Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Xylem vand distribution i woody planter visualiseret med en Cryo-scanning elektronmikroskop

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

Observation af vandfordelingen i xylem giver betydelige oplysninger om vand flow dynamik i woody planter. I denne undersøgelse demonstrerer vi den praktiske tilgang til at observere xylem vandfordeling in situ ved hjælp af en kryostat og Cryo-SEM, som eliminerer kunstige ændringer i vandets tilstand under prøveforberedelsen.

Abstract

En scanning elektronmikroskopi installeret kryo-enhed (Cryo-SEM) giver mulighed for prøve observation ved temperaturer under frysepunktet og har været anvendt til at udforske vandfordelingen i plantevæv i kombination med freeze fikserings teknikker ved hjælp af flydende nitrogen (LN 2). for woody arter, dog, forberedelser til observation af xylem tværsnit overflade indebærer nogle vanskeligheder på grund af orienteringen af træfibre. Desuden kan højere spændinger i vandsøjlen i xylem ledningskanaler lejlighedsvis forårsage kunstige ændringer i vandfordelingen, især under prøve fiksering og opsamling. I denne undersøgelse demonstrerer vi en effektiv procedure til at observere vandfordelingen inden for xylem af woody planter in situ ved hjælp af en kryostat og Cryo-SEM. I første omgang, under prøven indsamling, måling af xylem vand potentiale bør afgøre, om høj spænding er til stede i xylem ledningskanaler. Når xylems vand potentialet er lavt (< ca. − 0,5 MPa), er der behov for en spændings lempelsesprocedure for at lette en bedre konservering af vandets tilstand i xylem-kanaler under prøve fryse fiksation. Dernæst en vandtæt krave er fastgjort omkring træet stammen og fyldt med LN2 for freeze fiksering af vandets status af xylem. Efter høst skal det sikres, at prøven opbevares frosset, mens procedurerne for prøveforberedelse til observation fuldføres. En kryostat er ansat til tydeligt at eksponere xylem tværsnit overflade. I Cryo-SEM observationer kræves tidsjustering for fryse ætsning for at fjerne frost støv og fremhæve kanten af cellevæggene på betragtnings overfladen. Vores resultater viser anvendeligheden af Cryo-SEM teknikker til observation af vandfordeling inden for xylem på cellulære og subcellulære niveauer. Kombinationen af Cryo-SEM med ikke-destruktiv in situ observation teknikker vil gennemgribende forbedre udforskning af woody plante vand flow dynamik.

Introduction

Tilgængeligheden af vandressourcer (dvs. nedbør, jordens vandindhold) bestemmer nøje dødeligheden og den geografiske fordeling af plantearter, da de er nødt til at absorbere vand fra jorden og transportere den til bladene til fotosyntetisk produktion. Anlæggene skal opretholde deres vand transportsystem under svingende vandforsyninger. Især woody planter generere høje spændinger i deres ledninger langs transpiration vandløb, som i nogle tilfælde, de har brug for at holde deres krone mere end ~ 100 m over jorden. For at opretholde vandsøjler under så højt negativt tryk, xylem ledninger består af et kontinuum af rørformede celler med stive og hydrofobe-lignificerede cellevægge1. Sårbarheden over for xylem dysfunktion af xylem ledninger i hver art er en god afgørende af arten overlevelse under svingende vandforsyning2. Desuden er det vigtigt at studere vandstatus for xylem-kanaler for at vurdere helbredstilstanden for de enkelte træer, der udsættes for abiotiske eller biotiske belastninger. Måling af SAP-flow eller vand potentiale kan give estimater af en woody plantens vandstatus på grund af den integrerede hydrauliske funktion af xylem ledningskanaler. Desuden kan visualisering af vandfordelingen i xylem-celler tydeliggøre tilstanden af de enkelte komponenter i det hydrauliske system xylem.

