Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kombinera två prov bearbetningsmetoder, högtrycks frysning och mikrovågsugn-assisted prov bearbetning, följt av minimal harts inbäddning för att förvärva data med en fokuserad ion beam Scanningelektronmikroskop (FIB-SEM). Detta framgår med hjälp av en mus tibia nerv prov och Caenorhabditis elegans.
Abstract
Den beskrivna prov förberedelse tekniken är utformad för att kombinera ultrastrukturella bevarande med den lämpligaste kontrasten för bildframställning modalitet i en fokuserad ion beam Scanningelektronmikroskop (FIB-SEM), som används för att få bästa kvalitet travar av sekventiell bilder för 3D rekonstruktion och modellering. Högtrycks frysning (HPF) tillåter nära infödda strukturella bevarande, men den efterföljande frysa substitution ofta ger inte tillräcklig kontrast, särskilt för ett större exemplar, som är nödvändig för hög kvalitet imaging i SEM krävs för 3D återuppbyggnad. Därför, i detta protokoll, efter att ersätta det frysa, ytterligare kontrasterande steg utförs i rumstemperatur. Även om dessa steg genomförs i en mikrovågsugn, är det också möjligt att följa traditionella bänk bearbetning, vilket kräver längre inkubationstider. För efterföljande inbäddning i minimala mängder harts möjliggör snabbare och mer exakt inriktning och förberedelse inuti FIB-SEM. Protokollet är särskilt användbart för prover som kräver förberedelse av högtrycks frysning för en tillförlitlig ultrastrukturella bevarande men inte få tillräckligt med kontrast under frysa substitution för volym imaging använder FIB-SEM. I kombination med minimal harts bädda in, ger det här protokollet ett effektivt arbetsflöde för förvärv av högkvalitativa volymdata.
Introduction
Högtrycks frysning är den prov förberedelse metoden val för att få hög kvalitet ultrastrukturella bevarande, som representerar det ursprungliga tillståndet av ett prov som är mycket bättre än konventionella beredningsmetoder som använder kemiska fixering1. Detta cryo-förberedelse metod är användbar för prover, såsom myeliniserade mus vävnad2 och ett strikt krav för användning av modellen organismen Caenorhabditis elegans3. Efter frysning substitution och harts inbäddning analyseras dessa prover vanligen av transmissionselektronmikroskopi (TEM) eller electron tomografi (ET). Om större volymer måste avbildas med FIB-SEM eller seriell block-face imaging för högupplösta storskaliga 3D rekonstruktioner, vår erfarenhet korrekt avbildning av SEM ofta hämmas av brist på kontrast. I FIB-SEM registreras vanligtvis bilden av detektion av bakåtspritt elektroner från primära elektronen strålar. Avkastningen av bakåtspritt elektroner är proportionell mot halten av tungmetaller i provet. Därför utformades särskilt protokoll för volym imaging för att förbättra kontrasten av ytterligare tungmetall impregnering. Sådana metoder är baserade på kemiskt fasta prover och tillämpa en kombination av osmium vanligtvis-thiocarbohydrazide-osmium vanligtvis4, som beskrivs av Knott et al.5, för seriell block-ansikte och fokuserade ion beam svepelektronmikroskopi. Ändringar inklusive användning av formamid och pyrogallol6 eller bly aspartat7 har framgångsrikt tillämpats för olika avbildningstekniker.
Protokollet anges här kombinerar cryo-framställning av exemplar av HPF och frysa substitution med efterföljande mikrovågsugn-assisterad behandling för förbättrad kontrast med thiocarbohydrazide/osmium vanligtvis i aceton i rumstemperatur. Vi visar detta på myeliniserade nervus tibialis möss och Caenorhabditis elegans, som representerar prover som kräver högtrycks frysning för högkvalitativa ultrastrukturella bevarande. Dessutom visas hur, efter uttorkning och infiltration, proverna är inbäddade med som lite harts som möjligt. Denna minimala harts inbäddning8 möjliggör snabbare inriktning av intresse struktur och minskar den tid som spenderas på prov behandling, inbegripet mindre tid krävs för utsätta regionen av intresse med ion balken. Efter utför ytterligare provberedningssteg inuti mikroskopet, utförs imaging och fräsning av provet kontinuerligt för att förvärva en bunt med bilder. 3D-visualisering, används bildbehandlingsprogram (IMOD) för att rekonstruera delar av datamängden.
Vårt arbetsflöde beskrivs hur den lämpligaste kontrasterande prover för volym imaging kan kombineras med bästa ultrastrukturella bevarandet av HPF och frysa substitution. Detta är användbart för prover som strikt kräver cryo-förberedelser. Program är begränsad till små prover som kan framställas genom HPF. I prover av olika karaktär, såsom växtmaterial eller mikroorganismer, kräver detta protokoll anpassning.
Protocol
Alla experiment inklusive prover från djur som beskrivs här har godkänts av den institutionella Animal Care och lägre Sachsen statens byrå för kundskydd och mat säkerhet (LAVES).
1. högtrycks frysning och frysa substitution
- Dissekera nervus tibialis från en mus (t.ex. C57Bl6N, 12 veckor, hona)9.
- Fördjupa nervus tibialis i en droppe av 20% polyvinylpyrrolidon (PVP 1 g i 5 mL) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skär bitar av 2 mm längd. Sedan placera den i en metall provet transportör (typ A, 0,2 mm djup) med fin pincett. Lägga till en annan platta bärare (typ B) belagd med ett tunt lager av hexadecane som ett lock och infoga denna församling i preparatet patronen.
- Överföra flera C. elegans upphängd i en droppe av 20% bovint serumalbumin (BSA) i M9 (se Tabell för material) med en disponibel plast pipett på metall cykelhållaren (typ A). Sedan lägga till en andra bärare som lock ovanpå (typ B) och montera kassetten.
- För båda proverna, Fortsätt med följande: högtrycks frysa de prov transportör församlingarna one-by-one genom att ladda dem i tredelad patronen på lastning stationen i högtrycks frysen. Tryck på knappen processen enligt tillverkarens bruksanvisning.
Obs: Båda typerna av prover kan bearbetas tillsammans i efterföljande frysa substitution. - Placera proverna i cryovials innehållande 2 mL frysta 0,1% garvsyra i aceton. Utföra överföringen i ett bad av flytande kväve utan att spilla flytande kväve i skålarna. Överför cryovials till en automatisk frysa substitution enhet10 set-90 ° c och starta programmet.
Obs: Proverna förvaras-90 ° C under 100 h. garvsyra innan osmification används som betningsmedel för att öka upptaget av osmium vanligtvis11. - Manuellt tvätta proverna 3 x 30 min med 2 mL aceton-90 ° c i enheten frysa substitution.
- Lämna proverna i 2 mL 2% osmium vanligtvis, 0,1% uranyl acetat i aceton för fortsatt färgning för automatisk frysa substitution enhet för 7 h vid-90 ° C.
FÖRSIKTIGHET: Osmium vanligtvis är giftig och bör hanteras i dragskåp och skyddsutrustning bör bäras.
Obs: Frysa substitution enheten automatiskt höjer temperaturen till-20 ° C vid 5 ° C/h. Proverna förvaras vid-20 ° C i 16 h i enheten frysa substitution. Temperaturen höjs automatiskt till 4 ° C vid 10 ° C/h. - Utbyta osmium vanligtvis lösningen med ren aceton när temperaturen har nått 4 ° C. Ta bort cryovials från enheten frysa substitution.
2. mikrovågsugn-assisterad behandling
Obs: Utföra alla följande steg vid rumstemperatur12 använda en temperatur styrenhet för att hålla temperaturen stabil (se Tabell för material).
- Lämna mössor av reaktionsrören öppna under bearbetning i mikrovågsugn.
- Ta metall prov bärarna av cryovials och ta bort proverna från metall transportören med fin pincett eller en nål, samtidigt hålla proverna i aceton i ett urglas maträtt (150 mm).
- Överföra proverna i 2 mL reaktionsrören med fin pincett eller en pipett och tvätta med 1 mL aceton fyra gånger för 40 s 250 W.
Varning: Thiocarbohydrazide är giftig och bör hanteras i dragskåp, skyddsutrustning bör bäras. - Fläcken prover med 1 mL 1% thiocarbohydrazide i aceton för 14 min på 150 W att öka kontrasten. För att utföra färgningen, pipett thiocarbohydrazide lösningen i reaktionsröret, placera röret i mikrovågsugn och ställa in programmet till en energinivå på 150 W (med vakuum-funktionen påslagen) för 2 min på/2 minuter off, iteration för 14 min totalt. Starta mikrovågsugnen.
Obs: Thiocarbohydrazide reagerar med den osmium vanligtvis som tillämpades under frysa substitution. Det bildar en bro, vilket gör att mer osmium vanligtvis deponeras på den ursprungliga osmium vanligtvis platser13. - Tvätta proverna 4 x med 1 mL aceton för 40 s 250 W. pipetten aceton i en reaktionsröret, placera röret i mikrovågsugn och välj 250 W för 40 s. Start mikrovågsugn.
- Fläcken i 1 mL 2% osmium vanligtvis i aceton för 14 min på 150 W. pipett osmium vanligtvis lösningen till en reaktionsröret, placera röret i mikrovågsugn, och ställa in programmet till en energinivå på 150 W (med vakuum-funktionen påslagen) i 2 min på/2 min av , iteration för 14 min totalt. Starta mikrovågsugnen.
- Tvätta proverna 4 x med 1 mL aceton för 40 s 250 W (som gjort i steg 2.5).
- Infiltrera med 1 mL ökande koncentrationer av harts i aceton (se Tabell för material) av 25%, 50%, 75%, 90%, 100% och 100% i 3 min varje 250 W. pipetten kådan i en reaktionsröret, placera röret i mikrovågsugn och ställa in programmet till en makt leve l 250 W (med vakuum-funktionen påslagen) för 3 min. Starta mikrovågsugnen.
3. Minimal harts inbäddning8
- Ta den nervus tibialis och C. elegans ur reaktionsröret med en tandpetare och placera dem på en bit plast film (se Tabell för material).
- Använd tandpetare för att tryck försiktigt provet på plastfilmen tills inga kvarvarande harts upptäcks. Använd en halogenlampa för uppvärmning (se Tabell för material) så kådan blir mindre trögflytande och kan tas bort enkelt. Plats halogenlampan nära nog värma upp kådan (vara noga med att inte bränna händerna).
- Polymerisera proverna för minst 48 h vid 60 ° C ovanpå plast film i ugnen.
4. förberedelser för FIB-SEM
- Klipp ut polymeriserat proverna tillsammans med plast film med hjälp av ett rakblad på en storlek passande SEM stub och bifoga dem till de SEM stubbar med en Konduktiv silver harts (se Tabell för material). Polymerisera igen vid 60 ° C i minst 4 tim eller över natten.
- Fräsande coat stub-proverna på SEM med guld för 1 min 35 mA använder en fräsande bestrykare (platina/palladium kan också användas, en 10 nm tjock beläggning räcker) och placera dem inuti FIB-SEM.
5. data acquisition inuti FIB-SEM
- Bild proverna med sekundär electron detektorn med hjälp av grundläggande programvara som kör mikroskopet (se Tabell för material). Provet bör vara orienterade så att regionen av intresse (t.ex. mellersta delen av nervus tibialis eller den C. elegans) är i synfältet.
Obs: För att utföra dataförvärvet, luta scenen till en position så att provet ansikten ion balken i 90° vinkel på ett lämpligt avstånd (5 mm) i så kallade tillfällighet pekar av den ion och electron beam. Med våra instrument har uppnås detta på en scen tilt av 54° och 5 mm arbetsavstånd. - Ställ in rätt position av provet, centrera ett vanligt inslag på en 0° lutning medan avbildning med sekundär electron detektorn. Långsamt recentering tilt till 54° (5°, 20°, 54°), samma objekt genom att flytta M-axeln.
- Hitta den tillfällighet punkten av centrering en funktion medan imaging med sekundär electron detektorn på 54°, följt av flytta funktionen till det centrala läget i FIB-läge. Utför detta genom att Visa hårkorset i programvaran SEM att ha en indikation på mitten. Då först flytta funktionen urval till mitten av bildytan med hjälp av funktionen center point av programvaran SEM. Sedan centrera funktionen längs y-axeln genom att flytta scenen i z. Eventuell final förskjutning mellan FIB och SEM korrigeras med SEM beam shift.
- Öppna den avancerade programvaran (se Tabell för material) för inspelning 3D datamängder och följ guiden programvara steg för steg.
- På området av intresse, insättning kol eller platinum (400 nm) ovanpå ROI med en 3 nA som är aktuella att tillåta även fräsning och minska artefakter induceras av laddning.
Obs: Genom att dra regionen av intresse att vara slipat på preparatytan avbildas med FIB (bredd, höjd, djup), programvaran beräknar och lägger i storlekar olika prov förberedelse funktioner, såsom diken att malas eller område för Platinum/kol nedfall. Också vara försiktig med imaging prov ytan med alltför hög FIB strömmar, eftersom detta kan skada provet. En ström av 50 pA räcker för avbildning. - Använda den fokuserade ion beam för att fräsa ett dike för att exponera regionen av intresse (ROI) med hjälp av en 15/30 nA nuvarande.
- Använd den fokuserade ion beam till polska tvärsnitt med en 7 nA nuvarande.
- Efter avslutad provpreparering, ställa in följande imaging parametrar: FIB fräsning parametrar i FIB inställningsfliken (FIB fräsning ström); SEM imaging parametrar i den inställningsfliken och bilden finjusteringsparametrarna i fliken SEM AutoTune (utför autofokus och autostigmation varje 60 min, 50 nm pixelstorlek, uppehållstid 3, rad genomsnittliga 3). Optimera detta för varje prov.
- För att förhindra någon termisk drift orsakar block-ansiktet att glida under körning, lämna rummet för minst 2 h innan förvärvet.
- Förvärva datamängden i en kontinuerlig kvarn och förvärva läge med en 700 pA FIB aktuellt. Använd 1,5 kV (analytic läge, 900 V) ESB detektor med en grid spänning på 400 V att förvärva bilder med 5 nm pixelstorlek med hjälp av avancerad programvara (se Tabell av material) och 50 nm slice tjocklek. En bild förvärvandet tar ca 1,5 min med en uppehållstid på 6 µs.
- Starta datainsamling. En FIB-bild på den nuvarande fräsningen förvärvas för att säkerställa att provet inte flytta och regionen rätt sevärdheter är markerad. Justera vid behov.
6. datavisualisering
- Öppna bilder i Fiji genom att dra mappen som innehåller alla bilder i Fiji och välj Virtuell Stack.
- Beskära regionen av intresse med hjälp av rektangelverktyget (Bild > Beskär).
- Invertera data för att visa den traditionella överföring elektronmikroskopi kontrasten med membran som dyker upp i mörkret (Redigera > Invertera).
- Använda TrackEM214 (Fiji15) för justering. Läsa in data i TrackEM2 (Fil > Nytt > TrackEM2) genom att klicka på lager. När alla bilder har laddats, justera dem med flera lager mosaik-funktionen (Högerklicka på Bild > Justera > Justera multi-layer mosaik). Efter justering, bilderna ska exporteras som enskilda tiff-filer (Högerklicka på Bild > Exportera > gör platt bild). Markera alla bilder som ska exporteras och välj Spara fil.
- För efterbearbetning, Använd Gaussisk oskärpa (Process > Filter > Gaussisk oskärpa; sigma 2) och lokal kontrastförstärkning (Process > förbättra lokal kontrast; CLAHE: blocksize 127, histogram lagerplatser 256, maximal lutning 1,5), som tillämpas i Fiji att släta bilden och få en bättre signal-brus-förhållande.
- IMOD16 används för att utföra en manuell segmentering och visualisera strukturen av intresse i 3D. Öppna datamängden i IMOD och välj ritverktyg (särskilda > ritverktyg) att utföra manuell segmentering. Olika manuella verktyg kan användas för att följa strukturen av intresse i hela volymen (till exempel Join, Sculpt). Använda mikroskopi bild webbläsare (MIB17) för halvautomatisk segmentering.
Representative Results
Arbetsflödet startar med ett prov (här, en färsk dissekerade mus nervus tibialis) placeras i metall hållare för högtrycks frysning (figur 1a). Transportörer är återhämtat sig från flytande kväve (figur 1b) och placeras i en frys substitution enhet ovanpå den frysta första kemiskt cocktail (figur 1 c). Efter en lång frysa substitution protokoll inklusive 2% osmium vanligtvis och 0,1% uranyl acetat, tas proverna bort från bärarna i rumstemperatur (figur 1 d). För att ytterligare förbättra kontrasten, överförs proverna till plaströr som ska bearbetas i mikrovågsugn (figur 1e). Den vakuumkammare och temperatur styrenhet används för att optimera processen (figur 1f).
För att kunna utföra för minimal harts inbäddning, tandpetare och ark av plastfolie behövs (figur 2a). Efter infiltrera proverna med harts använder mikrovågsugn, de placeras på bitar av plastfilm och flyttade runt tills ingen kåda finns kvar på prov ytan. En halogenlampa är används för att dränera resterande kådan och lämna provet minimalt inbäddade (figur 2b) på plastfilmen. Det bör noteras att mer harts bort från toppen av provet är bra. Fortfarande bör det finnas en liten mängd kvar under provet till hålla den kopplad till substratet. Provet som polymeriseras på plastfilmen skärs och monterad ovanpå SEM påbörjad med silver Konduktiv harts (figur 2 c). Stubben är polymeriserat för minst 4 h vid 60 ° C (figur 2d). Komponenterna blandas grundligt eller blandningen kan inte polymerisera korrekt. För att undvika laddning inuti svepelektronmikroskop, stub-funktionen fräsande belagda med guld eller platina/palladium (figur 2e).
Proverna placeras i FIB-SEM och avbildas med en sekundär electron detektor att rikta regionen av intresse (figur 3ae). En ion beam används för att ta bort material direkt framför regionen av intresse att exponera ett tvärsnitt (figur 3b-d, 3f-h). Standardprotokoll lider ofta brist på membran kontrast (figur 3bf), medan förbättrad protokollet ger en stark membran kontrast (figur 3 c-d, 3 g-h).
EM data (efter efterbehandling) visualiseras med IMOD, en bild bearbetning och modellering program. För att uppnå en bättre förståelse av den 3D-informationen, virtuella reslicing data används (figur 4a). Olika strukturer på datamängden är segmenterade manuellt (figur 4b-d).
Figur 1: högtrycks frysning, frysa-substitution och mikrovågsugn-assisterad behandling. (a) prova bärare som innehåller mus nervus tibialis, skala bar 3 mm. (b) provet transportör som innehåller mus nervus tibialis efter frysning, skala bar 3 mm. (c) automatiska frysa substitution (AFS) Högtrycksenheten med prover. Infällt: skräddarsydda metall behållare för upp till 23 prov flaskor och två stora flaskor som innehåller kemikalier i AFS. (d) prover tas bort från bärare i en glasskål i aceton, skala bar 3 mm. (e) prover i reaktionsrören sättas i mikrovågsugn för bearbetning. (f) vakuum kammare och temperatur kontroll enhet i mikrovågsugn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Minimal harts inbäddning och förberedelse för FIB-SEM. (a) plastfilm och tandpetare som används för minimal kådan inbäddning, skala bar 4 cm. (b) Nervus tibialis tömd på harts ovanpå plastfilmen, skala bar 250 µm. (c) Nervus tibialis polymeriseras på plastfilm, sedan skära och monterad ovanpå den SEM påbörjad med Silver Konduktiv harts, skala bar 250 µm. (d) prover polymeriseras ovanpå SEM stub, skala bar 3 mm. (e) prover belagda med guld på SEM stub, skala bar 3 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: provberedning inuti FIB-SEM. (en och e) Sekundära electron bild inuti FIB-SEM provets yta (a) Nervus tibialis, skala bar 100 µm. (e) C. elegans, skala bar 2 µm. (b-d) och (f-h) tvärsnitt genom prov med ESB detektor för avbildning. (b och c) Nervus tibialis, skala bar 2 µm. (f och g) C. elegans, skala bar 1 µm och 200 nm. (b och f) Visas resultatet av högtrycks frysning och frysa substitution utan förbättring, medan alla andra bilder visar resultat av förbättrad frysa substitution. (d och h) Detaljerad bild av provet med ESB detektorn. (d) Nervus tibialis, skala bar 200 nm. (h) C. elegans, skala bar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bild förvärv och visualisering. (a) EM-data som visas i IMOD med nästan resliced x / z- och y/z-plan, skala bar 2 µm. (b) segmenterade axoner på EM data (blå), Remak buntar (röd), myelin slidor (gul och orange) och mitokondrier (turkos), skala bar 2 µm. (c och d) 3D-modellen, skala bar 2 µm och 500 nm . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet har utvecklats för att illustrera optimalt bevarande och kontrast till utföra seriell block-face imaging med en FIB-SEM. Därför valde vi att tillämpa cryo-immobilisering följt av efter färgning med frysa substitution och mikrovågsugn-assisterad behandling. Detta protokoll är därför begränsad till prover som är små nog för högtrycks frysning. Storlek begränsning av 3 till 6 mm i bredd och tjocklek av ~ 200 µm fastställs av storleken på den prov transportör, som matchar den urvalsstorlek som ordentligt kan frysas med denna teknik. Detta är relevant för mus nerv provet, eftersom ischiasnerven är för stor i diameter för att passa in i 0,2 mm bärarna som krävs för att säkerställa korrekt frysning. Därför rekommenderas noggrann dissektion av en mindre nerv som tibial nerven eller andra tunna nerv såsom femoralisblockad. Eftersom myelinskidan är känslig för stretching, måste vara mycket försiktig under dissektion av färska och livskraftiga nerven att undvika hantering av artefakter. I allmänhet bör endast livskraftiga prover användas för elektron mikroskopisk studier.
Mikrovågsugn-assisterad behandling och minimal harts inbäddning är utformade för påskynda förberedelserna och inriktning process. Mikrovågsugn-assisterad behandling tillämpar en modifierad OTO protokoll4 används för rumstemperatur kemiska fixering. Mikrovågsugn hushåll kommer att inte ge samma resultat, eftersom det finns ingen homogen fördelning av mikrovågor, dess temperatur styrs inte, och det finns inga tomrum som kan tillämpas. Den mindre en prov, bättre penetration av kemikalier; Därför, bästa resultat uppnås genom mindre prover. För att undvika skador på provet av överhettning, är temperaturkontroll och tillämpningen av den nödvändiga supportinformationen mikrovågseffekten kritiska. Mikrovågsugn-assisted processtegen kan utföras på bänken om det finns ingen mikrovågsugn tillgängliga, vilket leder till längre handläggningstider. Till direkt målstrukturer i SEM är det viktigt att ta bort så mycket harts som möjligt från toppen av provet. Efter inspelning en datamängd, är efterbehandling av raw-data nödvändigt att minska filstorleken och förbättra signal-brus-förhållandet. Moderna volym avbildningstekniker producera stora mängder data. För att utföra behandling på ett snabbt och tillräckligt sätt, behövs därför tillräckligt med RAM på arbetsstationen. För justering operationer krävs minst två gånger så mycket RAM som dataset storlek.
Detta protokoll har testats på nervus tibialis på musen så väl som i C. elegans. Hall et al. 12 används en liknande förbättring steg efter deras frysa substitution på bänken för beredning av C. elegans. För alla andra modellorganism såsom Zebrafiskar är justeringar av protokollet sannolikt nödvändigt. En möjlig ändring är att ändra sammansättningen av frysa substitution cocktail, såsom genom tillsats av vatten som används för kontrast förbättring18. Dessutom varaktigheten av frysa substitution måste anpassas till provet och kan förkortas avsevärt enligt snabb frysning substitution protokoll19. En möjlighet är tillämpningen av agitation för att påskynda den frysa substitution process20. Efter att ersätta det frysa, ytterligare är ändringar möjliga, till exempel upprepad applicering av kemikalier och osmium vanligtvis21. Under mikrovågsugn bearbetning, kan den temperatur, inkubationstider och energiinställningar varieras för att optimera resultaten för respektive provet.
Detta protokoll visar att en sådan förbättring kan kombineras med andra frysa substitution protokoll och olika typer av prover som beskrivs av Hall12 som är avbildad i en FIB-SEM eller genom seriell block-face skanning elektronmikroskopi. Dessa bildgivande tekniker kräver förbättrad kontrast, vilket är mindre viktigt för transmissionselektronmikroskopi.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
De FIB-SEM och Asplund (positionen för operatorn FIB-SEM) finansieras av Cluster of Excellence och Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) Research Center nanoskala Mikroskopi och molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB). Vi tackar labbet av Thomas Müller-Reichert för att tillhandahålla C. elegans proverna. Vi tackar Ulrich Weikert för att delta i filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
- Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
- Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
- Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
- Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
- Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
- Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
- Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
- Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
- Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).
