوكول هو موضح في الشكل 1.

1. أخذ العينات: الاسترخاء التوتر داخل عمود المياه من قنوات Xylem

ملاحظة: ينصح بعلاج تخفيف التوتر التالي قبل تطبيق LN2 لتجنب كل من التجميد والتوتر الناجم عن القطع الأثرية في توزيع المياه إكسيليم.

  1. قم بتضمين فرع ويترك لأخذ العينات مع كيس بلاستيكي أسود لتوازن إمكانات المياه بين إكسيليم ويترك أكثر من ساعتين قبل أخذ العينات.
  2. تحديد إمكانية المياه من أوراق اثنين على الأقل من العينة باستخدام غرفة الضغط أو جهاز نفس. عندما تكون إمكانية المياه أعلى من 0.5 باسكال (أي لا يوجد توتر أو توتر منخفض جدا)، يمكن حصاد عينة بعد التجميد (انظر القسم 2: تجميدالتثبيت). عندما تكون إمكانية المياه أقل من -0.5 مليون باسكال، هناك حاجة إلى علاج للاسترخاء على النحو المبين أدناه.
  3. إصلاح طوق محكم حول الجذعية من أجل أن تكون مليئة بالماء. كوب من البلاستيك دون أسفل يمكن أن تكون بمثابة طوق محكم. وينبغي الحرص على إغلاق المساحات بإحكام بين الجذعية وطوق باستخدام شريط لزجة لمنع تسرب الوسائط السائلة التي تستخدم في وقت لاحق. لحصاد ينبع مرنة مثل فروع رقيقة أو الأغصان، تغرق جزء قطع في دلو مليئة بالماء عن طريق الانحناء الجذعية. قطع تحت سطح الماء باستخدام المقصات التقليص أو منشار. نقل العينة إلى وعاء آخر من الماء في أسرع وقت ممكن لتقليل تعريض نهاية قطع إلى الهواء.
  4. الحفاظ على نهاية قطع من العينة تحت الماء. بالنسبة للأنواع ذات الأوراق العريضة، تأكد من أن الطول من البقعة التي يتم فيها الحصول على عينة من الكريو لـ SEM إلى حافة القطع من الساق المقطوعة أطول من الحد الأقصى لطول السفن للعينات من أجل منع القطع الأثرية الناجمة عن التوتر داخل العينة المبردة.
  5. تغطية عينة تحتوي على أوراق مع كيس من البلاستيك الأسود للحد من transpiration. الحفاظ على نهاية قطع من العينة في الماء والحفاظ على هذا الشرط لمدة 30 دقيقة تقريبا من أجل الاسترخاء التوتر xylem. تجنب وقت أطول الاسترخاء (> 1 ح) بسبب إعادة ملء الاصطناعية المحتملة من القنوات تجويف12.
  6. قياس إمكانات المياه مرة أخرى لتأكيد الاسترخاء من التوتر xylem (ما يقرب من 0 مابا).
    ملاحظة: قبل أخذ العينات، ينبغي بحث الحد الأقصى لطول السفن للأنواع المستهدفة أو تحديدها بعينات مماثلة بواسطة طريقة حقن الهواء. عند أخذ عينات من شجرة كبيرة، أو فرع كبير، فإنه من الصعب إجراء إجراءات تخفيف التوتر المذكورة أعلاه. ولذلك، يجب جمع عينات من الأشجار الكبيرة خلال فترة ما قبل الفجر عندما تكون إمكانات المياه xylem أعلى.

2. تجميد التثبيت مع LN2

  1. قطع وفتح جانب واحد من طوق محكم مع مقص أو سكين فائدة. قم بإرفاق الطوق حول الجذع بشريط لاصق مع الضغط على الفتحة أفقياً.
  2. ارتداء قفازات عازلة / القفاز، ولكن تأكد من عقد زجاجة LN2 بأمان، وتشغيل LN2 في طوق لملء مع LN2. احتفظ به مملوءاً بإضافة LN2 بشكل مطرد لتجميد الماء بالكامل في إكسيليم. الوقت المطلوب لتجميد يعتمد على حجم العينة; 1 دقيقة بعد الغليان من سكب LN2 وقد توقفت كافية لغصين صغير أو الشتلات، في حين أن هناك حاجة لأكثر من 20 دقيقة لجذع شجرة أكبر20. إضافة LN2 باستمرار أثناء التجميد كما يتبخر بسرعة بسبب الاختلافات في درجة الحرارة الكبيرة بين LN2 ودرجات الحرارة المحيطة.
  3. فصل طوق من الجزء المجمدة من الجذعية عينة من أجل إزالة LN2 بعد وقت التجميد كافية. تأكد من ارتداء قفازات عازلة لتجنب ملامسة الانسكابات LN2 المحتملة الناجمة عن فصل طوق.
  4. حصاد العينة مع منشار يدوي غرامة على الفور.
  5. تغطية العينة المجمدة مع قطعة من رقائق الألومنيوم أو وضعه في أنبوب عينة، والتي يتم كتابة أرقام الهوية عينة. ضع العينة المقطوعة بسرعة في حاوية مليئة بـ LN2 أو قم بتغليفها في صندوق معزول مملوء بالثلج الجاف.
  6. تخزين العينات في الفريزر العميق حتى المراقبة. درجة حرارة التخزين المفضلة هي -80 درجة مئوية من أجل منع التسامي الجليدي وبلورته أثناء التخزين.

3. إعداد العينات

ملاحظة: للملاحظة، يجب أن يتم اقتطاع عينة ويجب تخطيط سطحها للمراقبة في درجة حرارة دون الصفر من أجل الحفاظ على توزيع المياه في إكسيليم في الموقع. الميكروتومي البيولوجي مع نظام كريوستات (كريوستات) مثالية لتقليم وفضح سطح عينة في هذا النوع من المراقبة من قبل cryo-SEM.

  1. تعيين درجة حرارة غرفة عينة من كريوستات إلى -30 درجة مئوية، والتي عادة ما تكون باردة بما فيه الكفاية للحفاظ على النسغ إكسيليم من معظم النباتات في حالة المجمدة.
  2. قم بتقليم عينة في قطعة صغيرة (< ca. 2 سم في الطول و < ca. 1 سم في العرض أو القطر) التي يمكن تعديلها لحامل العينة من CRYO-SEM. استخدم سكين حاد أو منشار مسنن غرامة للتشذيب من أجل منع كسر الجليد في العينة. في حالة عينة أكبر التي لا يمكن قطع بسكين، بسرعة قبل قطع مع منشار تبريد في صندوق الفريزر.
  3. نعلق قطعة قلص إلى تشاك، حامل لcryostat عن طريق تركيب على الأنسجة تجميد تضمين المتوسطة (على سبيل المثال، مجمع OCT) للتقسيم بالتبريد. ثم، إرفاق تشاك إلى حامل عينة من ميكروتومي من كريوستات.
  4. قم بتقليم السطح عن طريق الحلاقة المتكررة مع أجزاء 5-7 ميكرومتر في سمك. التشذيب عن طريق قطع أكثر من 1،000 إلى 2،000 ميكروم، في العمق الكلي من السطح الأولي في جمع العينة، مفيد للقضاء على الجزء التالف من العينة الناجمة عن قطع ما قبل بسكين أو المنشار كما هو موضح في الخطوة 3.2.
  5. بعد تقريبًا بتقليم سطح العينة، قم بضبط جزء غير مستخدم من شفرة الميكروتومي فوق سطح العينة. لا تسمح للشفرة للمس العينة التي من شأنها أن تتجاوز الإعداد سمك.
  6. قبل قطع الأولى من قبل الجزء شفرة غير المستخدمة، وتوسيع قليلا المسافة بين سطح العينة وشفرة.
  7. قطع سطح العينة مرة واحدة فقط أو مرتين. وعلاوة على ذلك، قم بتمرير النصل مرة أخرى مع ضبط جزء شفرة غير مستخدم على سطح العينة.
  8. كرر الخطوات 3.6 و 3.7 ثلاث أو أربع مرات. وهذا أمر مهم من أجل الحصول على سطحواضح بدون "علامات سكين" (الشكل 4).
  9. بعد القطع النهائي، قم بتعيين موضع النصل بعيدًا عن العينة لمنع الغبار من الالتصاق بالعينة.
  10. فصل تشاك من حامل العينة وفصل العينة من تشاك عن طريق إزالة المتوسطة التضمين المجمدة بسكين حادة. تأكد من وضع العينة في غرفة كريوستات لمنع سطحها المخطط من غبار الصقيع.
  11. نعلق العينة على حامل عينة cryo-SEM مع تجميد الأنسجة المتوسطة في غرفة كريوستات.

4. نقل إلى غرفة العينات Cryo-SEM

ملاحظة: يجب حماية العينة التي تم إعدادها على السطح من زيادة درجة الحرارة أو تراكم الصقيع أثناء النقل من غرفة كريوستات إلى مرحلة المراقبة في غرفة العينات cryo-SEM.

  1. الحفاظ على درجة حرارة المرحلة الباردة في غرفة العينات CRYO-SEM عند أقل من -120 درجة مئوية مع LN2 وفقا لدليل المستخدم للمعدات.
  2. ضع حامل العينة مع العينة المعدة في حاوية عازلة مليئة بـ LN2 في غرفة كريوستات.
  3. عقد حامل العينة مع عينة تبادل قضيب تحت LN2. تجنب تعريض حامل العينة للهواء كلما كان ذلك ممكنا.
  4. بسرعة تعيين حامل العينة إلى غرفة ما قبل الإجلاء من غرفة عينة CRYO-SEM بمجرد بدء إخلاء غرفة ما قبل الإخلاء. ثم، وضع حامل العينة على المرحلة الباردة بعد يتم اخلاء الهواء تماما. على الرغم من أن قليلا من تراكم الصقيع أمر لا مفر منه، فإن إجراء "التجميد النقش" (الخطوة 6) يمكن إزالته.

5. الإعداد في SEM

ملاحظة: إعداد نموذجي للملاحظة هو موضح أدناه. بعض التعديلات مطلوبة اعتمادا على حالة فراغ أو شعاع الإلكترون.

  1. تعيين معلمات SEM للملاحظة كما يلي:
    تسارع الجهد: 3-5 كيلو فولت
    درجة حرارة مرحلة العينة: < −120 درجة مئوية
    كاشف: الانبعاثات الثانوية

6. تجميد النقش

ملاحظة: تجميد النقش هو الإجراء لإبراز حافة جدران الخلية العينة عن طريق التسامي الكريستال الجليدي طفيف. تجميد النقش ينطوي أيضا على إزالة الغبار الصقيع السطحي.

  1. بدوره على الجهد تسارع من بندقية كهربائية أثناء تجميد الحفر. فمن الأفضل لإجراء تجميد النقش أثناء مراقبة العينة.
  2. رفع درجة حرارة مرحلة العينة إلى -100 درجة مئوية.
  3. انتظر عدة دقائق حتى تتم إزالة غبار الصقيع والمستوى السطحي للجليد في خلايا إكسيليم قد انخفض قليلا بالمقارنة مع جدران الخلية.
  4. خفض درجة حرارة مرحلة العينة إلى -120 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا لم يكن هناك وحدة تحكم درجة الحرارة المثبتة لمرحلة العينة، عقد العينة باستخدام قضيب تبادل وفصله من مرحلة العينة لبضع دقائق. لاحظ العينة عدة مرات خلال عملية التجميد هذه للتحقق من حالة التسامي للعينة.

7. طلاء المعادن (اختياري)

ملاحظة: يمكن أن تقدم التحسينات الأخيرة على أداة SEM ومعالجة الصور صور عالية الجودة من عينات العزل الكهربائي دون طلاء معدني. غير أن العينات غير الموصلة، مثل المواد البيولوجية، تخضع أحيانا ً للحشو؛ سطوع أعلى في مواقع محددة من العينة بسبب تراكم الإلكترونات ("الشحن"). تعريض العينة إلى الحزم الإلكترون لفترة أطول من الزمن أو لتكبير عالية، يزيد من آثار الشحن. طلاء سطح العينة مع المواد المعدنية الكهربائية الموصلة يمنع حدوث الشحن. استخدام نظام طلاء الفراغ الذي تم تثبيته داخل وحدة CRYO-SEM من أجل منع درجة حرارة العينة من الزيادة أثناء الطلاء.

  1. تأكد من تركيب مواد الطلاء على رأس المبخر المعين لنظام الطلاء.
  2. الحفاظ على درجة حرارة المرحلة الباردة في نظام الطلاء أدناه -170 درجة مئوية.
  3. وضع حامل العينة على المرحلة الباردة من نظام الطلاء بعد ما يكفي من تجميد النقش.
  4. فتح قسم بين المرحلة الباردة ورأس المبخر.
  5. تعيين القيمة الحالية وقيمة الجهد من رئيس المبخر في ما يقرب من 30 مادا و5 V، على التوالي.
  6. تتبخر مواد الطلاء ل30 s لمعطف سطح العينة.
  7. تعيين كل من القيم الحالية والجهد من رئيس المبخر في الصفر وإغلاق القسم.
  8. وضع حامل العينة على المرحلة الباردة من غرفة عينة للمراقبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر في الشكل 2صور تمثيلية لأسطح القطع المستعرضة لزيليم الأشجار الصنوبرية والعريضة الأوراق، التي لاحظها كريو-سيم . عند التكبير المنخفض، تشير المنطقة السوداء في الصور إلى تجاويف المياه التي تختفي منها المياه كلياً أو جزئياً، وتشير المنطقة الرمادية إلى جدران خلايا إكسيليم والسيتوبلاسم والماء (الشكل2أ). في التكبير العالي، من الواضح أن الماء لا يضيع تماما من الإنارة من ثلاثة الرغامى، مما يدل على حدوث فقاعات الماكرو في النسغ xylem في الموقع (الشكل2B). وفيما يتعلق بالأنواع ذات الأوراق العريضة، يمكن اكتشاف حدوث التجويف بسهولة داخل السفن، في حين يصعب التمييز بين وجود المياه داخل الألياف، وخاصة عند التكبير المنخفض (الشكل2C). يمكن تمييز السيتوبلازم في خلايا parenchyma من المياه داخل trahceids أو السفن من خلال القوام سهل الجليد (على سبيل المثال، الشكل 2B).

يظهر تأثير درجة الحرارة على عملية التجميد والحفر في الشكل 3. يتم إزالة غبار الصقيع تدريجيا وتصبح أغشية الحفرة البينية أكثر وضوحا من خلال تطور التسامي مع ارتفاع درجة الحرارة. يمكن القضاء على جزيئات غبار الصقيع الكبيرة المتبقية عن طريق مزيد من التجميد النقش ولكن هذا يمكن أن يكون إشكالية لأنه يقلل دون داع من مستوى سطح الجليد في قنوات xylem.

وتتحقق جودة المراقبة العالية إلى حد كبير من خلال إعداد العينات الدقيقة؛ مهم بشكل خاص هو تمهيد السطح مع شفرة حادة من ميكروتومي. التجانس غير الكافي بواسطة شفرة مستعملة يمكن أن يسبب في بعض الأحيان سطح خشن (يسمى "علامات سكين"، الشكل4) أو العديد من الحوادث من الغبار من التخفيضات. بعد التخطيط بعناية لسطح العينة، فإن النقل السريع للعينة إلى غرفة العينة أمر بالغ الأهمية أيضًا للقضاء على التلوث الناجم عن تشكيل الصقيع.

سوف تجميد عينة دون الاسترخاء من الضغط السلبية عمود المياه يسبب الحث الارتكافي من التجويف في قنوات xylem (الشكل 5). ولوحظت بلورات الثلج المتجمعة في أوعية من العينات التي لم تكن العينة مسترخية منها (رؤوس الأسهم في الشكل 5أ)،على النقيض من ذلك، لم تلاحظ أي بلورات ثلج متجمعة في عينات عينات مريحة ذات إمكانات مائية مماثلة ( الشكل 5 ويميل هذا إلى أن يكون أكثر أهمية في الزيليم من الأشجار ذات الأوراق العريضة بدلا من الأشجار الصنوبرية (بيانات غير منشورة).

Figure 1
الشكل 1: مخطط تخطيطي لهذا البروتوكول. ويرد بيان بتدفق الإجراءات من أخذ العينات إلى الملاحظة SEM الوارد وصفها في هذه الورقة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مثال ميكروغرافات CRYO-SEM للأسطح المستعرضة للأنواع الوعائية وشجرة الجيومنوسبير. المناطق الرمادية والسوداء في خلايا إكسيليم تتوافق مع الماء والتجاويف في عمود المياه من خلايا إكسيليم، على التوالي. وبما أن العينات كانت ثابتة بالنيتروجين السائل قبل جمع العينات، فإن الصور التي كتبها cryo-SEM تظهر حالة المياه في المحطة وانسدادها الأصلي في لحظة أخذ العينات. (أ) و (ب): غصين عمره سنتان لشجرة بالغة من Cryptomeria Japonica (خشب الصنوبري). وكان قطر الغصين 3 مم، وكانت إمكانات المياه -0.39 مليون باسكال عند الحصاد قبل الفجر. (ج): تصوير الشتلات التي يبلغ عمرها عامين من كربينوس تشونوكسكي (الخشب المسامية المنتشر) (1.4 متر في الارتفاع و1.1 سم في القطر القاعدي). وقد أخذت عينات من الشتلات بعد إجراء تخفيف التوتر بعد تمديد فترة القيد في الري لمدة أربعة أيام. وكانت إمكانات المياه -1.78 باسكال بعد جفاف طويل وكان +0.15 MPa بعد إجراء تخفيف التوتر. Tr: الرغامى, R: شعاع parenchyma, V: سفينة, F: الألياف, AP: parenchyma المحورية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تذويب وحفر التقدم الإجراء عن طريق رفع درجة حرارة مرحلة العينة الباردة. سطح مستعرض قطع من xylem من الغصين Cryptomeria Japonica (خشب الصنوبرية). ودرجات الحرارة المتناقصة في مرحلة العينة هي (A) - 113.0 درجة مئوية، (B) - 105.3 درجة مئوية، (C) - 101.9 درجة مئوية و (D) - 99.7 درجة مئوية. تم الحصول على كل صورة حوالي 5 دقيقة بعد تعيين درجة حرارة مرحلة العينة الباردة في قيمة درجة الحرارة المعنية. تقدم التسامي الجليدي إذا تم الحفاظ على درجة حرارة المرحلة فوق -120 درجة مئوية تقريبا (لمعداتنا). Tr: القصبات الهوائية، B: زوج حفرة الحدود، PM: حفرة الغشاء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مثال على علامة السكين. سطح مستعرض قطع من xylem من غصين Cryptomeria Japonica (الخشب الصنوبري) تظهر ما يسمى علامات السكين. تمثل رؤوس الأسهم والخطوط المتقطعة علامات سكين نموذجية. يجب أن يتم تطهير سطح عينة من قبل cryostat من قبل جزء غير مستخدم من شفرة السكين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مثال على تأثير تخفيف التوتر في عمود الماء في القنوات. سطح مقطع مستعرض من الجذعية من الشتلات كاربينوس tschonoskii (الخشب المنتشر المسامية) التي لاحظها cryo-SEM. وكانت إمكانات المياه خلال النهار مماثلة في كل من الشتلات. تم تجميد جذع الشتلات المُتَحَبَدة (A)، بينما تم تجميد جذع شتلة أخرى بعد استرخاء التوتر الهيدروليكي القائم (B). وكانت إمكانات المياه (ب) في الحصاد -0.5 باسكال بعد إجراء تخفيف التوتر. Arrowheads في لوحة (A) وتجميد القطع الأثرية من بلورات الجليد داخل السفن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طرق المراقبة cryo-SEM التي أدخلت في هذه الورقة عملية لتصور واضح لتوزيع المياه على نطاق الخلوية. ومن خلال هذه الطريقة، يمكن أن يساعد استكشاف التغيرات في توزيع المياه داخل إكسيليم في توضيح آلية تحمل أنواع الأشجار للإجهاد غير الحيوي (نقص المياه أو تجميدها) أو الإجهاد الحيوي (مرض الشجرة).

وتتمثل أهم خطوة في هذا الأسلوب في الحفاظ على خصائص توزيع المياه في حالة المياه الأصلية أثناء جمع العينات وإعداد العينات اللاحقة. يمكن أن تفقد بسهولة من نسيج Xylem من الأنواع ذات القنوات الطويلة (وخاصة السفن في وقت مبكر من الأشجار التي يسهل اختراقها) المياه أثناء الحصاد والتجميد. وقد ناقش Cochard وآخرون (2000) تجميد القطع الأثرية بسبب التوتر العالي في عمود المياه على طول قنوات xylem38,41. وأكد أوميباياشي وآخرون (2016) صحة عمليات الرصد بالتبريد والحركة من العينات المريحة للتوتر مقارنة بملاحظات التصوير بالرنين المغناطيسي غير المدمرة39. وأظهرت تقنيتي المراقبة نمطا مماثلا لتوزيع المياه. على الرغم من أننا لا تزال بحاجة إلى التحقق من متانة الأنواع الخاصة ضد دخول الهواء الناجمة عن تجميد تحت التوتر الهيدروليكي العالي، ينبغي إجراء إجراءات الاسترخاء لتوفير تقديرات موثوقة لتوزيع المياه، وعلى وجه الخصوص لل المياه المتوترة النباتات.

الصقيع والجليد الجسيمات هي عقبات كبيرة للمراقبة التفصيلية. لمنع تراكم الصقيع ، لا ينبغي أن تتعرض العينة إلى الغلاف الجوي حتى يتم إرفاقها بغرفة عينة CRYO-SEM. وعلى الرغم من أن التعرض للغلاف الجوي لا يمكن منعه تماماً أثناء نقل العينة إلى غرفة العينات، فإن وقت النقل ينبغي أن يظل قصيراً. يجب أن تكون حاوية نقل العازلة من حامل العينة جيدا المجففة بعد إزالة حامل العينة وLN2 من أجل منع الصقيع والجليد نشأت من التكثيف الندى.

ويتوقف طول الوقت المناسب لتجميد الحفر على أداء الأدوات المستخدمة. العوامل الهامة في تحديد هذا هي مستوى الفراغ في غرفة العينة واستقرار وحدة تحكم درجة الحرارة من مرحلة العينة. وينبغي تقييم مدى التسامي الذي يقابل درجة الحرارة في المقام الأول قبل الاستخدام الرسمي. سوف تجميد الحفر المفرط تخفيف وجود المياه في قنوات xylem وتجعل من الصعب تحديد، وخاصة في الوضوء من الخلايا الضيقة.

وهي تتخذ خطوات وجهوداً محددة لضمان خلو الأساليب التدميرية لأخذ العينات من حدوث القطع الأثرية أثناء إجراءات التجميد والحصاد والتشذيب. على الرغم من أن أهمية حدوث القطع الأثرية كثيرا ما أشار، فإن درجة حدوث تجميد القطع الأثرية في قنوات xylem لم يتم التحقق بما فيه الكفاية38،39. ومن المستصوب زيادة التحقق من صحتها بطرق غير مدمرة للتأكد من دقة إجراء تخفيف التوتر وتثبيت التجميد. وبما أن نظم التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير بالرنين المغناطيسي القائمة على السينكروترون لم تكن سائدة بما فيه الكفاية في دراسة العلاقات بين النباتات والمياه بالمقارنة مع نظام التبريد والماء، فإن تطبيق نظام ميكروكت التجاري يمكن أن يؤدي إلى إحراز تقدم في التحقق من صحة نتائج كريو -SEM42 .

وسمات الأشجار الهيدروليكية، مثل تدفق النسغ، والتوصيل الهيدروليكي لقطاعات الجذع، والنسبة المئوية لفقدان الموصلية (PLC)، أو السعة إكسيليم، توفر تقديرات لاستخدام مياه الأشجار ومقاومة الجفاف. وهناك حاجة إلى مقارنة استخدام المياه بين الأنواع للتنبؤ ببقاء الأشجار تحت ضغط الماء الناجم عن تغير المناخ البشري المنشأ2. تتمتع عملية مراقبة Cryo-SEM بالعديد من المزايا في توفير المعرفة التشريحية لتوضيح سبب التغييرات في الخصائص الهيدروليكية. التحسينات الأخيرة لكل من الطرق المدمرة وغير المدمرة للدراسات التشريحية والهيدروليكية النباتية يمكن أن تعمّق معا فهمنا لطبيعة استخدام مياه الأشجار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 232480222, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Tags

العلوم البيئية، العدد 148، كريو-سيم، كريوستات، تجميد التثبيت، تخفيف التوتر، توزيع المياه، قنوات إكسيليم
توزيع المياه Xylem في النباتات الخشبية تصور مع مجهر إلكترون المسح بالتبريد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter