Summary
Questo protocollo dimostra iniezione di un vettore virale retrogradely trasportabile nel tessuto del midollo spinale del ratto. Il vettore è preso alla sinapsi e trasportato al corpo cellulare dei neuroni bersaglio. Questo modello è adatto per l'analisi retrograda di importanti vie spinali o cellule targeting per applicazioni di terapia genica.
Abstract
L'introduzione di proteine di interesse nella cellule nel sistema nervoso è impegnativo a causa delle barriere biologiche innate che limitano l'accesso alla maggior parte delle molecole. Iniezione direttamente nel tessuto del midollo spinale ignora queste barriere, fornendo accesso ai corpi cellulari o sinapsi dove molecole possono essere incorporati. Combinando la tecnologia di vettore virale con questo metodo consente di introduzione di geni bersaglio in tessuto nervoso ai fini della terapia genica o la traccia del tratto. Qui un virus progettato per trasporto retrogrado altamente efficiente (HiRet) è stato introdotto alle sinapsi di interneuroni propriospinal (PNs) per incoraggiare il trasporto specifico ai neuroni nel midollo spinale e dei nuclei del tronco cerebrale. Targeting PNs sfrutta le numerose connessioni che ricevono da vie del motore come i tratti nucleo e reticulospinal, nonché la loro interconnessione con a vicenda durante segmenti del midollo spinale. Rappresentante l'analisi utilizzando il vettore HiRet con dettagli di alta fedeltà spettacoli costitutivamente attiva proteina fluorescente verde (GFP) di corpi cellulari, assoni e pergole dendritiche in PNs toracica e in neuroni di reticulospinal nella formazione reticolare di Pontina. HiRet incorpora bene nella vie del tronco cerebrale e PNs ma mostra età dipendente integrazione nei neuroni del tratto corticospinale. In sintesi, l'iniezione del midollo spinale usando vettori virali è un metodo adatto per introduzione di proteine di interesse in neuroni dei tratti mirati.
Introduction
Vettori virali sono importanti strumenti biologici che possono introdurre materiale genetico nelle cellule al fine di compensare i geni difettosi, proteine di sovraregolare l'importante crescita o fabbricare proteine marker che mettono in risalto la struttura e le connessioni sinaptiche del loro obiettivi. Questo articolo si concentra su iniezione diretta di un vettore lentivirale retrogradely trasportabile altamente efficiente nel midollo spinale del ratto al fine di evidenziare le principali vie del motore con l'analisi fluorescente. Questo metodo è anche molto adatto per studi di rigenerazione e la ricrescita assonali per introdurre le proteine di interesse in diverse popolazioni di neuroni ed è stato utilizzato per mettere a tacere i neuroni per mappatura funzionale studi1,2.
Molti dei dettagli anatomici delle vie motorie spinali sono stati chiariti attraverso studi di iniezione diretta con traccianti classici quali BDA e fluoro-oro3,4,5,6,7 , 8. tali rivelatori sono considerati il gold standard ma possono avere alcuni svantaggi come l'assorbimento dagli assoni danneggiati, o assoni in passaggio nella materia bianca che circonda un'iniezione sito9,10,11 . Questo potrebbe portare a errate interpretazioni della connettività via e può essere uno svantaggio negli studi di rigenerazione dove assorbimento della tintura da assoni danneggiati o mozzati potrebbe essere scambiato per la rigenerazione delle fibre durante la successiva analisi12.
Vettori lentivirali sono popolari in studi di terapia genica, in quanto forniscono espressione stabile, a lungo termine in popolazioni neuronali13,14,15,16,17,18 ,19. Tuttavia, tradizionalmente confezionati vettori lentivirali può avere limitata trasporto retrogrado e può innescare la risposta del sistema immunitario quando utilizzato in vivo4,20,21. Un vettore di trasporto retrogrado efficiente chiamato HiRet è stato prodotto da Kato et modificando la busta virale con una glicoproteina del virus di rabbia per creare un vettore di ibrido che migliora il trasporto retrogrado22,23.
Analisi retrograda introduce un vettore nello spazio sinaptico di un neurone bersaglio, permettendo così di essere ripreso da assone di tale cella e trasportati al corpo cellulare. Trasporto di successo di HiRet è stata dimostrata da sinapsi neuronali nel cervello di topi e primati23,24 e dal muscolo nei motoneuroni22. Questo protocollo dimostra iniezione nel midollo spinale lombare, specificamente destinati i terminali sinaptici di propriospinal interneuroni e neuroni del tronco cerebrale. PNs ricevere connessioni da molte diverse vie spinali e quindi può essere utilizzato per indirizzare una popolazione diversificata di neuroni nel midollo spinale e del tronco cerebrale. Neuroni identificati in questo studio rappresentano circuiti che innervano motoneurone piscine relative alla funzione motoria hindlimb. Etichettatura robusto è visto nel midollo spinale e del tronco cerebrale, compresi i dettagli ad alta fedeltà di pergolati dendritiche e terminali assonici. Abbiamo anche utilizzato questo metodo negli studi precedenti all'interno del midollo spinale cervicale per etichettare propriospinal e del tronco cerebrale reticulospinal vie25.
Questo protocollo dimostra l'iniezione di un vettore virale nel midollo spinale lombare di un ratto. Come si vede nel film 1, l'incisione è mirata individuando la vertebra L1 che si trova presso l'ultima costola. Viene utilizzato come punto di riferimento caudale per un'incisione di 3-4 cm che espone la muscolatura sopra la colonna vertebrale L1-L4. Laminectomies degli aspetti dorsali delle vertebre T11-T13 vengono eseguite e un ago di vetro smussato è diretto 0.8 mm laterale dalla linea mediana e abbassato 1,5 mm profondità nella materia grigia per iniettare il virus.
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Protocol
Tutte le seguenti procedure di cura chirurgica e animale sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato della Temple University.
1. pre-operatoria preparazioni
- Preparare il vetro tirato aghi per iniezione virale pochi giorni prima dell'intervento chirurgico utilizzando pipette capillari 3,5 in vetro nanolitro progettati per nanolitro iniettori. Tirare ogni pipetta un estrattore di ago in due fasi secondo le istruzioni del produttore per creare due modelli di aghi.
- Affinare la punta dei modelli dell'ago con il taglio da circa 1-2 mm di vetro in eccesso con microforbici. Misura approssimativa apertura dimensioni sotto un microscopio con un vetrino di calibrazione per isolare gli aghi con aperture di 30-40 µm.
- Con l'ago posizionato a 30°, è possibile utilizzare una Smussatrice micropipetta per creare una punta con un'apertura di 30-40 µm e un angolo di smusso di 45°. Verificare la larghezza di apertura con la scala del nonio su vetrino di calibrazione. Passare acqua ed etanolo attraverso l'ago di vetro usando una siringa con un allegato di ago flessibile per lavare via i detriti e contrassegnare l'ago a intervalli regolari con un pennarello nero.
- Posizionare gli aghi in un piatto coperto di Petri precedentemente puliti con etanolo al 70% e sterilizzare per 30 min in una cappa di biosicurezza ai raggi UV.
- Preparare dei lentivirus HiRet rimuovendo un volume idoneo dal freezer immediatamente prima della procedura.
Nota: Un volume idoneo include l'importo necessario per l'iniezione (1 µ l per iniezione x numero di iniezioni) più una piccola quantità di volume in più per tenere conto per il pipettaggio e perdite di carico. Trasportare e conservare il virus su ghiaccio quando non in uso. - Preparare l'iniettore inserendolo la micropompa e mettendoli in un micromanipolatore con scala Vernier.
- Per preparare l'ago di vetro, accuratamente caricare una tintura colorata come olio rosso con una siringa provvisti di un ago flessibile. Garantire che nessun bolle rimangono nell'ago. Usare una tecnica asettica quando si maneggia l'ago e astenersi dal toccare la punta.
- Inserire l'ago di vetro l'iniettore, assicurando che l'ago sia inserita correttamente nelle rondelle, iniettore è chiusa con il tappo stretto e ago dell'iniettore in acciaio si estende approssimativamente ¾ della lunghezza dell'ago di vetro. Virus possono essere caricati nell'ago in un passaggio successivo.
2. anestesia e preparazione del sito chirurgico
- Pesare l'animale su una bilancia digitale. Registrare il peso pre-operatorio per determinare il volume di anestetico richiesto e per consentire il monitoraggio di peso post-chirurgia. Ratti Sprague-Dawley femminili circa 200 – 250 g sono stati usati in questo protocollo.
- Anestetizzare il ratto tramite inalazione isoflurane o una soluzione di chetamina/xilazina iniettata (k / x). Qui, la ketamina è iniettato intraperitonealmente a 67 mg/kg e xilazina ad un dosaggio di 6,7 mg/kg.
- Confermare un appropriato piano di anestetico pizzicando il piede saldamente. In caso di ritiro riflessivo, attendere alcuni minuti supplementari prima di procedere.
Nota: Osservare anche i baffi, gli occhi e tasso di respirazione per segni di coscienza. Se i baffi sono spasmi muscolari, l'occhio lampeggia quando viene toccato delicatamente o respirazione è rapido e superficiale, attendere fino a quando il piano di anestetico è più profondo di procedere con il protocollo. Inoltre monitorare questi segni in tutta la chirurgia di laminectomy e iniezione. Se l'animale Visualizza un piano superficiale di anestetico, amministrare un booster shot di sola ketamina uguale a ½ l'originale k / x dosaggio. - Radere il ratto lungo la linea mediana dorsale dai fianchi fino all'angolo inferiore delle scapole. Tendere la pelle dell'animale per una rasatura più facile e precisa.
- Applicare unguento oftalmico in entrambi gli occhi.
- Applicare antisettico per zona rasata per sterilizzare il sito. Per la prima macchia, bagnare garze sterili con una soluzione di 5% di iodio e pulisca via tutti i capelli e detriti. Seguire questo con uno swipe unidirezionale con garza sterile imbevuta di etanolo al 70%, in modo che nessuna zona è contattata due volte. Utilizzare questa stessa tecnica con alternanza di iodio e garza imbevuta di etanolo di altre due volte.
3. preparazione di campo e strumento chirurgica
- Preparare un set di strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave che includono un bisturi, Pinze ossivore, ratto dente pinze, forbici di primavera, emostatiche, punto medio curvata forcipe e divaricatori o ganci ponderate di scartare l'involucro sterile per creare un campo sterile.
- Aprire un pacchetto di guanti chirurgici sterili e posizionare l'involucro sterile guanto sul tavolo. Utilizzare questo come un campo sterile supplementare per gli strumenti utilizzati per prevenire la contaminazione dell'involucro sterile.
- Lasciar cadere una lama per bisturi #10 sul campo sterile. Fissare la lama ad un manico con emostatiche. Soluzione salina sterile posizione, 4,0 catgut cromico sutura e materiali per controllare lo spurgo come un cauterizzatore, garza sterile, applicatori di cotone con punta sterili (per le sbavature del muscolo), o gelfoam o bonewax (per le sbavature dell'osso) in un luogo accessibile.
- Recuperare l'animale e impostarlo su un panno sterile. Posizionare la garza sotto la vescica per raccogliere l'urina. Puntellare l'area di destinazione con un asciugamano arrotolato sotto l'addome. Se disponibile, posto un rilievo di riscaldamento chirurgico sotto il panno sterile, soprattutto per le procedure più lunghe.
Nota: La sterilità è importante durante la chirurgia di sopravvivenza. Tenere una bottiglia dello spruzzo di etanolo al 70% a disposizione per mantenere la sterilità delle mani guantate e uno sterilizzatore di perlina di uso se è stata compromessa la sterilità dello strumento, o tra singoli interventi chirurgici.
4. esponendo la colonna vertebrale e identifica il sito di laminectomia
- Identificare l'area in cui un'incisione della pelle verrà effettuata premendo delicatamente le dita presso l'ultima costola per individuare la vertebra L1. Usando questo come un punto di riferimento, fare un'incisione cutanea di 3-4 cm con un bisturi chirurgico #10 termina appena inferiore a L1 per esporre il muscolo. Tendete la pelle delicata diffondendo e premere con forza con la lama del bisturi per garantire un'incisione pulita.
- Tagliare e diffondere il grasso superficiale con pinze e le forbici se necessario. (A seconda sulla vertebra di destinazione, ci può o non essere un grande rilievo grasso superficiale al muscolo).
- Sento per i processi spinous con il piatto della lama bisturi o un dito. Spesso la zona del midline sarà delineata da una "V" della fascia bianca su entrambi i lati. Fare un piccolo taglio rostrale per consentire di afferrare saldamente su un processo superiore con il forcipe di ratto del dente, poi fare 2 lunghi, profondi tagli più vicino i processi possibili. Il punto più profondo del taglio, la superficie dorsale delle vertebre può essere sentita con il bisturi.
- Tenere i muscoli laterali da parte con divaricatori o ponderate ganci per migliorare la visibilità. Muscolare chiaro circa i processi con un bisturi, forbici di primavera o Pinze ossivore per determinare la forma delle loro teste.
Nota: Ricordare che il midollo spinale non si estende l'intera lunghezza della colonna vertebrale, come le fermate di tessuto del midollo spinale prima nello sviluppo di osso in crescita. Ciò significa che il livello spinale di destinazione potrebbe essere sotto una vertebra diversamente denominata. - Individuare il T11 e i processi di T12 e T13 adiacenti.
Nota: Assistenza di mira i corretti livelli vertebrali è reperibile in un Atlante di midollo spinale del ratto e gli studi precedenti che delinea luoghi d'interesse al mouse, che ha una molto simile struttura vertebrale6,33. Un processo spinous rostrale come T9. lasciare riposare per dare un punto di riferimento del midline.
5. esecuzione di una laminectomia
- Una volta identificata correttamente l'area di destinazione, eseguire i laminectomies degli aspetti dorsali di T11-T13. Delicatamente e diffondere le vertebre per rivelare legamenti intervertebrali, che sono buoni siti per inserire Pinze ossivore per il morso iniziale dell'osso. Tenere le Pinze ossivore in grado di aumentare il controllo fine chiusa a metà.
- Rimuovere i processi spinous e funzione dorsale delle vertebre prendendo piccoli morsi con le Pinze ossivore. Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale o disturbare la dura madre. Sollevare leggermente con il forcipe del dente di ratto per contribuire a tirare il midollo spinale dalle vertebre e diminuire la tendenza a colpire il tessuto del midollo spinale.
- Sgombrare il campo dell'osso dalla linea mediana affinché il linea mediana del vaso sanguigno possono essere osservato. Lasciare una finestra che chiaramente Mostra il tessuto del midollo spinale ed è privo di detriti.
- Toccare delicatamente il midollo spinale con il forcipe. Alcuni animali possono riflessivamente saltare, anche se il loro aereo anestetico è profondo. Applicare alcune gocce di un agente paralizzante come la lidocaina direttamente al midollo spinale per evitare di saltare durante la procedura di iniezione.
- Fissare l'animale in un supporto spinale di fissaggio stabilizzante forcipe ai processi spinous rostrali e caudali alla finestra laminectomia. Sollevare l'addome dell'animale usando il titolare spinale per negare l'effetto di movimenti di respirazione. Ciò aumenterà la stabilità dell'ago e garantire adeguata profondità di iniezione.
6. caricamento virus e posizionamento dell'iniettore
- Caricare virus nell'iniettore di pipettaggio circa 5 µ l su un pezzo di parafilm e posizionare l'ago in modo che la punta è dentro la goccia.
- Utilizzare la micropompa per prelevare fino a 4 µ l di virus ad un tasso di 20 – 100 nL/s.
- Impostare il controller per iniettare e rilasciare una piccola quantità di virus dall'ago affinché che la punta dell'ago non sia ostruita. Eliminare virus in eccesso con un panno da laboratorio.
Nota: Una siringa Hamilton con un ago d'acciaio può essere utilizzata come alternativa alle pipette in vetro tirato. - Posizionare il micromanipolatore, in modo che la scala del nonio è visibile e posizionare l'ago al midline del midollo spinale.
Nota: La linea mediana può trovarsi a volte da un grande vaso sanguigno in esecuzione sulla superficie anteriore del midollo spinale. Tuttavia, questo può variare in ratti individuali e il targeting del midline dovrebbe essere confermato dal confronto con un processo spinous intatto. - Dirigere l'ago lateralmente da 0,8 mm utilizzando la scala di Vernier il micromanipolatore.
- Abbassare l'ago al midollo spinale fino al rientro, ma non perforare, la dura madre. Con un rapido movimento rotatorio, la puntura dura con l'ago fino a quando ha affondato ad una profondità di 1,5 mm.
7. iniettare il virus nel midollo spinale
- Una volta che l'ago è in posizione, programma l'iniettore per iniettare a una velocità di 400 nL/min., a conferma che il virus sta entrando il midollo spinale di osservare l'andamento della parte anteriore di tintura. Ci dovrebbe essere nessuna perdita evidente o rigonfiamento del tessuto del midollo spinale. Se la perdita è osservata, a volte possono essere alleviato riducendo la velocità di iniezione di 200 nL/min.
- Una volta terminata l'iniezione, consentire l'ago riposare nel midollo spinale per 2 – 5 min (a seconda del volume iniettato) per facilitare la diffusione del virus.
- Lentamente, ritirare l'ago e spostare il prossimo sito di iniezione. Iniettare 1 µ l di virus in ognuno dei 6 siti uniformemente spaziati circa 1 mm di distanza lungo la lunghezza del tessuto spinale L1-L4. L'ago stesso può essere utilizzato per ogni iniezione, purché continui a funzionare correttamente.
8. cura di chiusura e post-operatorio della ferita
- Rimuovere l'animale dal titolare spinale ed estrarre divaricatori o ganci utilizzati per diffondere il muscolo laterale. Assicurarsi che la ferita sia libera da tutti i detriti prima della chiusura.
- Suturare il muscolo utilizzando una sutura 4.0 catgut cromico. Tagliate i fili di sutura vicino il nodo per ridurre il rischio di irritazione della pelle interna.
- Fiocco la pelle chiusa utilizzando clip 9 mm della ferita. Per consentire una guarigione ottimale, allineare i bordi della pelle prima di pinzatura.
- Metti l'animale su una convezione di acqua riscaldamento pad e monitor fino a quando il vigile.
- Iniettare 5 – 10 mL di soluzione fisiologica sterile per via sottocutanea per reintegrare i liquidi e un antibiotico come cefazolin per prevenire l'infezione. Quando l'animale è ambulatorio, inserirlo indietro nella sua gabbia a casa e fornire analgesici iniziali. I ratti di qualsiasi segno di dolore e l'angoscia di monitorare e trattare secondo la procedura IACUC approvato per alleviamento di dolore.
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Representative Results
Iniezione di successo e di trasporto del vettore virale dovrebbe comportare di trasduzione di una popolazione robusta dei neuroni unilaterale nel midollo spinale ed in alcuni nuclei del tronco cerebrale. Figura 1 di seguito viene illustrato l'etichettatura stereotipata dei neuroni ed assoni nel midollo spinale toracico e nella formazione reticolare Pontina del tronco cerebrale ad post-iniezione quattro settimane. Espressione significativa di GFP è visto in neuroni in materia grigia del midollo spinale toracico sul lato ipsilateral all'iniezione (Figura 1A, area circoscritta). Alcuni neuroni si osservano anche sul lato controlaterale, soprattutto vicino al midline. Nella materia bianca, espressione di GFP è osservato in assoni nel midollo ipsilateral (Figura 1A, frecce e punte di freccia), soprattutto nelle zone tipiche di assoni propriospinal (frecce). Figura 1A' Mostra un ingrandimento superiore della zona boxed in A, dimostrando tipica espressione nei corpi delle cellule neuronali e dendriti. Espressione di GFP in neuroni può essere osservato anche nei nuclei del tronco cerebrale come la formazione reticolare di pontine (Figura 1B, ingrandimento maggiore dell'area circoscritta in Figura 1B').
Figura 1: trasduzione dei neuroni del midollo spinale e del tronco cerebrale. Espressione (A), GFP in neuroni (area circoscritta), gli assoni dei neuroni propriospinal (frecce) e assoni di altri tratti (frecce) nel midollo spinale toracico. (A') Maggiore ingrandimento di un neurone espressione l'area circoscritta di r. (B), la formazione reticolare di pontine nel tronco cerebrale che esprimono GFP-etichettato neuroni e dendriti. (B') Maggiore ingrandimento dell'area circoscritta in B. Scala bar: (A) = 500 μm; (B) = 1 mm; (A'), (B) = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: L'iniezione nel midollo spinale lombare del ratto di targeting. Questa sintesi video le nozioni di base di targeting e l'iniezione di un vettore virale nel midollo spinale del ratto. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Manipolazione genetica dei neuroni nel cervello e nel midollo spinale è servito ad evidenziare sensoriali, motorie e autonomiche vie tramite l'analisi fluorescente e di esplorare il potenziale di ricrescita dei tratti neuronale dopo lesione27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. diretto iniezione di un vettore virale retrogradely trasportabile nel midollo spinale può avere come bersaglio le popolazioni neuronali tramite loro connessioni sinaptiche, rendendo questo metodo una scelta eccellente per le vie di mapping nel sistema nervoso centrale. Il vettore HiRet Mostra specificamente l'assorbimento selettivo alle sinapsi neuronali22,24,25e l'analisi precedente con analoga strutturate vettori hanno mostrati nessuna diffusione negli assoni danneggiati o cellule indipendenti 34 , 35, che è coerente con i risultati con le HiRet costrutto22,23,25. Così, iniezione diretta di HiRet come tracciante retrogrado è un metodo ideale per esplorare interneuronale circuiti che subiscono la plasticità dopo la ferita.
Ci sono due concetti critici coinvolti nel successo iniezione di un vettore virale nel midollo spinale. Il primo è stabilire il bersaglio corretto con l'ago di vetro, e il secondo consiste nel garantire un flusso adeguato del virus dall'ago nel tessuto. Come questo protocollo comporta l'analisi retrograda, come target l'area corretta richiede una conoscenza approfondita delle connessioni sinaptiche della popolazione neuronale di interesse. Neuroni propriospinal e reticulospinal collegamento al midollo spinale lombare sono indirizzati qui. Questi neuroni sono distribuiti in tutto il tronco encefalico e il midollo spinale cervicale e toracico segmenti, con la maggior parte dei PNs localizzato alle lamine V-VII all'interno della materia grigia. Per garantire la trasduzione dell'adeguata della popolazione di neuroni, sei iniezioni virale sono realizzate su un'area che attraversa quattro segmenti spinali. I segmenti di L1-L4 sono scelti a causa della presenza di generatori l'elemento centrale del modello e le loro connessioni noti ad altre aree del midollo spinale. Una volta che il corretto o dei segmenti spinali e lamine sono noti, posizione fisica di queste destinazioni tramite reperi anatomici è cruciale. Atlanti che mostra i dettagli della struttura anatomica e forma vertebrale possono essere utile per confermare la destinazione monumenti8,36. Va notato che la maggior parte del presente protocollo rimane lo stesso se sono fatti una iniezione o sei; la differenza è solo nel numero dei segmenti spinali esposto tramite laminectomy e il fatto che è necessario ricaricare l'ago di vetro con virus aggiuntivi se l'iniezione più di 4 µ l. Il protocollo può anche essere facilmente adattato per il mouse. Grazie alle sue dimensioni più piccole, il volume del virus iniettato il cavo dovrebbe essere regolato verso il basso e le misure necessarie a colpire le lamine spinale corrette regolato. Diversi video di simili interventi chirurgici del mouse sono stati precedentemente pubblicati37,38.
La considerazione successiva è adeguata diffusione nel tessuto. Un'attenta preparazione dell'ago è necessaria garantire che l'apertura è sufficiente per la sospensione virale a fluire verso l'esterno e che i detriti non bloccano la punta, e la visualizzazione del flusso dall'ago nel midollo spinale attraverso un fronte di tintura colorata è utili per confermare che la sospensione è penetrare il tessuto. Una volta che la sospensione è stata distribuita nel tessuto, mantenendo l'ago all'interno del midollo spinale per 2-5 minuti garantirà un'adeguata diffusione.
Trasduzione del successo di una popolazione di destinazione può dipendere anche da proprietà intrinseche del virus iniettato come titolo, sierotipo e infezione l'efficienza. Troviamo un titolo copia genomic di almeno 1010 GC/mL per HiRet lentivirus per lavorare bene per la sperimentazione in vivo. Volumi di iniezione o più alti titoli potrebbero mostrare più alto indice d'etichettatura, ma la cura deve essere presa in quanto il virus potrebbe diffondere fuori della zona prevista o nel midollo spinale controlaterale. Deve anche considerare il tipo di vettore appropriato per etichettatura celle di interesse basato su loro tropismo. Alcuni sierotipi virali possono avere infezione migliore e tariffe di trasduzione in diverse popolazioni di neuroni39. Vettori lentivirali tradizionali sono noti per infettare una vasta gamma di tipi di cellule a causa della proteina di busta VSV-G, tuttavia le modifiche a questo vettore possono influenzare il suo tropismo40. Il costrutto HiRet modifica la busta di pseudotipizzazione con una glicoproteina (FuG-B) di fusione del virus di rabbia, che permette per altamente-efficiente trasporto retrogrado22,23 ed è efficace nel trasdurre propriospinal e tratti di reticulospinal, con un neurone numeri paragonabili alla tracciatura delle vie tramite metodi quali fluorogold e microruby4,41 (per dettagli di costruzione della sede di vettore HiRet Hirano et al.) 22. Tuttavia, esso ha fatto non sufficientemente etichettare il tratto corticospinale adulto in questi esperimenti, anche se etichetta il CST in neonati con alta efficienza in altri studi1. È possibile che recettori necessari per l'assorbimento di HiRet alle sinapsi mirati, ad esempio NCAM o p75NTR, sono solo debolmente espresse sull'adulto CST neuroni42,43, anche se questo è ancora in fase di studio. In ogni caso, questo dimostra l'importanza di stabilire se il vettore utilizzato è appropriato per le celle di destinazione. In questo esperimento, cervello e midollo spinale del tessuto sono stati elaborati e sondati dopo quattro settimane per garantire tempo abbondante per l'amplificazione e trasporto da midollo lombare a tutte le aree del cervello. HiRet viene trasportato tramite il trasporto assonale retrogrado veloce, e quindi un più breve periodo sperimentale potrebbe essere appropriato se la distanza percorsa è minore, come se l'area di iniezione è nel midollo spinale cervicale.
Iniezione diretta chirurgia è uno strumento utile per l'introduzione della tecnologia di vettore virale nel midollo spinale. Uso di HiRet per sperimentazione genetica è vantaggioso in quanto permette stabile, lunga durata l'espressione del transgene e non è tossico ai neuroni. In questo esperimento, alcuna etichettatura di GFP è stato visto in neuroni che non fanno diretto connessioni sinaptiche alla zona di iniezione. Anche questo era vero in precedenti studi in animali con una contusione toracica lesioni25. Inoltre, HiRet-GFP è riuscito a etichettare motoneuroni spinali o neuroni del ganglio di radice dorsale quando iniettato nel nervo sciatico transitoriamente demyelinated (osservazioni non pubblicate). Insieme, questi dati suggeriscono che HiRet non entra facilmente attraverso gli assoni e trasduce in modo efficiente i neuroni dall'assorbimento del vettore alle sinapsi, fornendo una mappa più dettagliata e ad alta fedeltà delle connessioni neuronali della popolazione mirata. Questo è un vantaggio sopra altri vettori virali retrogradely trasportabili come retrogrado virus adeno-associato (rAAV-retro), che è noto essere preso dagli assoni in passage44 e rende HiRet particolarmente utile negli studi di mappatura rigenerante e Ricollegare i circuiti del midollo spinale danneggiato. Vantaggi di HiRet potrebbero consentire anche per il targeting specifico di popolazioni neuronali per silenziamento o ablazione studi25,44,45,46,47.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione dal Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo R01 R01NS103481 e Shriners Hospital per la ricerca pediatrica concede SHC 84051 e SHC 86000 e il dipartimento della difesa (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
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