Summary
Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.
Abstract
Açıklanan örnek hazırlama tekniği en iyi kalite bir odaklı iyon demeti Taramalı elektron almak için kullanılan mikroskobu (FIB-SEM), görüntüleme yöntemi için en uygun kontrastlı ultrastructural muhafaza edilmesi birleştirmek için tasarlanmıştır Sıralı görüntüleri 3D imar ve modelleme yığınları. Yüksek basınçlı (HPF) dondurma yakın yerli Yapısal koruma sağlar, ancak sonraki ikame kez dondurma yeterli kontrast için özellikle yüksek kaliteli görüntüleme 3D için gerekli SEM için gerekli olan daha büyük örnek, sağlamaz yeniden yapılanma. Bu nedenle, bu protokol için donma ikame sonra ek zıt adımlar oda sıcaklığında yapılmaktadır. Her ne kadar bu adımlar bir mikrodalga fırında gerçekleştirilir, ayrıca daha uzun kuluçka süreleri gerektirir geleneksel tezgah işleme takip etmek mümkündür. Bırakmak için daha hızlı ve daha hassas hedefleme ve hazırlık FIB-SEM içinde sonraki en az miktarda reçine katıştırma Bu iletişim kuralı tarafından güvenilir bir ultrastructural korunması için yüksek basınçlı donma hazırlık gerektirir, ancak yeterli kontrast sırasında donma ikame FIB-SEM kullanarak birim görüntüleme için kazanmak değil örnekleri için özellikle kullanışlıdır En az reçine gömülmesi ile birlikte, bu iletişim kuralı yüksek kaliteli ses veri toplama için etkin bir iş akışı sağlar.
Introduction
Yüksek basınç donma kimyasal fiksasyonu1kullanarak geleneksel hazırlama yöntemleri çok daha iyi bir örnek yerel durumunu gösterir yüksek kaliteli ultrastructural koruma elde etmek için örnek hazırlama yönteminin seçimi var. Bu cryo-hazırlama yöntemi myelinated fare doku2 ve model organizma Caenorhabditis elegans3kullanmak için sıkı bir gereği gibi örnekleri için kullanışlıdır. Donma ikame ve reçine gömme sonra bu örnekler genellikle transmisyon elektron mikroskobu (TEM) veya elektron tomografi (ET) tarafından incelenir. Eğer daha büyük birimler için uygun görüntüleme SEM tarafından sık sık kontrast eksikliğinden engel oluyor bizim deneyim yüksek çözünürlüklü büyük ölçekli 3D rekonstrüksiyonlar FIB-SEM veya seri blok-yüz görüntüleme kullanarak yansıma gerekir. YALAN-SEM, görüntü genellikle birincil elektron ışını backscattered elektron tespiti tarafından kaydedilir. Backscattered elektron verim ağır metaller örnek içeriği orantılıdır. Bu nedenle, iletişim kuralları özellikle kontrastı arttırmak için görüntüleme birimi için ek heavy metal emprenye tarafından dizayn edilmiştir. Tür yöntemler kimyasal olarak sabit örneklere dayalı ve Osmiyum tetroxide-thiocarbohydrazide-Osmiyum tetroxide4, bir arada Knott ve ark.5, seri blok-yüz tarafından açıklanan geçerli ve elektron mikroskobu tarama iyon demeti odaklı. Formamide ve pyrogallol6 veya kurşun aspartat7 kullanımı dahil olmak üzere değişiklik için farklı görüntüleme teknikleri başarıyla uygulandı.
Burada sağlanan iletişim kuralı cryo-hazırlık HPF tarafından örneklerin birleştirir ve mikrodalga destekli gelişmiş kontrast için thiocarbohydrazide/Osmiyum tetroxide oda sıcaklığında aseton kullanarak işleme sonraki ile ikame dondurma. Biz yüksek kaliteli ultrastructural korunması için buz gibi yüksek basınç gerektirir örnekleri temsil myelinated nervus tibialis farelerin ve Caenorhabditis elegans, üzerinde göstermek. Buna ek olarak, bu nasıl, dehidratasyon ve infiltrasyon sonra örnekleri ile mümkün olduğunca küçük reçine olarak katıştırılan gösterilir. En az bu reçine8 katıştırma daha hızlı faiz yapısını hedefleme için sağlar ve örnek işleme, kısa sürede ilgi iyon demeti ile bölgenin maruz kalmaları için gerekli dahil olmak üzere üzerinde harcanan zamanı azaltır. Daha fazla örnek hazırlık adımları içinde mikroskop gerçekleştirdikten sonra görüntüleme ve örnek freze sürekli bir yığın görüntüleri elde etmek için yapılır. 3D görselleştirme için görüntü işleme yazılımı (but) veri kümesi bölümlerini yeniden oluşturmak için kullanılır.
Bizim iş akışı nasıl örnekleri birim görüntüleme için en uygun zıt ile en iyi ultrastructural koruma HPF ve donma ikame tarafından birleştirilebilir açıklar. Bu kesinlikle cryo-hazırlık gerektiren örnekleri için yararlıdır. Uygulamaları HPF tarafından hazırlanan küçük örnekleri için sınırlıdır. Farklı doğa, bitki materyali veya mikroorganizmalar, gibi örneklerde bu protokolü adaptasyon gerektirir.
Protocol
Tüm deneylerin hayvanlar burada açıklanan örnekleri de dahil olmak üzere kurumsal hayvan bakım ve Aşağı Saksonya eyalet Office tarafından müşteri koruma ve gıda güvenliği (LAVES) için onaylanmıştır.
1. yüksek basınçlı dondurma ve donma ikame
- Bir fare (örneğin, C57Bl6N, 12 hafta, erkek)9nervus tibialis incelemek.
- % 20 polyvinylpyrrolidone (5 ml PVP 1 g) bir damlacık nervus tibialis fosfat tamponlu tuz (PBS) bırakın ve 2 mm uzunlukta parçalar kesin. Sonra bir metal örnek taşıyıcı (tip A, 0.2 mm derinlik) yer iyi forseps kullanarak. Hexadecane bir kapak olarak ince bir tabaka ile kaplı başka bir düz taşıyıcı (B tipi) ekleyin ve bu derleme numune kartuşu takın.
- M9 içinde % 20 sığır serum albumin (BSA) bir damlacık içinde birkaç C. elegans transfer ( Tablo malzemelerigörmek) metal taşıyıcı (tür A) içine bir tek kullanımlık plastik pipet ile. Sonra ikinci bir taşıyıcı olarak kapağı üstte (B tipi) ekleyin ve kartuş araya.
- Her iki örnekleri için aşağıdaki ile devam: yüksek basınçlı yüksek basınç dondurucu yükleme istasyonu üç parçalı kartuşu içine yükleyerek örnek taşıyıcı derlemeler tek tek dondur. Üreticinin işletim talimatları doğrultusunda işlem düğmeye basın.
Not: Her iki tür örnekleri birlikte sonraki donma ikame işlenebilir. - Örnekleri 2 mL aseton donmuş % 0,1 Tannik asit içeren cryovials içine koyun. Transfer banyo sıvı nitrojen tüpleri sıvı azot dökmeden gerçekleştirin. Bir otomatik dondurma ikame birim-90 ° C'de10 set içine cryovials transfer ve programı başlatın.
Not: osmification Mordan Osmiyum tetroxide11alımını artırmak için kullanılmadan önce örnekleri için 100 h. Tannik asit-90 ° C'de tutulur. - El ile örnekleri 3 yıkamak için aseton donma ikame biriminde-90 ° C'de 30 dk ile 2 mL x.
- Örnekleri 2 mL % 2 Osmiyum tetroxide bırak, % 0,1 uranyl asetat sürekli otomatik boyama için aseton içinde ikame birimi için 7 h-90 ° C'de dondurmak
Dikkat: Osmiyum tetroxide zehirli ve duman başlık altında ele alınmalıdır ve koruyucu ekipman giyilmelidir.
Not: Freeze ikame birim sıcaklığı-20 ° c 5 ° C/s otomatik olarak yükseltir. Örnekleri dondurma ikame biriminde 16 h için-20 ° C'de tutulur. Sıcaklık 10 ° C/h 4 ° C'de otomatik olarak yükseltilecektir. - 4 ° c sıcaklık ulaşmıştır Osmiyum tetroxide çözüm saf aseton ile değişimi Cryovials dondurma ikame birimden çıkartın.
2. mikrodalga destekli işleme
Not: tüm oda sıcaklığında12 sıcaklığı sabit tutmak için bir sıcaklık kontrol ünitesi kullanarak aşağıdaki adımları gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek).
- Reaksiyon tüpler kapaklar mikrodalga işlemi sırasında açık bırakın.
- Cryovials dışarı metal örnek taşıyıcıları ve aseton izle cam tabak (150 mm) örtülü örnekleri tutarken iyi forseps veya bir iğne kullanılarak metal gemisinden örnekleri sökün.
- Örnekleri iyi forseps veya bir pipet kullanarak 2 mL tepki tüpler içine aktarmak ve yıkama ile 1 mL aseton 40 için dört kez 250 W. s
Dikkat: Thiocarbohydrazide zehirli ve duman başlık altında ele alınmalıdır, koruyucu ekipman giyilmelidir. - Örnekleri ile aseton kontrastı arttırmak için 150 W, 14 dk için % 1 thiocarbohydrazide 1 mL leke. Boyama gerçekleştirmek için thiocarbohydrazide çözüm tepki tüp içine pipette, tüp mikrodalga fırında yerleştirin ve 150 W güç düzeyini programa (vakum fonksiyonu açık ile) kapalı, toplam 14 dk yineleme 2 dk/2 min için ayarla. Mikrodalga başlatın.
Not: Freeze değiştirme sırasında uygulanan Osmiyum tetroxide ile Thiocarbohydrazide tepki verir. Daha fazla Osmiyum özgün Osmiyum tetroxide siteleri13yatırılır tetroxide sağlayan bir köprü oluşturur. - Örnekleri 4 yıkama ile 1 mL aseton 40 x 250 pipet bir tepki tüp içine aseton W. s tüp mikrodalga yerleştirin ve 250 W 40 s. başlangıç mikrodalga için seçin.
- 1 ml % 2 Osmiyum tetroxide içinde vasıl 150 W. pipet 14 dk için aseton Osmiyum tetroxide çözüm bir tepki tüp içine leke, mikrodalga tüpüne yerleştirin ve 150 W (vakum fonksiyonu açık ile) güç düzeyini programa 2 min için ayarla/2 dk kapalı , 14 dk toplam topluluk içinde yineleme yapma. Mikrodalga başlatın.
- Örnekleri 4 yıkama ile 1 mL aseton 40 x 250 (2.5 adımda yapılır gibi) W, s.
- 1 mL aseton reçine konsantrasyonları artan ile sızmak ( Tablo malzemelerigörmek) % 25, % 50, % 75, % 90'ı, % 100 ve % 100 3 dk her 250 pipet reçine bir tepki tüp içine W. için tüp mikrodalga yerleştirin ve program için bir güç leve ayarla l 250 W (ile açık vakum işlev) için 3 dk. mikrodalga başlatın.
3. en az reçine8 katıştırma
- C. elegans ve nervus tibialis çöpten tepki tüp plastik parçası üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek) filme bir kürdan ve yer alın.
- Hiçbir kalan reçine gelinceye yavaşça örnek üzerinde plastik film itip kürdan kullanın. Halojen lamba reçine daha az yapışkan hale gelir ve daha kolay kaldırılması yapabiliyor ( Tablo malzemelerigörmek) Isıtma için kullanın. Yer halojen lamba (eller yakmamaya dikkat) reçine kadar ısıtmak için yeterince yakın.
- Örnekleri için en az 48 saat 60 ° c fırında plastik film üstüne polimerize.
4. FIB-SEM için hazırlık
- Polimerli örnekleri SEM saplama uygun boyutta bir jilet kullanarak plastik film ile birlikte kesip ve iletken bir gümüş reçine kullanarak SEM taslakları ekleyebilirsiniz (bkz. Tablo malzeme). Yine en az 4 saat veya gece boyunca 60 ° C'de polimerize.
- SEM üzerinde örnekleri saplama altın için 1 dk 35 sputter kat bir sputter coater kullanarak mA (Platin/Paladyum da kullanılabilir; 10 nm kalın kaplama yeterlidir) ve yer onları içinde FIB-SEM
5. veri toplama FIB-SEM içinde
- Örnekleri mikroskop sürüş temel yazılım kullanarak ikincil elektron bulmak ile görüntü ( Tablo malzemelerigörmek). Böylece faiz (örneğin, orta kısmı nervus tibialis veya C. elegans) görüş alan bölgedir örnek odaklı olmalıdır.
Not: böylece örnek iyon ışın uygun bir çalışma mesafesi (5 mm), 90 ° açıyla karşıya veri toplama gerçekleştirmek için Sahne Alanı'na bir pozisyon iyon ve elektron ışını sözde tesadüf noktasında eğ. Bizim enstrüman kullanarak, bu bir sahne tilt 54 ° ve 5 mm çalışma mesafesi olarak elde edilir. - Örnek doğru konum yukarı ayarlamak için ikincil elektron bulmak ile ortak bir özelliği 0 ° Tilt görüntüleme sırasında ortalayın. Yavaş yavaş tilt 54 ° (5°, 20° 54°), M-ekseni hareket ettirerek aynı nesne recentering.
- Tesadüf noktası 54 °, FIB modunda Merkezi konumu özelliğini taşıyarak ardından ikincil elektron dedektörü ile görüntüleme sırasında bir özellik merkezleme tarafından bulmak. Bu merkezi bir göstergesi olması SEM yazılım hedef işaretini görüntüleyerek gerçekleştirin. Sonra ilk seçilen örnek özelliği görüntü alanının merkezi merkezi noktası işlevi SEM yazılım kullanarak taşıyın. Sonra y ekseni boyunca özellik z. sahneye taşıyarak ortalayın. Yalan ATTIM ve SEM arasında herhangi bir final ofset SEM ışın shift ile giderilmiştir.
- Gelişmiş yazılım açın (bkz. Tablo reçetesi) 3D veri kümeleri ve takip adım adım yazılım Sihirbazı'nı kaydetmek için.
- Faiz, para yatırma karbon ya da Platin bölgesi, (400 nm) üstünde tepe-in ROI bile freze izin ve eserler azaltmak için 3 nA geçerli kullanarak şarj tarafından indüklenen.
Not: Bölge FIB (genişlik, yükseklik, derinlik) ile görüntülü numune yüzeyi öğütülmüş ilgi çizerek yazılım hesaplar ve siperler öğütülmüş veya alan için gibi farklı örnek hazırlama özellikleri boyutları bindirir Platin/karbon birikimi. Ayrıca, bu örnek yüzey zarar verebilir gibi çok yüksek FIB akımları, örnek yüzeyle görüntüleme dikkatli olun. 50 PA bir akım görüntüleme için yeterlidir. - Faiz (ROI) 15/30 nA geçerli kullanarak bölge ortaya çıkarmak için bir siper değirmen için odaklı iyon demeti kullanın.
- Odaklı iyon kiriş kesiti ile 7 nA geçerli parlatmak için kullanın.
- Numune hazırlama bitirdikten sonra aşağıdaki görüntü parametreleri ayarlayın: parametreleri FIB Kur sekmesinde (FIB freze akım); freze FIB SEM parametreleri Kur sekmesini ve SEM AutoTune sekmesinde parametreler ayarlama görüntü görüntüleme (autofocus ve autostigmation her 60 dk 50 nm piksel boyutunu, bekleme süresi 3 gerçekleştirmek, ortalama 3 hat). Bu her örnek için en iyi duruma getirme.
- Çalışma sırasında kayması blok yüz neden herhangi bir termal drift önlemek için satın alma başlamadan önce en az 2 h yer bırakın.
- Sürekli fabrikasında bir dataset elde etmek ve bir 700 pA FIB geçerli modu kazanmak. Kullanım 1,5 kV (analitik modu, 900 V) ESB bulmak bir kılavuz gerilim elde etmek için 400 V ile her biri 5 nm piksel boyutu gelişmiş yazılım kullanarak görüntüleri ( Tablo malzemelerigörmek) ve 50 nm dilim kalınlığı. Bir resim alma 6 µs Işınma Zamanı ile yaklaşık 1.5 dakika sürer.
- Veri toplama başlatın. Geçerli freze FIB Image'da örnek kımıldamadı ve ilgi doğru bölge seçili olduğundan emin olmak için satın aldı. Gerekirse ayarlayın.
6. veri görselleştirme
- Fiji tüm görüntüleri içeren klasörü sürükleyerek Fiji'de görüntüleri açın ve Sanal yığınıseçin.
- Dikdörtgen aracını kullanarak faiz bölgesinin kırpma (Görüntü > Kırpma).
- Karanlıkta gösterilmesini membranlar ile geleneksel transmisyon elektron mikroskobu kontrast göstermek için veri tersine çevir (Düzenle > Ters Çevir'i).
- TrackEM214 (Fiji15) için hizalamayı da kullanabilirsiniz. Verileri TrackEM2 yüklemek (Dosya > Yeni > TrackEM2) Katmantıklayarak. Tüm görüntüleri yüklendikten sonra hizalamadan çok katmanlı mozaik işlevini kullanarak (sağ tıklayın Görüntü > Hizala > çok katmanlı mozaik hizalamak). Hizalama sonra görüntüleri tek tek TIFF dosyaları dışa aktarılır (sağ tıklayın Görüntü > Dışa Aktar > yapmak düz görüntü). Tüm görüntüleri dışa ve dosyayı kaydetmekseçin seçin.
- Gauss Bulanıklığı sonrası işleme için kullanın (süreci > Filtreler > Gaussian blur; sigma 2) ve yerel kontrast geliştirme (süreci > Yerel kontrastı Artır; CLAHE: blok boyutu 127, çubuk grafik depo gözleri 256, maksimum eğim 1.5), hangi görüntü düzgün ve daha iyi bir sinyal / gürültü oranı elde etmek Fiji'de uygulanır.
- But16 3D ilgi yapısını görselleştirmek ve el ile bir bölümleme gerçekleştirmek için kullanılır. BUT içinde veri kümesini açın ve çizim araçları seçin (özel > çizim araçları) el ile ayrılmasını gerçekleştirmek için. Farklı el ile Araçlar birim (örneğin birleştirme, heykel) boyunca ilgi yapıyı takip için kullanılabilir. Mikroskopi görüntü tarayıcısı (MIB17) yarı otomatik bölümleme için kullanın.
Representative Results
İş akışını başlatır bir örnek (burada, taze disseke fare nervus tibialis) yüksek basınç dondurma (Şekil 1a) için metal taşıyıcı konuyor. Taşıyıcılar sıvı azot (Şekil 1b) yeniden elde etmek ve donma ikame Massetme dondurulmuş ilk kimyasal kokteyl (şekil 1 c) üzerine yerleştirilir. Uzun bir dondurma sonra % 2 Osmiyum tetroxide ve % 0.1 uranyl asetat dahil olmak üzere değiştirme protokolü, örnekleri, oda sıcaklığında (şekil 1 d) gemisi kaldırılır. Daha fazla kontrastı arttırmak için örnekleri mikrodalga (şekil 1e) işlenecek plastik tüpler için transfer edilir. Vakum odası ve sıcaklık kontrol ünitesi (şekil 1f) işlemini en iyi duruma getirmek için kullanılır.
En az reçine katıştırma gerçekleştirmek için kürdan ve yaprak plastik film ihtiyaç vardır (şekil 2a). Mikrodalga kullanarak reçine ile örnekleri infiltre sonra onlar plastik film parçaları üzerinde yerleştirilen ve etrafında hareket yok reçine örnek yüzeyinde terk edene kadar. Halojen lamba kalan reçine drenaj ve minimal gömülü örnek (2b rakam) plastik filmi terk yardımcı olmak için kullanılır. Bu örnek en baştan çıkarmak daha fazla reçine iyi olması gerekmektedir. Hala bunu için belgili tanımlık substrate bağlı tutmak için örnek altında kalan küçük bir miktar olmalıdır. Plastik film polimerli örnek kesme ve SEM saplama gümüş iletken reçine (Şekil 2 c) ile üzerine monte edilmiş. Saplama en az 4 h 60 ° c (şekil 2B) için polimerli. Bileşenler iyice karışık veya karışımı düzgün polimerize değil. Taramalı elektron mikroskobu içinde şarj önlemek için altın ya da Platin/Paladyum (2e rakam) ile kaplı sputter taslaktır.
Örnekleri FIB-SEM yerleştirilir ve faiz (şekil 3ae) bölgesinin hedef için ikincil elektron bulmak ile görüntüsü. Bir iyon ışını doğrudan önünde bir kesit (şekil 3b-d, 3f-h) ortaya çıkarmak için faiz bölge malzeme çıkarmak için kullanılır. Gelişmiş iletişim kuralı bir güçlü membran kontrast (şekil 3 c-d, 3 g-h) sağlar, ancak standart protokolleri kez membran kontrast(şekil 3bf), bir eksikliği muzdarip.
(Sonra Post-processing) EM veri but, görüntü işleme ve modelleme programı kullanarak görüntülenir. Sanal veri reslicing 3D bilgileri daha iyi bir anlayış elde etmek için kullanılır (şekil 4a). Farklı yapıları veri kümesi el ile bölümlenmiş (şekil 4b-d).
Şekil 1: yüksek basınçlı donma, donma-ikame ve mikrodalga destekli işleme. (a) taşıyıcı fare nervus tibialis içeren örnek, (b) örnek sonra yüksek basınç dondurucu, ölçek çubuğu 3 mm. (c) otomatik dondurma ikame (AFS) birim örnekleri ile fare nervus tibialis içeren 3 mm. taşıyıcı bar ölçek. İç metin: 23 örnek şişeleri ve AFS kimyasallar içeren iki büyük şişeleri için ısmarlama teneke kutuda. (d) örnekleri gemisi aseton, bir cam tabakta kaldırılmakta çap işleme için mikrodalga koymak için 3 mm. (e) örneklerinde tepki tüpler bar. (f) vakum odası ve sıcaklık kontrolü mikrodalga birimidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Minimal reçine gömme ve FIB-SEM için hazırlık (a) plastik film ve katıştırma en az reçine için kullanılan kürdan, ölçek çubuğu 4 cm. (b) Nervus tibialis reçine plastik film, plastik film, polimerli o zaman kesmek ve SEM saplama ile üstüne monte ölçek çubuğu 250 µm. (c) Nervus tibialis üzerine süzülmüş Silver iletken reçine, çap bar 250 µm. (d) SEM saplama üzerinde ölçek polimerli örnekleri bar 3 mm. (e) SEM saplama, ölçek üzerinde altınla kaplı örnekleri 3 mm. bar Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: örnek FIB-SEM içinde hazırlanması (bir ve e) YALAN-SEM örnek içinde ikincil elektron resim görüntüleme için (a) Nervus tibialis, ölçek bar 100 µm. (e) C. elegans, ölçek bar 2 µm. (b-d) ve (f-h) kesit ESB dedektörü kullanarak örneği üzerinden yüzey. (b ve c) Nervus tibialis, çap 2 µm. (f ve g) C. elegans, ölçek 1 µm bar ve 200 nm. (b ve f) Diğer tüm görüntüleri geliştirilmiş donma ikame sonuçlarını göstermek ise yüksek basınç donma ve donma ikame geliştirme, olmadan sonuçları gösterilmiştir. (b ve h) Ayrıntılı görüntü ESB dedektörü kullanarak örnek. (d) Nervus tibialis, ölçeği 200 bar nm. (h) C. elegans, ölçeği 200 bar nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: resim edinme ve görselleştirme. (a) but ile gösterilen EM veri hemen hemen resliced x / z ve y/z-uçaklar, çap 2 µm. (b) Segmented akson EM veri (mavi), Remak demetleri (kırmızı), miyelin kılıfı (sarı ve turuncu) ve mitokondri (Turkuaz), ölçek 2 µm. (c ve d) 3D model bar bar 2 µm ölçek ve 500 nm . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
İletişim kuralı en iyi korunması ve FIB-SEM ile seri blok-yüz görüntülemede gerçekleştirmek için karşıtlığı göstermek için geliştirilmiştir Bu nedenle, cryo-immobilizasyon sonrası donma ikame ve mikrodalga destekli işleme kullanarak boyama tarafından takip uygulamak seçti. Bu nedenle, bu iletişim kuralı için yüksek basınçlı donma küçük örnekleri sınırlıdır. 3-6 mm genişliğinde boyutu sınırlamaları ve ~ 200 µm kalınlığında düzgün bu tekniği ile donmuş olabilir örnek boyutunun aynı örnek taşıyıcı boyutunu tarafından oluşturulur. Siyatik sinir çapı uygun donma sağlamak için gerekli 0.2 mm taşıyıcı sığdırmak için çok büyük olduğu için bu fare sinir örnek için söz konusudur. Bu nedenle, tibial sinir veya diğer ince femoral sinir gibi gibi daha küçük bir sinir dikkatli diseksiyon önerilir. Miyelin kılıf germe için hassas olduğundan, büyük taze ve canlı cesaret diseksiyonu sırasında eserler işleme önlemek için özen göstermelidir. Genel olarak, sadece uygun örnekleri elektron mikroskobik çalışmalar için kullanılır.
Mikrodalga destekli işleme ve en az reçine katıştırma hazırlık kadar hız ve işlem hedefleme için tasarlanmıştır. Bir modifiye OTO protokolü4 uygulama mikrodalga destekli işleme oda sıcaklığında kimyasal fiksasyonu için kullanılır. Ev bir mikrodalga yoktur mikrodalgalar yok homojen dağılımı, sıcaklık kontrol edilmez ve uygulanabilir yok vakum olduğunu beri aynı sonuçlar vermez. Küçük bir örnek, kimyasallar daha iyi nüfuz; Bu nedenle, en iyi sonuçları daha küçük örnekleri tarafından sağlanmaktadır. Isıdan zarar örnek görmesini önlemek için sıcaklık kontrolü ve gerekli en az mikrodalga güç uygulanması önemlidir. Uzun işlem süreleri için yol açacak hiçbir mikrodalga kullanılabilir, eğer mikrodalga destekli işleme adımlarını bankta gerçekleştirilebilir. SEM içinde doğrudan hedef yapıları için kadar reçine mümkün olduğunca örnek en baştan çıkarmak çok önemlidir. Bir veri kümesi kaydettikten sonra Post-işleme ham veri dosya boyutunu küçültmek ve sinyal-gürültü oranı artırmak gereklidir. Modern birim görüntüleme teknikleri büyük miktarda veri üretmek. Bu nedenle, hızlı ve yeterli bir şekilde veri işleme gerçekleştirmek için iş istasyonu üzerinde yeterli RAM gereklidir. Hizalama işlemleri için en az iki kat daha fazla RAM veri kümesi boyutu olarak gereklidir.
Bu iletişim kuralı nervus tibialis de C. elegansolduğu gibi fare üzerinde test edilmiştir. Hall ve ark. 12 kullanılan benzer bir geliştirme adım tezgah üzerinde onların dondurma ikame sonra hazırlanması için C. elegans. Herhangi bir diğer model organizma için Zebra balığı gibi büyük olasılıkla gerekli ayarlamaları Protokolü vardır. Kontrast geliştirme18için kullanılan su ilavesi donma ikame kokteyl gibi kompozisyonu değiştirmek için bir olası değişiklik olduğunu. Ayrıca, donma değiştirme süresi için örnek adapte zorunda ve hızlı donma ikame protokolü19göre önemli ölçüde kısaltılabilir. Ajitasyon dondurma yerine koyma işlemi20hızlandırılması için uygulama bir ihtimal. Donma ikame sonra daha fazla değişiklikler, kimyasallar ve Osmiyum tetroxide21tekrarlanan uygulama gibi mümkündür. Mikrodalga işleme sırasında sıcaklık, kuluçka süreleri ve güç ayarlarını sonuçları ilgili örnek için optimize etmek için çeşitli olabilir.
Bu iletişim kuralı böyle bir donanım diğer dondurma ikame protokolleri ve FIB-SEM veya seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu görüntüsü Hall12 tarafından açıklandığı gibi örnekleri farklı türleri ile kombine edilebilir gösterir. Bu görüntüleme teknikleri transmisyon elektron mikroskopi için daha az önemli olan gelişmiş kontrast gerektirir.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Acknowledgments
YALAN-SEM ve a.ş. (FIB-SEM operatörü konumunu) küme mükemmellik ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Araştırma Merkezi Nano mikroskobu ve moleküler Fizyoloji beyin (CNMPB) tarafından finanse edilmektedir. Thomas Müller-Reichert laboratuvar C. elegans örnekleri. verdiğiniz için teşekkür ederiz Ulrich Weikert filmde katıldığınız için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
- Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
- Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
- Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
- Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
- Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
- Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
- Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
- Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
- Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).
