Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Vann fordelingen fra Xylem i Woody Plants

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

Observere vann fordelingen i xylem gir betydelig informasjon om vannstrømmen dynamikk i Woody planter. I denne studien viser vi den praktiske tilnærmingen til å observere vannfordeling i xylem ved hjelp av en kryostaten og en fryse-SEM, som eliminerer artifactual endringer i vann statusen under prøve forberedelsen.

Abstract

Et skanner elektronmikroskop som er installert på fryse enheten (Frys-SEM) gjør det mulig å observere prøven ved Subzero temperaturer og har blitt brukt til å utforske vannfordeling i plante vev i kombinasjon med fryse fiksering teknikker ved hjelp av flytende nitrogen (LN 2). for Woody arter, men forberedelser for å observere xylem tverrgående-cut overflaten innebære noen vanskeligheter på grunn av retningen av tre fibre. I tillegg kan høyere spenning i vannsøylen i xylem-kanaler av og til forårsake artifactual endringer i vann fordelingen, spesielt under prøve fiksering og-oppsamling. I denne studien, viser vi en effektiv prosedyre for å observere vann fordelingen i xylem av Woody planter in situ ved hjelp av en kryostaten og fryse-SEM. Ved første, under prøvetaking samling, måle xylem vann potensialet bør avgjøre om høy spenning er til stede i xylem rør. Når vann potensialet i xylem er lavt (< ca. − 0,5 MPa), er det nødvendig med en spennings hvile prosedyre for å tilrettelegge for bedre bevaring av vann statusen i xylem-rør under prøve fryse fiksering. Deretter festes en vanntett krage rundt trestammen og fylles med LN2 for fryse fiksering av vann statusen til xylem. Etter høsting, forsiktighet bør utvises for å sikre at prøven er bevart frosset mens fullføre prosedyrene for prøven forberedelse til observasjon. En kryostaten er ansatt for å tydelig avdekke xylem tverrgående overflate. I Freeze-SEM observasjoner, tid justering for fryse-etsing er nødvendig for å fjerne frost støv og fremheve kanten av celleveggene på visningsflaten. Våre resultater viser anvendelsen av fryse-SEM teknikker for observasjon av vann distribusjon innen xylem på mobilnettet og subcellulære nivåer. Kombinasjonen av fryse-SEM med ikke-ødeleggende in situ observasjon teknikker vil dypt forbedre utforskningen av Woody plante vannstrømmen dynamikk.

Introduction

Tilgjengelighet av vannressurser (dvs. nedbør, jord vanninnhold) avgjør strengt dødelighet og Geografisk fordeling av plantearter, siden de trenger å absorbere vann fra jorda og transportere den til bladene for fotosyntetiske produksjon. Planter må opprettholde sitt vann transport system under varierende vannforsyninger. Spesielt, Woody planter generere høye spenninger i sine kanaler langs transpirasjon bekker som, i noen tilfeller, de trenger for å holde sin krone mer enn ~ 100 m over bakken. For å opprettholde vannsøyler under så høyt negativt trykk, består xylem-kanalene av et kontinuum av rørformede celler med stive og hydrofobe lignified celle vegger1. Sårbarheten for å xylem dysfunksjon av xylem-kanaler i hver art er en god avgjørende faktor for arten overlevelse under varierende vannforsyning2. I tillegg studere vann status xylem energibærere er viktig for evalueringen av helsetilstanden til enkelte trær utsatt for abiotiske eller biotiske påkjenninger. Måler SAP flyte eller vann muligheter kanne skaffe anslår av en Woody plante ' vann rang på grunn av det integrert hydraulisk funksjonen av xylem rør. Videre kan visualisering av vann fordelingen i xylem-cellene avklare tilstanden til de enkelte komponentene i hydraulikksystemet i xylem.

Flere teknikker for å visualisere vannet status for xylem energibærere finnes3. Den klassiske og nyttige metoder for å observere vann trasé i Woody vev innebære farging av vannsøylen ved å senke endene av kuttet grener i et fargestoff eller ved å injisere et fargestoff i stående trestammer4. Soft x-ray Photography også tillater visualisering av vann distribusjon av skiver av tre plater på grunn av differensial X-ray absorpsjon intensiteten av fuktigheten i xylem5,6. Disse metodene, men bare gi spor av vann bevegelse eller demonstrere makroskopisk distribusjoner av vann. Nylig, ikke-destruktive observasjons teknikker, slik som Micro Focus X-ray beregnet tomografi (benvolum)7,8,9,10og magnetisk resonans imaging (MRI)11, 12, har blitt betydelig forbedret for å tillate observasjon av vann i xylem-kanaler innenfor intakt saplings. Disse ikke-destruktive metoder har store fordeler i at vi kan observere xylem ' s vann status uten kunstige skjære effekter, og vi kan spore vannstrømmen dynamikk ved sekvensiell Imaging eller innføre en kontrast agent10. Men vi trenger å bruke en tilpasset MRI for anlegget Imaging eller et spesialisert anlegg for Synchrotron-baserte Benvolum for å få bilder som kan identifisere cellulære nivå vanninnhold. I tillegg, selv om den Synchrotron-baserte benvolum system aktivert for å oppnå fine bilder med høy romlig oppløsning, som kan sammenlignes med lys mikroskopi7,8,9, kan levende celler bli skadet av stråling av høy energi X-ray13,14. Ansette en skanning elektronmikroskop der fryse-enheter er installert (fryse-SEM) er en svært nyttig metode for nøyaktig lokalisering av vann i xylem på cellenivå, selv om dette krever ødeleggende måte høsting prøven for observasjon. For å fikse vannet i xylem-kanaler, er en del av stilkene (dvs. kvister, grener eller stengler) frosset in situ av flytende nitrogen (LN2). Observasjoner av overflaten av trimmet, frosne eksemplarer av fryse-SEM gir svært forstørret bilder av xylem strukturen som vi kan identifisere vannet i xylem energibærere som is. En betydelig begrensning av denne metoden er at sekvensiell observasjon av vann bevegelighet innenfor samme prøve er umulig. Imidlertid er anvendelsen av Benvolum eller MRI for sekvensiell observasjon av trær som bor i et felt ekstremt utfordrende fordi disse instrumentene ikke er bærbare. I kontrast, har fryse-SEM et potensial for å bruke denne teknikken på store trær i feltet eksperimenter for å tydelig visualisere vanninnholdet på ikke bare cellenivå, men også på et finere struktur nivå, for eksempel vann i intervascular groper15, vann i intercellulære mellomrom16, eller bobler i vann kolonne17.

Mange studier observere xylem Water av fryse-SEM har blitt rapportert 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) etablerte først protokollen for observasjon av xylem in situ ved å fryse-fiksering av en levende stamme via fylling LN2 inn i en beholder satt på stammen21. Temperaturen på prøven ble opprettholdt under-20 ° c under prøvetaking og under fryse-SEM forberedelse for å unngå å smelte isen i xylem-kanaler. Denne metoden har blitt brukt til å observere vannet i xylem for å klargjøre vann fordelingen under skiftende vannregime11,12,24,25,26, 27,28, den sesongmessige variasjonen av vann distribusjon21,29,30, effekten av fryse-tine sykluser17,31, 32, fordelingen av vann i vått tre5, endringer i vann fordelingen under overgangen fra yteved til kjerne ved20, sesongmessige tid løpet av cambial aktivitet og differensiering av fartøy33, og kavitasjon indusert av visse biotiske spenninger23,34. Hydrauliske ledningsevne og rør sårbarhet for kavitasjon har også blitt verifisert ved hjelp av fryse-SEM35,36. Den er utstyrt med energi dispersive X-ray-massespektrometri (EDX eller EDS) som har blitt brukt til å studere element fordeling over overflaten av en prøve som inneholder vann37.

Freeze-fiksering av en levende stamme som inneholder rør under høy hydraulisk spenning noen ganger fører til kunstige kavitasjoner som er observert av Frys-SEM som brukket iskrystaller i lumen av energibærere38,39. Spesielt er løvtrær arter med lengre og bredere energibærere sårbare for spennings induserte artefakter, slik som kavitasjon forårsaket av prøve kutting, selv om det ble utført under vann3,40. Kavitasjon artefakter blir iøynefallende etter prøvetaking av et transpiring tre (dvs. prøvetaking i løpet av dagtid) eller under alvorlige tørke forhold, og de kan villede til en overvurdering av kavitasjon forekomst3,38, i 39. Derfor må spenningen som arbeider i energi rør frigis for å unngå artifactual kavitasjon3,12,39.

Den fryse-brudd teknikk ved hjelp av en kniv installert i et prøve kammer er ofte brukt for å avdekke prøveoverflaten for Freeze-SEM observasjon. Men fryse-brukket flyene av Woody plante vev, spesielt tverrgående deler av sekundær xylem, er for grovt til å tydelig observere Anatomiske egenskaper og vann i vevet6. Anvendelsen av en kryostaten for trimming av en prøve tillater rask og høy kvalitet utarbeidelse av prøve overflater20,23. Det overordnede målet med denne metoden er å gi bevis med elektron mikroskopi oppløsning av vann fordelingen i ulike typer xylem-celler in situ uten forekomst av prøvetaking gjenstander. Vi introduserer vår oppdaterte prosedyre, som har blitt stadig bedre siden vi først vedtok det, om prøvetaking, trimming og rengjøring av prøveoverflaten for å oppnå høy kvalitet elektron micrographs av fryse-faste prøver av xylem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: et skjematisk diagram av denne protokollen er vist i figur 1.

1. prøvetaking: strekk avslapping innen Vannsøyle av Xylem energibærere

Merk: følgende spenning avslapping behandling anbefales før LN2 -programmet for å unngå både frysing og spenning-indusert gjenstander i xylem vann fordelingen.

  1. Legg en gren og blader for prøvetaking med en svart plastpose for å likevekt vann potensialet mellom xylem og etterlater mer enn to timer før prøvetaking.
  2. Bestem vann potensialet til minst to blader fra prøven ved hjelp av et trykk kammer eller en psykrometer. Når vann potensialet er høyere enn ca. − 0,5 MPa (dvs. ingen eller svært lav spenning eksisterer), kan en prøve høstes etter frysing (se avsnitt 2: fryse fiksering). Når vann potensialet er lavere enn − 0,5 MPa, trengs en behandling for avslapping som beskrevet nedenfor.
  3. Fest en vanntett krage rundt stammen for å bli fylt med vann. En plast kopp uten bunn kan tjene som en vanntett krage. Forsiktighet bør utvises for å tett forsegle mellomrommene mellom stammen og kragen ved hjelp av en klebrig tape for å hindre lekkasje av flytende medier som brukes senere. For høsting fleksible stengler som tynne grener eller kvister, synke en klippe del i en vann fylt bøtte ved å bøye stammen. Skjær under vannflaten ved hjelp av beskjæringssakser eller en SAG. Overfør prøven til en annen beholder med vann så raskt som mulig for å minimere utsette kutte enden til luft.
  4. Hold snitt enden av prøven under vann. For løvtrær arter, sikre at lengden fra stedet der en fryse-prøve for SEM vil bli innhentet til kutt kanten av høstes stammen er lengre enn prøvene ' maksimale fartøy lengde for å hindre spenning-indusert gjenstander i fryse prøve.
  5. Dekk prøven som inneholder blader med en svart plastpose for å redusere transpirasjon. Hold kutte enden av prøven i vannet og opprettholde denne tilstanden i ca 30 min for å slappe av xylem spenning. Unngå en lengre avslapning tid (> 1 t) på grunn av mulig kunstig påfylling av cavitated rør12.
  6. Mål vannet potensialet igjen for å bekrefte avslapning av xylem spenning (nesten 0 MPa).
    Merk: før prøvetaking bør maksimal beholder lengde for mål arten undersøkes eller fastslås med lignende prøver ved hjelp av luft injeksjons metode. Når prøvetaking et stort tre, eller en stor gren, er det vanskelig å gjennomføre spenning-avslapping prosedyrer som er beskrevet ovenfor. Derfor må prøvene fra store trær samles i grålysningen perioden når vann potensialet i xylem er høyere.

2. fryse fiksering med LN2

  1. Klipp og åpne den ene siden av en vanntett krage med saks eller en verktøy kniv. Fest kragen tett rundt stammen med en selvklebende tape mens du holder blenderåpningen horisontalt.
  2. Bruk isolerende hansker/vott, men sørg for å holde flasken med LN2 trygt, og Kjør ln2 inn i kragen for å fylle den med ln2. Hold den fylt av stadig å legge LN2 til helt fryse vannet i xylem. Tiden som kreves for frysing er avhengig av utvalgsstørrelsen; 1 min etter koking av helte LN2 har stoppet er tilstrekkelig for en liten kvist eller frøplante, mens mer enn 20 min er nødvendig for en stilk av et større tre20. Legg LN2 kontinuerlig under frysing som fordamper raskt på grunn av store temperaturforskjeller mellom ln2 og omgivelsestemperaturer.
  3. Løsne kragen fra den frosne delen av prøve stammen for å fjerne LN2 etter tilstrekkelig fryse tid. Pass på å bruke isolerende hansker for å unngå kontakt med potensielle LN2 søl forårsaket ved å løsne kragen.
  4. Høste prøven med en fin håndsag umiddelbart.
  5. Dekk den frosne prøven med et stykke aluminiumsfolie eller putte den inn i en prøve tube, som sample ID-numre er skrevet. Plasser høstet prøven raskt i en beholder fylt med LN2 eller Pakk inn i en isolert boks fylt med tørr is.
  6. Oppbevar prøvene i en dyp fryseboks til observasjon. Den foretrukne lagrings temperaturen er − 80 ° c for å forhindre is sublimering og omkrystallisering under lagring.

3. forberedelse av prøver

Merk: for observasjon må et utvalg beskjæres og overflaten for observasjon må planlegges ved Subzero temperatur for å holde vann fordelingen i sin xylem in situ. En biologisk mikrotomen med et kryostaten system (kryostaten) er ideell for trimming og utsette overflaten av en prøve i denne type observasjon av fryse-SEM.

  1. Still inn temperaturen på prøvekammeret på kryostaten til − 30 ° c, som vanligvis er kaldt nok til å holde xylem SAP av de fleste plantene i en frossen tilstand.
  2. Trim en prøve i et lite stykke (< ca. 2 cm i høyden og < ca. 1 cm i bredde eller diameter) som kan justeres for prøve holderen til en fryse-SEM. Bruk en skarp kniv eller en fin tann sag til trimming for å unngå å bryte isen i prøven. I tilfelle av et større utvalg som ikke kan kuttes med en kniv, raskt pre-cut med en avkjølt så i en fryseboks.
  3. Fest trimmet stykket til en Chuck, en holder for en kryostaten ved å montere på en vev frysing embedding medium (f. eks, OCT sammensatte) for Frys-snitting. Fest deretter Chuck til en prøve innehaver av en mikrotomen på kryostaten.
  4. Trim overflaten ved å gjentatte ganger barbering med 5 – 7 μm seksjoner i tykkelse. Trimming ved å kutte bort mer enn 1 000 til 2 000 μm, i total dybde fra den første overflaten på prøvetaking samling, er nyttig for å eliminere den skadede delen av prøven forårsaket av pre-skjæring med en kniv eller sag som beskrevet i trinn 3,2.
  5. Etter at du har trimming en overflate av prøven, justerer du den ubrukte delen av mikrotomen over overflaten på prøven. Ikke la bladet berøre prøven som ville overskride tykkelse innstillingen.
  6. Før det første kuttet av den ubrukte kniven delen, utvide litt avstanden mellom overflaten av prøven og bladet.
  7. Klipp bare overflaten av prøven én eller to ganger. Videre skyver du kniven igjen for å justere en ubrukt blad del på prøveoverflaten.
  8. Gjenta trinn 3,6 og 3,7 tre eller fire ganger. Dette er viktig for å få en klar overflate uten "kniv merker" (Figur 4).
  9. Etter siste kutt, sett kniven posisjon langt fra prøven for å hindre støv fra å stikke på prøven.
  10. Løsne Chuck fra prøveholderen og løsne prøven fra Chuck ved å fjerne det frosne bygge mediet med en skarp kniv. Sørg for at prøven er plassert i kryostaten kammeret for å hindre at den planlegges overflaten mot frost støv.
  11. Fest prøven til en fryse-SEM prøve holder med en vev frysing embedding medium i kryostaten kammeret.

4. overføring til Prøvekammeret til fryse-SEM

Merk: overflaten – tilberedt prøve må beskyttes mot en økning i temperatur eller akkumulering av frost under overføringen fra kryostaten kammeret til observasjons fasen i prøvekammeret til fryse-SEM.

  1. Oppretthold den kalde scene temperaturen i prøvekammeret til fryse-SEM ved lavere enn – 120 ° c med LN2 i henhold til utstyrets bruksanvisning.
  2. Sett prøveholderen med den tilberedte prøven inn i en isolerende beholder fylt med LN2 i kryostaten kammeret.
  3. Hold prøveholderen med et prøve bytte stav under LN2. Unngå å utsette prøveholderen til luft når det er mulig.
  4. Sett prøveholderen raskt til pre-evakuering kammeret i fryse-SEM prøve kammer så snart som starter evakuering av pre-evakuering kammeret. Deretter plasserer du prøveholderen på den kalde scenen etter at luften er fullstendig evakuert. Selv om litt frost akkumulering er uunngåelig, kan "fryse-etsing"-prosedyren (trinn 6) fjerne den.

5. innstilling i SEM

Merk: typiske innstillinger for observasjon er beskrevet nedenfor. Noen modifikasjoner er nødvendig avhengig av vakuum tilstand eller elektronstråle.

  1. Angi SEM-parametere for observasjon som følger:
    Akselerasjon spenning: 3 – 5 kV
    Temperatur på prøve trinnet: < − 120 ° c
    Detektor: sekundær emisjon

6. Frys-etsing

Merk: Frys-etsing er prosedyren for å accentuating kanten av prøven celle vegger ved liten iskrystall sublimering. Freeze-etsing innebærer også fjerning av overflate frost støv.

  1. Slå på akselerasjons spenningen til den elektriske pistolen under fryse-etsing. Det er bedre å gjennomføre fryse-etsing mens observere prøven.
  2. Hev temperaturen på prøve etappen til − 100 ° c.
  3. Vent i flere minutter før frost støv er fjernet og overflaten nivå av isen i xylem-celler har sunket litt i forhold til celleveggene.
  4. Senk temperaturen på prøve etappen til − 120 ° c.
    Merk: Hvis det ikke er installert en temperatur kontroller for prøve trinnet, holder du prøven ved hjelp av utvekslings stangen og løsner den fra prøve etappen i noen minutter. Legg merke til prøven flere ganger under denne fryse-etsing-prosessen for å verifisere sublimering status for prøven.

7. metal coating (valgfritt)

Merk: nylige forbedringer av SEM-instrumentet og bildebehandling kan gi høy kvalitet bilder av elektriske isolerende eksemplarer uten metall belegg. Imidlertid er ikke-ledende prøver, slik som biologiske materialer, noen ganger gjenstand for kostnader; høyere lysstyrke ved bestemte posisjoner på prøven på grunn av akkumulering av elektroner ("lading"). Utsette prøven til elektron bjelker for en lengre periode eller for en høy forstørrelse, øker ladingen effekter. Coating overflaten av prøven med elektrisk ledende Metallmaterialer hindrer forekomsten av lading. Bruk vakuum belegg systemet som er installert i fryse-SEM-enheten for å hindre at temperaturen i prøven øker under belegget.

  1. Sørg for at beleggmaterialet er installert på en utpekt fordamper hodet av belegget systemet.
  2. Oppretthold temperaturen på den kalde fasen i belegg systemet under − 170 ° c.
  3. Plasser prøveholderen på den kalde fasen av belegg systemet etter tilstrekkelig fryse-etsing.
  4. Åpne en partisjon mellom den kalde scenen og fordamperen hodet.
  5. Still inn den gjeldende verdien og spenningsverdien til fordamper hodet ved henholdsvis ca. 30 mA og ca. 5 V.
  6. Fordampe belegg materiale for ca. 30 s for å belegge overflaten av prøven.
  7. Sett begge strøm-og spennings verdiene til fordamperen hodet på null og Lukk partisjonen.
  8. Plasser prøveholderen på det kalde stadiet i prøvekammeret for observasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative bilder av tverrgående overflater av bartre og løvtrær Tree xylem, observert av fryse-SEM, er vist i figur 2. Ved lav forstørrelse, viser det svarte området i bildene hulrom som vannet helt eller delvis forsvinner, og det grå området indikerer xylem celle vegger, cytoplasma, og vann (figur 2A). Ved høy forstørrelse, er det tydelig at vannet ikke er helt tapt fra Lumina av tre tracheids, indikerer forekomsten av makro bobler i xylem SAP in situ (figur 2B). Med hensyn til løvtrær arter, er kavitasjon forekomst lett oppdages i fartøy, mens vann eksistens er vanskelig å skille innenfor fibre, spesielt ved lav forstørrelse (figur 2C). Cytoplasma i parenchyma celler kan skilles fra vann i trahceids eller fartøy gjennom isen vanlig teksturer (f. eks figur 2b).

Effekten av temperatur på fryse-etsing prosessen er vist i Figur 3. Frost støv er gradvis fjernet og intertracheary pit membraner bli klarere gjennom progresjon av sublimering med økende temperatur. Resterende store frost støvpartikler kan elimineres ved ytterligere fryse-etsing, men dette kan være problematisk som det unødvendig reduserer overflaten-nivået av is i xylem energibærere.

Den høye kvaliteten på observasjon er i stor grad oppnås gjennom nøyaktig prøveforberedelse; spesielt viktig er å jevne overflaten med et skarpt blad av mikrotomen. Utilstrekkelig utjevning av en brukt-blad kan noen ganger forårsake grov overflate (kalt "kniv merker", Figur 4) eller en rekke forekomster av støv fra kuttene. Etter at prøveoverflaten er nøye planlagt, er rask overføring av prøven til prøvekammeret også avgjørende for å eliminere forurensninger forårsaket av frost dannelse.

Sample frysing uten avslapning av negative Vannsøyle trykket vil føre artifactual induksjon av kavitasjon i xylem-kanaler (figur 5). I klynger ble det observert iskrystaller i fartøy med prøver der prøven ikke var avslappet (pilspisser i figur 5A), contrastingly, ingen grupperte iskrystaller ble observert i avslappede prøve prøver med et lignende vann potensiale ( Figur 5 B). Dette har en tendens til å være mer signifikant i xylem av løvtrær trær i stedet for i bartrær (upubliserte data).

Figure 1
Figur 1: et skjematisk diagram av denne protokollen. Flyten av prosedyrer fra prøvetaking til SEM observasjon beskrevet i denne utredningen er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempel micrographs av de tverrgående overflater av Dekkfrøede planter og Nakenfrøede treslag. Grå og svarte områder i xylem celler tilsvarer vann og hulrom i vannsøylen av xylem celler, henholdsvis. Siden prøvene var fryse-fast med flytende nitrogen før prøvetaking samling, bildene av Frys-SEM viser anleggets vann status og innfødte emboli i øyeblikket av prøvetaking. (A) og (B): to år gamle kvist av et voksent tre av Cryptomeria japonica (bartre). Diameteren av kvist var 3 mm, og vann potensialet var − 0,39 MPa ved grålysningen høsting. (C): to år gamle skyte av Carpinus tschonoskii (diffus-porøse tre) frøplante (1,4 m i høyde og 1,1 cm i basal diameter). Den frøplante ble samplet etter spenning-avslapping prosedyre etter forlenget begrensning av vanning i fire dager. Vann potensialet var − 1,78 MPa etter langvarig tørke og var − 0,15 MPa etter spenning-avslapping-prosedyren. TR: tracheid, R: Ray parenchyma, V: fartøy, F: fiber, AP: aksial parenchyma. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: avriming og etsing av prosedyre progresjon ved å heve temperaturen på det kalde prøve stadiet. Tverrgående overflate av xylem av en Cryptomeria japonica kvist (bartre). Den synkende temperaturen i prøvefasen er (A) − 113,0 ° c, (B) − 105,3 ° c, (C) − 101,9 ° c og (D) − 99,7 ° c. Hvert bilde ble oppnådd ca 5 min etter at temperaturen på det kalde prøve stadiet ble innstilt ved den respektive temperatur verdien. Ice sublimering skrider frem hvis temperaturen på scenen opprettholdes over ca − 120 ° c (for vårt utstyr). TR: tracheid, B: avgrenset pit pair, PM: pit membran. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel på kniv merke. Tverrgående overflate av xylem av en Cryptomeria japonica kvist (bartrær) som viser såkalte kniv merker. Pilspisser og stiplede linjer representerer vanlige kniv merker. Å tømme overflaten av en prøve med en kryostaten skal fullføres av en ubrukt del av knivbladet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: eksempel på effekten av avslapning av vannet kolonnen spenningen i energibærere. Tverrgående overflate av stammen av en Carpinus tschonoskii frøplante (diffus-porøs tre) observert av fryse-SEM. Vannet potensialet på dagtid var lik i begge frøplanter. Stammen av transpiring frøplante var frosset intakt (A), mens stammen av en annen frøplante var frosset etter avslapping av eksisterende hydraulisk spenning (B). Vann potensialet i (B) ved høsting var − 0,5 MPa etter spenningen-avslapping prosedyren. Pilspisser i panel (A) fryser gjenstander av iskrystaller i fartøy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

The fryse-SEM observasjon metoder innført i dette papiret er praktisk for å tydelig visualisere vann fordelingen på en mobilnettet skala. Gjennom denne metoden, utforske endringene i fordelingen av vann i xylem kan potensielt bidra til å avklare mekanismen av treslag toleranse for abiotiske stress (vannmangel eller frysing) eller biotiske stress (tre sykdom).

Det mest avgjørende skritt i denne metoden er å bevare vann fordelingen karakteristisk for den innfødte vann status under prøvetaking samling og påfølgende prøve forberedelser. Xylem vev av arter med lange kanaler (spesielt earlywood fartøy av ring-porøse trær) kan lett miste vann under høsting og frysing. Cochard et al. (2000) har diskutert fryse gjenstander på grunn av høy spenning i vannsøylen langs xylem-kanaler38,41. Umebayashi et al. (2016) bekreftet gyldigheten av fryse-SEM observasjoner av spenning-avslappede prøver i forhold til ikke-destruktive MRI-observasjoner39. Begge observasjons teknikker viste et lignende mønster av vann distribusjon. Selv om vi fortsatt trenger å verifisere Art-spesifikk robusthet mot luft-oppføring indusert ved frysing under høy hydraulisk spenning, bør avslapping prosedyrer gjennomføres for å gi pålitelige estimater av vann distribusjoner, og spesielt for vann-stresset planter.

Frost og is partikler er betydelige hindringer for detaljert observasjon. For å unngå frost oppsamling bør ikke prøven utsettes for atmosfæren før den er festet til prøvekammeret til fryse-SEM. Selv om eksponering for atmosfæren ikke kan forhindres helt under overføringen av prøven til prøvekammeret, bør overføringstiden holdes kort. Den isolerende overførings beholderen på prøveholderen skal tørkes godt etter at prøveholderen er fjernet og LN2 for å unngå frost og is som stammer fra dugg kondens.

Den passende tidslengden for fryse-etsing avhenger av ytelsen til instrumentene som brukes. Viktige faktorer for å bestemme dette er vakuumnivået i prøvekammeret og stabiliteten til temperatur kontrolleren til prøve stadiet. Omfanget av sublimering som tilsvarer temperaturen bør først og fremst vurderes før formell bruk. Overdreven fryse-etsing vil dempe tilstedeværelsen av vann i xylem-kanaler og gjøre det vanskelig å bli identifisert, spesielt i Lumina av smale celler.

Det tar konkrete skritt og innsats for å sikre at destruktive metoder for prøvetaking er fri for gjenstand forekomst under frysing, høsting og trimming prosedyrer. Selv om betydningen av forekomsten av artefakter er ofte påpekt, graden av forekomst av frysing gjenstander i xylem energibærere har ikke vært tilstrekkelig validert38,39. Ytterligere validering av ikke-destruktive metoder er ønskelig for å bekrefte nøyaktigheten av spenningen-avslapping prosedyre og fryse-fiksering. Siden Synchrotron-baserte Benvolum-eller MRI-systemer ikke har vært tilstrekkelig utbredt i studiet av plante-vann-forhold i forhold til fryse-SEM-systemet, kan anvendelsen av et kommersielt Benvolum-system muligens utvikle valideringen av fryse-SEM-resultater42 .

Hydrauliske tre egenskaper, for eksempel SAP Flux, hydraulisk ledningsevne av stammen segmenter, prosentvis tap av ledningsevne (PLC), eller xylem kapasitans gi anslag over treet vann bruk og motstand mot tørke. Sammenligning av vann bruk blant arter er nødvendig for å forutsi treet overlevelse under vann stress forårsaket av menneskeskapte klimaendringer2. Den har mange fordeler med å gi anatomiske kunnskaper for å avklare årsaken til endringer i hydrauliske funksjoner. Den nylige forbedringer av både destruktive og ikke-destruktive metoder for plante anatomiske og hydrauliske studier kan sammen utdype vår forståelse av innholdet i treet vann bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI (nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Tags

Environmental Sciences Frys-SEM kryostaten fryse fiksering spenning avslapping vann distribusjon xylem rør
Vann fordelingen fra Xylem i Woody Plants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter