Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Xylem Распределение воды в Древесных растениях, визуализированных с крио-сканирования электронный микроскоп

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

Наблюдение за распределением воды в ксилеме дает важную информацию о динамике потока воды в древесных растениях. В этом исследовании мы демонстрируем практический подход к наблюдению за распределением воды ксилем на месте с помощью криостата и крио-SEM, который устраняет артефактные изменения в состоянии воды во время подготовки образца.

Abstract

Сканирующий электронный микроскоп, установленный крио-единица (крио-SEM), позволяет наблюдать за образцами при минусовых температурах и используется для изучения распределения воды в тканях растений в сочетании с методами замораживания фиксации с использованием жидкого азота (LN 2). Для древесных видов, однако, препараты для наблюдения ксилем поперечной огранки поверхности связаны с некоторыми трудностями из-за ориентации древесных волокон. Кроме того, более высокое напряжение в колонке воды в ксилемских каналах иногда может привести к артефактным изменениям в распределении воды, особенно во время фиксации и сбора проб. В этом исследовании мы демонстрируем эффективную процедуру наблюдения за распределением воды в ксилеме древесных растений на месте с помощью криостата и крио-SEM. Во-первых, во время сбора образцов, измерения потенциала воды ксилем аможет должен определить, присутствует ли высокое напряжение в ксилемских каналах. При низком потенциале ксилема воды (злот; около 0,5 МПа), процедура релаксации напряжения необходима для содействия лучшему сохранению состояния воды в ксилемских каналах во время фиксации замораживания образцов. Далее, водонепроницаемый воротник крепится вокруг ствола дерева и заполнен ы LN2 для замораживания фиксации состояния воды ксилем. После сбора урожая следует позаботиться о том, чтобы образец сохранялся замороженным при завершении процедур подготовки образца к наблюдению. Криостат используется, чтобы четко разоблачить поперечную поверхность ксилема. При крио-SEM-наблюдениях требуется корректировка времени для замораживания травления для удаления ледяной пыли и акцентирования края стенок клеток на смотровой поверхности. Наши результаты демонстрируют применимость крио-SEM методов для наблюдения распределения воды в xylem на клеточном и субклеточном уровнях. Сочетание крио-SEM с неразрушающими методами наблюдения на месте позволит значительно улучшить изучение динамики потока воды древесных растений.

Introduction

Наличие водных ресурсов (т.е. осадки, содержание воды в почве) строго определяет смертность и географическое распределение видов растений, поскольку им необходимо поглощать воду из почвы и транспортировать ее в листья для фотосинтетического производства. Растения должны поддерживать свою систему водного транспорта под колеблющимися запасами воды. В частности, древесные растения создают высокую напряженность в своих каналах вдоль транспирационных потоков, поскольку в некоторых случаях им необходимо удерживать свою корону на высоте более 100 м над землей. Для поддержания столбов воды при таком высоком отрицательном давлении ксилемные каналы состоят из континуума трубчатых клеток с жесткими и гидрофобно-лигнированными клеточными стенками1. Уязвимость ксилем дисфункции ксилем каналов в каждом виде является хорошим детерминантом выживания видов при колебаниях водоснабжения2. Кроме того, изучение водного состояния ксилемных каналов имеет важное значение для оценки состояния здоровья отдельных деревьев, подвергающихся абиотическим или биотическим стрессам. Измерение потока сока или водного потенциала может дать оценку состояния воды древесного растения в связи с интегрированной гидравлической функцией ксилемовых каналов. Кроме того, визуализация распределения воды в клетках ксилема может прояснить состояние отдельных компонентов ксилемской гидравлической системы.

Несколько методов для визуализации состояния воды ксилем каналов существуют3. Классические и полезные методы наблюдения водных путей в древесной ткани включают окрашивание водного столба путем погружения концы разрезающих ветвей в краситель или путем введения красителя в стоячие стебли деревьев4. Мягкая рентгеновская фотография также позволяет визуализировать распределение воды нарезанных деревянных дисков из-за дифференциальной интенсивности поглощения рентгеновского излучения влаги в xylem5,6. Эти методы, однако, только обеспечивают следы движения воды или демонстрируют макроскопические распределения воды. В последнее время, неразрушающие методы наблюдения, такие как микрофокус рентгеновская компьютерная томография (ККТ)7,8,9,10и магнитно-резонансная томография (МРТ)11, 12, были значительно улучшены, чтобы позволить наблюдения воды в ксилем каналов в нетронутых саженцев. Эти неразрушающие методы имеют большие преимущества в том, что мы можем наблюдать состояние воды xylem без искусственных эффектов резки, и мы можем отслеживать динамику потока воды путем последовательной визуализации или введения контрастного агента10. Тем не менее, мы должны использовать индивидуальные МРТ для визуализации растений или специализированное средство для синхротронной основе ККТ для того, чтобы получить изображения, которые могут определить содержание воды клеточного уровня. Кроме того, хотя синхротронная система ЗКТ позволила получить тонкие изображения с высоким пространственным разрешением, что сопоставимо с световой микроскопией7,8,9, живые клетки могут быть повреждены излучение высокой энергии рентген13,14. Использование сканирующего электронного микроскопа, в котором установлены крио-единицы (крио-SEM), является очень полезным методом для точного определения местонахождения воды в ксилеме на клеточном уровне, хотя для этого требуется разрушительное сбор образца для наблюдения. Для фиксации воды в ксилем-каналах часть стеблей (т.е. ветки, ветви или стебли) замораживаются наместе жидким азотом (LN 2). Наблюдения за поверхностью обрезанных, замороженных образцов крио-SEM обеспечивают высокоувеличенные изображения структуры ксилема, из которой мы можем определить воду в ксилемских каналах как лед. Существенным ограничением этого метода является то, что последовательное наблюдение за подвижностью воды в пределах одного образца невозможно. Тем не менее, применение ККТ или МРТ для последовательного наблюдения за деревьями, которые живут в поле является чрезвычайно сложной задачей, поскольку эти инструменты не являются портативными. В отличие от этого, крио-SEM имеет потенциал для использования этой техники на больших деревьях в полевых экспериментах, чтобы четко визуализировать содержание воды не только на клеточном уровне, но и на более тонком уровне структуры, например, вода в межсосудистых ямах15, вода в межклеточные пространства16, или пузырьки в колонке воды17.

Многие исследования наблюдения ксилем воды крио-SEM были зарегистрированы 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) первоначально установили протокол для наблюдения xylem in situ путем замораживания-фиксации живого ствола через заполнение LN2 в контейнер, установленный на стебель21. Температура образца сохранялась ниже -20 градусов по Цельсию во время сбора образцов и во время подготовки крио-SEM, чтобы избежать таяния льда в ксилемских каналах. Этот метод был использован для наблюдения за водой в ксилеме для уточнения распределения воды при изменении водного режима11,12,24,25,26, 27,28, сезонные колебания распределения воды21,29,30, эффект заморозки оттепели циклов17,31, 32, распределение воды во влажной древесине5, изменения в распределении воды во время перехода от заболоня к heartwood20, сезонный курс времени камбиальной активности и дифференциации сосудов33, и кавитации индуцированных определенных биотических стрессов23,34. Гидравлическая проводимость и уязвимость каналов к кавитации также были проверены с помощью крио-SEM35,36. Cryo-SEM, оснащенный энергетической диспергивной рентгено-рентгенометрической спектрометрией (EDX или EDS), был использован для изучения распределения элементов на поверхности образца, содержащего воду37.

Замораживание-фиксация живого ствола, который содержит каналы под высоким гидравлическим напряжением, иногда вызывает искусственные кавитации, которые наблюдаются крио-SEM как сломанные кристаллы льда в просвете проводников38,39. В частности, широколинейшие виды с более длинными и широкими каналами уязвимы для артефактов, вызванных напряженностью, таких как кавитация, вызванная вырубкой образцов, даже если она проводится под водой3,40. Артефакты кавитации становятся заметными после отбора проб транспирирующегося дерева (т.е. выборки в дневное время) или в условиях сильной засухи, и они могут ввести в заблуждение к завышению кавитации возникновения3,38, 39. Таким образом, напряжение, работая в каналах должен быть освобожден, чтобыизбежать артефактной кавитации 3,12,39.

Техника замораживания-перелома с помощью ножа, установленного в камере образца, часто используется для того, чтобы обнажить поверхность образца для наблюдения крио-SEM. Однако, замерзать-раздробленные плоскости древесных тканей завода, специально поперечные разделы вторичного xylem, слишком грубы для того чтобы ясно наблюдать анатомические характеристики и воду в ткани6. Применение криостата для обрезки образца позволяет быстро и качественно подготовить образец поверхностей20,23. Общая цель этого метода является предоставление доказательств с электронной микроскопии разрешение распределения воды в различных видах клеток ксилем на месте без возникновения выборок артефактов. Мы вводим нашу обновленную процедуру, которая постоянно совершенствуется с тех пор, как мы впервые ее приняли, в отношении отбора проб, обрезки и очистки поверхности образца для получения высококачественных электронных микрографов крио-фиксированных образцов ксилема.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая диаграмма этого протокола показана на рисунке 1.

1. Отбор проб: Напряжение Релаксация в пределах колонки воды Xylem Conduits

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее лечение релаксации напряжения рекомендуется перед приложением LN2, чтобы избежать как замораживания, так и напряжённых артефактов в распределении воды ксилема.

  1. Приложить ветка и листья для отбора проб с черным полиэтиленовым пакетом, чтобы уравновесить водный потенциал между ксилем и листья более чем за два часа до отбора проб.
  2. Определите водный потенциал по крайней мере двух листьев из образца с помощью камеры давления или psychrometer. Когда водный потенциал выше, чем около 0,5 МПа (т.е. нет или очень низкое напряжение существует), образец может быть собран после замораживания (обратите сью (обратите сью р. 2: Замораживание фиксации). Когда водный потенциал ниже, чем 0,5 МПа, лечение для релаксации необходимо, как описано ниже.
  3. Исправить водонепроницаемый воротник вокруг стебля для того, чтобы быть заполнены водой. Пластиковый стаканчик без дна может служить водонепроницаемым воротником. Следует позаботиться о том, чтобы плотно запечатать пробелы между стеблем и воротником с помощью липкой ленты для предотвращения утечки жидких носителей, которые используются впоследствии. Для сбора гибких стеблей, таких как тонкие ветви или ветки, раковина резки часть в заполненном водой ведро, изгиб стебля. Вырезать под поверхностью воды с помощью обрезки ножницы или пилы. Передача образца в другой контейнер с водой как можно быстрее, чтобы свести к минимуму подвергая разрез конца воздуха.
  4. Держите разрезавую часть образца под водой. Для широкоолечных видов убедитесь, что длина от места, где крио-образец для SEM будет получена до разрезанный край собранного стебля больше, чем максимальная длина сосуда образца, чтобы предотвратить напряжение индуцированных артефактов в крио образец.
  5. Обложка образец, содержащий листья с черным полиэтиленовым пакетом, чтобы уменьшить транспирации. Держите разрез аналечку в воде и поддерживать это условие в течение примерно 30 минут для того, чтобы расслабиться напряжение xylem. Избегайте более длительного времени релаксации (Nogt;1 h) из-за возможной искусственной заправки кавитированных каналов12.
  6. Измерьте водный потенциал еще раз, чтобы подтвердить ослабление напряжения ксилема (почти 0 MPa).
    ПРИМЕЧАНИЕ: До отбора проб максимальная длина судов целевого вида должна быть исследована или определена с помощью аналогичных образцов методом впрыска воздуха. При отборе проб большого дерева или большой ветви трудно проводить описанные выше процедуры релаксации напряжения. Таким образом, образцы с больших деревьев должны быть собраны в предрассветный период, когда потенциал воды ксилем выше.

2. Заморозить фиксации с LN2

  1. Вырезать и открыть одну сторону водонепроницаемый воротник с ножницами или утилита нож. Плотно прикрепите воротник вокруг стебля клейкой лентой, удерживая отверстие горизонтально.
  2. Носите изоляционные перчатки / варежки, но убедитесь, что держать бутылку LN2 безопасно, и запустить LN2 в воротник, чтобы заполнить его с LN2. Держите его заполнены, постоянно добавляя LN 2, чтобы полностью заморозить воду в xylem. Время, необходимое для замораживания, зависит от размера выборки; 1 мин после кипения налитого LN2 остановился достаточно для небольшой ветки или рассады, в то время как более 20 мин необходимо для стебля большего дерева20. Добавляйте LN2 непрерывно во время замораживания, так как он быстро испаряется из-за больших перепадов температур между LN2 и температурой окружающей среды.
  3. Отсоедините воротник от замороженной части стебля образца, чтобы удалить LN2 после достаточного времени замерзания. Убедитесь в том, чтобы носить изоляционные перчатки, чтобы избежать контакта с потенциальными разливов LN 2, вызванных отсоединением воротника.
  4. Урожай образца с тонкой ручной пилы немедленно.
  5. Обложка замороженный образец с куском алюминиевой фольги или положить его в образец трубки, на котором образец id номера написаны. Быстро поместите собранный образец в контейнер, наполненный LN2 или упаковать в изолированную коробку, наполненную сухим льдом.
  6. Храните образцы в глубокой морозильной камере до наблюдения. Предпочтительная температура хранения составляет 80 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить сублимацию льда и его кристаллизацию во время хранения.

3. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения образец должен быть обрезан, а его поверхность для наблюдения должна планироваться при минусовой температуре, чтобы сохранить распределение воды в ксилеуме на месте. Биологический микротом с криосатсистемной системой (криостат) идеально подходит для обрезки и обнажения поверхности образца в этом типе наблюдения крио-SEM.

  1. Установите температуру образец камеры криостата до 30 градусов по Цельсию, что, как правило, достаточно холодно, чтобы держать ксилем сок большинства растений в замороженном состоянии.
  2. Обрезать образец на небольшой кусок (злт; около 2 см в высоту и злт; около 1 см в ширину или диаметр), которые могут быть скорректированы для образца держатель крио-SEM. Используйте острый нож или тонкозубой пилой для обрезки, с тем чтобы предотвратить нарушение льда в образце. В случае большего образца, который нельзя разрезать ножом, быстро предварительно вырезать охлаждением пилой в морозильной камере.
  3. Прикрепите обрезанный кусок к чаку, держателю для криостата, устанавливая на ткани замораживания встраивая среду (например, OCT соединение) для крио-секции. Затем прикрепите патрон к образецу держателя микротома криостата.
  4. Обрезать поверхность, неоднократно бритья с 5-7 мкм разделов в толщину. Обрезка путем отсечения более 1000 до 2000 мкм, в общей глубине от первоначальной поверхности при сборе образцов, полезно для устранения поврежденной части образца, вызванного предварительной резки ножом или видел, как описано в шаге 3.2.
  5. После грубой обрезки поверхности образца, отрегулируйте неиспользованную часть лезвия микротома над поверхностью образца. Не позволяйте лезвию прикасаться к образецу, который превысит толщину.
  6. Перед первым разрезом неиспользованной частью лезвия, слегка расширить расстояние между поверхностью образца и лезвием.
  7. Вырезать поверхность образца только один или два раза. Далее, сдвиньте лезвие снова регулируя неиспользованную часть лезвия на поверхности образца.
  8. Повторите шаги 3,6 и 3,7 три или четыре раза. Это важно для того, чтобы получить четкую поверхность без "ножмарок"(рисунок 4).
  9. После окончательного разреза установите положение лезвия далеко от образца, чтобы предотвратить наливание пыли на образец.
  10. Отсоедините патрон от держателя образца и отсоедините образец от патрона, удалив замороженный встраивающий сятря острым ножом. Убедитесь, что образец помещается в криостатную камеру, чтобы предотвратить его запланированную поверхность от ледяной пыли.
  11. Прикрепите образец к держателю образца крио-SEM с замораживанием ткани встраивающей средой в криостатную камеру.

4. Передача в Крио-SEM Specimen камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленный на поверхности образец должен быть защищен от повышения температуры или накопления мороза во время переноса из криостатной камеры на этап наблюдения в крио-SEM образец камеры.

  1. Поддерживайте температуру холодной стадии в камере образца крио-SEM на уровне ниже -120 градусов с LN2 в соответствии с руководством пользователя оборудования.
  2. Поместите держатель образца с подготовленным образцом в изоляционный контейнер, наполненный LN 2, в криостатной камере.
  3. Держите держатель образца с образцом обмена стержня под LN2. Избегайте разоблачения держателя образца в воздух, когда это возможно.
  4. Быстро установите держатель образца к камере pre-эвакуации камеры образца крио-SEM как только начиная опорожнение камеры pre-эвакуации. Затем поместите держатель образца на холодную стадию после полной эвакуации воздуха. Хотя немного накопления мороза является неизбежным, "замораживание травления" процедура (шаг 6) может удалить его.

5. Установка в SEM

ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные настройки для наблюдения описаны ниже. Некоторые изменения необходимы в зависимости от состояния вакуума или электронного луча.

  1. Установите параметры SEM для наблюдения следующим образом:
    Напряжение ускорения: 3-5 кВ
    Температура стадии образца: злт;
    Детектор: Вторичные выбросы

6. Замораживание травления

ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание травления является процедура для акцентирования края клеточных стен образца путем небольшой сублимации кристалла льда. Замораживание травления также включает в себя удаление поверхностной ледяной пыли.

  1. Включите ускорение напряжения электрической пушки во время замораживания травления. Лучше проводить замораживание-травление при наблюдении за образцом.
  2. Поднимите температуру стадии образца до 100 градусов по Цельсию.
  3. Подождите несколько минут, пока морозная пыль не будет удалена и уровень поверхности льда в клетках ксилема несколько снизился по сравнению с стенками клеток.
  4. Понизите температуру стадии образца до 120 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет установленного контроллера температуры для стадии образца, удерживайте образец с помощью биржевого стержня и отсоедините его от стадии образца в течение нескольких минут. Наблюдайте за образцом несколько раз во время этого процесса замораживания травления, чтобы проверить состояние сублимации образца.

7. Металлическое покрытие (необязательно)

ПРИМЕЧАНИЕ: Недавние улучшения в SEM прибор и обработка изображений могут обеспечить высокое качество изображения электрических изоляционных образцов без металлического покрытия. Однако непроводящие образцы, такие, как биологические материалы, иногда подвергаются заряду; более высокая яркость в определенных положениях образца за счет накопления электронов ("зарядка"). Подвергая образец электронным лучам в течение более длительного периода времени или для высокого увеличения, увеличивает зарядэффекты. Покрытие поверхности образца электропроводящими металлическими материалами предотвращает возникновение зарядки. Используйте систему вакуумного покрытия, которая устанавливается в блоке крио-SEM, чтобы предотвратить повышение температуры образца во время покрытия.

  1. Убедитесь, что материал покрытия устанавливается на назначенную голову испарителя системы покрытия.
  2. Поддержание температуры холодной стадии в системе покрытия ниже 170 градусов по Цельсию.
  3. Поместите держатель образца на холодную стадию системы покрытия после достаточного замораживания травления.
  4. Откройте перегородку между холодной стадией и головкой испарителя.
  5. Установите текущее значение и значение напряжения головы испарителя в размере около 30 мА и около 5 В соответственно.
  6. Испаряйный материал покрытия для около 30 с, чтобы покрыть поверхность образца.
  7. Установите как ток, так и значения напряжения головы испарителя на нуле и закройте раздел.
  8. Поместите держатель образца на холодную стадию камеры образца для наблюдения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные изображения поперечных поверхностей хвойных и широколицированных деревьев ксилем, наблюдаемые крио-SEM, показаны на рисунке 2. При низком увеличении черная область на снимках указывает на полости, из которых вода полностью или частично исчезает, а серая область указывает на стенки клеток ксилема, цитоплазму и воду(рисунок 2А). При высоком увеличении, очевидно, что вода не полностью теряется от светила из трех трахеев, что указывает на появление макро пузырьков в xylem sap на месте (Рисунок 2B). Что касается широкоолечённых видов, то в сосудах легко обнаруживается кавитация, в то время как существование воды трудно различить в волокнах, особенно при низком увеличении(рисунок 2C). Цитоплазма в клетках паренхимы можно отличить от воды в трхеиидах или сосудах через текстуры ледяной равнины (например, рисунок 2B).

Влияние температуры на процесс замораживания травления показано на рисунке 3. Морозная пыль постепенно удаляется и межрегиональные ямёны становятся яснее через прогрессирование сублимации с повышением температуры. Оставшиеся крупные частицы ледяной пыли могут быть устранены путем дальнейшего замораживания травления, но это может быть проблематичным, поскольку это неоправданно снижает уровень поверхности льда в ксилем-каналах.

Высокое качество наблюдений в значительной степени достигается за счет точной подготовки образцов; особенно важным является сглаживание поверхности острым лезвием микротома. Недостаточное сглаживание использованным лезвием иногда может вызвать шероховатую поверхность (так называемые "ножные знаки", Рисунок 4) или многочисленные случаи пыли от разрезов. После тщательного планирования поверхности образца быстрая передача образца в камеру образца также имеет решающее значение для устранения загрязнений, вызванных образованием мороза.

Образец замораживания без ослабления отрицательного давления столба воды вызовет артефактную индукцию кавитации в ксилем-каналах(рисунок 5). Кластерные кристаллы льда наблюдались в сосудах образцов, из которых образец не был смягчен (наконечники на рисунке 5А),контрастно, в расслабленных образцах с аналогичным водным потенциалом не наблюдалось никаких кластерных кристаллов льда ( Рисунок 5 B), Это, как правило, более значительным в xylem широколиких деревьев, а не в хвойных деревьев (неопубликованные данные).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая диаграмма этого протокола. Показан поток процедур от выборки к наблюдению SEM, описанным в настоящем документе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Пример крио-SEM микрографов поперечных вырезать поверхностей ангиосперма и gymnosperm видов деревьев. Серые и черные области в клетках ксилема соответствуют воде и полости в водной колонке клеток ксилема, соответственно. Поскольку образцы были заморожены с жидким азотом до сбора образцов, изображения крио-SEM показывают состояние воды завода и родной эмболии в момент отбора проб. (A) и (B): двухлетняя веточка взрослого дерева Cryptomeria japonica (хвойные леса). Диаметр ветки составлял 3 мм, а водный потенциал на предрассветной уборке был 0,39 мпа. (C): двухлетняя съемка рассады Carpinus tschonoskii (диффузно-пористая древесина) (1,4 м в высоту и 1,1 см в базальном диаметре). Рассада была взята после процедуры релаксации напряжения после длительного ограничения орошения в течение четырех дней. Водный потенциал был 1,78 мпа после продолжительной засухи и был 0,15 МПа после процедуры релаксации напряжения. Тр: трахеид, Р: лучевая паранхима, V: сосуд, F: волокно, AP: осевая паранхима. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Процесс размораживания и травления прогрессирует, повышая температуру стадии холодного образца. Поперечная поверхность ксилема ветки Cryptomeria japonica (хвойная древесина). Снижение температуры образца стадии (A) 113,0 C, (B) 105,3 C, (C) 101,9 C и (D) 99,7 c. Каждое изображение было получено примерно через 5 минут после того, как температура на стадии холодного образца была установлена при соответствующем температурном значении. Сублимация льда прогрессирует, если температура на сцене поддерживается выше примерно 120 градусов по Цельсию (для нашего оборудования). Tr: трахеид, B: граничатая пара ямы, Pm: мембрана ямы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Пример метки ножа. Поперечная поверхность ксилема ветки Cryptomeria japonica (хвойные дерева) с изображением так называемых следов ножа. Стрелы и разбитые линии представляют собой типичные следы ножа. Очистка поверхности образца криостатом должна быть завершена неиспользованной частью лезвия ножа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Пример эффекта релаксации напряжения водяной колонки в каналах. Поперечная поверхность стебля карпина цоноски (диффузно-пористая древесина) наблюдается крио-SEM. Водный потенциал в дневное время был схож в обоих саженцев. Стебель просаживающейся рассады был заморожен нетронутым (A), в то время как стебель другой рассады был заморожен после ослабления существующего гидравлического напряжения (B). Водный потенциал (B) при уборке урожая составил 0,5 мпа после процедуры релаксации напряжения. Стрелы в панели (A) являются замораживание артефактов кристаллов льда в сосудах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы наблюдения крио-SEM, представленные в настоящем документе, практичны для четкой визуализации распределения воды в клеточном масштабе. С помощью этого метода изучение изменений в распределении воды в ксилеме потенциально может помочь прояснить механизм толерантности видов деревьев к абиотическому стрессу (нехватка воды или замораживание) или биотическое напряжение (болезнь дерева).

Наиболее важным шагом в этом методе является сохранение распределения воды, характерной для местного состояния воды при сборе проб и последующей подготовке образцов. Ксилемткани видов с длинными каналами (особенно ранние сосуды кольцево-пористых деревьев) могут легко терять воду во время уборки и замерзания. Cochard et al. (2000) обсудили замораживание артефактов из-за высокого напряжения в колонке воды вдоль ксилемовских каналов38,41. Umebayashi et al. (2016) подтвердили обоснованность крио-SEM наблюдений образцов с ослаблением напряжения по сравнению с неразрушающими наблюдениями МРТ39. Обе методы наблюдения показали аналогичную картину распределения воды. Хотя нам все еще необходимо проверить видовую прочность, связанную с проникновением воздуха, вызванным замораживанием при высоком гидравлическом напряжении, следует проводить процедуры релаксации для обеспечения надежной оценки распределения воды, и в частности водно-напряженных растений.

Частицы мороза и льда являются значительными препятствиями для детального наблюдения. Чтобы предотвратить накопление мороза, образец не должен подвергаться воздействию атмосферы до тех пор, пока он не будет прикреплен к крио-SEM образец камеры. Хотя воздействие атмосферы не может быть полностью предотвращено во время переноса образца в камеру образца, время передачи должно быть коротким. Изоляционный контейнер для переноса держателя образца должен быть хорошо высушен после удаления держателя образца и LN2 для предотвращения заморозков и льда, возникших в конденсате росы.

Соответствующий срок для замораживания травления зависит от производительности используемых инструментов. Важными факторами при определении этого являются уровень вакуума в камере образца и стабильность температурного контроллера стадии образца. Степень сублимации, соответствующая температуре, должна быть в первую очередь оценена перед формальным использованием. Чрезмерное замораживание травления устранит присутствие воды в ксилемских каналах и затруднит идентификацию, особенно в светиле узких клеток.

Он предпринимает конкретные шаги и предпринимает усилия для обеспечения того, чтобы разрушительные методы отбора проб были свободны от появления артефактов во время процедур замораживания, сбора урожая и обрезки. Хотя значение возникновения артефактов часто указывается, степень появления замораживания артефактов в ксилем-каналах не была достаточно проверена38,39. Дальнейшая проверка неразрушающими методами желательно для подтверждения точности процедуры релаксации напряжения и замораживания-фиксации. Поскольку синхротронные системы ККТ или МРТ не были достаточно распространены в изучении отношений между растениями и водой по сравнению с системой крио-СЭМ, применение коммерческой системы ЗКТ, возможно, может привести к прогрессу проверки результатов крио-SEM42 .

Гидравлические черты дерева, такие как поток сока, гидравлическая проводимость стволовых сегментов, процентная потеря проводимости (PLC), или ксилемовая емость обеспечивают оценки использования воды в деревьях и устойчивости к засухе. Сравнение водопользования среди видов необходимо для прогнозирования выживания деревьев при водном стрессе, вызванном антропогенным изменением климата2. Крио-SEM наблюдения имеет много преимуществ в предоставлении анатомических знаний для уточнения причины изменений в гидравлических особенностей. Недавние усовершенствования как разрушительных, так и неразрушаемых методов анатомических и гидравлических исследований могут вместе углубить наше понимание природы использования воды в деревьях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI (Нет. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H0285)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Tags

Экологические науки Выпуск 148 крио-SEM криостат замораживание фиксации релаксации напряжения распределение воды ксилем-каналы
Xylem Распределение воды в Древесных растениях, визуализированных с крио-сканирования электронный микроскоп
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter