Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.
Abstract
הטכניקה הכנה מדגם שתואר זה נועד לשלב את האיכות הטובה ביותר של שימור ultrastructural עם הניגוד המתאימים ביותר עבור המודאליות ההדמיה ביון ממוקדת קרן סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (שיקרתי-SEM), אשר נמצא בשימוש כדי להשיג ערימות של תמונות רציפים עבור שחזור תלת-ממד, דוגמנות. בלחץ גבוה קפוא (HPF) מאפשר קרוב שימור מבני מקורי, אך עוקבות להקפיא החלפת לעתים קרובות אינו מספק חדות מספקת, במיוחד עבור דגימה גדולה יותר, אשר נדרש עבור הדמיה באיכות גבוהה בעוד SEM הנדרש עבור תלת-ממד שחזור. לכן, ב פרוטוקול זה, לאחר ההחלפה ההקפאה, פעולות מנוגדים נוספות מתבצעות בטמפרטורת החדר. למרות פעולות אלה מבוצעות במיקרוגל, זה גם אפשרי לעקוב אחרי עיבוד ספסל המסורתית, אשר דורשת יותר זמן דגירה פעמים. ההטמעה עוקבות בכמויות מינימליות של שרף מאפשר מהירה ומדויקת יותר מיקוד והכנה בתוך שיקרתי-ב-SEM. פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור דגימות דורשים הכנה על ידי קירור בלחץ גבוה לשימור ultrastructural אמין אך לא יקבלו מספיק חדות במהלך ההחלפה ההקפאה עבור אמצעי הדמיה באמצעות שיקרתי-ב-SEM. בשילוב עם שרף מינימלי את ההטמעה, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה עבור רכישת נתונים באיכות גבוהה נפח.
Introduction
הקפאה בלחץ גבוה היא שיטת הכנה מדגם של בחירה להשגת שימור ultrastructural באיכות גבוהה, אשר מייצג את המדינה מקורית של מדגם הרבה יותר טוב מאשר שיטות הכנה קונבנציונאלי בעזרת קיבוע כימי1. שיטת הקפאה-הכנה זו שימושית עבור דגימות רקמה העכבר ו2 ו דרישה קפדנית לשימוש של האורגניזם דגם Caenorhabditis elegans3. לאחר החלפת ההקפאה, שרף הטבעה, דגימות אלה מנותחים בדרך כלל על-ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) או אלקטרון טומוגרפיה (ET). אם אמצעי אחסון גדול חייב לדימות באמצעות שיקרתי-SEM או פרצוף-בלוק טורי דימות ברזולוציה גבוהה שחזורים תלת-ממד בקנה מידה גדול, מניסיוננו הדמיה נאותה על ידי SEM היא לעיתים קרובות הקשו על ידי חוסר חדות. שיקרתי-SEM, התמונה נרשם בדרך כלל על-ידי זיהוי אלקטרונים backscattered כשקרן האלקטרונים הראשית. התשואה של אלקטרונים backscattered הוא יחסי לתוכן של מתכות כבדות במדגם. לכן, פרוטוקולים תוכננו במיוחד עבור אמצעי הדמיה כדי לשפר את הניגודיות על-ידי הספגה נוספים הבי מטאל. שיטות כאלה מבוססים על דגימות כימי קבוע להחיל שילוב של אוסמיום ארבע-חמצני-thiocarbohydrazide-אוסמיום ארבע-חמצני4, כפי שתואר על ידי Knott ואח5, רחוב טורי-לפנים, ממוקד יון קרן סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים. שינויים כולל שימוש formamide ו pyrogallol6 או עופרת אספרטט7 הוחלו בהצלחה לטכניקות ההדמיה.
פרוטוקול שסופק כאן משלב הקפאה-הכנת דגימות מאת HPF ומקפיאים החלפה עם עוקבות מיקרוגל בסיוע לעיבוד חדות משופרת באמצעות thiocarbohydrazide/אוסמיום ארבע-חמצני אצטון בטמפרטורת החדר. נדגים זאת על סיבי העצב nervus השוקה של עכברים, Caenorhabditis elegans, אשר מייצגים דוגמאות הדורשים בלחץ גבוה קפוא לשימור ultrastructural באיכות גבוהה. בנוסף, הוא הראה איך, לאחר התייבשות, חדירה, הדגימות מוטבעים עם כמו שרף קטן ככל האפשר. זה שרף מינימלי הטבעה8 מאפשר מיקוד מהיר של המבנה של הריבית, מקצרת את הזמן על עיבוד הדגימה, כולל פחות זמן נדרש לחשוף את האזור עניין בעזרת קרן יון. לאחר ביצוע עוד יותר מדגם צעדים הכנה בתוך המיקרוסקופ, הדמיה, כרסום המדגם מתבצע באופן רציף לרכוש ערימה של תמונות. לוויזואליזציה תלת-ממדית, עיבוד תוכנה (IMOD) תמונה משמש לבנייה מחדש של חלקי ערכת הנתונים.
זרימת העבודה שלנו מתאר איך מנוגדים המתאימים ביותר דוגמאות עבור אמצעי הדמיה של יכול להיות משולב עם שימור ultrastructural בצורה הטובה ביותר על ידי החלפת HPF, ההקפאה. פעולה זו שימושית עבור דגימות שדורשים הקפאה-הכנה בלבד. יישומים מוגבלות מדגמים קטנים זה ניתן להכין על ידי HPF. בדגימות של טבע שונים, כגון חומר צמחי או מיקרואורגניזמים, פרוטוקול זה דורש הסתגלות.
Protocol
כל הניסויים כולל דגימות מבעלי המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים משרדי המדינה סקסוניה התחתונה עבור הגנת הצרכן ובטיחות מזון (LAVES).
1. שתרם קירור ומקפיאים החלפת
- לנתח את השוקתי nervus מן העכבר (למשל, C57Bl6N, 12 שבועות, נקבה)9.
- לטבול את השוקתי nervus ב- droplet של 20% פוליוינילפירולידון (1 גרם של PVP ב 5 מ ל) buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) וחותכים לחתיכות של 2 מ מ אורך. לאחר מכן, מניחים אותה נשא לדוגמה מתכת (סוג א', 0.2 מ מ עומק) באמצעות מלקחיים משובחים. להוסיף עוד נושא שטוח (סוג B) מצופה בשכבה דקה של hexadecane כמו מכסה והכנס הרכבה זו לתוך הדיו הדגימה.
- העברת מספר C. elegans הושעו ב- droplet של 20% שור אלבומין (BSA) ב- M9 (ראה טבלה של חומרים) עם פיפטה פלסטיק חד פעמיות לתוך התא מתכת (סוג A). לאחר מכן, הוסף נשאית השנייה המכסה למעלה (סוג B), להרכיב את מיכל הדיו.
- שני הצדדים של הדגימות להמשיך הדברים הבאים: בלחץ גבוה להקפיא ההרכבות המוביל מדגם אחד--אחד על ידי לטעון אותם לתוך הדיו שלושה חלקים לתחנת הטעינה של המקפיא בלחץ גבוה. לחץ על לחצן תהליך לפי הוראות ההפעלה של היצרן.
הערה: שני סוגי דוגמאות ניתן יהיה לעבד יחד ההחלפה ההקפאה עוקבות. - למקם את הדגימות cryovials המכיל 2 מ"ל חומצה טאנית 0.1% קפוא אצטון. ביצוע ההעברה בתוך אמבט של חנקן נוזלי מבלי לשפוך חנקן נוזלי לתוך הבקבוקונים. להעביר את cryovials לתוך ערכה10 יחידה של החלפת ההקפאה אוטומטית ב-90 ° C, הפעלת התוכנית.
הערה: הדגימות נשמרים ב-90 ° C עבור 100 ה חומצה טאנית לפני osmification משמש mordant כדי להגביר את ספיגת אוסמיום ארבע-חמצני11. - באופן ידני לשטוף את הדגימות 3 x במשך 30 דקות עם 2 מ"ל של אצטון ב-90 ° C ביחידת החלפה ההקפאה.
- להשאיר את הדגימות 2 מ של 2% אוסמיום ארבע-חמצני, 0.1% אצטט uranyl ב אצטון עבור צביעת המשך אוטומטית הקפאת החלפת יחידת עבור 7 שעות ב-90 º C.
התראה: אוסמיום ארבע-חמצני רעיל צריך להיות מטופל ברדס fume ו ציוד מגן לענידה.
הערה: יחידת החלפת ההקפאה מעלה באופן אוטומטי את הטמפרטורה ל-20 ° C-h 5 ° C. הדגימות נשמרים ב-20 ° C עבור h 16 ביחידת החלפה ההקפאה. הטמפרטורה יגדל באופן אוטומטי עד 4 ° C-h 10 ° C. - להחליף את הפתרון אוסמיום ארבע-חמצני עם אצטון טהור כאשר הטמפרטורה הגיעה 4 ° C. הסר את cryovials יחידת החלפת ההקפאה.
2. מיקרוגל בסיוע עיבוד
הערה: בצע את כל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר12 באמצעות יחידת בקרת טמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה יציב (ראה טבלה של חומרים).
- השאר את הפקקים של הצינורות התגובה פתוח במהלך עיבוד במיקרוגל.
- קח נושאות מתכת מדגם מתוך cryovials הדגימות ולהסיר המוביל מתכת בעזרת מלקחיים בסדר או מחט, תוך שמירה על הדגימות submersed ב אצטון בקערת זכוכית השעון (150 מ"מ).
- להעביר את הדגימות לתוך צינורות תגובה 2 מ"ל באמצעות מלקחיים בסדר או פיפטה ולשטוף עם 1 מ"ל של אצטון ארבע פעמים על 40 s ב 250 W.
התראה: Thiocarbohydrazide הוא רעיל, צריך להיות מטופל ברדס fume, יש ללבוש ציוד מגן. - כתם דגימות עם 1 מ"ל של 1% thiocarbohydrazide ב אצטון עבור 14 דקות ב 150 W כדי להגדיל את החדות. לביצוע ההכתמה, pipette את הפתרון thiocarbohydrazide לתוך הצינור התגובה, להציב את הצינור במיקרוגל, ולהגדיר לתוכנית רמת כוח של 150 W (עם הפונקציה ואקום מופעלת) למשך 2 דקות ב/2 min. איטראציה עבור סה כ 14 דקות. להפעיל את המיקרוגל.
הערה: Thiocarbohydrazide מגיב עם אוסמיום ארבע-חמצני היה מוחל במהלך ההחלפה ההקפאה. היא יוצרת גשר, המאפשר יותר אוסמיום ארבע-חמצני למוסרם אל אתרי אוסמיום ארבע-חמצני המקורי13. - לשטוף את הדגימות 4 x עם 1 מ"ל של אצטון 40 s ב 250 W. פיפטה אצטון לתוך צינור התגובה, להכניס את הצינורית בתוך המיקרוגל, ובחר 250 ואט להתחלה ס' 40 במיקרוגל.
- כתם ב מ 1 ל 2% אוסמיום ארבע-חמצני ב אצטון עבור 14 דקות ב 150 W. פיפטה הפתרון אוסמיום ארבע-חמצני לתוך צינור התגובה למקם את הצינור למיקרוגל, להגדיר את התוכנית כדי רמת כוח של 150 W (עם הפונקציה ואקום מופעל) עבור 2 דקות ב/2 דקות. , איטראציה עבור סה כ 14 דקות. להפעיל את המיקרוגל.
- לשטוף את הדגימות 4 x עם 1 מ"ל של אצטון 40 s ב 250 ואט (כפי שנעשה צעד 2.5).
- לחדור עם 1 מ"ל הגדלת ריכוזים של שרף אצטון (ראה טבלה של חומרים) של 25%, 50%, 75%, 90%, 100% ו 100% למשך 3 דקות כל-250 W. פיפטה השרף לתוך צינור התגובה, להכניס את הצינורית בתוך המיקרוגל, והגדר את התוכנית כוח בלי להתרסק l של 250 ואט (עם הפונקציה ואקום מופעל) עבור מינימום 3 להפעיל את המיקרוגל.
3. מינימלי שרף הטבעה8
- להוציא הצינור התגובה עם קיסם, המקום אותם על חתיכת פלסטיק הסרט (ראה טבלה של חומרים) nervus השוקה של C. elegans .
- השתמש בקיסם כדי דחף בעדינות את הדגימה על הסרט פלסטיק עד שרף הנותרים לא מזוהה. השתמש מנורת הלוגן חימום (ראה טבלה של חומרים) אז השרף הופך צמיגה פחות והוא מסוגל להסיר בקלות רבה יותר. המקום מנורת הלוגן קרוב מספיק כדי לחמם את השרף (להיות זהירות לא לשרוף את הידיים).
- פולימריזציה הדגימות לפחות 48 שעות ב 60 מעלות צלזיוס על גבי הסרט פלסטיק בתנור.
4. הכנה שיקרתי-SEM
- לגזור את הדגימות polymerized יחד עם הסרט פלסטיק באמצעות סכין גילוח בגודל מתאים לספח SEM וחבר אותם הספחים SEM באמצעות שרף כסף מוליך (ראה טבלה של חומרים). פולימריזציה שוב ב 60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות או לילה.
- המעיל לרעוד. להוציא הדוגמאות על ה-SEM דפק עם זהב 1 דקות ב- 35 באמצעות coater לרעוד. להוציא את אמא (ניתן להשתמש גם פלטינה/פלדיום; ציפוי עבה nm 10 מספיקה) ומניחים אותם בתוך שיקרתי-ב-SEM.
5. נתוני הרכישה בתוך ה-שיקרתי-SEM
- תמונה הדגימות עם גלאי משני אלקטרונים באמצעות תוכנה בסיסית נהיגה המיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים). המדגם צריך להיות בכיוון הנכון כך האזור של הריבית (למשל, החלק האמצעי של השוקה nervus או של C. elegans) בתוך שדה הראייה.
הערה: כדי לבצע רכישת נתונים, להטות את הבמה למיקום כך לדוגמה פונה הקרן יון בזווית של 90° מרחק עבודה המתאימה (5 מ מ) בנקודת מקרים כביכול של הקורה יון, אלקטרון. באמצעות המכשיר שלנו, זו מושגת על הטיה הבמה של 54° ומרחק עבודה 5 מ מ. - כדי להגדיר את המיקום הנכון של המדגם, מרכז תכונה נפוצה ב 0° הטיה תוך הדמיה עם גלאי משני אלקטרונים. לאט הטיה ° 54 (5 מעלות, 20 מעלות, 54°), recentering של אותו אובייקט על-ידי הזזת M-הציר.
- למצוא את נקודת מקרים על ידי מרכוז תכונה תוך הדמיה עם גלאי משני אלקטרונים ב ° 54, ולאחריו לעבור בתכונת המיקום המרכזי במצב שיקרתי. לבצע זאת על-ידי הצגת על הכוונת בעוד SEM לתוכנה יש אינדיקציה של המרכז. לאחר מכן קודם להזיז את התכונה הדגימה שנבחרה למרכז לאזור התמונה באמצעות הפונקציה נקודת מרכז של התוכנה SEM. אז מרכז התכונה לאורך ציר ה-y באמצעות הזזת את הבמה ב- z. כל היסט הסופי בין שיקרתי SEM מתוקנת עם משמרת קרן SEM.
- לפתוח את התוכנה מתקדם (ראה טבלה של חומרים) להקלטת 3D datasets ופעל אשף התוכנה צעד אחר צעד.
- -האזור של הריבית, פיקדון פחמן או פלטינה (400 ננומטר) על רועי באמצעות של נה 3 הנוכחית כדי לאפשר אפילו כרסום ולהפחית חפצים המושרה על-ידי חיוב.
הערה: על ידי ציור האזור לעניין להיות פיקנטיים על פני השטח הדגימה עם תמונה עם שיקרתי (רוחב, גובה, עומק), התוכנה מחשבת, superimposes הגדלים של התכונות הכנה דגימה שונים, כגון תעלות כדי להיות פיקנטיים או שטח פלטינה/פחמן התצהיר. כמו כן, להיות זהיר הדימות השטח מדגם עם זרמים שיקרתי גם-גבוהה, כמו זו עלולה לגרום נזק המשטח מדגם. זרם של הרשות הפלסטינית 50 מספיקה עבור הדמיה. - השתמש קרן יון ממוקד כדי מיל תעלה לחשוף את האזור של הריבית (ROI) באמצעות 15/30 נה הנוכחי.
- השתמש קרן יון ממוקד להבריק חתך עם נה 7 הנוכחית.
- לאחר שסיים את הכנת הדוגמא, הגדר את פרמטרי הדימות הבאים: מקרים כרסום פרמטרים בכרטיסיה התקנה שיקרתי (שיקרתי הטחינה נוכחי); SEM הדמיה בפרמטרים הכרטיסיה הגדרת ואת הדימוי כוונון הפרמטרים בכרטיסיה SEM כוונון אוטומטי (לבצע פוקוס אוטומטי ו autostigmation כל 60 דקות, 50 ננומטר גודל הפיקסל, להתעכב זמן 3, שורה 3 ממוצע). למטב את זה עבור כל דגימה.
- כדי למנוע כל הסחף תרמי גורם הבלוק-הפנים דריפט במהלך הריצה, לעזוב את החדר כבר לפחות שעתיים לפני תחילת הרכישה.
- לרכוש את ערכת הנתונים טחנת רציפה ולרכוש מצב עם הרשות 700 שיקרתי הנוכחי. שימוש 1.5 kV (מצב אנליטית, 900 V) גלאי ESB עם מתח רשת של 400 V לרכוש תמונות כל אחד עם 5 גודל הפיקסל של nm, שימוש בתוכנה מתקדמת (ראה טבלה של חומרים) 50 עובי הפרוסה ננומטר. ייבוא תמונות אחד לוקח בערך 1.5 דקות עם זמן להתעכב על 6 µs.
- התחל את חדרי קירור והקפאה. תמונת שיקרתי-הטחינה הנוכחית היא רכשה כדי להבטיח כי המדגם לא זז, האזור הנכון עניין נבחרה. התאם במידת הצורך.
6. ויזואליזציה של נתונים
- פתח תמונות בפיג'י על-ידי גרירת התיקייה הכוללת את כל התמונות לתוך פיג'י ובחר מחסנית וירטואלי.
- לחתוך את האזור עניין שימוש בכלי מלבן (תמונה > חיתוך).
- להפוך את הנתונים כדי להציג את הניגוד מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מסורתי עם ממברנות להופיע בחושך (עריכה > ' היפוך ').
- השתמש TrackEM214 (פיג'י15) עבור יישור. לטעון את הנתונים לתוך TrackEM2 (קובץ > ניו > TrackEM2) על ידי לחיצה על שכבה. אחרי כל התמונות נטענים, ליישר אותן באמצעות פונקציית פסיפס רב-שכבתית (לחץ לחיצה ימנית על תמונה > יישור > יישר פסיפס רב-שכבתית). לאחר יישור, התמונות מיוצאות כקובצי tiff בודדים (לחץ לחיצה ימנית על תמונה > ייצוא > תמונה שטוחה הופכים). בחר תמונות כל לייצא ובחר שמור בקובץ.
- לשימוש שלאחר עיבוד, טשטוש לפי עקומת גאוס (תהליך > מסננים > טשטוש לפי עקומת גאוס; סיגמא 2) ולשיפור חדות מקומי (תהליך > לשפר את הניגודיות המקומי; CLAHE: גודל הבלוק 127, היסטוגרמה פחי 256, השיפוע המרבי 1.5), אשר מוחלות בפיג'י חלקה בתמונה ולקבל יחס אות לרעש טוב יותר.
- IMOD16 משמש כדי לבצע פילוח ידנית ותנסו לדמיין את המבנה של הריבית ב- 3D. פתח את ערכת הנתונים ב- IMOD ובחר כלי ציור (מיוחדים > כלי ציור) כדי לבצע את פילוח ידנית. כלים ידניים שונים ניתן לעקוב אחר המבנה של עניין בכל נפח (למשל הצירוף, Sculpt). להשתמש בדפדפן תמונת מיקרוסקופ (MIB17) עבור פילוח חצי אוטומטיים.
Representative Results
זרימת העבודה מופעלת באמצעות דגימה (כאן, של השוקה nervus העכבר טרי גזור) שיוצבו מתכת ספקים עבור קירור בלחץ גבוה (איור 1 א'). נשאים התאוששה חנקן נוזלי (איור 1b) והניח ביחידת החלפה ההקפאה על גבי הקפוא הראשונה הכימי קוקטייל (איור 1 c). אחרי ארוכה להקפיא פרוטוקול החלפת כולל 2% אוסמיום ארבע-חמצני ו- 0.1% uranyl אצטט, הדגימות יוסרו נושאות בטמפרטורת החדר (איור 1 d). כדי לשפר עוד יותר את הניגוד, הדגימות של העברת צינורות פלסטיק יעובדו במיקרוגל (איור 1e). תא ואקום של יחידת בקרת טמפרטורה משמשות כדי לייעל את התהליך (איור 1f).
כדי שתוכל לבצע את ההטמעה שרף מינימלי, נדרשים קיסמים, יריעות פלסטיק (איור 2 א). לאחר שחדר הדגימות עם שרף באמצעות המיקרוגל, הם מניחים על חתיכות של הסרט פלסטיק, זז עד שרף לא נשאר על פני השטח הדגימה. מנורת הלוגן משמש כדי לסייע לנקז שרף הנותרים ולעזוב את הדגימה מינימלית מוטבע (איור 2b) על הסרט פלסטיק. יצוין, כי שרף יותר הוסרו מחלקו העליון של המדגם הוא טוב. עדיין צריך להיות כמות קטנה שמאלה מתחת המדגם לשמור אותו למצע. המדגם להיות polymerized על הסרט פלסטיק חתוך, רכוב על גבי ספח SEM עם כסף מוליך שרף (איור 2 c). ה-stub של polymerized במשך לפחות 4 שעות ב- 60 ° צלזיוס (איור דו-ממדי). הרכיבים אמור. להיות מעורב באופן יסודי או התערובת לא ייתכן פולימריזציה כראוי. כדי למנוע טעינה בתוך המיקרוסקופ האלקטרוני סריקה, ה-stub היא לרעוד. להוציא מצופה זהב או פלטינה/פלדיום (איור 2e).
הדגימות להציב שיקרתי-SEM, עם תמונה עם גלאי משני אלקטרונים למקד את האזור של הריבית (איור 3ae). קרן יון משמש כדי להסיר את החומר ישירות לפני האזור עניין לחשוף חתך רוחב (איור 3b3f-d, - h). פרוטוקולים סטנדרטיים סובלים לעתים קרובות חוסר חדות ממברנה (איור 3bf), ואילו פרוטוקול משופרת מספק ניגוד חזק ממברנה (איור 3 c-d, דור 3-h).
נתונים EM (לאחר עיבוד שלאחר) הם visualized באמצעות IMOD, תמונה ועיבוד דגמי התוכנית. כדי להשיג הבנה טובה יותר של הנתונים התלת-ממדיים, reslicing וירטואלי של הנתונים משמש (איור 4a). מבנים שונים של ערכת הנתונים הם מחולקים באופן ידני (איור 4b-d).
איור 1: שתרם לאפס ההקפאה-החלפת, עיבוד בסיוע מיקרוגל. (א) לטעום המוביל המכיל השוקתי nervus את העכבר, קנה המידה של בר 3 מ"מ. הספק (ב) מדגם המכיל את השוקתי nervus העכבר לאחר בלחץ גבוה לקפוא, סולם בר 3 מ מ. (ג) אוטומטי ההקפאה החלפת (AFS) יחידת עם דגימות. שיבוץ: מיכל מתכת בהזמנה אישית עבור מבחנות דגימה עד 23 ושתי מבחנות גדולות המכילים חומרים כימיים AFS. (ד) דגימות הוסר מן נושאות בקערת זכוכית בתוך אצטון, קנה המידה בר 3 מ מ. (e) דגימות התגובה צינורות כדי לשים במיקרוגל לעיבוד. יחידה (נ) תא ואקום ובקרת טמפרטורה של המיקרוגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שרף מינימלי הטבעה והכנה שיקרתי-ב-SEM. (א) הסרט פלסטיק, קיסמים המשמשים עבור שרף מינימלי הטבעה, סולם בר 4 ס מ. (ב) Nervus השוקתי נסחטה שרף על גבי הסרט פלסטיק, סולם בר 250 מיקרומטר. (ג) Nervus השוקתי polymerized בסרט פלסטיק, ואז לחתוך, רכוב על גבי ה-stub SEM עם סילבר שרף מוליך, לטפס בר 250 מיקרומטר. (ד) דגימות polymerized על גבי ה-stub SEM, סולם בר 3 מ מ. בר 3 מ מ. (e) דגימות מצופה זהב על ה-stub SEM, סולם אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הכנת המדגם בתוך שיקרתי-ב-SEM. (ו- e) משני אלקטרונים התמונה שבתוך ה-שיקרתי-SEM של המדגם על פני השטח (א) סולם Nervus השוקה, בר 100 מיקרומטר. (ה) C. elegans, סולם בר 2 מיקרומטר. (b-d), חתך רוחב (f-h) באמצעות דגימה באמצעות גלאי ESB עבור הדמיה. (b ו- c) Nervus השוקה, גודל בר 2 מיקרומטר. (f ו- g) C. elegans, סולם בר 1 מיקרומטר ו- 200 ננומטר. (b ו f) מוצגות התוצאות של הקפאה בלחץ גבוה וההחלפה להקפיא ללא שיפור, ואילו כל שאר תמונות להראות תוצאות של החלפת ההקפאה משופרת. (d ו- h) תמונה מפורטת של המדגם באמצעות גלאי ESB. (ד) Nervus השוקה, סולם בר 200 ננומטר. (h) בקנה מידה C. elegans, בר 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תמונה ויזואליזציה של רכישת. (א) אם הנתונים המוצגים IMOD עם כמעט resliced x / z - ו y/z-מטוסים, קנה המידה בר 2 מיקרומטר. (b) Segmented אקסונים על אותם נתונים (כחול), שלך מחודשת חבילות (אדום), עטיפות מיאלין (צהוב וכתום) ועל המיטוכונדריה (טורקיז), גודל בר 2 מיקרומטר. (c ו- d) דגם התלת-ממד, סולם בר 2 מיקרומטר, 500 ננומטר . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
הפרוטוקול פותחה כדי להמחיש את שימור אופטימלית והניגודיות כדי לבצע הדמיה בלוק טורי-פרצוף עם שיקרתי ב- sem לכן, בחרנו ליישם הקפאה-הנייח ואחריו פוסט-צביעת באמצעות הקפאת החלפת ועיבוד בסיוע מיקרוגל. לכן, פרוטוקול זה הוא מוגבל כי הם קטנים מספיק עבור לקפוא בלחץ גבוה. מגבלות גודל של 3 עד 6 מ מ רוחב ועובי של מיקרומטר ~ 200 נקבעו לפי גודל מדגם ההובלה, אשר תואם את גודל המדגם זה שיכול להיות קפוא כראוי בטכניקה זו. זה רלוונטי עבור המדגם עצב העכבר, מכיוון בעצב גדול מדי בקוטר להשתלב נושאות 0.2 מ מ הנדרשים כדי להבטיח הקפאה נכונה. לכן, מומלץ ניתוח זהיר של עצב קטנים יותר כגון העצב הטיביאלי או עצב דק אחרים כגון העצב הירך. מאז למעטפת מיאלין רגישה מותח, נהדר חייבים להקפיד במהלך ניתוח של עצב רענן בר -קיימא כדי למנוע טיפול חפצים. באופן כללי, מעשית דוגמאות בלבד אמור לשמש ללימודי מיקרוסקופית אלקטרונים.
עיבוד בסיוע מיקרוגל והטבעה שרף מינימלי מתוכננים להאצת ההכנה ומיקוד בתהליך. עיבוד בסיוע מיקרוגל החלת השינוי OTO פרוטוקול4 משמש עבור קיבוע כימי בטמפרטורת החדר. מיקרוגל ביתי לא תניב את אותן תוצאות, שכן יש אין חלוקה הומוגנית של גלי מיקרו, הטמפרטורה שלו לא נשלט, יש אין ואקום זה יכול להיות מיושם. קטן יותר לדוגמה, חדירה טובה יותר של הכימיקלים; לכן, התוצאות הטובות ביותר מושגות על ידי דגימות קטנות יותר. כדי למנוע נזק המדגם על ידי התחממות יתר, בקרת טמפרטורה ויישום של הכוח המינימלי הדרוש מיקרוגל הם קריטיים. ניתן לבצע את השלבים בעיבוד בסיוע מיקרוגל על הספסל אם אין מיקרוגל זמינים, אשר יוביל פעמים עיבוד ארוך יותר. ישירות מטרה מבנים בעוד SEM, זה הכרחי להסיר כמה שיותר שרף ככל האפשר מהחלק העליון של המדגם. לאחר הקלטת dataset, שלאחר עיבוד של הנתונים הגולמיים יש צורך להקטין את גודל הקובץ וגם לשפר את יחס אות לרעש. טכניקות הדמיה כרך מודרני לייצר כמויות גדולות של נתונים. לכן, כדי לבצע עיבוד נתונים בצורה מספקת ומהירה, דרוש זיכרון RAM המספיק בתחנת העבודה. לפעולות יישור נדרש לפחות שתי פעמים יותר RAM כגודל הנתונים (dataset).
פרוטוקול זה נבדקו על השוקה nervus של העכבר באותה מידה כמו C. elegans. אולם ואח. 12 שימוש צעד שיפור דומה לאחר החלפת ההקפאה שלהם על הספסל להכנה של C. elegans. עבור כל שאר אורגניזם מודל כמו דג זברה, התאמות של הפרוטוקול הם הצורך סביר. שינוי אפשרי אחד הוא לשנות את ההרכב של ההחלפה ההקפאה קוקטייל, כמו למשל על ידי הוספת מים המשמש עבור שיפור ניגודיות18. יתר על כן, משך ההחלפה ההקפאה יש להתאים את הדגימה, יכול להתקצר במידה ניכרת על-פי פרוטוקול החלפת19הקפאה מהירה. אפשרות אחת היא היישום של עצבנות עבור מאיץ את תהליך החלפת ההקפאה20. לאחר ההחלפה ההקפאה, עוד שינויים אפשריים, כגון יישום חוזר ונשנה של שיפור כימיקלים, אוסמיום ארבע-חמצני21. במהלך עיבוד מיקרוגל, טמפרטורה, דגירה פעמים, הגדרות צריכת החשמל יכולים להיות מגוונים כדי למטב את תוצאות המדגם בהתאמה.
פרוטוקול זה מראה כי שיפור כזה יכול להיות משולב עם הקפאת החלפת פרוטוקולים אחרים וסוגים שונים של דגימות כפי שתואר על ידי מסדרון12 הם צילמו שיקרתי-SEM או באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה בלוק טורי-פרצוף. טכניקות הדמיה אלה דורשים חדות משופרת, וזה פחות חשוב במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
Disclosures
שאין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
שיקרתי-SEM של א. צ. (המיקום של המפעיל שיקרתי-SEM) ממומנות על ידי האשכול של מצוינות, דויטשה פתוח (DFG) מחקר מרכז הננומטרי מיקרוסקופ ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB). אנו מודים המעבדה של תומאס מולר-רייכהרט למתן את הדגימות C. elegans . אנו מודים אולריך וייקרט על השתתפות בסרט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
- Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
- Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
- Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
- Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
- Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
- Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
- Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
- Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
- Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).
