Summary
L'observation de la distribution d'eau dans le xylisme fournit des informations significatives sur la dynamique du débit d'eau dans les plantes ligneuses. Dans cette étude, nous démontrons l'approche pratique pour observer la distribution d'eau de xylée in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM, qui élimine les changements artifactual dans l'état de l'eau pendant la préparation de l'échantillon.
Abstract
Un microscope électronique à balayage installé cryo-unité (cryo-SEM) permet l'observation des spécimens à des températures inférieures à zéro et a été utilisé pour explorer la distribution d'eau dans les tissus végétaux en combinaison avec des techniques de fixation du gel à l'aide d'azote liquide (LN 2). Pour les espèces ligneuses, cependant, les préparations pour l'observation de la surface transversale du xylisme impliquent certaines difficultés en raison de l'orientation des fibres de bois. En outre, une tension plus élevée dans la colonne d'eau dans les conduits de xylée peut parfois provoquer des changements artificiels dans la distribution de l'eau, en particulier lors de la fixation et la collecte de l'échantillon. Dans cette étude, nous démontrons une procédure efficace pour observer la distribution d'eau dans le xylisme des plantes ligneuses in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM. Dans un premier temps, lors de la collecte de l'échantillon, la mesure du potentiel d'eau xylée devrait déterminer si une tension élevée est présente dans les conduits de xylisme. Lorsque le potentiel d'eau du xylée est faible (lt; vers 0,5 MPa), une procédure de relaxation de tension est nécessaire pour faciliter une meilleure préservation de l'état de l'eau dans les conduits de xylée pendant la fixation du gel de l'échantillon. Ensuite, un collier étanche est fixé autour de la tige de l'arbre et rempli de LN2 pour la fixation de gel de l'état de l'eau du xylème. Après la récolte, il faut veiller à ce que l'échantillon soit conservé congelé tout en complétant les procédures de préparation à l'observation de l'échantillon. Un cryostat est utilisé pour exposer clairement la surface transversale du xylisme. Dans les observations cryo-SEM, l'ajustement du temps pour le gel-gravure est nécessaire pour enlever la poussière de gel et d'accentuer le bord des parois cellulaires sur la surface d'observation. Nos résultats démontrent l'applicabilité des techniques cryo-SEM pour l'observation de la distribution d'eau dans le xylisme aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La combinaison de cryo-SEM avec des techniques d'observation in situ non destructive améliorera profondément l'exploration de la dynamique du débit d'eau des plantes ligneuses.
Introduction
La disponibilité des ressources en eau (c.-à-d. précipitations, teneur en eau du sol) détermine strictement la mortalité et la répartition géographique des espèces végétales, puisqu'elles doivent absorber l'eau du sol et la transporter vers les feuilles pour la production photosynthétique. Les usines doivent maintenir leur système de transport d'eau sous des approvisionnements fluctuants en eau. En particulier, les plantes ligneuses génèrent de fortes tensions dans leurs conduits le long des cours d'eau de transpiration car, dans certains cas, elles doivent tenir leur couronne à plus de 100 m au-dessus du sol. Pour maintenir des colonnes d'eau sous une pression négative aussi élevée, les conduits de xylée se composent d'un continuum de cellules tubulaires avec des parois cellulaires rigides et hydrophobes lignifiées1. La vulnérabilité au dysfonctionnement du xylée des conduits de xylisdans chaque espèce est un bon déterminant de la survie de l'espèce sous l'approvisionnement fluctuant en eau2. En outre, l'étude de l'état de l'eau des conduits de xylée est importante pour l'évaluation de l'état de santé des arbres individuels soumis à des stress abiotiques ou biotiques. La mesure du débit de sève ou du potentiel d'eau peut fournir des estimations de l'état de l'eau d'une usine ligneuse en raison de la fonction hydraulique intégrée des conduits de xylisme. En outre, la visualisation de la distribution de l'eau dans les cellules xylées peut clarifier l'état des composants individuels du système hydraulique xylée.
Plusieurs techniques de visualisation de l'état de l'eau des conduits de xylage existent3. Les méthodes classiques et utiles pour observer les voies d'eau dans les tissus ligneux impliquent de tacher la colonne d'eau en plongeant les extrémités des branches coupées dans un colorant ou en injectant un colorant dans les tiges d'arbres debout4. La photographie aux rayons X souple permet également la visualisation de la distribution de l'eau des disques de bois tranchés en raison de l'intensité différentielle d'absorption des rayons X de l'humidité dans le xylisme5,6. Ces méthodes, cependant, ne fournissent que des traces de mouvement de l'eau ou démontrent des distributions macroscopiques de l'eau. Récemment, les techniques d'observation non destructives, telles que la tomographie calculée par rayons X micro focus (CT)7,8,9,10et l'imagerie par résonance magnétique (IRM)11, 12, ont été considérablement améliorés pour permettre l'observation de l'eau dans les conduits de xylage dans les jeunes arbres intacts. Ces méthodes non destructives ont de grands avantages en ce que nous pouvons observer l'état de l'eau du xylèm sans effets de coupe artificielles, et nous pouvons suivre la dynamique du débit d'eau par imagerie séquentielle ou l'introduction d'un agent de contraste10. Cependant, nous devons utiliser une IRM personnalisée pour l'imagerie végétale ou une installation spécialisée pour l'OstT à base de synchrotron afin d'obtenir les images qui peuvent identifier la teneur en eau au niveau cellulaire. En outre, bien que le système de TCT à base de synchrotron ait permis d'obtenir des images fines avec une haute résolution spatiale, ce qui est comparable à la microscopie légère7,8,9, les cellules vivantes peuvent être blessées par le rayonnement de rayons X à haute énergie13,14. L'utilisation d'un microscope électronique à balayage dans lequel des cryo-unités sont installées (cryo-SEM) est une méthode très utile pour localiser précisément l'eau dans le xylisme au niveau cellulaire, bien que cela nécessite la récolte destructrice de l'échantillon pour l'observation. Pour fixer l'eau dans les conduits de xylème, une partie des tiges (c.-à-d. brindilles, branches ou tiges) sont congelées in situ par l'azote liquide (LN2). Les observations de la surface des spécimens congelés et taillés par cryo-SEM fournissent des images très amples de la structure du xylisme à partir de laquelle nous pouvons identifier l'eau dans les conduits de xylée comme de la glace. Une limitation importante de cette méthode est qu'il est impossible d'observer séquentiel la movabilité de l'eau dans le même échantillon. Cependant, l'application de l'ItC ou de l'IRM pour l'observation séquentielle des arbres qui vivent dans un champ est extrêmement difficile parce que ces instruments ne sont pas portables. En revanche, cryo-SEM a un potentiel pour utiliser cette technique sur les grands arbres dans les expériences sur le terrain pour visualiser clairement le contenu de l'eau non seulement au niveau cellulaire, mais aussi à un niveau de structure plus fine, par exemple, l'eau dans les fosses intervasculaires15, l'eau dans espaces intercellulaires16, ou bulles dans la colonne d'eau17.
Beaucoup d'études observant l'eau de xylem par cryo-SEM ont été rapportées 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et coll. (1996) ont d'abord établi le protocole d'observation du xylème in situ par congélation d'un tronc vivant en remplissant le LN2 dans un récipient fixé sur la tige21. La température de l'échantillon a été maintenue en dessous de -20 oC pendant la collecte de l'échantillon et pendant la préparation cryo-SEM afin d'éviter de faire fondre la glace dans des conduits de xylisme. Cette méthode a été utilisée pour observer l'eau dans le xylisme afin de clarifier la distribution de l'eau sous le régime changeant de l'eau11,12,24,25,26, 27,28, la variation saisonnière de la distribution d'eau21,29,30, l'effet des cycles de gel-dégel17,31, 32, la distribution de l'eau dans le bois humide5, les changements dans la distribution de l'eau au cours de la transition du bois de sève au bois de coeur20, le cours saisonnier de temps de l'activité cambiale et la différenciation des navires33, et la cavitation induite par certains stress biotiques23,34. La conductivité hydraulique et la vulnérabilité des conduits à la cavitation ont également été vérifiées à l'aide de cryo-SEM35,36. Cryo-SEM équipé d'une spectrométrie de rayons X dispersive séduismnisée (EDX ou EDS) a été utilisé pour étudier la distribution des éléments à la surface d'un spécimen contenant de l'eau37.
La fixation par congélation d'un tronc vivant qui contient des conduits sous haute tension hydraulique provoque parfois des cavitations artificielles qui sont observées par cryo-SEM comme cristaux de glace fracturés dans le lumen des conduits38,39. En particulier, les espèces à larges deleurs avec des conduits plus longs et plus larges sont vulnérables aux artefacts induits par la tension, tels que la cavitation causée par la coupe d'échantillons, même si elle est menée sous l'eau3,40. Les artefacts de cavitation deviennent visibles après l'échantillonnage d'un arbre qui transpire (c.-à-d. l'échantillonnage pendant la journée) ou dans de graves conditions de sécheresse et ils peuvent induire en erreur une surestimation de l'occurrence de cavitation3,38, 39. Par conséquent, la tension de travail dans les conduits doit être libéré afin d'éviter la cavitation artifactual3,12,39.
La technique de congélation-fracture à l'aide d'un couteau installé dans une chambre de spécimen est souvent employée pour exposer la surface de spécimen pour l'observation cryo-SEM. Cependant, les plans gelés des tissus végétaux ligneux, en particulier les sections transversales du xylisme secondaire, sont trop rugueux pour observer clairement les caractéristiques anatomiques et l'eau dans le tissu6. L'application d'un cryostat pour l'élagage d'un spécimen permet une préparation rapide et de haute qualité des surfaces d'échantillon20,23. L'objectif global de cette méthode est de fournir des preuves avec la résolution de microscopie électronique de la distribution de l'eau dans divers types de cellules xylées in situ sans l'occurrence d'artefacts d'échantillonnage. Nous introduisons notre procédure mise à jour, qui a été régulièrement améliorée depuis que nous l'avons adoptée pour la première fois, en ce qui concerne l'échantillonnage, la coupe et le nettoyage de la surface du spécimen pour obtenir des micrographes électroniques de haute qualité d'échantillons cryo-fixes de xylisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE : Un tableau schématique de ce protocole est affiché à la figure 1.
1. Échantillonnage : Relaxation de tension dans la colonne d'eau des conduits de Xylem
REMARQUE : Le traitement suivant de relaxation de tension est recommandé avant l'application de LN2 pour éviter les artefacts de congélation et de tension-induits dans la distribution d'eau de xylème.
- Enfermer une branche et des feuilles pour l'échantillonnage avec un sac en plastique noir pour équilibrer le potentiel d'eau entre le xylisme et les feuilles plus de deux heures avant l'échantillonnage.
- Déterminer le potentiel hydrique d'au moins deux feuilles de l'échantillon à l'aide d'une chambre de pression ou d'un psychromètre. Lorsque le potentiel d'eau est supérieur à environ 0,5 MPa (c.-à-d. qu'il n'existe pas ou qu'il n'y a pas de tension très faible), un échantillon peut être récolté après congélation (voir à la section 2 : fixation dugel). Lorsque le potentiel d'eau est inférieur à 0,5 MPa, un traitement de relaxation est nécessaire comme décrit ci-dessous.
- Fixer un collier étanche autour de la tige afin d'être rempli d'eau. Une tasse en plastique sans fond peut servir de collier étanche. Il faut prendre soin de sceller étroitement les espaces entre la tige et le collier à l'aide d'un ruban adhésif pour prévenir les fuites de supports liquides qui sont utilisés par la suite. Pour la récolte de tiges flexibles comme les branches minces ou les brindilles, couler une partie de coupe dans un seau rempli d'eau en pliant la tige. Couper sous la surface de l'eau à l'aide de cisailles ou d'une scie. Transférer l'échantillon dans un autre récipient d'eau le plus rapidement possible afin de minimiser l'exposition de l'extrémité coupée à l'air.
- Gardez l'extrémité coupée de l'échantillon sous l'eau. Pour les espèces à larges deleurs, assurez-vous que la longueur de l'endroit où un cryo-échantillon pour seM sera obtenu jusqu'au bord coupé de la tige récoltée est plus longue que la longueur maximale du récipient des échantillons afin d'éviter les artefacts induits par la tension dans l'échantillon cryo.
- Couvrir l'échantillon contenant des feuilles avec un sac en plastique noir pour réduire la transpiration. Gardez l'extrémité coupée de l'échantillon dans l'eau et maintenez cette condition pendant environ 30 min afin de détendre la tension du xylisme. Éviter un temps de relaxation plus long (à 1 h) en raison d'un éventuel remplissage artificiel des conduits cavitated12.
- Mesurer à nouveau le potentiel d'eau pour confirmer la relaxation de la tension du xylée (près de 0 MPa).
REMARQUE : Avant l'échantillonnage, la longueur maximale du navire de l'espèce cible devrait faire l'objet de recherches ou d'échantillons semblables selon la méthode d'injection d'air. Lors de l'échantillonnage d'un grand arbre, ou d'une grande branche, il est difficile de mener les procédures de tension-relaxation décrites ci-dessus. Par conséquent, les échantillons de grands arbres doivent être prélevés au cours de la période avant l'aube lorsque le potentiel d'eau xylée est plus élevé.
2. Congeler la fixation avec LN2
- Couper et ouvrir un côté d'un collier étanche avec des ciseaux ou un couteau utilitaire. Attachez fermement le collier autour de la tige avec un ruban adhésif tout en tenant l'ouverture horizontalement.
- Portez des gants isolants/mitten, mais assurez-vous de tenir la bouteille de LN2 en toute sécurité, et exécutez LN2 dans le col pour le remplir avec LN2. Gardez-le rempli en ajoutant régulièrement LN2 pour geler complètement l'eau dans le xylème. Le temps nécessaire au gel dépend de la taille de l'échantillon; 1 min après l'ébullition de la LN2 versée est suffisante pour une petite brindille ou un semis, tandis que plus de 20 min est nécessaire pour une tige d'un arbre plus grand20. Ajouter le LN2 en continu pendant le gel car il s'évapore rapidement en raison de grandes différences de température entre l'An2 et les températures ambiantes.
- Détachez le collier de la partie congelée de la tige de l'échantillon afin d'enlever le LN2 après le temps de congélation suffisant. Assurez-vous de porter des gants isolants pour éviter tout contact avec d'éventuels déversements de LN2 causés par le détachement du col.
- Récoltez l'échantillon immédiatement avec une fine scie à main.
- Couvrez l'échantillon congelé d'un morceau de papier d'aluminium ou mettez-le dans un tube d'échantillon, sur lequel les numéros d'iD d'échantillon sont écrits. Placez rapidement l'échantillon récolté dans un contenant rempli de LN2 ou emballez-le dans une boîte isolée remplie de glace sèche.
- Conserver les échantillons dans un congélateur profond jusqu'à l'observation. La température de stockage préférée est de 80 oC afin d'éviter la sublimation de la glace et sa recristallisation pendant le stockage.
3. Préparation des spécimens
REMARQUE : Pour l'observation, un échantillon doit être coupé et sa surface pour observation doit être rabotée à une température inférieure à zéro afin de maintenir la distribution d'eau dans son xylisme in situ. Un microtome biologique avec un système cryostat (cryostat) est idéal pour tailler et exposer la surface d'un spécimen dans ce type d'observation par cryo-SEM.
- Fixer la température de la chambre de spécimen du cryostat à 30 oC, qui est habituellement assez froide pour maintenir la sève de xylée de la plupart des plantes dans un état gelé.
- Couper un échantillon en un petit morceau (environ 2 cm de hauteur et environ 1 cm de largeur ou de diamètre) qui peut être ajusté pour le porte-échantillon d'un cryo-SEM. Utilisez un couteau pointu ou une scie à denté fine pour le rognage afin d'éviter de briser la glace dans le spécimen. Dans le cas d'un échantillon plus gros qui ne peut pas être coupé avec un couteau, pré-couper rapidement avec une scie refroidie dans une boîte de congélation.
- Fixez la pièce taillée à un mandrin, un support pour un cryostat en montant sur un milieu d'intégration de congélation de tissu (par exemple, composé d'OCT) pour la cryo-sectionnement. Puis, attachez le mandrin à un spécimen titulaire d'un microtome du cryostat.
- Couper la surface en rasant à plusieurs reprises avec des sections de 5 à 7 m d'épaisseur. Le découpage en coupant plus de 1 000 à 2 000 m, en profondeur totale par rapport à la surface initiale de la collecte de l'échantillon, est utile pour éliminer la partie endommagée de l'échantillon causée par le précoupement à l'avance avec un couteau ou la scie décrite à l'étape 3.2.
- Après avoir grossièrement coupé une surface de l'échantillon, ajuster une partie inutilisée de la lame de microtome au-dessus de la surface du spécimen. Ne laissez pas la lame toucher l'échantillon qui dépasserait le réglage de l'épaisseur.
- Avant la première coupe par la partie lame inutilisée, élargir légèrement la distance entre la surface du spécimen et la lame.
- Couper la surface de l'échantillon seulement une ou deux fois. De plus, faites glisser la lame en ajustant à nouveau une partie de lame inutilisée sur la surface du spécimen.
- Répétez les étapes 3.6 et 3.7 trois ou quatre fois. Ceci est important pour obtenir une surface claire sans « marques de couteau » (figure 4).
- Après la coupe finale, placez la position de la lame loin de l'échantillon pour empêcher la poussière de coller sur l'échantillon.
- Détachez le mandrin du porte-échantillon et détachez le spécimen du mandrin en enlevant le milieu d'intégration congelé à l'intérieur d'un couteau pointu. Assurez-vous que le spécimen est placé dans la chambre cryostat pour empêcher sa surface rabotée de la poussière de gel.
- Attachez le spécimen à un porte-échantillons cryo-SEM avec un milieu d'intégration de congélation de tissu dans la chambre de cryostat.
4. Transfert à la chambre de spécimen Cryo-SEM
REMARQUE : Le spécimen préparé à la surface doit être protégé contre une augmentation de la température ou une accumulation de gel pendant le transfert de la chambre cryostat à l'étape d'observation dans la chambre de spécimen cryo-SEM.
- Maintenir la température du stade froid dans la chambre de spécimen cryo-SEM à moins de 120 oC avec Le LN2 selon le manuel d'utilisation de l'équipement.
- Placer le porte-échantillons avec le spécimen préparé dans un récipient isolant rempli de LN2 dans la chambre cryostat.
- Tenez le porte-échantillon avec un spécimen échangeant la tige sous le LN2. Évitez d'exposer le porte-échantillons à l'air dans la mesure du possible.
- Installez rapidement le porte-échantillons dans la chambre de pré-évacuation de la chambre de spécimen cryo-SEM dès le début de l'évacuation de la chambre de pré-évacuation. Ensuite, placez le porte-échantillons sur la scène froide après l'évacuation complète de l'air. Bien qu'un peu d'accumulation de gel soit inévitable, la procédure de « gel-gravure » (étape 6) peut l'enlever.
5. Réglage dans SEM
REMARQUE : Le paramètre typique de l'observation est décrit ci-dessous. Certaines modifications sont nécessaires en fonction de l'état du vide ou du faisceau d'électrons.
- Définiz les paramètres SEM pour l'observation comme suit :
Tension d'accélération : 3 à 5 kV
Température de l'étape du spécimen : 'lt; '120 'C
Détecteur : Émission secondaire
6. Congélation
REMARQUE : Le gel-gravure est la procédure pour accentuer le bord des parois cellulaires de l'échantillon par la sublimation légère de cristal de glace. Le gel-gravure implique également l'élimination des poussières de gel de surface.
- Allumez la tension d'accélération du pistolet électrique pendant le gel-gravure. Il est préférable d'effectuer des congélations pendant l'observation du spécimen.
- Augmenter la température de l'étape du spécimen à 100 oC.
- Attendez plusieurs minutes jusqu'à ce que la poussière de gel soit enlevée et que le niveau de surface de la glace dans les cellules xylées ait légèrement diminué par rapport aux parois cellulaires.
- Abaisser la température de l'étape du spécimen à 120 oC.
REMARQUE : S'il n'y a pas de contrôleur de température installé pour l'étape du spécimen, maintenez le spécimen à l'aide de la tige d'échange et détachez-le de l'étape du spécimen pendant quelques minutes. Observez le spécimen plusieurs fois au cours de ce processus de congélation afin de vérifier l'état de sublimation du spécimen.
7. Revêtement métallique (facultatif)
REMARQUE : Les améliorations récentes apportées à l'instrument SEM et au traitement de l'image peuvent fournir des images de haute qualité de spécimens isolants électriques sans revêtement métallique. Cependant, les spécimens non conducteurs, tels que les matériaux biologiques, sont parfois sujets à charge; une luminosité plus élevée à des positions spécifiques du spécimen en raison de l'accumulation d'électrons (« charge »). L'exposition du spécimen à des faisceaux d'électrons pendant une plus longue période ou pour un grossissement élevé, augmente les effets de charge. Le revêtement de la surface du spécimen avec des matériaux métalliques électriques-conducteurs empêche l'apparition de la charge. Utilisez le système de revêtement sous vide qui est installé dans l'unité cryo-SEM afin d'empêcher la température du spécimen d'augmenter pendant le revêtement.
- Assurez-vous que le matériau de revêtement est installé à une tête d'évaporateur désignée du système de revêtement.
- Maintenir la température de l'étape froide dans le système de revêtement en dessous de 170 oC.
- Placez le porte-échantillon sur le stade froid du système de revêtement après un gel suffisant.
- Ouvrez une cloison entre le stade froid et la tête de l'évaporateur.
- Définir la valeur actuelle et la valeur de tension de la tête de l'évaporateur à environ 30 mA et 5 V, respectivement.
- Évaporer le matériau de revêtement pendant environ 30 s pour enrober la surface du spécimen.
- Définir à la fois les valeurs de courant et de tension de la tête de l'évaporateur à zéro et fermer la partition.
- Placez le porte-échantillons sur le stade froid de la chambre du spécimen pour observation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Des images représentatives des surfaces transversales du xylée d'arbre conifère et à feuilles larges, observées par cryo-SEM, sont montrées à la figure 2. Au faible grossissement, la zone noire des images indique les cavités d'où disparaît entièrement ou partiellement l'eau, et la zone grise indique les parois des cellules xylées, le cytoplasme et l'eau (Figure 2A). Au grossissement élevé, il est évident que l'eau n'est pas entièrement perdue de la sommité de trois trachéides, ce qui indique l'apparition de macro bulles dans la sève xylée in situ (Figure 2B). En ce qui concerne les espèces à larges de leurs deses, l'occurrence de la cavitation est facilement détectée à l'intérieur des navires, tandis que l'existence de l'eau est difficile à distinguer dans les fibres, en particulier à faible grossissement (figure 2C). Le cytoplasme dans les cellules parenchymes peut être distingué de l'eau dans les trahceids ou les vaisseaux à travers des textures de plaine de glace (p. ex., figure 2B).
L'effet de la température sur le processus de congélation est indiqué à la figure 3. La poussière de givre est progressivement éliminée et les membranes des fosses intertracheary deviennent plus claires grâce à la progression de la sublimation avec l'augmentation de la température. Les grosses particules de poussière de givre restantes peuvent être éliminées par d'autres congélations, mais cela peut être problématique car elle diminue inutilement le niveau de surface de la glace dans les conduits de xylisme.
La haute qualité de l'observation est en grande partie obtenue grâce à une préparation précise des spécimens; particulièrement important est de lisser la surface avec une lame pointue du microtome. Un lissage insuffisant par une lame usagée peut parfois causer une surface rugueuse (appelée « marques de couteau », figure 4) ou de nombreuses occurrences de poussière provenant des coupures. Après avoir soigneusement planifié la surface du spécimen, le transfert rapide du spécimen à la chambre du spécimen est également crucial pour éliminer les contaminations causées par la formation de gel.
La congélation d'échantillon sans la relaxation de la pression négative de colonne d'eau causera l'induction artifactual de la cavitation dans des conduits de xylée (figure 5). Des cristaux de glace groupés ont été observés dans des vaisseaux de spécimens dont l'échantillon n'était pas détendu (têtes de flèche à la figure 5A),de façon contrastée, aucun cristal de glace groupé n'a été observé dans des échantillons détendus avec un potentiel d'eau similaire ( Figure 5 B). Cela tend à être plus important dans le xylisme des arbres à larges deleurs que dans les conifères (données non publiées).
Figure 1 : Graphique schématique de ce protocole. Le flux des procédures de l'échantillonnage à l'observation SEM décrite dans ce document est montré. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemple de micrographies cryo-SEM des surfaces transversales des espèces d'angiospermes et de gymnospermes. Les zones grises et noires des cellules xylées correspondent respectivement à l'eau et aux cavités de la colonne d'eau des cellules xylées. Étant donné que les échantillons ont été congelés avec de l'azote liquide avant la collecte de l'échantillon, les images de cryo-SEM montrent l'état de l'eau et l'embolie indigène de la plante au moment de l'échantillonnage. (A) et (B) : brindille de deux ans d'un arbre adulte de Cryptomeria japonica (bois de conifère). Le diamètre de la brindille était de 3 mm, et le potentiel d'eau était de 0,39 MPa à la récolte avant l'aube. (C) : pousse de plants de Carpinus tschonoskii (bois diffus-poreux) (1,4 m de hauteur et 1,1 cm de diamètre basal). Le plant a été échantillonné après la procédure tension-relaxation suivant la limitation prolongée de l'irrigation pendant quatre jours. Le potentiel d'eau était de 1,78 MPa après une sécheresse prolongée et était de 0,15 MPa après la procédure de relaxation de tension. Tr: trachéid, R: ray parenchyma, V: navire, F: fibre, AP: parenchyme axial. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : La procédure de dégivrage et de gravure progresse en augmentant la température du stade du spécimen froid. Surface transversale du xylème d'une brindille Cryptomeria japonica (bois de conifère). Les températures décroissantes de l'étape du spécimen sont (A) de 113,0 oC, (B) de 105,3 oC, (C) de 101,9 oC et (D) de 99,7 oC. Chaque image a été obtenue environ 5 min après que la température du stade du spécimen froid a été fixée à la valeur de température respective. La sublimation de la glace progresse si la température de l'étape est maintenue au-dessus d'environ 120 oC (pour notre équipement). Tr: trachéid, B: paire de fosses bordées, Pm: membrane de la fosse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemple de marque de couteau. Surface transversale de xylème d'une brindille De Cryptomeria japonica (bois de conifère) montrant ce qu'on appelle des marques de couteau. Les pointes de flèche et les lignes pointillées représentent des marques typiques de couteau. Le dégagement de la surface d'un spécimen par un cryostat doit être complété par une partie inutilisée de la lame du couteau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Exemple de l'effet de relaxation de la tension de la colonne d'eau dans les conduits. Surface transversale de tige d'un plant de Carpinus tschonoskii (bois diffus-poreux) observée par cryo-SEM. Le potentiel hydrique pendant la journée était similaire dans les deux semis. La tige du semis transpirant a été congelée intacte (A), tandis que la tige d'un autre semis a été congelée après la relaxation de la tension hydraulique existante (B). Le potentiel d'eau (B) à la récolte était de 0,5 MPa après la procédure de tension-relaxation. Les pointes de flèche dans le panneau (A) sont des artefacts de glace gelés à l'intérieur des navires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les méthodes d'observation cryo-SEM introduites dans ce document sont pratiques pour visualiser clairement la distribution de l'eau à l'échelle cellulaire. Grâce à cette méthode, l'exploration des changements dans la distribution de l'eau dans le xylisme peut potentiellement aider à clarifier le mécanisme de tolérance des espèces d'arbres au stress abiotique (pénurie d'eau ou de congélation) ou au stress biotique (maladie des arbres).
L'étape la plus cruciale de cette méthode est de préserver la caractéristique de distribution de l'eau de l'état de l'eau indigène lors de la collecte de l'échantillon et de la préparation subséquente de l'échantillon. Le tissu Xylem d'espèces avec de longs conduits (en particulier les vaisseaux de bois précoce des arbres poreux) peut facilement perdre de l'eau pendant la récolte et la congélation. Cochard et coll. (2000) ont discuté des artefacts de congélation en raison de la tension élevée dans la colonne d'eau le long des conduits de xylage38,41. Umebayashi et coll. (2016) ont confirmé la validité des observations cryo-SEM d'échantillons dissémitant la tension par rapport aux observations non destructives d'IRM39. Les deux techniques d'observation ont montré un modèle similaire de distribution d'eau. Bien que nous ayons encore besoin de vérifier la robustesse spécifique à l'espèce contre l'entrée d'air induite par le gel sous haute tension hydraulique, des procédures de relaxation devraient être menées pour fournir des estimations fiables des distributions d'eau, et en particulier pour plantes à stress hydrique.
Les particules de givre et de glace sont des obstacles importants à l'observation détaillée. Pour éviter l'accumulation de gel, le spécimen ne doit pas être exposé à l'atmosphère tant qu'il n'est pas attaché à la chambre du spécimen cryo-SEM. Bien que l'exposition à l'atmosphère ne puisse être entièrement empêchée lors du transfert de l'échantillon à la chambre du spécimen, le temps de transfert doit être court. Le récipient de transfert isolant du porte-échantillons doit être bien séché après avoir enlevé le porte-échantillon et le LN2 afin d'éviter le gel et la glace provenant de la condensation de rosée.
La durée appropriée du gel de l'gravure dépend de la performance des instruments utilisés. Les facteurs importants pour déterminer ceci sont le niveau de vide dans la chambre de spécimen et la stabilité du contrôleur de température du stade de spécimen. L'étendue de la sublimation correspondant à la température doit être principalement évaluée avant utilisation formelle. Le gel excessif atténuant la présence d'eau dans les conduits de xylisme et la rendra difficile à identifier, en particulier dans la lumina des cellules étroites.
Il prend des mesures et des efforts spécifiques pour s'assurer que les méthodes destructrices d'échantillonnage sont exemptes de l'occurrence d'artefacts pendant les procédures de congélation, de récolte et de coupe. Bien que l'importance de l'apparition d'artefacts soit fréquemment soulignée, le degré d'occurrence d'artefacts congelés dans les conduits de xylisme n'a pas été suffisamment validé38,39. Une validation supplémentaire par des méthodes non destructives est souhaitable pour confirmer l'exactitude de la procédure de tension-relaxation et de la fixation de gel. Étant donné que les systèmes de TCC ou d'IRM à base de synchrotron n'ont pas été suffisamment répandus dans l'étude des relations entre les plantes et l'eau par rapport au système cryo-SEM, l'application d'un système commercial cT peut éventuellement faire progresser la validation des résultats cryo-SEM42 .
Les caractéristiques hydrauliques des arbres, comme le flux de sève, la conductivité hydraulique des segments de tige, la perte en pourcentage de conductivité (PLC) ou la capacité du xylème fournissent des estimations de l'utilisation de l'eau des arbres et de la résistance à la sécheresse. La comparaison de l'utilisation de l'eau entre les espèces est nécessaire pour prédire la survie des arbres sous le stress hydrique causé par le changement climatique anthropique2. L'observation cryo-SEM présente de nombreux avantages en fournissant des connaissances anatomiques pour clarifier la cause des changements dans les caractéristiques hydrauliques. Les récentes améliorations des méthodes destructrices et non destructives d'études anatomiques et hydrauliques végétales peuvent, ensemble, approfondir notre compréhension de la nature de l'utilisation de l'eau des arbres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
References
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
