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वुडी पौधों में Xylem जल वितरण एक Cryo-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

जाइलम के भीतर जल वितरण को देखने से वुडी पौधों में जल प्रवाह गतिशीलता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी मिलती है। इस अध्ययन में, हम एक cryostat और क्रायो-SEM, जो नमूना तैयार करने के दौरान पानी की स्थिति में artifactual परिवर्तन समाप्त का उपयोग करके situ में xylem जल वितरण का निरीक्षण करने के लिए व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं.

Abstract

एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप स्थापित क्रायो-इकाई (cryo-SEM) subzero तापमान पर नमूना अवलोकन की अनुमति देता है और तरल नाइट्रोजन का उपयोग फ्रीज निर्धारण तकनीकों के साथ संयोजन में संयंत्र के ऊतकों में पानी के वितरण की खोज के लिए इस्तेमाल किया गया है (LN 2) वुडी प्रजातियों के लिए, तथापि, जाइलम अनुप्रस्थ सतह को देखने के लिए तैयारी लकड़ी फाइबर के उन्मुखीकरण के कारण कुछ कठिनाइयों को शामिल. इसके अतिरिक्त, जाइलम conduits में पानी स्तंभ में उच्च तनाव कभी कभी पानी वितरण में artifactual परिवर्तन पैदा कर सकता है, विशेष रूप से नमूना निर्धारण और संग्रह के दौरान. इस अध्ययन में, हम एक क्रायओस्टैट और क्रायो-सेम का उपयोग करके सीटू में वुडी पौधों के जाइलम के भीतर जल वितरण का निरीक्षण करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया प्रदर्शित करते हैं। सबसे पहले, नमूना संग्रह के दौरान, जाइलम पानी की क्षमता को मापने के लिए निर्धारित करना चाहिए कि उच्च तनाव xylem नाली में मौजूद है. जब जाइलम जल क्षमता कम होती है (और का. ]0.5 एम.पी.ए.), नमूना फ्रीज निर्धारण के दौरान जाइलम नाली में जल की स्थिति के बेहतर संरक्षण को सुविधाजनक बनाने के लिए तनाव विश्राम प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। इसके बाद, एक watertight कॉलर पेड़ स्टेम के आसपास जुड़ा हुआ है और xylem के पानी की स्थिति के फ्रीज निर्धारण के लिए LN2 से भरा है. कटाई के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि अवलोकन के लिए नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं को पूरा करते समय नमूना को संरक्षित किया जाता है। एक cryostat स्पष्ट रूप से जाइलम अनुप्रस्थ-कट सतह का पर्दाफाश करने के लिए कार्यरत है। क्रायो-एसईएम टिप्पणियों में, फ्रोज़न-इचिंग के लिए समय समायोजन को ठंढ धूल को हटाने और देखने की सतह पर सेल दीवारों के किनारे को बढ़ाने के लिए आवश्यक है। हमारे परिणाम सेलुलर और subcellular स्तर पर जाइलम के भीतर जल वितरण के अवलोकन के लिए क्रायो-SEM तकनीकों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन. गैर विनाशकारी के साथ क्रायो-SEM के संयोजन situ अवलोकन तकनीकों में गहराई से वुडी संयंत्र पानी के प्रवाह गतिशीलता के अन्वेषण में सुधार होगा.

Introduction

जल संसाधनों की उपलब्धता (अर्थात, वर्षा, मृदा जल की मात्रा) पौधों की प्रजातियों की मृत्यु दर और भौगोलिक वितरण को कड़ाई से निर्धारित करती है, क्योंकि उन्हें मिट्टी से जल को अवशोषित करने और प्रकाश संश्लेषी उत्पादन के लिए पत्तियों तक ले जाने की आवश्यकता होती है। पौधों को अस्थिर पानी की आपूर्ति के तहत अपनी जल परिवहन प्रणाली को बनाए रखना चाहिए। विशेष रूप से, वुडी पौधों transpiration धाराओं के साथ उनके नाली में उच्च तनाव उत्पन्न के रूप में, कुछ मामलों में, वे जमीन से अधिक 100 मीटर से अधिक अपने मुकुट पकड़ की जरूरत है. इस तरह के उच्च नकारात्मक दबाव के तहत पानी के कॉलम को बनाए रखने के लिए, जाइलम conduits कठोर और हाइड्रोफोबिक-लिग्नीकृत सेल दीवारों1के साथ ट्यूबलर कोशिकाओं के एक निरंतरता से मिलकर बनता है। प्रत्येक प्रजाति में जाइलम कंसित्स के जाइलम रोग की भेद्यता अस्थिर जल आपूर्ति2के अंतर्गत प्रजातियों के जीवित रहने का एक अच्छा निर्धारक है . इसके अलावा, जाइलम नाली की पानी की स्थिति का अध्ययन अजैविक या जैविक तनाव के अधीन व्यक्तिगत पेड़ों के स्वास्थ्य की स्थिति के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है। मापने रस प्रवाह या पानी की क्षमता जाइलम नाली के एकीकृत हाइड्रोलिक समारोह के कारण एक वुडी संयंत्र के पानी की स्थिति का अनुमान प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, जाइलम कोशिकाओं में पानी के वितरण visualizing जाइलम हाइड्रोलिक प्रणाली के व्यक्तिगत घटकों की स्थिति स्पष्ट कर सकते हैं.

जाइलम नाली के जल की स्थिति को विज़ुअलाइज़ करने के लिए अनेक तकनीकेंमौजूद हैं 3. वुडी ऊतक में जल पथों को देखने के लिए शास्त्रीय और उपयोगी विधियों में कटी हुई शाखाओं के सिरोंको डाई में डुबोकर या खड़े पेड़ में डाई का इंजेक्शन लगाकर जल स्तंभ को धुंधला करना शामिल है . नरम एक्स-रे फोटोग्राफी भी जाइलम5,6में नमी के अंतर एक्स-रे अवशोषण तीव्रता के कारण कटा हुआ लकड़ी डिस्क के पानी के वितरण के दृश्य की अनुमति देता है। इन तरीकों, तथापि, केवल पानी आंदोलन की पटरियों प्रदान करते हैं या पानी के स्थूल वितरण का प्रदर्शन. हाल ही में, इस तरह के माइक्रो फोकस एक्स-रे गणना टोमोग्राफी के रूप में गैर विनाशकारी अवलोकन तकनीक,7,8,9,10और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)11, 12, बरकरार पौधों के भीतर जाइलम नाली में पानी के अवलोकन की अनुमति देने के लिए काफी सुधार किया गया है। इन गैर विनाशकारी तरीकों में महान लाभ है कि हम कृत्रिम काटने के प्रभाव के बिना जाइलम पानी की स्थिति का निरीक्षण कर सकते हैं, और हम अनुक्रमिक इमेजिंग द्वारा पानी के प्रवाह गतिशीलता ट्रैक या एक विपरीत एजेंट शुरू कर सकते हैं10. हालांकि, हम संयंत्र इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित एमआरआई या synchron आधारित जेडसीटी के लिए एक विशेष सुविधा का उपयोग करने के लिए छवियों जो सेलुलर स्तर पानी की सामग्री की पहचान कर सकते हैं प्राप्त करने की जरूरत है. इसके अलावा, हालांकि synchron आधारित जेडसीटी प्रणाली उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ठीक छवियों को प्राप्त करने के लिए सक्षम है, जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी के बराबर है7,8,9, जीवित कोशिकाओं द्वारा घायल हो सकता है उच्च ऊर्जा एक्स-रे13,14का विकिरण । एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप जिसमें क्रायो-इकाइयों स्थापित कर रहे हैं रोजगार (cryo-SEM) ठीक एक सेलुलर स्तर पर जाइलम में पानी का पता लगाने के लिए एक बहुत ही उपयोगी तरीका है, हालांकि यह विनाशकारी अवलोकन के लिए नमूना कटाई की आवश्यकता है. जाइलम नाली में पानी को ठीक करने के लिए, तनों का एक हिस्सा (अर्थात, टहनियाँ, शाखाएंया तनों) को तरल नाइट्रोजन (एलएन 2) द्वारा सीटू में जमकर रखना पड़ता है। क्रायो-सेम द्वारा छंटनी की गई, जमे हुए नमूनों की सतह के प्रेक्षण जाइलम संरचना के उच्च-उत्रूपित प्रतिबिंब प्रदान करते हैं जहां से हम जाइलम नाली में जल को बर्फ के रूप में पहचान सकते हैं। इस विधि का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि एक ही नमूने के भीतर पानी movability के अनुक्रमिक अवलोकन असंभव है. हालांकि, एक क्षेत्र में रहने वाले पेड़ों की अनुक्रमिक अवलोकन के लिए जेडसीटी या एमआरआई का उपयोग बेहद चुनौतीपूर्ण है क्योंकि ये उपकरण पोर्टेबल नहीं हैं। इसके विपरीत, क्रायो-एसईएम क्षेत्र प्रयोगों में बड़े पेड़ों पर इस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक क्षमता है स्पष्ट रूप से न केवल सेलुलर स्तर पर पानी की सामग्री कल्पना लेकिन यह भी एक बेहतर संरचना स्तर पर, उदाहरण के लिए, intervascular गड्ढे में पानी15, पानी में अंतरकोशिकीय स्थान16, या जल स्तंभ17में बुलबुले .

क्रायो-सेम द्वारा जाइलम जल को देखने वाले अनेक अध्ययनों में 5,12,18,19,20,21,23की सूचना दी गई है . Utsumi एट अल (1996) शुरू में स्टेम21पर सेट एक कंटेनर में LN2 भरने के माध्यम से एक जीवित ट्रंक के फ्रीज-फिक्सेशन द्वारा सीटू में जाइलम के अवलोकन के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की। नमूना संग्रह के दौरान और जाइलम नाली के भीतर बर्फ पिघलने से बचने के लिए क्रायो-सेम तैयारी के दौरान नमूना का तापमान -20 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखा गया था। इस विधि का उपयोग जाइलम में जल का निरीक्षण करने के लिए किया गया है ताकि बदलते जल शासन11,12,24,25,26के अंतर्गत जल वितरण को स्पष्ट किया जा सके, 27,28, जल वितरण की मौसमी भिन्नता21,29,30, फ्रीज-थॉ व चक्र17,31, 32, गीली लकड़ीमेंजल का वितरण 5 , सैपवुड से हार्टवुड20में संक्रमण के दौरान जल वितरण में परिवर्तन , कैम्बियल गतिविधि का मौसमी समय पाठ्यक्रम और जहाजों का विभेद33, और कुछ जीवीय तनाव23,34द्वारा प्रेरित गुहिकायन . द्रवीय चालकता और गुहिकाभों की भेद्यता का सत्यापन क्रायो-सेम35,36से किया गया है। क्रायो-सेम ऊर्जा प्रसारक एक्स-रे स्पेक्ट्रोमेट्री (EDX या EDS) से लैस पानी37युक्त एक नमूना की सतह पर तत्व वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

एक जीवित ट्रंक का फ्रीज-फिक्सेशन जिसमें उच्च हाइड्रोलिक तनाव होता है, कभी-कभी कृत्रिम कैविटेशन का कारण बनता है जो क्रायो-सेम द्वारा नाली38,39के लुमेन में खंडित बर्फ क्रिस्टल के रूप में मनाया जाता है। विशेष रूप से, लंबे समय तक और व्यापक नाली वाली व्यापक प्रजातियां तनाव-प्रेरित कलाकृतियों की चपेट में होती हैं, जैसे नमूना काटने के कारण गुहिकायन, भले ही पानी3,40 केनीचे आयोजित की जाती हों। Cavitation कलाकृतियों एक traspiring पेड़ के नमूने के बाद स्पष्ट हो (यानी, दिन के समय के दौरान नमूना) या गंभीर सूखे की स्थिति में और वे गुहिकायन घटना3,38के एक overestimation को गुमराह कर सकते हैं, 39. इसलिए , नाली में काम करने वाले तनाव को जारी करना होगा ताकि कृत्रिम गुहिकायन3,12,39से बचा जा सके .

एक नमूना कक्ष में स्थापित चाकू का उपयोग फ्रीज फ्रैक्चर तकनीक अक्सर cryo-SEM अवलोकन के लिए नमूना सतह का पर्दाफाश करने के लिए कार्यरत है। तथापि, वुडी पादप के ऊतकों के फ्रीज-फ्रैक्टेड विमानों, विशेष रूप से द्वितीयक जाइलम के अनुप्रस्थ खंड, ऊतक6में शारीरिक विशेषताओं और जल को स्पष्ट रूप से देखने के लिए बहुत अधिक कठिन होते हैं। किसी नमूने को ट्रिम करने के लिए क्रायोस्टैट का प्रयोग नमूना सतहों की तीव्र और उच्च गुणवत्ता वाली तैयारीकीअनुमति देता है 20,23. इस विधि का समग्र लक्ष्य नमूना कलाकृतियों की घटना के बिना सीटू में जाइलम कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार में जल वितरण के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संकल्प के साथ सबूत प्रदान कर रहा है। हम अपनी अद्यतन प्रक्रिया है, जो तेजी से सुधार किया गया है के बाद से हम पहली बार इसे अपनाया, नमूना के बारे में, trimming और जाइलम के cryo-निश्चित नमूने के उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन micrographs प्राप्त करने के लिए नमूना सतह की सफाई.

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चार्ट चित्र 1में दिखाया गया है।

1. नमूना: Xylem Conduits के जल स्तंभ के भीतर तनाव विश्राम

नोट: निम्न तनाव छूट उपचार Xylem जल वितरण में ठंड और तनाव प्रेरित कलाकृतियों से बचने के लिए LN2 आवेदन से पहले की सिफारिश की है.

  1. एक शाखा और एक काले प्लास्टिक बैग के साथ नमूने के लिए पत्तियों को संलग्न करने के लिए जाइलम के बीच पानी की क्षमता को बराबर और नमूने से पहले दो घंटे से अधिक छोड़ देता है.
  2. एक दबाव कक्ष या एक साइक्रोमीटर का उपयोग कर नमूना से कम से कम दो पत्तियों के पानी की क्षमता का निर्धारण. जब जल संभाव्यता ca. $0.5 MPa (अर्थात, कोई या बहुत कम तनाव मौजूद है) से अधिक होती है, तो एक नमूना ठंड के बाद काटा जा सकता है (अनुभाग 2: फ्रीज निर्धारणदेखें )। जब पानी की क्षमता $ 0.5 MPa से कम है, विश्राम के लिए एक उपचार के रूप में नीचे वर्णित की जरूरत है.
  3. पानी से भरा होने के लिए स्टेम के चारों ओर एक watertight कॉलर ठीक करें। नीचे के बिना एक प्लास्टिक कप एक watertight कॉलर के रूप में सेवा कर सकते हैं. देखभाल कसकर स्टेम और कॉलर के बीच रिक्त स्थान तरल मीडिया जो बाद में उपयोग किया जाता है के रिसाव को रोकने के लिए एक चिपचिपा टेप का उपयोग कर सील करने के लिए लिया जाना चाहिए। पतली शाखाओं या टहनियों जैसे लचीला तनों की कटाई के लिए, तने को मोड़कर पानी से भरे बाल्टी में एक काटने के हिस्से को सिंक करें। कटान कतरनी या एक आरी का उपयोग कर पानी की सतह के नीचे कट। हवा में कटौती अंत को उजागर करने को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके पानी के एक और कंटेनर के लिए नमूना स्थानांतरण।
  4. नमूने के कटे हुए सिरा को पानी के नीचे रखें। व्यापक लीव्ड प्रजातियों के लिए, सुनिश्चित करें कि जगह जहां SEM के लिए एक क्रायो नमूना काटा स्टेम के कट किनारे करने के लिए प्राप्त किया जाएगा से लंबाई के लिए नमूने की अधिकतम पोत लंबाई से अधिक है ताकि क्रायो नमूना के भीतर तनाव प्रेरित कलाकृतियों को रोकने के लिए.
  5. ट्रांसपिरेशन को कम करने के लिए एक काले प्लास्टिक बैग के साथ पत्तियों युक्त नमूना कवर करें। पानी में नमूने के कट अंत रखें और जाइलम तनाव को आराम करने के लिए लगभग 30 मिनट के लिए इस स्थिति को बनाए रखें। कैविटेड नाली12की संभावित कृत्रिम रिफिलिंग के कारण लंबे समय तक विश्राम के समय (gt; 1 ज) से बचें।
  6. जाइलम तनाव की छूट की पुष्टि करने के लिए फिर से पानी की क्षमता को मापने (लगभग 0 MPa).
    नोट: नमूने से पहले, लक्ष्य प्रजातियों की अधिकतम पोत लंबाई अनुसंधान या हवा इंजेक्शन विधि द्वारा इसी तरह के नमूनों के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए। जब एक बड़े पेड़, या एक बड़ी शाखा का नमूना, यह तनाव छूट प्रक्रियाओं ऊपर वर्णित का संचालन करने के लिए मुश्किल है. इसलिए, बड़े पेड़ों से नमूने predawn अवधि के दौरान एकत्र किया जाना चाहिए जब xylem पानी की क्षमता अधिक है.

2. LN2 के साथ फ्रीज फिक्सेशन

  1. कट और कैंची या एक उपयोगिता चाकू के साथ एक watertight कॉलर के एक तरफ खुला. एपर्चर क्षैतिज पकड़े हुए एक चिपकने वाला टेप के साथ स्टेम के चारों ओर कसकर कॉलर देते हैं।
  2. इन्सुलेट दस्ताने पहनें / यह तेजी से LN2 जोड़ने के लिए पूरी तरह से जाइलम में पानी फ्रीज द्वारा भरा रखें. ठंड के लिए आवश्यक समय नमूना आकार पर निर्भर है; डाला LN2 के उबलते के बाद 1 मिनट एक छोटी टहनी या एक अंकुर के लिए पर्याप्त है, जबकि 20 मिनट से अधिक एक बड़े पेड़ के एक तने के लिए आवश्यक है20. ठंड के दौरान LN2 लगातार जोड़ें क्योंकि यह एलएन2 और परिवेश के तापमान के बीच बड़े तापमान अंतर के कारण तेजी से वाष्पित हो जाता है।
  3. पर्याप्त ठंड समय के बाद LN2 को दूर करने के क्रम में नमूना स्टेम के जमे हुए हिस्से से कॉलर detach. कॉलर अलग करने के कारण संभावित LN2 spills के साथ संपर्क से बचने के लिए इन्सुलेट दस्ताने पहनने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. एक ठीक handsaw के साथ नमूना तुरंत फसल.
  5. एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के साथ जमे हुए नमूने को कवर या यह एक नमूना ट्यूब में डाल दिया, जिस पर नमूना आईडी नंबर लिखा जाता है. तेजी से एक कंटेनर LN2 से भरा में काटा नमूना जगह या सूखी बर्फ से भरा एक अछूता बॉक्स में पैक.
  6. अवलोकन तक एक गहरी फ्रीजर में नमूने स्टोर. भंडारण के दौरान बर्फ के उदात्तीकरण और इसके पुनः क्रिस्टलीकरण को रोकने के लिए पसंदीदा भंडारण तापमान 80 डिग्री सेल्सियस है।

3. चश्मा तैयारी

नोट: अवलोकन के लिए, एक नमूना छंटनी की जानी चाहिए और अवलोकन के लिए इसकी सतह subzero तापमान पर योजना बनाई जानी चाहिए ताकि इसके जाइलम में सीटू में जल वितरण रखने के लिए. क्रायोस्टैट प्रणाली (क्रायोस्टैट) के साथ एक जैविक माइक्रोटोम क्रियो-सेम द्वारा इस प्रकार के प्रेक्षण में किसी नमूने की सतह को ट्रिम करने और उजागर करने के लिए आदर्श होता है।

  1. क्रायोस्टैट के नमूना कक्ष का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें, जो आमतौर पर अधिकांश पौधों के जाइलम रस को जमे हुए राज्य में रखने के लिए काफी ठंडा होता है।
  2. एक छोटे टुकड़े में एक नमूना ट्रिम करें (और ca. 2 सेमी ऊंचाई और और एल.टी.; ca. 1 सेमी चौड़ाई या व्यास में) जिसे क्रायो-सेम के नमूना धारक के लिए समायोजित किया जा सकता है। नमूना में बर्फ को तोड़ने से रोकने के लिए एक तेज चाकू या बारीक दांतों वाली आरी का उपयोग करें। एक बड़ा नमूना है कि एक चाकू के साथ काटा नहीं जा सकता के मामले में, जल्दी से एक फ्रीजर बॉक्स में एक ठंडा देखा के साथ पूर्व कटौती.
  3. एक चक करने के लिए छंटनी टुकड़ा संलग्न, एक ऊतक ठंड embedding मध्यम पर बढ़ते द्वारा एक cryostat के लिए एक धारक (उदाहरण के लिए, OCT यौगिक) क्रायो अनुभाग के लिए. फिर, cryostat के एक microtome के एक नमूना धारक को चक देते हैं.
  4. मोटाई में 5-7 डिग्री सेल्सियस वर्गों के साथ बार-बार शेविंग द्वारा सतह को ट्रिम करें। नमूना संग्रह में प्रारंभिक सतह से कुल गहराई में, 1,000 से 2,000 डिग्री से अधिक दूर काटने से ट्रिमिंग, एक चाकू के साथ पूर्व काटने की वजह से नमूना के क्षतिग्रस्त हिस्से को नष्ट करने के लिए उपयोगी है या चरण 3.2 में वर्णित के रूप में देखा।
  5. मोटे तौर पर नमूना की एक सतह trimming के बाद, नमूना की सतह के ऊपर microtome ब्लेड के एक अप्रयुक्त भाग को समायोजित करें. ब्लेड मोटाई सेटिंग से अधिक होगा जो नमूना को छूने के लिए अनुमति नहीं है।
  6. अप्रयुक्त ब्लेड भाग द्वारा पहली कटौती से पहले, थोड़ा नमूना और ब्लेड की सतह के बीच की दूरी को चौड़ा.
  7. नमूने की सतह को केवल एक या दो बार काटें। इसके अलावा, ब्लेड फिर से नमूना की सतह पर एक अप्रयुक्त ब्लेड भाग का समायोजन स्लाइड.
  8. चरण 3.6 और 3.7 तीन या चार बार दोहराएँ. यह महत्वपूर्ण है क्रम में एक स्पष्ट सतहप्राप्त करने के लिए बिना "knife निशान" (चित्र 4).
  9. अंतिम कटौती के बाद, नमूने पर चिपके से धूल को रोकने के लिए नमूने से दूर ब्लेड की स्थिति निर्धारित करें।
  10. नमूना धारक से चक को अलग करें और एक तेज चाकू के साथ जमे हुए एम्बेडिंग माध्यम को हटाकर नमूना को चक से अलग करें। सुनिश्चित करें कि नमूना cryostat कक्ष में रखा गया है ठंढ धूल से अपनी योजना बनाई सतह को रोकने के लिए.
  11. क्रायो-सेम नमूना धारक के लिए नमूना संलग्न करें जिसमें क्रायोस्टैट कक्ष में एक ऊतक ठंड embedding माध्यम के साथ।

4. क्रायो-सेम चश्मा चैंबर में स्थानांतरण

नोट: सतह तैयार नमूना तापमान की वृद्धि या cryostat कक्ष से क्रायो-SEM नमूना कक्ष में अवलोकन चरण के लिए स्थानांतरण के दौरान ठंढ के संचय से संरक्षित किया जाना चाहिए।

  1. उपकरण के उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार LN2 के साथ -120 डिग्री सेल्सियस से कम पर क्रायो-SEM नमूना कक्ष में ठंड चरण तापमान बनाए रखें।
  2. नमूना धारक को क्रिओस्टैट कक्ष में एलएन2 से भरे एक इन्सुलेट कंटेनर में तैयार नमूना के साथ रखें।
  3. नमूना धारक को एलएन2के नीचे एक नमूना विनिमय छड़ के साथ पकड़ो . जब भी संभव हो नमूना धारक को हवा में उजागर करने से बचें।
  4. पूर्व निकासी कक्ष की निकासी शुरू करते ही जैसे ही क्रायो-सेम नमूना कक्ष के पूर्व खाली करने के कक्ष में नमूना धारक को तेजी से सेट करें। फिर, हवा को पूरी तरह से खाली करने के बाद नमूना धारक को ठंडे चरण पर रखें। हालांकि ठंढ संचय का एक सा अपरिहार्य है, "फ्रीज-etching" प्रक्रिया (चरण 6) इसे हटा सकते हैं.

5. SEM में सेटिंग

नोट: अवलोकन के लिए विशिष्ट सेटिंग नीचे वर्णित है। कुछ संशोधन ों की आवश्यकता होती है जो निर्वात स्थिति या इलेक्ट्रॉन बीम के आधार पर होते हैं।

  1. SEM पैरामीटर अवलोकन के लिए निम्नानुसार सेट करें:
    त्वरण वोल्टता: 3ण्5 केवी
    नमूना चरण का तापमान: और lt; $120 डिग्री सेल्सियस
    डिटेक्टर: माध्यमिक उत्सर्जन

6. फ्रीज-उत्कीर्णन

नोट: फ्रीज-etching मामूली बर्फ क्रिस्टल उदात्तीकरण द्वारा नमूना सेल दीवारों के किनारे उच्चारण के लिए प्रक्रिया है। फ्रीज-उत्कीर्णन में सतह की ठंढ धूल को भी हटाना शामिल है।

  1. फ्रीज-उत्कीर्णन के दौरान विद्युत गन का त्वरण वोल्टता चालू कीजिए। नमूना देखते समय फ्रीज-एचिंग का संचालन करना बेहतर है।
  2. नमूना चरण का तापमान 100 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाइए।
  3. कई मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक ठंढ धूल हटा दिया जाता है और जाइलम कोशिकाओं में बर्फ की सतह के स्तर को थोड़ा सेल दीवारों की तुलना से कम हो गया है.
  4. नमूना चरण के तापमान को 120 डिग्री सेल्सियस तक कम करें।
    नोट: यदि नमूना चरण के लिए कोई स्थापित तापमान नियंत्रक नहीं है, तो एक्सचेंज रॉड का उपयोग करके नमूना पकड़ें और इसे कुछ मिनट के लिए नमूना चरण से अलग करें। नमूना के उदात्तीकरण की स्थिति को सत्यापित करने के लिए इस फ्रीज-एचिंग प्रक्रिया के दौरान नमूने का कई बार निरीक्षण करें।

7. धातु कोटिंग (वैकल्पिक)

नोट: SEM साधन और छवि प्रसंस्करण के लिए हाल ही में सुधार धातु कोटिंग के बिना बिजली इन्सुलेट नमूनों की उच्च गुणवत्ता छवियों प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, गैर-चालक नमूने, जैसे जैविक सामग्री, कभी-कभी चार्ज के अधीन होते हैं; इलेक्ट्रॉनों के संचय के कारण नमूना की विशिष्ट स्थितियों पर उच्च चमक ("चार्जिंग")। समय की एक लंबी अवधि के लिए या एक उच्च आवर्धन के लिए इलेक्ट्रॉन बीम के लिए नमूना उजागर, चार्ज प्रभाव बढ़ जाती है. विद्युत-चालक धातु सामग्री के साथ नमूने की सतह कोटिंग चार्ज करने की घटना को रोकता है। कोटिंग के दौरान बढ़ रही से नमूना के तापमान को रोकने के क्रम में क्रायो-सेम इकाई के भीतर स्थापित किया गया है जो वैक्यूम कोटिंग प्रणाली का उपयोग करें।

  1. सुनिश्चित करें कि कोटिंग सामग्री कोटिंग प्रणाली के एक नामित वाष्पित्र सिर पर स्थापित किया गया है।
  2. कोटिंग प्रणाली में ठंड चरण के तापमान को 170 डिग्री सेल्सियस से नीचे बनाए रखें।
  3. पर्याप्त फ्रीज-एचिंग के बाद कोटिंग सिस्टम के ठंडे चरण पर नमूना धारक को रखें।
  4. शीत अवस्था और वाष्पित्र सिर के बीच विभाजन खोलें।
  5. क्रमशः 30 उए तथा सव 5 ट पर वाष्पित्र शीर्ष का वोल्टता मान तथा वोल्टता मान निर्धारित कीजिए।
  6. नमूने की सतह को कोट करने के लिए कै 30 एस के लिए एवज कोटिंग सामग्री का उत्सर्जन करें।
  7. वाष्पित्र शीर्ष के धारा और वोल्टता दोनों मान शून्य पर सेट करें और विभाजन को बंद करें।
  8. नमूना धारक को प्रेक्षण के लिए नमूना कक्ष के ठंडे चरण पर रखें।

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Representative Results

क्रायो-सेम द्वारा देखे गए शंकुधारी और विस्तृत वृक्ष जाइलम के अनुप्रस्थ-कट सतहों के प्रतिनिधि चित्र चित्र 2में दर्शाए गए हैं। कम आवर्धन पर, छवियों में काला क्षेत्र गुहाओं को इंगित करता है जिसमें से पानी पूरी तरह से या आंशिक रूप से गायब हो जाता है, और ग्रे क्षेत्र जाइलम सेल दीवारों, कोशिकाद्रव्य, और पानी को इंगित करता है (चित्र 2ए)। उच्च आवर्धन पर, यह स्पष्ट है कि पानी पूरी तरह से तीन tracheids के lumina से खो नहीं है, situ में xylem रस में मैक्रो बुलबुले की घटना का संकेत है (चित्र 2बी). व्यापक प्रजातियों के संबंध में, गुहिकायन घटना आसानी से जहाजों के भीतर पता लगाया है, जबकि पानी के अस्तित्व फाइबर के भीतर भेद करने के लिए मुश्किल है, विशेष रूप से कम आवर्धन पर (चित्र 2ग)। पैरेन्काइमा कोशिकाओं में साइटोप्लाज्म को बर्फ के मैदान बनावट के माध्यम से ट्रैहसीड या जहाजों के भीतर पानी से अलग किया जा सकता है (उदा., चित्र 2बी)।

फ्रीज-एचिंग प्रक्रिया पर तापमान का प्रभाव चित्र 3में दिखाया गया है। फ्रॉस्ट धूल धीरे-धीरे हटा दिया जाता है और तापमान में वृद्धि के साथ उदात्तीकरण की प्रगति के माध्यम से इंटरट्रेकरी पिट झिल्ली स्पष्ट हो जाती है। शेष बड़े ठंढ धूल कणों आगे फ्रीज-etching द्वारा समाप्त किया जा सकता है, लेकिन यह समस्याग्रस्त हो सकता है क्योंकि यह अनावश्यक रूप से जाइलम नाली में बर्फ की सतह के स्तर को कम कर देता है।

अवलोकन की उच्च गुणवत्ता काफी हद तक सटीक नमूना तैयारी के माध्यम से हासिल की है; विशेष रूप से महत्वपूर्ण microtome के एक तेज ब्लेड के साथ सतह smoothing है. एक इस्तेमाल किया ब्लेड द्वारा अपर्याप्त smoothing कभी कभी किसी न किसी सतह पैदा कर सकता है (कहा जाता है "चाकू के निशान", चित्रा 4) या कटौती से धूल की कई घटनाओं. ध्यान से नमूना की सतह की योजना बनाने के बाद, नमूना कक्ष के लिए नमूना के त्वरित हस्तांतरण भी ठंढ गठन की वजह से संदूषण को नष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है।

निगेटिव वाटर कॉलम प्रेशर की छूट के बिना नमूना हिमन के कारण जाइलम कन्ड्यूस में गुहिकायन की कृत्रिम प्रेरण (चित्र5) का कारण होगा। नमूनों के उन नमूनों में संकुलित बर्फ क्रिस्टल पाए गए जिनसे नमूना शिथिल नहीं था (चित्र 5कमें ऐरोहेड्स ), इसके विपरीत, समान जल क्षमता वाले आराम से नमूने में कोई संकुल बर्फ क्रिस्टल नहीं देखे गए ( चित्र 5 बी) यह शंकुधारी पेड़ों (अप्रकाशित डेटा) के बजाय व्यापक पेड़ों के जाइलम में अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है।

Figure 1
चित्र 1: इस प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चार्ट. इस पत्र में वर्णित SEM अवलोकन करने के लिए नमूने से प्रक्रियाओं का प्रवाह दिखाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एंजियोस्पर्म और जिम्नोस्पर्म पेड़ प्रजातियों के अनुप्रस्थ-कट सतहों के उदाहरण क्रायो-सेम माइक्रोग्राफ। जाइलम कोशिकाओं में ग्रे और काले क्षेत्र क्रमशः जाइलम कोशिकाओं के जल स्तंभ में जल और गुहाओं के अनुरूप होते हैं। चूंकि नमूने नमूना संग्रह से पहले तरल नाइट्रोजन के साथ स्थिर थे, cryo-SEM द्वारा छवियों नमूना के क्षण में संयंत्र के पानी की स्थिति और देशी एम्बोलिज्म दिखा. (ए) और (बी): क्रिप्टोमेरिया जैपोनिका (शंकुधारी लकड़ी) के एक वयस्क पेड़ की दो वर्षीय टहनी। टहनी का व्यास 3 मिमी था, और पानी की क्षमता $ 0.39 MPa predawn कटाई पर था. (सी): कार्पिनस tschonoskii के दो वर्षीय गोली मार (कठिन-पोरस लकड़ी) अंकुर (1.4 मीटर ऊंचाई में और बेसल व्यास में 1.1 सेमी). चार दिनों तक सिंचाई की लंबी सीमा के बाद तनाव-आराम की प्रक्रिया के बाद अंकुर का नमूना लिया गया था। लंबे समय तक सूखे के बाद पानी की क्षमता 1.78 एमपीए थी और तनाव-आराम की प्रक्रिया के बाद $0.15 MPa था। Tr: tracheid, आर: रे पैरेन्काइमा, वी: पोत, एफ: फाइबर, एपी: अक्षीय पैरेन्काइमा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: शीत नमूना चरण के तापमान को बढ़ाकर defrost और उत्कीर्णन प्रक्रिया प्रगति. एक क्रिप्टोमेरिया जैपोनिका टहनी (कोनिफेरस वुड) के जाइलम की अनुप्रस्थ-कट सतह। नमूना चरण का घटता तापमान (A) [113.0 ]C, (B) [105.3 ]C, (C) ]101.9 डिग्री सेल्सियस और (D) ]99.7 डिग्री सेल्सियस है। प्रत्येक छवि लगभग 5 मिनट प्राप्त किया गया था के बाद ठंड नमूना चरण के तापमान संबंधित तापमान मूल्य पर निर्धारित किया गया था. यदि अवस्था का ताप लगभग 120 डिग्री सेल्सियस (हमारे उपकरणों के लिए) से ऊपर रखा जाता है तो बर्फ का उदात्तीकरण प्रगति करता है। Tr: tracheid, बी: बॉर्डर पिट जोड़ी, प्रधानमंत्री: गड्ढे झिल्ली. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: चाकू चिह्न उदाहरण. एक क्रिप्टोमेरिया जैपोनिका टहनी (कोनिफेरस लकड़ी) के जाइलम की अनुप्रस्थ-कट सतह तथाकथित चाकू के निशान दिखा रही है। Arrowheads और डैश्ड लाइनों ठेठ चाकू के निशान का प्रतिनिधित्व करते हैं. एक cryostat द्वारा एक नमूने की सतह समाशोधन चाकू ब्लेड के एक अप्रयुक्त भाग द्वारा पूरा किया जाना चाहिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: नाली में जल स्तंभ तनाव की छूट के प्रभाव का उदाहरण। क्रायो-सेम द्वारा मनाया जाने वाला एक कार्पिनस श्नोनोस्की अंकुर (गंदे-पोरस लकड़ी) के तने की अनुप्रस्थ-कट सतह। दिन के दौरान पानी की क्षमता दोनों अंकुरों में समान थी। traspiring अंकुर के स्टेम बरकरार (ए) जमे हुए था, जबकि एक और अंकुर के स्टेम मौजूदा हाइड्रोलिक तनाव (बी) की छूट के बाद जमे हुए था. कटाई में (बी) की जल क्षमता तनाव-आराम की प्रक्रिया के बाद $0.5 MPa थी। पैनल में Arrowheads (ए) जहाजों के भीतर बर्फ क्रिस्टल की कलाकृतियों ठंड रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पत्र में शुरू की गई क्रायो-सेम अवलोकन विधियों को सेलुलर पैमाने पर जल वितरण को स्पष्ट रूप से विज़ुअलाइज़ करने के लिए व्यावहारिक है। इस विधि के माध्यम से, जाइलम के भीतर पानी के वितरण में परिवर्तन की खोज संभावित अजैविक तनाव (पानी की कमी या ठंड) या जैविक तनाव (वृक्ष रोग) के लिए पेड़ प्रजातियों सहिष्णुता के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं।

इस विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूना संग्रह और बाद में नमूना तैयारी के दौरान देशी पानी की स्थिति के जल वितरण विशेषता के संरक्षण है. लंबे नाली (विशेष रूप से रिंग-पोरस पेड़ों के जल्दी लकड़ी जहाजों) के साथ प्रजातियों के जाइलम ऊतक कटाई और ठंड के दौरान आसानी से पानी खो सकते हैं। कोचर एट अल (2000) ने जाइलम के कोंडुइट्स38,41के साथ जल कॉलम में उच्च तनाव के कारण ठंड कलाकृतियों पर चर्चा की है। Umebayashi एट अल (2016) गैर विनाशकारी एमआरआई टिप्पणियों39की तुलना में तनाव-आराम नमूनों की क्रायो-SEM टिप्पणियों की वैधता की पुष्टि की। दोनों प्रेक्षण तकनीकों में जल वितरण का एक समान पैटर्न दिखाया गया है। हालांकि हम अभी भी उच्च हाइड्रोलिक तनाव के तहत ठंड से प्रेरित हवा प्रवेश के खिलाफ प्रजातियों विशेष मजबूती सत्यापित करने की जरूरत है, विश्राम प्रक्रियाओं पानी वितरण के विश्वसनीय आकलन प्रदान करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए, और विशेष रूप से के लिए जल-तनावग्रस्त पौधे।

फ्रॉस्ट और बर्फ कणों विस्तृत अवलोकन करने के लिए महत्वपूर्ण बाधाएं हैं। ठंढ संचय को रोकने के लिए, नमूना वातावरण को उजागर नहीं किया जाना चाहिए जब तक यह क्रायो-सेम नमूना कक्ष से जुड़ा हुआ है। हालांकि नमूना कक्ष में नमूने के हस्तांतरण के दौरान वातावरण के संपर्क को पूरी तरह से रोका नहीं जा सकता है, स्थानांतरण समय कम रखा जाना चाहिए। नमूना धारक की इन्सुलेट स्थानांतरण कंटेनर को ओस संघनन से उत्पन्न ठंढ और बर्फ को रोकने के लिए नमूना धारक और एलएन2 को हटाने के बाद अच्छी तरह से सूख जाना चाहिए।

फ्रीज-एचिंग के लिए समय की उचित लंबाई इस्तेमाल किए गए उपकरणों के प्रदर्शन पर निर्भर करती है। इस का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण कारक नमूना कक्ष में निर्वात स्तर और नमूना चरण के तापमान नियंत्रक की स्थिरता हैं. तापमान के अनुरूप उदात्तीकरण की सीमा को मुख्य रूप से औपचारिक उपयोग से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए। अत्यधिक फ्रीज-इचिंग जाइलम conduits में पानी की उपस्थिति को कम करेगा और यह मुश्किल की पहचान करने के लिए, विशेष रूप से संकीर्ण कोशिकाओं के lumina में कर देगा।

यह यह सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट कदम और प्रयास करता है कि नमूने के विनाशकारी तरीके ठंड, कटाई और ट्रिमिंग प्रक्रियाओं के दौरान कलाकृति घटना से मुक्त हैं। यद्यपि कलाकृतियों की घटना के महत्व को बार-बार बताया जाता है, फिर भी जाइलम नाली में हिमन कलाकृतियों की मात्रा कोपर्याप्तरूप से मान्य नहीं किया गया है । गैर विनाशकारी तरीकों द्वारा आगे सत्यापन तनाव-आराम प्रक्रिया और फ्रीज-निर्धारण की सटीकता की पुष्टि के लिए वांछनीय है। चूंकि सिंक्रोट्रॉन-आधारित जेडसीटी या एमआरआई सिस्टम क्रायो-सेम प्रणाली की तुलना में संयंत्र-जल संबंधों के अध्ययन में पर्याप्त रूप से प्रचलित नहीं है, इसलिए वाणिज्यिक जेडसीटी प्रणाली का अनुप्रयोग संभवतः क्रायो-सेम परिणामों के सत्यापन की प्रगति कर सकता है42 .

हाइड्रोलिक पेड़ लक्षण, जैसे सैप फ्रलक्स, स्टेम सेगमेंट की हाइड्रोलिक चालकता, चालकता की प्रतिशत हानि (पीएलसी), या जाइलम समाई पेड़ के पानी के उपयोग और सूखे के लिए प्रतिरोध के अनुमान प्रदान करते हैं। मानवजनित जलवायु परिवर्तन2के कारण जल तनाव के अंतर्गत वृक्षों के जीवित रहने की भविष्यवाणी करने के लिए प्रजातियों में जल उपयोग की तुलना की आवश्यकता है . Cryo-SEM अवलोकन हाइड्रोलिक सुविधाओं के भीतर परिवर्तन के कारण को स्पष्ट करने के लिए शारीरिक ज्ञान प्रदान करने में कई फायदे हैं. संयंत्र शारीरिक और हाइड्रोलिक अध्ययन के दोनों विनाशकारी और गैर विनाशकारी तरीकों के हाल ही में सुधार एक साथ पेड़ के पानी के उपयोग की प्रकृति की हमारी समझ गहरा कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को जेएसपीएस केकेनही (नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था। 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H20285

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

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पर्यावरण विज्ञान अंक 148 क्रायो-सेम क्रायोस्टैट फ्रीज निर्धारण तनाव छूट जल वितरण जाइलम नाली
वुडी पौधों में Xylem जल वितरण एक Cryo-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना
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Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

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