Summary
本文提出了一种结合高压冷冻和微波辅助样品处理两种样品处理技术的协议, 然后用聚焦离子束扫描电子显微镜 (FIB-SEM) 进行最小树脂包埋, 用于获取数据。这是用小鼠胫骨神经样本和线虫证明的。
Abstract
所述样品制备技术旨在将聚焦离子束扫描电子显微镜 (FIB-SEM) 中的最佳超微结构保存质量与成像方式的最佳对比度结合起来, 该显微镜用于获得用于3D 重建和建模的顺序图像堆栈。高压冷冻 (HPF) 允许接近本机结构保存, 但随后的冻结替代往往不能提供足够的对比度, 特别是对于较大的样品, 这是在3D 所需的 SEM 中进行高质量成像所需的重建。因此, 在本协议中, 在冷冻替代后, 在室温下采取额外的对比步骤。虽然这些步骤是在微波中执行的, 但也可以遵循传统的工作台加工, 这需要更长的孵化时间。随后嵌入少量树脂, 可以在 FIB-SEM 内更快、更精确地进行定位和制备。该方案特别适用于需要高压冷冻制备以获得可靠的超微结构保存但在使用 FIB-SEM 进行体积成像的冷冻替代过程中没有获得足够对比度的样品。结合最小树脂嵌入, 该协议为获取高质量的卷数据提供了高效的工作流程。
Introduction
高压冷冻是获得高质量超微结构保存的首选样品制备方法, 它比使用化学固定1的传统制备方法表现得更好。这种冷冻制备方法适用于髓鞘小鼠组织2等样品, 对霉菌菌3的使用有严格的要求。在冷冻取代和树脂包埋后, 这些样品通常通过透射电子显微镜 (TEM) 或电子层析成像 (ET) 进行分析。如果必须使用 FIB-SEM 或串行块面成像对更大的体积进行成像, 以实现高分辨率大规模3D 重建, 那么在我们的经验中, SEM 的正确成像往往会受到缺乏对比度的阻碍。在 FIB-SEM 中, 图像通常是通过检测主电子束的背散射电子来记录的。背散射电子的产率与样品中重金属的含量成正比。因此, 协议是专门为体积成像设计的, 目的是通过额外的重金属浸渍来增强对比度。这种方法以化学固定样品为基础, 并将四氧化二酸-四氧化亚胺-四-四氧化亚铵-四的组合应用于系列块面和聚焦离子束扫描电子显微镜.包括使用甲酰胺和吡咯烷醇6或铅天冬氨酸7在内的改性已成功应用于不同的成像技术。
这里提供的协议结合了 HPF 的冷冻制备和冷冻辅助处理, 以增强在室温下使用丙酮中的四氧化二硫醚的对比度。我们在小鼠的髓鞘质质胫骨和线虫上证明了这一点,它们代表了需要高压冷冻以进行高质量超微结构保存的样品。此外, 它还显示了在脱水和渗透后, 样品是如何嵌入尽可能少的树脂的。这种最小的树脂嵌入8可以更快地定位感兴趣的结构, 并减少在样品处理上花费的时间, 包括减少使用离子束暴露感兴趣区域所需的时间。在显微镜内进行进一步的样品制备步骤后, 不断对样品进行成像和铣削, 以获得一叠图像。对于3D 可视化, 图像处理软件 (IMOD) 用于重建数据集的某些部分。
我们的工作流程描述了如何将最适合的体积成像样品对比结果与 HPF 和冷冻替代的最佳超微结构保存相结合。这对于严格需要冷冻制备的样品非常有用。应用仅限于可由 HPF 制备的小样本。在不同性质的样品中, 如植物材料或微生物, 该协议需要调整。
Protocol
所有实验, 包括这里描述的动物样本已获得机构动物护理和下萨克森州客户保护和食品安全办公室 (LAVES) 的批准。
1. 高压冷冻和冷冻替代
- 从老鼠身上解剖神经质胫骨 (例如, C57Bl6N, 12周, 女性)9。
- 将乙酰二聚体浸入20% 的聚乙烯醇吡咯烷酮 (5 毫升中的1克 PVP) 的液滴中, 浸泡在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 切割长度为2毫米。然后, 使用精细的钳子将其放置在金属样品载体 (A 型, 0.2 mm 深度) 中。添加另一个涂有一层薄薄的六烷的扁平托架 (B 型) 作为盖子, 并将该组件插入样品盒中。
- 用一次性塑料移液器将 M9 中20% 的牛血清白蛋白 (BSA) 液滴中悬浮的几种线虫转移到金属载体 (a型)中。然后, 在顶部 (B 型) 上添加第二个托架作为盖子, 然后组装墨盒。
- 对于这两个样品, 请继续进行以下操作: 将样品载体组件逐一冻结, 将其装入高压冰柜装载站的三件套墨盒中。根据制造商的操作说明按下工艺按钮。
注: 这两种类型的示例都可以在随后的冻结替换中一起处理。 - 将样品放入丙酮中含有2毫升冷冻0.1% 单宁酸的冷冻食品中。在液氮浴中进行转移, 而不会将液氮溢出到小瓶中。将冷冻设备转移到-90°c 的自动冷冻替代装置10 中, 然后启动程序。
注: 样品在-90°c 保存 100小时. 在渗透前使用单宁酸作为魔剂, 以增加四氧化二铬的吸收 11. - 在-90°c 的冷冻替代装置中, 用2毫升丙酮手动清洗样品 3倍30分钟。
- 将样品放在2毫升的2毫升中, 在丙酮中保留0.1% 醋酸铀, 以便在-90°c 的情况下在7小时的自动冷冻替代装置中持续染色。
注意: 四氧化二钼有毒, 应在烟罩下处理, 并应佩戴防护设备。
注: 冷冻替代装置在 5°c h 时自动将温度提高到-20°c。样品在冷冻替代装置中保持在-20°c 16小时。温度将在 10°c ~ h 时自动升高至4°c。 - 当温度达到4°c 时, 将四氧化铬溶液与纯丙酮交换。从冷冻替代装置中取出冷冻剂。
2. 微波辅助处理
注: 在室温12下使用温度控制单元执行以下所有步骤, 以保持温度稳定 (请参阅材料表)。
- 在微波处理过程中, 保持反应管的盖帽打开。
- 将金属样品载体从冷冻载体中取出, 用细钳或针头将样品从金属载体中取出, 同时将样品浸入手表玻璃盘 (150 毫米) 中, 将样品浸入丙酮中。
- 使用细钳或移液器将样品转移到2毫升反应管中, 并用1毫升丙酮4次清洗, 在 250 W 的情况下进行4次。
注意: 硫代替波林酰胺有毒, 应在烟罩下处理, 应佩戴防护设备。 - 在 150 W 的情况下, 用1毫升的1毫升在丙酮中染色, 时间为 14分钟, 以增加对比度。要进行染色, 将硫代卡波德拉酰化溶液移入反应管中, 将试管放入微波中, 并将程序设置为 150 W 的功率级别 (在真空功能打开的情况下打开), 关闭 2分钟, 迭代共14分钟。启动微波炉。
注: 硫代替波林与在冷冻替代过程中使用的四氧化二铬发生反应。它形成一座桥梁, 使更多的四氧化二铬被沉积到原四氧化铬的场地13。 - 用1毫升丙酮将样品用1毫升清洗, 在 250 W 的移液器中, 将丙酮放入反应管中, 将试管放入微波中, 并选择 250 W 的微波。
- 在丙酮中的1% 的2毫升中染色 14分钟, 在 150 W 的移液中将四氧化二铬溶液放入反应管中, 将试管放入微波中, 并将程序设置为 150 W 的功率级别 (真空功能打开), 时间为 2分钟/2分钟关闭, 迭代总共14分钟。启动微波炉。
- 用1毫升丙酮在 250 W 处用1毫升将样品清洗 40秒 (如步骤2.5 所示)。
- 在 250 w w. 移液液液中, 用1毫升的树脂浓度增加25%、50%、75%、90%、100% 和 100%, 每次3分钟的反应管渗透树脂, 将该试管放入微波, 并将程序设置为动力l 250 W (真空功能打开) 3分钟, 启动微波。
3. 最小树脂包埋8
- 用牙签把和从反应管中取出, 放在塑料薄膜上 (见材料表)。
- 使用牙签轻轻地将样品推到塑料薄膜上, 直到没有检测到残留的树脂。使用卤素灯加热 (见材料表), 使树脂变得不那么粘稠, 并且能够更容易地去除。将卤素灯放在足够近的地方加热树脂 (注意不要烧手)。
- 在烤箱中的塑料薄膜上, 在60°c 下将样品聚合至少48小时。
4. 纤维扫描器的准备工作
- 使用适合 SEM 存根的剃须刀刀片将聚合样品与塑料薄膜切割成一起, 并使用导电银树脂将其连接到 SEM 存根 (参见材料表)。在60°c 下再次聚合至少4小时或一夜。
- 用溅射涂布机 (也可以使用制粉涂布机) 将 SEM 存根上的样品涂上黄金 1分钟 (也可以使用 PLATINUM/ADO; 10 纳米厚的涂层就足够了), 然后将样品放在 FIB-SEM 内。
5. FIB-SEM 内部的数据采集
- 用二次电子检测器对样品进行成像, 使用驱动显微镜的基本软件 (见材料表)。样本的方向应该是这样的感兴趣的区域 (例如, 神经质的中间部分或线虫) 是在视野中。
注: 要进行数据采集, 请将舞台倾斜到一个位置, 以便样品在所谓的离子束和电子束的重合点以适当的工作距离 (5 毫米) 以90°角面对离子束。使用我们的仪器, 这是在54°和5毫米工作距离的阶段倾斜时实现的。 - 要设置样品的正确位置, 请在与二次电子探测器进行成像时, 以0°倾斜的速度将一个共同特征居中。慢慢倾斜到 54° (5°, 20°, 54°), 通过移动 m 轴重新进入同一对象。
- 在54°的二次电子探测器成像时, 通过将特征居中, 然后将特征移动到 FIB 模式下的中心位置, 找出重合点。通过在 SEM 软件中显示十字线来指示中心。然后, 首先使用 SEM 软件的中心点函数将选定的示例要素移动到图像区域的中心。然后通过在 z 中移动舞台, 将要素沿 y 轴居中。FIB 和 SEM 之间的任何最终偏移量都会通过扫描电镜光束移位进行校正。
- 打开用于记录3D 数据集的高级软件 (参见材料表), 然后逐步按照软件向导操作。
- 在感兴趣的区域, 使用 3 a 电流将碳或铂金 (400 nm) 沉积在投资回报率之上, 以实现均匀的铣削并减少充电引起的伪影。
注: 通过绘制要在用 FIB 成像的样品表面进行铣削的感兴趣区域 (宽度、高度、深度), 软件计算并叠加了不同样品制备特征的大小, 例如要铣削的沟槽或样品的面积铂/碳沉积。此外, 在对具有过高 FIB 电流的样品表面进行成像时要谨慎, 因为这可能会损坏样品表面。50 pA 的电流足以进行成像。 - 使用聚焦离子束磨出沟槽, 使用 15\ nA 电流暴露感兴趣的区域 (ROI)。
- 使用聚焦离子束使用 7 nA 电流抛光横截面。
- 完成样品制备后, 设置以下成像参数: FIB 铣削参数在 FIB 设置选项卡 (FIB 铣削电流) 中;设置选项卡中的 SEM 成像参数和 SEM 自动调整选项卡中的图像调优参数 (每60分钟执行一次自动对焦和自动调整, 50 nm 像素大小, 停留时间 3, 线平均 3)。针对每个样本对此进行优化。
- 为了防止任何热漂移导致块面漂移在运行过程中, 离开房间至少 2小时, 然后开始采集。
- 在连续磨机中获取数据集, 并以 700 pA FIB 电流获取模式。使用具有 400 v 网格电压的 1.5 kV (分析模式, 900 V) ESB 检测器, 使用先进的软件 (见材料表) 和50纳米的切片厚度获取每个具有 5 nm 像素大小的图像。一次图像采集大约需要1.5 分钟, 停留时间为6μs。
- 开始数据采集。在铣削电流处获取 FIB 图像, 以确保样品没有移动, 并选择正确的感兴趣区域。如有必要, 请进行调整。
6. 数据可视化
- 通过将包含所有图像的文件夹拖到斐济并选择 "虚拟堆栈", 在斐济打开图像。
- 使用矩形工具裁剪感兴趣的区域 (图像 ≫ 裁剪)。
- 反转数据以显示传统的透射电子显微镜与在黑暗中显示的膜的对比 (编辑 ≫ 反转)。
- 使用 TrackEM214 (斐济15) 进行对齐。通过单击图层, 将数据加载到 trackem2 (文件 ≫ 新 ≫ trackem2) 中。加载所有图像后, 使用多层镶嵌功能对齐它们 (右键单击"图像 ≫ 对齐" > "对齐多层镶嵌")。对齐后, 图像将作为单个平铺文件导出 (右键单击图像 ≫ 导出 > 制作平面图像)。选择应导出的所有图像, 然后选择"保存到文件"。
- 对于后处理, 使用高斯模糊 (过程 ≫ 滤镜 ≫ 高斯模糊; sigma 2) 和局部对比度增强 (过程 ≫ 增强局部对比度;CLAHE: 块大小 127, 直方图箱 256), 这是应用于斐济平滑图像, 并获得更好的信噪比。
- IMOD16用于执行手动分割和可视化的结构的兴趣在3d。在 IMOD 中打开数据集, 然后选择"绘图工具" ("特殊 > 绘图工具") 以执行手动分段。可以使用不同的手动工具来跟踪整个卷中感兴趣的结构 (例如 "联接"、"雕刻")。使用显微镜图像浏览器 (MIB17) 进行半自动分割。
Representative Results
工作流程从一个样品 (这里, 一个新解剖的老鼠神经质胫骨) 放置在金属载体中进行高压冷冻 (图 1a)。载体从液氮中回收 (图 1b), 并放置在冷冻第一化学鸡尾酒顶部的冷冻替代装置中 (图 1b)。经过长期冻结替代协议, 包括2% 的四氧化二铬和0.1% 醋酸铀, 样品在室温下从载体中取出 (图 1d)。为了进一步增强对比度, 样品被转移到塑料管中, 在微波中进行处理 (图 1e)。真空室和温度控制单元用于优化工艺 (图 1f)。
为了能够执行最小的树脂嵌入, 需要牙签和塑料薄膜片 (图 2a)。用微波用树脂渗透样品后, 将其放置在塑料薄膜上, 并四处移动, 直到样品表面没有树脂。卤素灯用于帮助排出剩余的树脂, 并将样品最小地嵌入到塑料薄膜上 (图 2b)。需要注意的是, 从样品顶部去除更多的树脂是好的。样品下面还应该剩下少量的, 以保持它与基板的连接。将聚合在塑料薄膜上的样品用银导电树脂切割并安装在 SEM 存根上 (图 2c)。存根在60°c 下聚合至少 4小时 (图 2d)。应将各组分彻底混合, 否则混合物可能无法正确聚合。为避免在扫描电子显微镜内充电, 将存根与黄金或铂/钯覆盖 (图 2e)。
样品被放置在 FIB-SEM 中, 并用二次电子探测器进行成像, 以瞄准感兴趣的区域 (图 3a, e)。离子束用于直接在感兴趣的区域前去除材料, 以暴露横截面 (图 3b-d, 3f-h)。标准协议通常缺乏膜对比度 (图 3b, f), 而增强的协议提供了强大的膜对比度 (图 3c-d, 3g-h)。
EM 数据 (后处理后) 使用 IMOD (图像处理和建模程序) 进行可视化。为了更好地理解3D 信息, 使用了数据的虚拟重新采样 (图 4a)。数据集的不同结构是手动分段的 (图 4b-d)。
图 1: 高压冷冻、冷冻替代和微波辅助加工.(a) 含有小鼠胫骨的样品载体, 标度条3毫米 (b) 含有高压冷冻后小鼠神经的样品载体, 标度棒3毫米 (c) 带有样品的自动冷冻替代装置。内装: 定制金属容器, 最多可容纳23个样品瓶和两个大小瓶, 其中含有美国战地服务团中的化学物质。(d) 从载体中取出丙酮玻璃盘中的样品, 标材3毫米 (e) 反应管中的样品放在微波炉中处理。(f) 微波的真空室和温度控制单元。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: fibsem 的最小树脂包埋和制备.(a) 用于最小树脂包埋、刻度条4厘米 (b) 在塑料薄膜顶部排出树脂的塑料薄膜和牙签, 将树脂排出250微米 (c) 钢耳在塑料薄膜上, 然后切割并安装在 SEM 存根顶部。 银导电树脂, 刻度条 250μm. (d) 样品聚合在 SEM 存根顶部, 刻度条3毫米 (e) 样品涂有黄金在 SEM 存根, 刻度条3毫米. 请点击此处查看此图的更大版本.
图 3: 在 fib-sem 内制备样品.(a 和 e)二次电子图像在 fib sem 内的样品表面 (a) 天牛, 标度条 100μm. (e) c. 线虫, 刻度条 2μm. (b-d) 和 (f-h) 横截面通过样品使用 esb 探测器成像. (b 和 c)胫骨神经, 刻度条2微米 (f 和 g) c.线虫, 刻度条1微米和200纳米。(b 和 f)显示的是高压冻结和冷冻替代的结果, 而没有增强, 而所有其他图像显示了增强冻结替代的结果。(d 和 h)使用 ESB 检测器的样品的详细图像。(d) 胫骨神经, 刻度棒200纳米。(h) c. elegans,刻度条200纳米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 图像采集和可视化.(a) IMOD 中显示的 EM 数据, 几乎是用新平面和平面, 标度条 2μm. (b) 在 EM 数据 (蓝色)、Remak 束 (红色)、髓鞘 (黄色和橙色) 和线粒体 (绿松石)、刻度条 2μm (c 和 d) 3D 模型、刻度条2μm 和 500 nm 上的分段轴突.请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
该协议的开发是为了说明使用 FIB-SEM 进行串行块面成像的最佳保存和对比。因此, 我们选择采用冷冻固定, 然后使用冷冻替代和微波辅助处理染色后。因此, 该协议仅限于足够小的样品, 用于高压冻结。样品载体的尺寸与该技术可以适当冻结的样品尺寸相匹配, 确定了宽度为3至 6 mm、厚度 ~ 200 微米的尺寸限制。这与小鼠神经样本有关, 因为坐骨神经直径太大, 无法容纳确保适当冻结所需的0.2 毫米载体。因此, 建议仔细解剖较小的神经, 如胫骨神经或其他细神经, 如股神经。由于髓鞘对伸展运动敏感, 在解剖新鲜可行的神经时必须非常小心, 以避免处理文物。一般来说, 只有可行的样品才应用于电子显微镜研究。
微波辅助加工和最小树脂包埋是为了加快制备和靶向过程。采用改进的 OTO 方案4进行微波辅助处理, 用于室温化学固定。家用微波不会产生相同的结果, 因为微波没有均匀分布, 温度不受控制, 也没有真空可以应用。样品越小, 化学品的渗透度就越好;因此, 通过较小的样品获得了最佳的结果。为了避免过热对样品造成损害, 温度控制和应用所需的最低微波功率至关重要。如果没有微波可用, 可以在工作台上执行微波辅助加工步骤, 这将导致更长的加工时间。要直接瞄准 SEM 中的结构, 必须从样品顶部去除尽可能多的树脂。在记录数据集之后, 需要对原始数据进行后处理, 以减小文件大小并提高信噪比。现代体积成像技术产生大量数据。因此, 要以快速、充分的方式执行数据处理, 需要在工作站上使用足够的 RAM。对于对齐操作, 所需的 RAM 至少是数据集大小的两倍。
该协议已在小鼠的神经质胫骨和线虫上进行了测试。Hall 等人12使用了类似的增强步骤后, 他们冻结替代在长凳上准备线虫.对于斑马鱼等任何其他模型生物, 可能需要调整协议。一个可能的修改是改变冷冻替代鸡尾酒的成分, 例如增加用于对比度增强的水 18.此外, 冻结替代的持续时间必须适应样品, 并可根据快速冻结替代议定书19大大缩短。一种可能是应用搅拌来加速冻结替代过程20。在冷冻替代之后, 可以进行进一步的修改, 例如反复应用增强化学物质和四氧化二铬 21.在微波处理过程中, 温度、孵化时间和功率设置可以变化, 以优化相应样品的结果。
该协议表明, 这种增强可以与其他冷冻替代协议和不同类型的样品结合起来, 如12号馆描述的那样, 这些样品是在 FIB-SEM 中成像的, 也可以是由串行块面扫描电子显微镜成像的。这些成像技术需要增强的对比度, 这对于透射电子显微镜来说并不那么重要。
Disclosures
未申报利益冲突。
Acknowledgments
FIB-SEM 和 a. s. (FIB-SEM 运营商的职位) 由卓越集群和德国气体科学研究中心纳米显微镜和大脑分子生理学 (CNMPB) 提供资金。我们感谢托马斯·穆勒-赖克特实验室提供了线虫的样品.我们感谢乌尔里希·韦克特参与这部电影。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
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