Summary
Her presenterer vi en protokoll for å kombinere to sample behandling teknikker, høytrykks frysing og mikrobølgeovn-assistert prøve behandling, etterfulgt av minimal harpiks innebygging for å skaffe data med en fokusert ion strålen scanning elektron mikroskop (FIB-SEM). Dette er demonstrert ved hjelp av en mus tibial nerve eksempel og Caenorhabditis elegans.
Abstract
Beskrevet eksempel forberedelse teknikken er utviklet for å kombinere den beste kvaliteten på ultrastructural bevaring med egnede kontrasten for bildebehandling modalitet i en fokusert ion strålen scanning elektron mikroskop (FIB-SEM), som brukes til å få stabler av sekvensielle bilder for 3D rekonstruksjon og modellering. Høytrykks frysing (HPF) lar nær innfødt strukturelle bevaring, men den etterfølgende fryse substitusjon ofte gir ikke tilstrekkelig kontrast, spesielt for en større prøven, som høykvalitets bildebehandling i SEM kreves for 3D rekonstruksjon. Derfor i denne protokollen utføres etter fryse substitusjon, kontrasterende trinnene ved romtemperatur. Selv om disse trinnene utføres i en mikrobølgeovn, er det også mulig å følge tradisjonelle benk behandling, som krever lengre inkubasjon ganger. Etterfølgende innebygging i minimale mengder harpiks gir raskere og mer nøyaktig målretting og forberedelse inne liten LØGN-SEM. Denne protokollen er spesielt nyttig for prøver som krever forberedelse av høytrykks frysepunktet for en pålitelig ultrastructural bevaring, men ikke oppnå nok kontrast under fryse substitusjon volum bildevisning FIB-SEM. I kombinasjon med minimal harpiks innebygging, gir denne protokollen en effektiv arbeidsflyt for kjøp av høy kvalitet volumdata.
Introduction
Høytrykks frysing er prøven forberedelse metoden for valg for å få høy kvalitet ultrastructural bevaring, som representerer den opprinnelige tilstanden i en utvalg mye bedre enn konvensjonelle forberedelse metoder å bruke kjemiske fiksering1. Denne cryo-forberedelser metoden er nyttig for prøver som myelinated musen vev2 og strenge krav for bruk av modell organismen Caenorhabditis elegans3. Etter fryse substitusjon og harpiks innebygging analyseres vanligvis disse prøvene av overføring elektronmikroskop (TEM) eller electron tomografi (ET). Hvis større volumer må avbildes bruker FIB-SEM eller seriell blokk-ansikt imaging for høyoppløselig store 3D rekonstruksjoner, vår erfaring riktig bildebehandling av SEM er ofte hemmet av mangel på kontrast. I FIB-SEM, er bildet vanligvis lagret av gjenkjenning av backscattered elektroner fra primære elektronstråle. Avkastningen av backscattered elektroner er proporsjonal med innholdet av tungmetaller i utvalget. Derfor var protokoller spesielt designet for volum for å forbedre kontrasten av ekstra heavy metal impregnering. Slike metoder er basert på kjemisk faste utvalg og bruker en kombinasjon av osmium tetroxide-thiocarbohydrazide-osmium tetroxide4, som beskrevet av Knott et al.5, for seriell blokk-ansikt og fokusert ion strålen skanning elektronmikroskop. Endringer inkludert bruk av formamide og pyrogallol6 eller bly aspartate7 er vellykket brukt for forskjellige Bildeteknikker.
Protokollen her kombinerer cryo-utarbeidelse av prøver av HPF og fryse substitusjon med påfølgende mikrobølgeovn-assistert behandling for utvidet kontrast med thiocarbohydrazide/osmium tetroxide i aceton ved romtemperatur. Dette viser vi på myelinated nervus tibialis mus og Caenorhabditis elegans, som representerer prøver som krever høytrykks frysepunktet for høykvalitets ultrastructural bevaring. I tillegg vises hvordan, etter dehydrering og infiltrasjon, prøvene er integrert med som liten harpiks som mulig. Denne minimale harpiks innebygging8 gir raskere målretting av interesse og reduserer tiden brukt på prøve behandling, inkludert mindre tid kreves for utsette regionen rundt med ion strålen. Etter utfører ytterligere eksempel forberedelsene i mikroskopet, utføres imaging og fresing av utvalget kontinuerlig for å erverve en bunke med bilder. For 3D-visualisering brukes bildebehandling (IMOD) til å rekonstruere deler av datasettet.
Våre arbeidsflyt beskriver hvordan den mest passende kontrasterende av prøver for volum bildebehandling kan kombineres med beste ultrastructural bevaring av HPF og Frys substitusjon. Dette er nyttig for prøver som strengt krever cryo-forberedelser. Programmer er begrenset til små prøver som tilberedes av HPF. Eksempler på ulike natur, som plantemateriale eller mikroorganismer, krever denne protokollen tilpasning.
Protocol
Alle eksperimenter inkludert fra dyr beskrevet her er godkjent av den institusjonelle Animal Care og lavere Sachsen staten kontoret for kunden beskyttelse og mat sikkerhet (LAVES).
1. høytrykks frysing og fryse substitusjon
- Dissekere nervus tibialis fra en mus (f.eks C57Bl6N, 12 uker, kvinnelige)9.
- Fordype nervus tibialis i en dråpe 20% polyvinylpyrrolidone (1 g av PVP i 5 mL) i fosfat bufret saltvann (PBS) og klippe stykker av 2 mm lengde. Deretter plasserer den i en metall eksempel operatør (Type A, 0.2 mm dybde) ved hjelp av fine pinsett. Legge til en annen flat bærer (Type B) belagt med et tynt lag av hexadecane som et lokk og sett denne samlingen inn prøven kassetten.
- Overføre flere C. elegans suspendert i en dråpe 20% bovin serum albumin (BSA) i M9 (se Tabell for materiale) med en engangs plast pipette inn i metall bærer (Type A). Deretter legge til en andre transportør som lokket på toppen (Type B) og montere kassetten.
- For begge eksemplene, fortsetter med følgende: høytrykks fryse eksempel carrier samlingene en etter en ved å laste dem inn i tre deler kassetten i lasting stasjonen i høytrykks fryseren. Trykk prosessen etter produsentens bruksanvisningen.
Merk: Begge typer prøver kan behandles sammen i påfølgende fryse substitusjon. - Plass prøvene i cryovials som inneholder 2 mL frosne 0,1% garvesyre i aceton. Utfør overføringen i et badekar med flytende nitrogen uten spilling flytende nitrogen i hetteglass. Overføre cryovials til en automatisk fryse substitusjon enhet10 satt-90 ° C og starter programmet.
Merk: Prøvene er holdt i-90 ° C i 100 h. garvesyre før osmification blir brukt som mordant for å øke opptaket av osmium tetroxide11. - Manuelt vaske prøvene 3 x i 30 min med 2 mL av acetone ved-90 ° C i fryse substitusjon enheten.
- La prøvene i 2 mL 2% osmium tetroxide, 0,1% uranyl acetate på aceton for fortsatt farging i automatiske fryse substitusjon enhet for 7 h på-90 ° C.
FORSIKTIG: Osmium tetroxide er giftig og skal håndteres under avtrekksvifte, og verneutstyr bør brukes.
Merk: Fryse substitusjon enheten automatisk hever temperaturen til-20 ° C på 5 ° C/t. Prøvene holdes på 20 ° C 16 h i fryse substitusjon enheten. Temperaturen økes automatisk til 4 ° C på 10 ° C/t. - Utveksle osmium tetroxide løsningen med ren aceton når temperaturen har nådd 4 ° C. Fjerne cryovials fra fryse substitusjon enheten.
2. mikrobølgeovn-assistert behandling
Merk: Utføre fremgangsmåten ved romtemperatur12 bruker en temperaturkontroll enhet for å holde temperaturen stabil (se Tabell for materiale).
- La caps av reaksjon tuber åpen under behandlingen i mikrobølgeovnen.
- Ta metall eksempel bærere av cryovials og fjerne prøvene fra metall transportøren med fine tang eller en nål, mens eksemplene senket i aceton i et ur glass rett (150 mm).
- Overføre prøvene til 2 mL reaksjon rør med fine tang eller en pipette og vask med 1 mL av aceton fire ganger for 40 s på 250 W.
FORSIKTIG: Thiocarbohydrazide er giftig og skal håndteres under avtrekksvifte, verneutstyr bør brukes. - Flekken prøver med 1 mL 1% thiocarbohydrazide i aceton i 14 min på 150 W å øke kontrasten. For å utføre den flekker, Pipetter thiocarbohydrazide løsningen i reaksjon røret, sett røret i mikrobølgeovn og sette programmet til et power 150 W (med vakuum funksjonen aktivert) i 2 minutter på/2 minutter av, gjentar i 14 minutter totalt. Starte mikrobølgeovn.
Merk: Thiocarbohydrazide reagerer med osmium tetroxide som ble brukt under fryse substitusjon. Den danner en bro, slik at flere osmium tetroxide skal deponeres på den opprinnelige osmium tetroxide nettsteder13. - Vask prøvene 4 x med 1 mL av aceton for 40 s på 250 W. Pipette aceton i en reaksjon tube, sett røret i mikrobølgeovn og velg 250 W for 40 s. Start mikrobølgeovn.
- Stain i 1 mL av 2% osmium tetroxide i aceton i 14 min på 150 W. Pipette osmium tetroxide løsningen i en reaksjon tube sett røret i mikrobølgeovn og sette programmet til et power 150 W (med vakuum funksjonen aktivert) i 2 minutter på/2 min av , gjentar i 14 minutter totalt. Starte mikrobølgeovn.
- Vask prøvene 4 x med 1 mL av aceton for 40 s på 250 W (som gjort i trinn 2.5).
- Infiltrere med 1 mL økende konsentrasjoner av harpiks i aceton (se Tabell for materiale) 25%, 50%, 75%, 90%, 100% og 100% for 3 min hver på 250 W. Pipette harpiks i en reaksjon tube, sett røret i mikrobølgeovn og sette programmet til en strøm leve l 250 W (med vakuum funksjonen aktivert) 3 min. starte mikrobølgeovn.
3. Minimal harpiks innebygging8
- Ta nervus tibialis og C. elegans av reaksjon røret med en tannpirker og legg dem på et stykke plast film (se Tabell for materiale).
- Bruk tannpirker Skyv prøven på plastfilm til ingen gjenværende harpiks oppdages. Bruk en halogenlampe for oppvarming (se Tabell for materiale) så harpiks blir mindre tyktflytende og kan fjernes lettere. Sted halogenlampen nær nok til å varme opp harpiks (å være forsiktig med å brenne hender).
- Danner prøvene for minst 48 timer på 60 ° C over plastfilm i ovnen.
4. forberedelse til FIB-SEM
- Kuttet ut polymerized prøvene sammen med plastfilm med et barberblad i størrelse passer SEM stubben og feste dem til SEM fødsler bruker en ledende sølv harpiks (se Tabell for materiale). Danner igjen ved 60 ° C i minst 4 timer eller over natten.
- Frese pels prøvene på SEM spire med gull for 1 min på 35 mA bruker en frese coater (platina/palladium kan også brukes, et 10 nm tykt belegg er tilstrekkelig) og plasser dem innenfor FIB-SEM.
5. datainnsamling inne liten LØGN-SEM
- Bilde prøver med sekundær electron detektoren ved hjelp av grunnleggende programvare kjører mikroskopet (se Tabell for materiale). Utvalget skal orientert slik at regionen rundt (f.eks midtre del av nervus tibialis eller C. elegans) i synsfeltet.
Merk: For å utføre datainnsamling, tilt scenen til en posisjon slik at prøven ansikter ion bjelken i 90° vinkel på en passende arbeidsavstand (5 mm) i såkalte tilfeldigheter poenget med ion og elektron strålen. Bruke våre instrument, oppnås dette på en scene tilt 54° og 5 mm arbeidsavstand. - Sette opp riktig posisjon av prøven, midtstille en vanlig funksjon på en 0° tilt mens bildebehandling med sekundær electron detektoren. Sakte recentering tilt til 54° (5°, 20°, 54°), samme objekt ved å flytte M-aksen.
- Finne et tilfeldig punkt ved å midtstille en funksjon under bildebehandling med sekundær electron detektoren på 54°, etterfulgt av flytte funksjonen til den sentrale posisjonen i FIB modus. Gjøre dette ved å vise trådkorset i SEM programvaren har en indikasjon på midten. Så først flytte funksjonen utvalgt utvalg midtpunkt bildeområdet ved hjelp av funksjonen midten punkt av SEM programvaren. Deretter sentrum funksjonen langs y-aksen ved å bevege scenen i z. Siste forskyvningen mellom LØGN og SEM er korrigert med SEM strålen SKIFT.
- Åpne Avansert programvare (se Tabell for materiale) for registrering av 3D datasett og følge veiviseren trinnvis.
- På området av interesse, innskudd karbon eller platinum (400 nm) på Avkastningen ved hjelp av en 3 nA gjeldende tillate selv fresing og redusere gjenstander indusert av lading.
Merk: Ved å tegne regionen rundt å være malt på prøveoverflaten fotografert med liten LØGN (bredde, høyde, dybde), programvaren beregner og superimposes størrelsen på de forskjellige utvalg forberedelse funksjonene, som skyttergravene skal frest eller område for Platinum/karbon deponering. Også være forsiktig Imaging eksempel overflaten med for høy FIB strøm, da dette kan skade overflaten prøven. En strøm av 50 pA er tilstrekkelig for bildebehandling. - Bruk fokusert ion strålen til mill en grøft for å avsløre regionen rundt (ROI) ved hjelp av en 15/30 nA gjeldende.
- Bruk fokusert ion strålen for å polere tverrsnitt med en 7 nA gjeldende.
- Etter endt eksempel utarbeidelse, angi følgende tenkelig parametere: LØGN fresing parametere i oppsettkategorien FIB (FIB fresing strøm); SEM imaging parametere i oppsettkategorien og bildet tuning parametere i kategorien SEM AutoTune (utføre autofokus og autostigmation hver 60 min., 50 nm pikselstørrelsen, holdetiden 3, linje gjennomsnittlig 3). Optimalisere dette for hvert utvalg.
- For å hindre noen termisk drift forårsaker blokk-ansiktet til drift under kjøringen, forlate rommet for minst 2 timer før oppkjøpet.
- Skaffe dataset i en kontinuerlig mill og kjøpe modus med en 700 pA FIB gjeldende. Bruk 1.5 kV (analytiske modus, 900 V) ESB detektor med en rutenettet spenning på 400 V hente bilder med 5 nm pikselstørrelse ved hjelp av avansert programvare (se Tabell for materiale) og 50 nm skive tykkelse. En bildeopptak tar ca 1,5 min bor tid av 6 µs.
- Starte av datainnsamling. En liten LØGN bilde på fresing gjeldende anskaffes prøven ikke flytte og høyre regionen rundt er valgt. Juster om nødvendig.
6. datavisualisering
- Åpne bilder i Fiji ved å dra mappen som inneholder alle bildene i Fiji, og velg Virtuelle stabel.
- Beskjære regionen rundt med rektangelverktøyet (bilde > Beskjær).
- Invertere dataene slik at den tradisjonelle overføring elektronmikroskop kontrasten med membraner i mørket (Rediger > Inverter).
- Bruk TrackEM214 (Fiji15) for justering. Laste inn dataene i TrackEM2 (Fil > Ny > TrackEM2) ved å klikke på lag. Etter at alle bildene er lastet, justere dem flerlags mosaikk funksjonen (Høyreklikk på bilde > Juster > Juster flerlags mosaikk). Etter justering bilder eksporteres som individuelle tiff-filer (Høyreklikk på bilde > Eksporter > gjør flat bilde). Velg alle bilder som skal eksporteres, og velg Lagre til fil.
- For etterbehandling, bruk en Gaussian blur (prosessen > filtre > Gaussian blur, sigma 2) og lokale contrast enhancement (prosessen > øke lokal derimot; CLAHE: blocksize 127, histogrammet hyller 256, maksimal helling 1.5), som brukes i Fiji glatt bildet og få et bedre signal-til-støy-forhold.
- IMOD16 brukes til å utføre en manuell segmentering og visualisere strukturen av interesse i 3D. Åpne dataset i IMOD og velger tegneverktøy (spesielle > tegneverktøy) utføre manuell segmenteringen. Forskjellige manuelle verktøy kan brukes å følge strukturen rundt hele volumet (for eksempel delta, skulptur). Bruk mikroskopi bilde nettleser (MIB17) for halvautomatisk segmentering.
Representative Results
Arbeidsflyten starter med en prøve (her, en fersk dissekert musen nervus tibialis) blir plassert i metall stativer for høytrykks frysing (figur 1a). Bærere er fikset flytende nitrogen (figur 1b) og plassert i en fryser substitusjon enhet over den frosne første kjemiske cocktail (figur 1 c). Etter en lang fryse substitusjon protokollen inkludert 2% osmium tetroxide og 0,1% uranyl acetate, blir prøvene fjernet fra bærere ved romtemperatur (figur 1 d). For å forbedre kontrasten, overføres prøvene til plastrør behandles i mikrobølgeovn (figur 1e). Vakuum kammer og temperaturkontroll enhet brukes til å optimalisere prosessen (figur 1f).
For å kunne utføre minimale harpiks innebygging, tannpirkere og ark av plast film er nødvendig (figur 2a). Etter infiltrere prøvene med harpiks bruker mikrobølgeovn, er de plassert på biter av plast film og flyttet rundt til ingen harpiks er igjen på prøven overflaten. En halogenlampe brukes til å hjelpe avløp gjenværende harpiks og la prøven minimal innebygd (figur 2b) på plastfilm. Det bør bemerkes at flere harpiks fjernes fra toppen av prøven er bra. Det bør fortsatt være litt igjen under prøve å holde det festet til underlaget. Prøven blir polymerized på plastfilm er kuttet og montert på SEM spire med sølv ledende harpiks (figur 2 c). Stubben er polymerized minst 4 h på 60 ° C (figur 2d). Komponentene bør blandes grundig eller blandingen kan ikke danner riktig. For å unngå lading inne scanning elektron mikroskop, er stubben frese belagt med gull eller platina/palladium (figur 2e).
Prøvene er plassert i FIB-SEM og fotografert med en sekundær electron detektor målrette regionen rundt (figur 3ae). En ion stråle brukes til å fjerne materiale rett foran regionen rundt å avsløre et tverrsnitt (figur 3bd 3f-h). Standardprotokoller lider ofte av mangel på membran kontrast (figur 3bf), mens den forbedrede protokollen gir en sterk membran kontrast (Figur 3 cd 3 g-h).
EM dataene (etter post-prosessering) er visualisert bruker IMOD, et bilde prosessering og modellering program. For å oppnå en bedre forståelse av 3D-informasjon, virtuelle reslicing data brukes (figur 4a). Ulike strukturer av datasettet er segmentert manuelt (figur 4bd).
Figur 1: høytrykks frysing, fryse-substitusjon og mikrobølgeovn-assistert behandling. (a) prøve carrier med musen nervus tibialis, skalere bar 3 mm. (b) prøve carrier med musen nervus tibialis etter høytrykks frysing, bar 3 mm. (c) automatisk fryse substitusjon (AFS) skalaenheten med eksempler. Innfelt: skreddersydd metall beholder for opptil 23 eksempel ampuller og to store ampuller som inneholder kjemikalier i AFS. (d) prøver å bli fjernet fra operatører i et glass rett i aceton, skalere bar 3 mm. (e) prøver i reaksjon rør settes i mikrobølgeovn for behandling. (f) vakuum kammer og temperatur kontroll enhet av mikrobølgeovnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Minimal harpiks innebygging og forberedelser for liten LØGN-SEM. (a) plastfolie og tannpirkere som brukes for minimal harpiks innebygging, skala bar 4 cm. (b) Nervus tibialis drenert av harpiks på plastfolie, skala bar 250 µm. (c) Nervus tibialis polymerized på plast film, deretter kuttet og montert på SEM stubben med sølv ledende harpiks, skalere bar 250 µm. (d) prøver polymerized på SEM stub, skala bar 3 mm. (e) prøver belagt med gull på SEM stub, skala bar 3 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: utarbeidelse av prøven inne liten LØGN-SEM. (en og e) Sekundær electron bildet innenfor FIB-SEM av utvalget overflaten (a) Nervus tibialis, skala bar 100 µm. (e) C. elegans, skala 2 µm. (b-d) og (f-h) Tversnitt utvalget med ESB detektor for bildebehandling. (b og c) Nervus tibialis, skalere bar 2 µm. (f og g) C. elegans, skala bar 1 µm og 200 nm. (b og f) Vist er resultatene av høytrykks frysing og fryse substitusjon uten forsterkning, mens alle andre bilder viser resultatene av forbedret fryse substitusjon. (d og h) Detaljert bilde av utvalget med ESB detektoren. (d) Nervus tibialis, skala bar 200 nm. (h) C. elegans, skala bar 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: oppkjøp og visualisering. (a) EM dataene som vises i IMOD med nesten resliced x / z og y/z-fly, skalere bar 2 µm. (b) segmentert axons på EM-data (blå), Remak-pakker (rød), myelin sheaths (gul og oransje) og mitokondrier (turkis), skalere 2 µm. (c og d) 3D-modellen, skala bar 2 µm og 500 nm . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen ble utviklet for å illustrere optimal bevaring og kontrast utføre føljetong blokk-ansikt bildebehandling med en LØGN-SEM. Derfor valgte vi å bruke cryo-immobilisering etterfulgt av etter farging fryse substitusjon og mikrobølgeovn-assistert behandling. Denne protokollen er derfor begrenset til prøver som er små nok for høytrykks frysing. Størrelsesbegrensningene for 3 til 6 mm i bredden og dybden på ~ 200 µm er etablert av størrelsen på utvalget transportøren, som samsvarer med størrelsen på utvalget som kan fryses riktig med denne teknikken. Dette er relevant for musen nerve prøven, siden ischias nerven er for stor i diameter å passe inn i 0.2 mm bærere som kreves for å sikre riktig frysing. Det anbefales derfor forsiktig Disseksjon av en mindre nerve som tibial nerve eller andre thin nerve som femur nerve. Siden myelin-skjeden er følsom å strekke, må stor forsiktighet tas under Disseksjon av frisk og levedyktig nerve å unngå håndtering gjenstander. Generelt bør bare levedyktig prøver brukes for elektron mikroskopiske studier.
Mikrobølgeovn-assistert behandling og minimal harpiks innebygging er utformet for påskynde utarbeidelse og målretting prosessen. Mikrobølgeovn-assistert behandling bruker en modifisert OTO protocol4 brukes til romtemperatur kjemiske fiksering. Husholdningenes mikrobølgeovn vil ikke gi de samme resultatene, siden distribueres ikke homogen av mikrobølger, sin temperatur kontrolleres ikke, og det er ingen vakuum som kan brukes. De mindre en prøve, bedre gjennomtrengning av kjemikaliene; Derfor oppnås de beste resultatene ved mindre prøver. For å unngå skade utvalget av overoppheting, er temperatur og anvendelse av påkrevde støtteinformasjonen mikrobølgeovn kraft avgjørende. Mikrobølgeovn-assistert behandlingstrinnene kan utføres på benken hvis det er nei mikrobølgeovn tilgjengelig, som vil føre til lengre behandlingstider. Direkte mål strukturer i SEM er det avgjørende å fjerne så mye harpiks som mulig fra toppen av prøven. Etter innspillingen dataset, er etterbehandling av rådata nødvendig å redusere filstørrelsen og forbedre signal-til-støy-forhold. Moderne volum Bildeteknikker produserer store mengder data. Derfor, for å utføre databehandlingen på en rask og tilstrekkelig måte, tilstrekkelig RAM på arbeidsstasjonen er nødvendig. Det kreves minst to ganger så mye RAM dataset størrelse for justering.
Denne protokollen er testet på nervus tibialis museklikk samt som C. elegans. Hall et al. 12 brukt en lignende ekstrautstyr trinn etter deres fryse substitusjon på benken for utarbeidelse av C. elegans. For alle andre modellen organisme som sebrafisk er justeringer av protokollen sannsynligvis nødvendig. En mulig endring er å endre sammensetningen av fryse substitusjon cocktail, som ved tilsetning av vann som brukes for kontrast ekstrautstyr18. Videre varigheten av fryse substitusjon må tilpasses prøven og kan bli vesentlig forkortet etter rask frysing substitusjon protokollen19. En mulighet er anvendelsen av agitasjon for akselererende fryse substitusjon prosessen20. Etter fryse substitusjon, ytterligere er endringer mulig, for eksempel gjentatt bruk av styrke kjemikalier og osmium tetroxide21. Under mikrobølgeovn behandlingen, kan temperatur, inkubasjon tider, og innstillinger endres for å optimalisere resultatene for de respektive prøven.
Denne protokollen viser at slike en forbedring kan kombineres med andre fryse substitusjon protokoller og ulike typer prøver som beskrevet av Hall12 som er fotografert i en LØGN-SEM eller seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskop. Disse Bildeteknikker krever forbedret kontrast, som er mindre viktig for overføring elektronmikroskop.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
FIB-SEM og AS (plasseringen av operatoren FIB-SEM) er finansiert av klyngen of Excellence og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center nanoskala mikroskopi og molekylære fysiologi av hjernen (CNMPB). Vi takker laboratoriet av Thomas Müller-Reichert for å gi C. elegans eksempler. Vi takker Ulrich Weikert for deltakelse i filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
- Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
- Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
- Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
- Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
- Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
- Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
- Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
- Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
- Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).