Flere teknikker til visualisering af vandstatus af xylem ledningskanaler findes3. De klassiske og nyttige metoder til observation af vandveje i trævæv involverer farvning af vandsøjlen ved at nedsænke enderne af afskårne grene i et farvestof eller ved at injicere et farvestof i stående træ stængler4. Soft røntgenfotografering giver også mulighed for visualisering af vandfordeling af skiver træ diske på grund af differential X-ray absorption intensitet af fugt i xylem5,6. Disse metoder, dog kun give spor af vand bevægelse eller demonstrere makroskopiske fordelinger af vand. For nylig ikke-destruktive observations teknikker, såsom Micro Focus X-ray computertomografi (μct)7,8,9,10og magnetisk resonans imaging (MRI)11, 12, er blevet væsentligt forbedret for at tillade observation af vand i xylem ledende inden for intakte træer. Disse ikke-destruktive metoder har store fordele i, at vi kan observere xylem vandstatus uden kunstige skære effekter, og vi kan spore vand flow dynamik ved sekventiel billeddannelse eller indføre en kontrastmiddel10. Men vi er nødt til at bruge en tilpasset MRI for plante billeddannelse eller en specialiseret facilitet for Synchrotron-baserede μCT for at opnå de billeder, der kan identificere cellulære niveau vandindhold. Selv om det synkrotron-baserede μct-system gjorde det muligt at opnå fine billeder med høj rumlig opløsning, som kan sammenlignes med let mikroskopi7,8,9, vil levende celler desuden kunne blive skadet af stråling af høj energi X-ray13,14. Anvendelse af en scanning elektronmikroskop, hvor Cryo-enheder er installeret (Cryo-SEM) er en meget nyttig metode til præcist at lokalisere vandet i xylem på et cellulær niveau, selv om dette kræver en destruktiv høst af prøven til observation. For at fastgøre vandet i xylem ledninger, er en del af stænglerne (dvs., kviste, grene eller stængler) frosset på stedet af flydende nitrogen (LN2). Observationer af overfladen af trimmede, frosne prøver af Cryo-SEM giver meget forstørrede billeder af xylem-strukturen, hvorfra vi kan identificere vandet i xylem-kanaler som is. En væsentlig begrænsning af denne metode er, at sekventiel observation af vand bevægelighed inden for samme prøve er umulig. Men, anvendelsen af μCT eller MRI til sekventiel observation af træer, der lever i et område er yderst udfordrende, fordi disse instrumenter ikke er bærbare. I modsætning hertil har Cryo-SEM et potentiale for at bruge denne teknik på store træer i marken eksperimenter til klart at visualisere vandindhold på ikke kun det cellulære niveau, men også på et finere struktur niveau, f. eks vand i intervaskulære Gruber15, vand i intercellulære rum16, eller bobler i vand kolonne17.

Mange undersøgelser, der iagttog xylem vand af Cryo-SEM er blevet rapporteret 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) indførte oprindeligt protokollen til observation af xylem in situ ved frysning af en levende stamme ved at fylde LN2 i en beholder, der er sat på stænglen21. Prøvens temperatur holdes under-20 °C under prøveudtagningen og under Cryo-SEM-præparation for at undgå smeltning af isen i xylem-kanaler. Denne metode er blevet anvendt til at observere vandet i xylem for at afklare vandfordelingen under skiftende vand regime11,12,24,25,26, 27,28, den sæsonmæssige variation af vandfordeling 21,29,30, virkningen af freeze-tø cyklusser17,31, 32, fordelingen af vand i vådt træ5, ændringer i vandfordelingen under overgangen fra afgrenet til heartwood20, sæsonbestemt tidsforløb af cambial aktivitet og differentiering af fartøjer33, og kavitation induceret af visse biotiske belastninger23,34. Hydraulisk ledningsevne og konduktivitets sårbarhed over for kavitation er også blevet verificeret ved hjælp af Cryo-SEM35,36. Cryo-SEM udstyret med energi udbredt røntgen SPEKTROMETRI (EDX eller EDS) er blevet anvendt til at studere element fordeling over overfladen af en prøve, der indeholder vand37.

Frysning-fiksering af en levende trunk, der indeholder ledninger under høj hydraulisk spænding undertiden forårsager kunstige kavitationer, som er observeret af Cryo-SEM som splittede iskrystaller i lumen af ledningskanaler38,39. Især er løvtræer med længere og bredere kanaler sårbare over for spændinger-induceret artefakter, såsom kavitation forårsaget af prøve skæring, selv om det udføres under vand3,40. Kavitation artefakter bliver iøjnefaldende efter prøvetagning af et indfaldende træ (dvs., prøvetagning i løbet af dagen tid) eller under strenge tørke betingelser, og de kan vildlede til en overvurdering af kavitation forekomst3,38, 39af Derfor skal spændingen, der arbejder i ledningerne, frigives for at undgå den artifaktuel kavitation3,12,39.

Fryse fraktur teknikken ved hjælp af en kniv, der er installeret i et prøvekammer, anvendes ofte til at eksponere prøveoverfladen for Cryo-SEM observation. Dog, fryse-fraktureret planer af woody plante væv, især tværgående sektioner af sekundære xylem, er for ru til klart at observere de anatomiske egenskaber og vand i vævet6. Anvendelsen af en kryostat til trimning af en prøve giver mulighed for hurtig og høj kvalitet fremstilling af prøveflader20,23. Det overordnede mål med denne metode er at tilvejebringe dokumentation med elektronmikroskopi opløsning af vandfordelingen i forskellige former for xylem celler in situ uden forekomst af stikprøveudtagning artefakter. Vi introducerer vores opdaterede procedure, som er blevet støt forbedret siden vi først vedtog det, om prøvetagning, trimning og rengøring af prøveoverfladen for at opnå høj kvalitet elektron mikrografer af Cryo-faste prøver af xylem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: et skematisk diagram over denne protokol er vist i figur 1.

1. prøveudtagning: spændings lempelse inden for vandsøjlen af xylem-kanaler

Bemærk: følgende spændings lempelses behandling anbefales før LN2 applikationen for at undgå både frysning og spændinger-induceret artefakter i xylem vandfordeling.

  1. Der omsluttes en gren og blade til prøveudtagning med en sort plastikpose for at ækvilibrere vand potentialet mellem xylem og blade mere end to timer før prøveudtagningen.
  2. Vand potentialet for mindst to blade fra prøven bestemmes ved hjælp af et trykkammer eller et psykrometer. Når vand potentialet er højere end ca. − 0,5 MPa (dvs. ingen eller meget lav spænding), kan en prøve høstes efter frysning (se punkt 2: fryse fiksation). Når vand potentialet er lavere end − 0,5 MPa, er der behov for en behandling for afslapning som beskrevet nedenfor.
  3. Fastgør en vandtæt krave omkring stænglen for at blive fyldt med vand. En plastik kop uden bund kan tjene som en vandtæt krave. Man skal være omhyggelig med at forsegle rummene mellem stænglen og kraven ved hjælp af en klæbrig tape for at forhindre lækage af flydende medier, som anvendes efterfølgende. Til høst fleksible stilke såsom tynde grene eller kviste, synke en skæring del i en vand fyldt spand ved at bøje stilken. Skær under vandoverfladen ved hjælp af beskærings sakse eller en sav. Prøven overføres til en anden beholder med vand så hurtigt som muligt for at minimere den afskårne ende til luft.
  4. Hold den afskårne ende af prøven under vand. For løvtræer skal det sikres, at længden fra det sted, hvor der opnås en kryo prøve for SEM til den afskårne kant af den høstede stamme, er længere end prøvernes maksimale længde for at forhindre spændinger-inducerede artefakter i kryo prøven.
  5. Prøven, der indeholder blade, skal dækkes med en sort plastikpose for at reducere transpirationen. Hold den afskårne ende af prøven i vandet og opretholde denne tilstand i ca. 30 min for at slappe af xylem spænding. Undgå en længere afslapning tid (> 1 h) på grund af mulig kunstig genopfyldning af kaviteret ledningskanaler12.
  6. Mål vand potentialet igen for at bekræfte afspænding af xylem-spændingen (næsten 0 MPa).
    Bemærk: før prøveudtagningen skal den maksimale fartøjs længde for målarterne undersøges eller bestemmes med tilsvarende prøver ved hjælp af luft Indsprøjtnings metoden. Ved prøvetagning af et stort træ eller en stor gren er det vanskeligt at gennemføre de ovenfor beskrevne spændinger-afslapnings procedurer. Derfor skal prøver fra store træer opsamles i fordagsperioden, når xylems vand potentialet er højere.

2. fryse fiksering med LN2

  1. Skær og Åbn den ene side af en vandtæt krave med saks eller en nytte kniv. Fastgør kraven rundt om stilken med et klæbebånd, mens du holder blænden vandret.
  2. Bær isolerende handsker/mitten, men sørg for at holde flasken på LN2 sikkert, og køre LN2 i kraven for at fylde den med LN2. Hold det fyldt ved støt at tilføje LN2 at helt fryse vandet i xylem. Den tid, der kræves til frysning, afhænger af stikprøvestørrelsen. 1 min efter kogning af hældte LN2 er stoppet er tilstrækkelig til en lille kvist eller en frøplante, mens mere end 20 min er nødvendig for en stilk af et større træ20. Tilføj LN2 kontinuerligt under frysning, da det fordamper hurtigt på grund af store temperaturforskelle mellem LN2 og omgivende temperaturer.
  3. Afmonter kraven fra den frosne del af prøve stammen for at fjerne LN2 efter tilstrækkelig fryse tid. Sørg for at bære isolerende handsker for at undgå kontakt med potentielle LN2 udslip forårsaget af løsne kraven.
  4. Høst prøven med en fin hånd sav med det samme.
  5. Dæk den frosne prøve med et stykke aluminiumsfolie, eller sæt den i et prøveglas, hvor der skrives prøve-ID-numre. Anbring hurtigt den høstede prøve i en beholder fyldt med LN2 eller Pak i en isoleret æske fyldt med tøris.
  6. Opbevar prøverne i en dybfryser indtil observation. Den foretrukne opbevaringstemperatur er − 80 °C for at forhindre issublimation og omkrystallisering under opbevaring.

3. forberedelse af præparatet

BEMÆRKNING: til observation skal en prøve trimmes, og dens overflade til observation skal planlægges ved temperaturer under frysepunktet for at holde vandfordelingen i xylem in situ. En biologisk mikrotom med et kryostatsystem (kryostat) er ideel til trimning og udsætter overfladen af en prøve i denne type observation af Cryo-SEM.

  1. Indstil temperaturen af prøvekammeret i kryostat til − 30 °C, som normalt er koldt nok til at holde xylem-SAP på de fleste planter i frossen tilstand.
  2. En prøve trimmes til et lille stykke (< ca. 2 cm i højden og < ca. 1 cm i bredden eller diameteren), som kan justeres for prøveholderen til en Cryo-SEM. Brug en skarp kniv eller en fintnæftet sav til trimning for at undgå at bryde isen i præparatet. I tilfælde af en større prøve, der ikke kan skæres med en kniv, hurtigt pre-cut med en afkølet sav i en fryser boks.
  3. Fastgør det trimmede stykke til en borepatron, en holder til en kryostat ved at montere på et væv frysning indlejrings medium (f. eks OLT sammensatte) for kryo-skæring. Fastgør derefter borepatronen til en prøveholder af en mikrotom af kryostaten.
  4. Trim overfladen ved gentagne gange at barberer med 5 – 7 μm sektioner i tykkelse. Trimning ved at skære mere end 1.000 til 2.000 μm, i total dybde fra den oprindelige overflade ved prøveudtagning, er nyttig til eliminering af den beskadigede del af prøven forårsaget af forskæring med en kniv eller sav som beskrevet i trin 3,2.
  5. Efter groft tilskæring af en overflade af prøven justeres en ubrugt del af mikrotomklingen over prøvens overflade. Lad ikke klingen røre ved prøven, som ville overskride tykkelsen.
  6. Før den første udskæring af den ubrugte klinge portion, udvide afstanden mellem overfladen af prøven og klingen.
  7. Skær kun prøvens overflade en eller to gange. Skub derefter kniven igen for at justere en ubrugt klinge del på prøvens overflade.
  8. Gentag trin 3,6 og 3,7 tre eller fire gange. Dette er vigtigt for at opnå en klar overflade uden "kniv mærker" (figur 4).
  9. Efter den endelige udskæring indstilles knivens position langt fra prøven for at forhindre, at der klæber støv på prøven.
  10. Tag borepatronen ud af prøveholderen, og Afmonter præparatet fra patronen ved at fjerne det frosne indlejrings medium med en skarp kniv. Sørg for, at prøven anbringes i kryostat kammeret for at forhindre, at den høvlede overflade fra frost støv.
  11. Præparatet fastgøres til en kryo-SEM-præparat holder med et indfrysnings medium til vævs frysning i kryostatkammeret.

4. Overfør til Cryo-SEM-prøvelokalet

Bemærk: overfladen-forberedt prøveeksemplar skal være beskyttet mod en temperaturstigning eller akkumulering af frost under overførslen fra kryostat kammer til observations stadiet i Cryo-SEM prøvelokalet.

  1. Den kolde temperatur i prøvekammeret i Cryo-SEM holdes på under – 120 °C med LN2 i henhold til udstyrets brugermanual.
  2. Prøveholderen anbringes i en isolerende beholder, der er fyldt med LN2 i kryostat kammeret.
  3. Hold prøveholderen med et præparat, der udveksler stang under LN2. Undgå at udsætte prøveholderen for luft, når det er muligt.
  4. Prøveholderen indstilles hurtigt til det før-evakuerings kammer i Cryo-SEM-prøvekammeret, så snart der påbegyndes evakuering af forevakuerings kammeret. Anbring derefter prøveholderen på den kolde fase, når luften er helt evakueret. Selv om en smule frost ophobning er uundgåelig, den "fryse-ætsning" procedure (trin 6) kan fjerne det.

5. indstilling i SEM

Bemærk: typiske indstillinger for observation er beskrevet nedenfor. Nogle modifikationer er nødvendige afhængigt af vakuum tilstand eller elektronstråle.

  1. Sæt SEM parametre for observation som følger:
    Acceleration spænding: 3 – 5 kV
    Prøvens temperatur: < − 120 °C
    Detektor: sekundær emission

6. fryse ætsning

Bemærk: fryse ætsning er proceduren for at fremhæve kanten af prøvens cellevægge ved let iskrystal Sublimation. Fryse ætsning indebærer også fjernelse af overflade frost støv.

  1. Tænd for accelerations spændingen på den elektriske pistol under fryse ætsning. Det er bedre at udføre fryse ætsning mens observere prøven.
  2. Hæv temperaturen på prøvestadiet til − 100 °C.
  3. Vent i flere minutter, indtil frost støvet er fjernet, og overflade niveauet af isen i xylem-celler er faldet svagt i forhold til cellevæggene.
  4. Sænk temperaturen i prøvestadiet til − 120 °C.
    Bemærk: Hvis der ikke er installeret temperaturregulator til prøvestadiet, skal du holde præparatet ved hjælp af udskiftnings stangen og fjerne det fra prøvestadiet i et par minutter. Overhold prøven flere gange under denne fryse ætsning for at verificere prøvens Sublimation status.

7. metal belægning (valgfri)

Bemærk: nylige forbedringer af SEM instrument og billedbehandling kan give høj kvalitet billeder af elektriske isolerende prøver uden metalbelægning. Dog er ikke-ledende enheder, såsom biologiske materialer, undertiden underlagt opladning; højere lysstyrke på bestemte positioner af præparatet på grund af akkumulering af elektroner ("opladning"). Hvis præparatet eksponerer for elektronstråler i længere tid eller for en høj forstørrelse, øges opladnings effekterne. Belægning overfladen af prøven med elektrisk-ledende metal materialer forhindrer forekomsten af opladning. Brug det vakuum belægnings system, der er installeret i Cryo-SEM-enheden, for at undgå, at prøvens temperatur stiger under belægningen.

  1. Sørg for, at belægningsmaterialet er monteret på et udpeget fordamper-hoved i belægnings systemet.
  2. Temperaturen i det kolde stadie i belægnings systemet holdes under − 170 °C.
  3. Prøveholderen anbringes på den kolde fase af belægnings systemet efter tilstrækkelig fryse ætsning.
  4. Åbn en skillevægge mellem den kolde fase og fordamper hovedet.
  5. Indstil den aktuelle værdi og spændings værdien af fordamper hovedet ved henholdsvis ca. 30 mA og ca. 5 V.
  6. Inddampning materiale for ca. 30 s at belægge overfladen af præparatet.
  7. Sæt begge de aktuelle og spændingsværdier af fordamper hovedet ved nul og luk partitionen.
  8. Prøveholderen anbringes i prøve kammerets kolde fase til observation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative billeder af tværsnit overflader af nåletræ og løvtræer med Bredbladet xylem, observeret af Cryo-SEM, er vist i figur 2. Ved lav forstørrelse angiver det sorte område i billederne de hulrum, hvorfra vand helt eller delvis forsvinder, og det grå område indikerer xylem-cellevægge, cytoplasma og vand (figur 2A). Ved høj forstørrelse, er det klart, at vandet ikke er helt tabt fra Lumina af tre tracheids, hvilket indikerer forekomsten af makro bobler i xylem SAP in situ (figur 2B). Med hensyn til løvtræer arter, kavitation forekomst er let påvises inden for fartøjer, mens vand eksistens er svært at skelne inden for fibre, især ved lav forstørrelse (figur 2C). Cytoplasmaet i parenkyma celler kan skelnes fra vand i trahceids eller fartøjer gennem isglatte teksturer (f. eks. figur 2b).

Effekten af temperatur på fryse ætsning proces er vist i figur 3. Frost støv fjernes gradvist, og intertracheary pit membraner bliver klarere gennem progression af Sublimation med stigende temperatur. Resterende store frost støvpartikler kan elimineres ved yderligere fryse ætsning, men dette kan være problematisk, da det unødigt nedsætter overflade niveauet af is i xylem ledninger.

Den høje kvalitet af observation opnås i vid udstrækning ved nøjagtig præparat forberedelse; særligt vigtigt er at udjævne overfladen med en skarp klinge af mikrotomen. Utilstrækkelig udjævning af et brugt blad kan sommetider forårsage ru overflade (kaldet "kniv mærker", figur 4) eller talrige forekomster af støv fra udskæringerne. Efter nøje planlægning af prøvens overflade er hurtig overførsel af præparatet til prøvekammeret også afgørende for at eliminere forureninger forårsaget af frost dannelse.

Prøve frysning uden lempelse af negative vandsøjle tryk vil forårsage artifaktuel induktion af kavitation i xylem ledningskanaler (figur 5). Der blev observeret klynge iskrystaller i beholdere af enheder, hvorfra prøven ikke blev slækket (pilespidser i figur 5A), kontraindiceret, ingen klynge iskrystaller blev observeret i afslappede prøveeksemplarer med et tilsvarende vand potentiale ( Figur 5 B). dette har tendens til at være mere signifikant i xylem af løvtræer i stedet for i nåletræer (ikke-offentliggjorte data).

Figure 1
Figur 1: et skematisk diagram over denne protokol. Den strøm af procedurer fra prøvetagning til SEM observation, der er beskrevet i dette dokument, vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksempler på Cryo-SEM-mikrografer af de tværsnit lige overflader af angiospermernes og gymnosædtræarter. Grå og sorte områder i xylem-celler svarer til vand og hulrum i vandsøjlen af xylem-celler. Da prøverne blev fastfrosset med flydende kvælstof før prøveindsamlingen, viser billederne af Cryo-SEM plantens vandstatus og indfødte embolisme på tidspunktet for prøvetagning. (A) og (B): to-årig kvist af et voksent træ af Cryptomeria japonica (nåletræ). Diameteren af kvist var 3 mm, og vand potentialet var − 0,39 MPA ved prædawn høst. (C): to-årig skyde af Carpinus tschonoskii (diffus-porøs træ) kimplante (1,4 m i højden og 1,1 cm i basal diameter). Frøplante prøven blev udtaget efter spændings-afslapnings proceduren efter forlænget begrænsning af kunstvanding i fire dage. Vand potentialet var − 1,78 MPa efter en langvarig tørke og var − 0,15 MPa efter spændings-afslapnings proceduren. Tr: tracheid, R: ray parenchyma, V: fartøj, F: fiber, AP: aksial parenchyma. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: afrimning og ætsning fremskridt ved at hæve temperaturen af den kolde prøvestadiet. Tværsnit overflade af xylem af en cryptomeria japonica kvist (nåletræ). De faldende temperaturer i prøvestadiet er (A) − 113,0 °C, (B) − 105,3 °C, (C) − 101,9 °C og (D) − 99,7 °C. Hvert billede blev opnået ca. 5 min. efter temperaturen af den kolde prøve fase blev sat til den respektive Temperaturværdi. Ice Sublimation skrider frem, hvis temperaturen af scenen holdes over ca. − 120 °C (for vores udstyr). Tr: tracheid, B: omkranset pit pair, PM: pit membran. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel på kniv mærke. Tværsnit overflade af xylem af en cryptomeria japonica kvist (nåletræ), der viser såkaldte kniv mærker. Pilespidser og stiplede linjer repræsenterer typiske kniv mærker. Rydning af prøveemnets overflade med en kryostat skal suppleres med en ubrugt del af knivbladet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: eksempel på effekten af afslapning af vandsøjlen spænding i ledningskanaler. Tværsnit overflade af stænglen af en Carpinus tschonoskii kimplante (diffus-porøs træ) observeret af Cryo-SEM. Vand potentialet i dagtimerne var ens i begge frøplanter. Stænglen af den viste frøplante var frosset intakt (A), mens stænglen af en anden frøplante blev frosset efter lempelse af den eksisterende hydrauliske spændinger (B). Vand potentialet i (B) ved høst var − 0,5 MPa efter spændings-afslapnings proceduren. Pilespidser i panel (A) er frysning artefakter af iskrystaller inden for fartøjer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cryo-SEM observation metoder indført i dette papir er praktiske til klart at visualisere vandfordeling på en cellulær skala. Gennem denne metode, udforske ændringer i fordelingen af vand i xylem kan potentielt bidrage til at afklare mekanismen af træarter tolerance over for abiotisk stress (vandmangel eller frysning) eller biotisk stress (træsygdom).

Det mest afgørende skridt i denne metode er at bevare vandfordelingen karakteristisk for den indfødte vandstatus under prøven indsamling og efterfølgende prøveforberedelse. Xylem væv af arter med lange ledninger (især earlywood fartøjer af ring-porøse træer) kan nemt tabe vand under høst og frysning. Cochard et al. (2000) har diskuteret fryse artefakter på grund af høj spænding i vandsøjlen langs xylem-kanaler38,41. Umebayashi et al. (2016) bekræftede validiteten af Cryo-SEM observationer af spændings-afslappede prøver i forhold til ikke-destruktive MRI observationer39. Begge observations teknikker viste et lignende mønster af vandfordeling. Selv om vi stadig har brug for at verificere den artsspecifikke robusthed mod luft indgang induceret ved frysning under høj hydraulisk spænding, bør der udføres afslapnings procedurer for at give pålidelige estimater af vand distributioner, og især for vand stressede planter.

Frost og is partikler er betydelige forhindringer for detaljeret observation. For at undgå frost ophobning må præparatet ikke udsættes for atmosfæren, før det er fastgjort til kryo-SEM-prøvekammeret. Selv om udsættelse for atmosfæren ikke helt kan forhindres under overførslen af prøven til prøvelokalet, bør overførings tiden holdes kort. Objekt indehaverens isolations overførings beholder skal være godt tørret efter udtagning af prøveholderen og LN2 for at undgå, at frost og is stammer fra kondensation.

Det passende tidsrum for fryse ætsning afhænger af de anvendte instrumenters ydeevne. Vigtige faktorer ved bestemmelse af dette er vakuumniveauet i prøvekammeret og stabiliteten af temperaturregulatoren på prøvestadiet. Omfanget af Sublimation svarende til temperaturen bør først og fremmest vurderes før formel brug. Overdreven fryse ætsning vil dæmpe tilstedeværelsen af vand i xylem ledningskanaler og gøre det vanskeligt at blive identificeret, især i Lumina af smalle celler.

Det tager specifikke skridt og bestræbelser på at sikre, at destruktive prøveudtagningsmetoder er fri for artefakt forekomster under fryse-, høst-og trimnings procedurerne. Selv om betydningen af forekomsten af artefakter ofte er påpeget, er graden af indfrysnings artefakter i xylem-kanaler ikke blevet tilstrækkeligt valideret38,39. Yderligere validering ved ikke-destruktive metoder er ønskelig for at bekræfte nøjagtigheden af spændings-afslapnings proceduren og fryse fiksation. Da synkrotron-baserede μCT-eller MRI-systemer ikke har været tilstrækkeligt udbredte i undersøgelsen af forholdet mellem planter og vand i forhold til Cryo-SEM-systemet, kan anvendelsen af et kommercielt μCT-system muligvis fremkomme ved valideringen af Cryo-SEM-resultaterne42 .

Hydrauliske trætræk, såsom SAP flux, hydraulisk ledningsevne af Stam segmenter, procentvis tab af ledningsevne (PLC), eller xylem kapacitans giver estimater af træ vand brug og modstandsdygtighed over for tørke. Sammenligning af vandanvendelse blandt arterne er nødvendig for at forudsige træets overlevelse under vand stress forårsaget af menneskeskabte klimaændringer2. Cryo-SEM observation har mange fordele i at give anatomisk viden til at afklare årsagen til ændringer inden for hydrauliske funktioner. De seneste forbedringer af både destruktive og ikke-destruktive metoder til plante anatomiske og hydrauliske undersøgelser kan sammen uddybe vores forståelse af karakteren af træ vand brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (no. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Tags

Miljøvidenskaber Cryo-SEM kryostat fryse fiksering spænding afslapning vandfordeling xylem ledningskanaler
Xylem vand distribution i woody planter visualiseret med en Cryo-scanning elektronmikroskop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter