Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/59160

Summary

هذا البروتوكول يوضح حقن ناقل فيروسي ريتروجراديلي قابلة للنقل في أنسجة النخاع الشوكي الفئران. تناولها في المشبك الناقل ونقلها إلى الجسم خلية من الخلايا العصبية المستهدفة. هذا النموذج مناسبة لاقتفاء أثر رجعي مسارات العمود الفقري هامة أو استهداف الخلايا لتطبيقات العلاج الجيني.

Abstract

إدخال البروتينات ذات الاهتمام في الخلايا في الجهاز العصبي يشكل تحديا بسبب الحواجز البيولوجية الفطرية التي تحد من الوصول إلى معظم الجزيئات. تتجاوز هذه الحواجز، وتوفير إمكانية الوصول إلى الأجهزة المحمولة الحقن مباشرة في أنسجة النخاع الشوكي أو synapses حيث يمكن إدراج الجزيئات. الجمع بين التكنولوجيا النواقل الفيروسية مع هذا الأسلوب يسمح لإدخال الجينات المستهدفة في النسيج العصبي غرض العلاج الجيني أو تتبع المسالك. هنا هو عرض فيروس هندسيا للنقل إلى الوراء ذات كفاءة عالية (حرية) عند نهايات من بروبريوسبينال إينتيرنيورونس (السندات الإذنية) لتشجيع النقل المحددة للخلايا العصبية في الحبل الشوكي ونوى جذع الدماغ. استهداف السندات الإذنية يستفيد من الاتصالات العديدة التي يتلقونها من مسارات السيارات مثل مساحات روبروسبينال وريتيكولوسبينال، فضلا عن بالترابط مع بعضها البعض في جميع أنحاء أجزاء الحبل الشوكي. الممثل التتبع باستخدام ناقلات هيريت مع تفاصيل عالية الدقة يظهر البروتين active مؤثرا الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) الهيئات الخلية ومحاور عصبية والعرش الجذعية في السندات الإذنية والصدر وفي الخلايا العصبية ريتيكولوسبينال في تشكيل شبكي البوتانية. حرية جيدا ودمج مسارات جذع الدماغ والجهاز العصبي المحيطي ولكن يظهر الاندماج يتوقف العمر في المسالك كورتيكوسبينال الخلايا العصبية. وخلاصة القول، حقن الحبل الشوكي باستخدام النواقل الفيروسية طريقة مناسبة لإدخال البروتينات ذات الاهتمام في الخلايا العصبية لمساحات محددة الأهداف.

Introduction

النواقل الفيروسية هي أدوات البيولوجية الهامة التي يمكن إدخال المواد الجينية في الخلايا من أجل التعويض عن الجينات المعيبة، بروتينات النمو الهام upregulate أو صنع البروتينات العلامة التي تسلط الضوء على هيكل واتصالات متشابك من أهدافها. تركز هذه المقالة على الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال ريتروجراديلي القابلة للنقل ذات كفاءة عالية في الحبل الشوكي الفئران بغية تسليط الضوء على مسارات السيارات الرئيسية مع تتبع الفلورسنت.  هذا الأسلوب هو أيضا مناسب جداً لدراسات التجديد وإعادة نمو محواري ﻹدخال البروتينات لمصلحة السكان متنوعة من الخلايا العصبية، وقد استخدمت لإسكات الخلايا العصبية لرسم الخرائط الوظيفية الدراسات1،2.

كثير من التفاصيل التشريحية للعمود الفقري مسارات السيارات تم توضيحها من خلال دراسات الحقن المباشر مع تتبع الكلاسيكية مثل BDA ومخفضات والذهب3،،من45،،من67 , 8-تتبع هذه تعتبر معيار الذهب ولكن قد يكون بعض العيوب مثل الإقبال بمحاور عصبية تالفة، أو محاور عصبية في ممر في هذا الشأن البيضاء المحيطة بحقن الموقع9،10،11 . وهذا يمكن أن يؤدي إلى تفسيرات خاطئة لمسار الاتصال وقد يكون هناك عيب في دراسات التجديد حيث يمكن أن يكون مخطئا امتصاص الصبغة بواسطة محاور عصبية معطوبة أو مقطوعة لتجديد الألياف أثناء تحليل لاحق12.

لينتيفيرال الناقلة شعبية في دراسات العلاج الجيني، كما أنها توفر التعبير مستقرة وطويلة الأمد في السكان العصبية13،،من1415،،من1617،18 ،19. بيد ناقلات لينتيفيرال تقليديا المعلبة يمكن حدت من النقل إلى الوراء وقد تؤدي إلى استجابة الجهاز المناعي عند استخدامها في فيفو4،،من2021. وتنتج ناقل نقل إلى الوراء ذات كفاءة عالية ووصف حرية كاتو et al. بتعديل المغلف الفيروسي مع داء فيروس بروتين سكري لإنشاء ناقل هجينة التي تعمل على تحسين النقل إلى الوراء22،23.

اقتفاء أثر رجعي يدخل متجه إلى مساحة متشابك لخلية الهدف، مما يسمح لها أن تتناولها إكسون تلك الخلية ونقلها إلى جسم الخلية. قد ثبت النقل الناجح حرية من نهايات الخلايا العصبية في أدمغة الفئران والقرود23،24 ومن العضلات في الخلايا العصبية الحركية22. هذا البروتوكول يوضح حقن في الحبل الشوكي القطني، تستهدف على وجه التحديد محطات متشابك إينتيرنيورونس بروبريوسبينال والخلايا العصبية في الدماغ. السندات الإذنية تلقي اتصالات من العديد من مسارات مختلفة العمود الفقري وهكذا يمكن أن تستخدم لاستهداف سكان متنوعة من الخلايا العصبية في الحبل الشوكي والدماغ. تسمية الخلايا العصبية في هذه الدراسة تمثل الدوائر إينيرفاتينج تجمعات الخلايا العصبية الحركية المتصلة بوظيفة الحركة اللكتات. ويعتبر وسم قوية في الحبل الشوكي وجذع الدماغ، بما في ذلك تفاصيل عالية الدقة للعرش الجذعية ومحطات إكسون. كما أننا استخدمنا هذا الأسلوب في الدراسات السابقة داخل الحبل الشوكي عنق الرحم لتسمية بروبريوسبينال والدماغ ريتيكولوسبينال مسارات25.

هذا البروتوكول يوضح ضخ النواقل الفيروسية في الحبل الشوكي القطني من الفئران. كما يظهر في الفيلم 1، يستهدف الشق طريق تحديد فقرة L1 يقع في الضلع الأخير. وهذا كعلامة بارزة والذيلية لشق سم 3-4 الذي يعرض الجهاز العضلي عبر الحبل الشوكي L1-L4. تتم لامينيكتوميس جوانب الظهرية لفقرات T11 T13 ويوجه إبرة زجاج مشطوف الوحشي 0.8 ملم من خط الوسط وخفض 1.5 مم عمق الرمادية لحقن الفيروس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات الجراحية والحيوان الرعاية التالية عليها برعاية الحيوانات واستخدام اللجنة لجامعة تمبل.

1-مرحلة ما قبل الجراحية التحضير

  1. إعداد الزجاج سحبت الإبر لحقن الفيروسية بضعة أيام قبل الجراحة باستخدام 3.5 نانولتر الزجاج الشعرية الماصات مصممة للحقن نانولتر. اسحب كل ماصة خطوتين إبرة ساحبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لإنشاء قوالب إبرة اثنين.
  2. صقل غيض القوالب إبرة بقطع حوالي 1-2 مم زجاج الزائد مع ميكروسسيسورس. قياس حجم الفتحة التقريبية تحت مجهر مع شريحة معايرة مجهر لعزل الإبر مع فتحات ميكرون 30-40.
  3. مع الإبرة المتمركزة على 30°، استخدم بيفيلير ميكروبيبيتي لإنشاء تلميح مع فتحه ميكرومتر 30-40 وزاوية مشطوفة 45°. تحقق من عرض الفتحة مع رنية على الشريحة المعايرة. تمرير المياه والايثانول من خلال إبرة الزجاج باستخدام المحاقن مع مرفق إبرة مرنة يجرف الحطام ومارك الإبرة على فترات منتظمة مع علامة سوداء.
  4. مكان الإبر في طبق بتري مغطاة تنظيفها مسبقاً مع الإيثانول 70% وتعقيم لمدة 30 دقيقة في غطاء السلامة الأحيائية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  5. إعداد لينتيفيروس حرية عن طريق إزالة وحدة تخزين مناسبة من الثلاجة مباشرة قبل الإجراء.
    ملاحظة: وحدة تخزين مناسب يتضمن المبلغ اللازم لحقن (1 ميليلتر للحقنة الواحدة × عدد الحقن) بالإضافة إلى كمية صغيرة من حجم إضافي على حساب بيبيتينج وتحميل الخسائر. نقل وتخزين الفيروس على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
  6. إعداد محقن بتوصيله إلى ميكروبومب ووضعه في ميكرومانيبولاتور مع ورنيه.
  7. لإعداد الإبرة الزجاجية، وتحميل صبغة ملونة مثل زيت الأحمر بعناية مع حقنه تجهيزه بإبرة مرنة. ضمان بقاء لا فقاعات في الإبرة. استخدام تقنية معقمة عند التعامل مع الإبرة، والامتناع عن لمس الحافة.
  8. إدراج إبرة زجاجية في محقن، ضمان أن الإبرة يجلس بشكل صحيح في الغسالات وكاب حاقن هو مشدود على ضيق، ومدد الإبرة حاقن الصلب تقريبا ¾ طول الإبرة الزجاج. الفيروسات يمكن تحميله إلى الإبرة في خطوة لاحقة.

2-التخدير وتحضير الموقع الجراحي

  1. وزن الحيوان على مقياس رقمي. تسجيل الوزن قبل العملية لتحديد حجم التخدير اللازمة والسماح للرصد من الوزن ما بعد الجراحة. إناث الفئران سبراغ داولي حوالي 200-250 غم استخدمت في هذا البروتوكول.
  2. تخدير الفئران باستخدام أما من استنشاق إيسوفلوراني أو حلاً الكيتامين/xylazine حقن (k/x). وهنا، يتم حقن الكيتامين إينترابيريتونيلي في 67 مغ/كغ وإكسيلازيني في جرعة 6.7 مغ/كغ.
  3. تأكيد طائرة مخدر مناسبة معسر في القدم بشدة. في حال حدوث انسحاب انعكاسية، انتظر عدة دقائق إضافية قبل المتابعة.
    ملاحظة: الانتباه أيضا شعيرات، والعيون ومعدل التنفس لعلامات الوعي. إذا كان يتم الوخز شعيرات، يومض العين عند لمسها بلطف، أو التنفس السريع والضحلة، انتظر حتى الطائرة مخدر أعمق المضي قدما في البروتوكول. كما ترصد هذه الإشارات في جميع أنحاء جراحة الاستئصال وحقن. إذا كان الحيوان يعرض طائرة مخدر ضحلة، إدارة رصاصة الداعم لتكافؤ الكيتامين فقط إلى ½ ك الأصلي/x الجرعة.
  4. يحلق الفئران على طول خط الوسط الظهرية من الوركين إلى زاوية أقل شأنا من سكابولاي. سحب جلد الحيوان مشدود لحلاقة أسهل وأكثر دقة.
  5. تطبيق مرهم العيون لكلتا العينين.
  6. تطبيق مطهر إلى منطقة حلق لتعقيم الموقع. لفرك الأولى، نقع شاش معقم مع الحل اليود 5% ومسح بعيداً كل الشعر والحطام. اتبع هذا مع انتقاد أحادي الاتجاه مع شاش معقم غارقة في الإيثانول 70%، حيث أنه لا توجد منطقة يتم الاتصال مرتين. استخدام هذه التقنية مع التناوب اليود والشاش غارقة في الإيثانول أكثر من مرتين.

3-العمليات الجراحية إعداد الحقل والصك

  1. إعداد مجموعة من الأدوات الجراحية يعقم التي تشمل مشرط، رونجيورس، الملقط الأسنان الفئران، مقص الربيع، هيموستاتس، ونقطة متوسطة منحنى ملقط والكامشات أو خطاطيف مرجح بإزالة التغليف التفاف العقيمة لإنشاء حقل عقيمة.
  2. فتح مجموعة قفازات الجراحية المعقمة ومكان التفاف القفازات المعقمة في الجدول. استخدام هذا كحقل إضافي معقم للأدوات المستخدمة لمنع تلوث التفاف العقيمة.
  3. إسقاط شفرة المبضع #10 على ميدان العقيمة. تأمين النصل إلى مقبض مع هيموستاتس. موقف عقيمة المالحة، 4.0 خياطة الوتر الكروميك، ومواد لمراقبة النزيف مثل كوتيريزير وشاش معقم والعقيمة القطن ذات الرؤوس (قضيب لتطبيق تجاوز الهوامش العضلات)، أو جيلفوام أو بونو (لتجاوز الهوامش العظام) في مكان الوصول.
  4. استرداد هذا الحيوان ووضعه على قطعة من قماش معقم. ضع شاش تحت المثانة لتجميع البول. دعم المنطقة المستهدفة بمنشفة تدحرجت تحت البطن. إذا كان متوفراً، ضع وسادة تدفئة جراحية تحت القماش العقيمة، خاصة بالنسبة لإجراءات أطول.
    ملاحظة: العقم مهم أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة. الاحتفاظ بزجاجة رذاذ من الإيثانول 70% من جهة الحفاظ على العقم الأيدي القفاز، واستخدام حبة معقم إذا تم اختراق العقم الصك، أو بين العمليات الجراحية الفردية.

4-تعريض العمود الفقري وتحديد موقع الصفيحة

  1. تحديد منطقة حيث ستبذل شق جلد بضغط الأصابع برفق في الضلع الأخير لتحديد فقرة L1. استخدام هذا كعلامة بارزة، جعل شق جلد 3-4 سم مع #10 مشرط جراحية المنتهية فقط أدنى من L1 لفضح العضلات. اضغط الجلد مشدود بنشر لطيف واضغط بشدة مع شفرة المبضع لضمان شق نظيفة.
  2. قطع وتنتشر الدهون سطحية مع ملقط ومقص إذا لزم الأمر. (اعتماداً على فقرة الهدف، قد يوجد أو لا يكون وسادة الدهون كبيرة سطحية للعضلات).
  3. يشعر للعمليات الشائكة مع الشقة شفرة المبضع أو إصبع. غالباً ما سوف أوجزها منطقة خط الوسط "الخامس" من اللفافة البيضاء على جانبي. قم بقطع صغيرة روسترال للسماح للغرفة للاستيلاء بشكل أمن على عملية العلوي مع الملقط الأسنان الفئران، ثم إجراء تخفيضات طويلة وعميقة 2 قريبة من العمليات قدر الإمكان. في أعمق نقطة من القطع، يمكن أن يرى سطح الفقرات الظهرية مع شفرة المبضع.
  4. عقد العضلات الجانبية جانبا مع الكامشات أو خطاطيف المرجحة تحسين الرؤية. العضلات واضحة حول العمليات بدون مشرط أو مقص الربيع أو رونجيورس لتحديد شكل رؤوسهم.
    ملاحظة: تذكر أن الحبل الشوكي لا يشمل كامل طول العمود الفقري، كما توقف أنسجة النخاع الشوكي تنمو في وقت سابق في التنمية أكثر من العظام. وهذا يعني أنه قد يكون المستوى المستهدف العمود الفقري تحت فقرة مسمى بشكل مختلف.
  5. تحديد موقع T11 وعمليات T12 و T13 المجاورة.
    ملاحظة: يمكن الاطلاع على المساعدة في استهداف مستويات العمود الفقري الصحيح في أطلس حبل الشوكي الفئران والدراسات السابقة التي تحدد معالم في الماوس، والذي قد مشابهة جداً بنية العمود الفقري6،33. اترك عملية الشائكة روسترال مثل T9 دون عائق لإعطاء علامة فارقة في خط الوسط.

5-القيام الاستئصال

  1. حالما تم التعرف بشكل صحيح على المنطقة المستهدفة، تنفيذ لامينيكتوميس جوانب الظهرية T11 T13. بلطف نشر فقرات لتكشف عن الأربطة الفقرية، التي مواقع جيدة لإدراج رونجيورس للدغة الأولية للعظام. عقد في رونجيورس في وضع نصف مغلقة لزيادة المراقبة الدقيقة.
  2. إزالة العمليات الشائكة وجانب الفقرات الظهرية بأخذ لدغات صغيرة مع رونجيورس. احرص على عدم تلف النخاع الشوكي أو تخل بلده دوراً. رفع قليلاً مع الملقط الأسنان الفئران للمساعدة في سحب الحبل الشوكي بعيداً عن الفقرات وانخفاض الميل إلى ضرب أنسجة النخاع الشوكي.
  3. مسح العظام بعيداً من خط الوسط حيث يمكن ملاحظة الأوعية الدموية في خط الوسط. اترك إطار الذي يظهر أنسجة النخاع الشوكي بوضوح وهو خال من الحطام.
  4. بلطف لمس الحبل الشوكي بالملقط. بعض الحيوانات قد الانتقال للغريزة حتى إذا طائرتهم تخدير عميق. تطبيق بضع قطرات من عامل الذهول مثل الليدوكايين مباشرة إلى الحبل الشوكي لمنع القفز أثناء إجراء الحقن.
  5. تأمين الحيوان في حامل العمود الفقري بابزيم الملقط استقرار العمليات الشائكة روسترال ووالذيليه إلى إطار الاستئصال. رفع البطن للحيوان باستخدام حامل العمود الفقري لإبطال مفعول الحركات في التنفس. وهذا زيادة الاستقرار إبرة وضمان العمق المناسب للحقن.

6-تحميل الفيروس وتحديد المواقع محقن

  1. تحميل الفيروس في محقن بيبيتينج حوالي 5 ميليلتر على قطعة من بارافيلم والإبرة لتحديد المواقع حيث يكون التلميح داخل القطرة.
  2. استخدام ميكروبومب سحب تصل إلى 4 ميليلتر للفيروس بمعدل 20 – 100 nL/s.
  3. تعيين وحدة تحكم لحقن والإفراج عن كمية صغيرة من الفيروس من الإبرة لضمان لا يتم حظر غيض الإبرة. تمحو الفيروس الزائدة مع مسح مختبر.
    ملاحظة: يمكن استخدام المحاقن هاملتون بإبرة الصلب كبديل للزجاج سحبت الماصات.
  4. ضع ميكرومانيبولاتور حيث تكون مرئية رنية ووضع الإبرة في خط الوسط النخاع الشوكي.
    ملاحظة: في بعض الأحيان يمكن أن يكون موجوداً في خط الوسط بالأوعية الدموية كبيرة تعمل على السطح الأمامي للنخاع الشوكي. ومع ذلك، هذا يمكن أن تختلف في الفئران الفردية، واستهداف خط الوسط ينبغي تأكيد مقارنة بعملية الشائكة سليمة.
  5. المباشر الإبرة أفقياً من 0.8 ملم استخدام في رنية على ميكرومانيبولاتور.
  6. أقل الإبرة للحبل الشوكي حتى مسافة بادئة، ولكن لا ثقب، في بلده دوراً. استخدام اقتراحا اللف سريع، ثقب في بلده دوراً بالإبرة حتى أنها غرقت على عمق 1.5 مم.

7-حقن الفيروس في الحبل الشوكي

  1. مجرد الإبرة في المكان، البرنامج محقن لحقن بمعدل 400 nL/دقيقة تأكيد أن الفيروس يدخل الحبل الشوكي بمراقبة التقدم المحرز في الجبهة صبغ. ينبغي أن يكون هناك لا تسرب واضحة أو انتفاخ أنسجة النخاع الشوكي. إذا لوحظ تسرب، وهذا يمكن تخفيفها في بعض الأحيان بتقليل سرعة الحقن إلى 200 nL/دقيقة.
  2. بمجرد الانتهاء من الحقن الإبرة للراحة في النخاع الشوكي لمدة 2-5 دقيقة (اعتماداً على حجم حقن) تسمح لتسهيل انتشار الفيروس.
  3. ببطء سحب الإبرة والانتقال إلى موقع الحقن القادم. حقن 1 ميليلتر من الفيروس في كل موقع من مواقع متباعدة بشكل متساو 6 تقريبا 1 ملم بعيداً على طول الأنسجة الشوكي L1-L4. يمكن استخدام نفس الإبرة لكل الحقن طالما أنها لا تزال تعمل بشكل صحيح.

8-الجرح الرعاية الإغلاق وما بعد المنطوق

  1. إزالة الحيوان من صاحب العمود الفقري وإخراج الكامشات أو خطاطيف تستخدم لنشر العضلات الجانبية. ضمان أن الجرح واضح من جميع الأنقاض قبل الإغلاق.
  2. خياطة العضلات خياطة الوتر الكروميك 4.0 باستخدام. قطع خيوط خياطة قريب من العقدة تقليل احتمال تهيج الجلد الداخلية.
  3. ترصيص الجلد إغلاق باستخدام مقاطع عيار 9 ملم الجرح. للسماح للشفاء الأمثل، محاذاة حواف الجلد قبل التدبيس.
  4. وضع الحيوان على الماء الحراري الاحترار وسادة ومراقبة حتى أرق.
  5. حقن 5-10 مل من عقيمة المالحة تحت الجلد لتجديد السوائل والمضادات الحيوية مثل سيفازولين للوقاية من العدوى. عندما يكون الحيوان المتنقلة، وضعه مرة أخرى في قفصة المنزلية وتوفير المسكنات الأولية.  رصد على الفئران لأي علامة على الألم والكرب وتعامل وفقا للإجراء الخاص بك IACUC المعتمدة للتخفيف من حدة الألم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ينبغي أن يؤدي الحقن ناجحة والنقل من النواقل الفيروسية في توصيل السكان قوية أحادية الخلايا العصبية في الحبل الشوكي وبعض نوى جذع الدماغ. يوضح الشكل 1 وسم النمطية من الخلايا العصبية ومحاور عصبية في الحبل الشوكي الصدري وفي تشكيل شبكي البوتانية الدماغ في حقن بعد أربعة أسابيع. ويعتبر التعبير بروتينات فلورية خضراء كبيرة في الخلايا العصبية في الرمادية النخاع الشوكي الصدري على الجانب عن حقن (الشكل 1A، منطقة مربعة). ولوحظت أيضا عدد قليل من الخلايا العصبية على الجانب كونترالاتيرال، خصوصا بالقرب من خط الوسط. في هذا الشأن الأبيض، تعبير بروتينات فلورية خضراء لوحظ في محاور عصبية في الحبل عن (الشكل 1Aوالأسهم ورؤوس أسهم)، لا سيما في المناطق النموذجية لمحاور عصبية بروبريوسبينال (رؤوس). الشكل 1A ' يظهر تكبير أعلى من منطقة محاصر في A، إظهار التعبير نموذجية في الهيئات الخلايا العصبية و dendrites. ويمكن أيضا ملاحظة تعبير بروتينات فلورية خضراء في الخلايا العصبية في الدماغ الأنوية مثل تشكيل شبكي البوتانية (الشكل 1B، التكبير أعلى من منطقة محاصر في 1B الشكل ').

Figure 1
رقم 1: توصيل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي وجذع الدماغ. (أ) التجارة والنقل في التعبير في الخلايا العصبية (محاصر منطقة) ومحاور عصبية من الخلايا العصبية بروبريوسبينال (رؤوس) ومحاور عصبية أخرى مساحات (الأسهم) في الحبل الشوكي الصدري. (أ ') أعلى التكبير التعبير الخلايا العصبية في منطقة محاصر ألف (ب) تشكيل شبكي البوتانية في الدماغ الإعراب عن التجارة والنقل المسماة الخلايا العصبية و dendrites. (ب) أعلى التكبير من منطقة محاصر في ب. تغيير حجم أشرطة: (أ) = 500 ميكرومتر؛ (ب) = 1 مم؛ (أ ')، (ب) = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Movie 1
الفيلم 1: استهداف حقن الفئران في الحبل الشوكي القطني. هذا ملخصات الفيديو أساسيات استهداف وضخ النواقل الفيروسية في الحبل الشوكي الفئران. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المعالجة الجينية للخلايا العصبية في المخ والحبل الشوكي عملت على تسليط الضوء، الحسية والحركية ومسارات الاستقلال الذاتي عن طريق تتبع الفلورسنت، واستكشاف إمكانات نمو مساحات الخلايا العصبية بعد إصابة27،28، 29 , 30 , 31 , 32 , 33-توجيه حقن ناقل فيروسي ريتروجراديلي قابلة للنقل في الحبل الشوكي يمكن أن تستهدف السكان الخلايا العصبية عبر صلاتهم متشابك، مما يجعل هذا الأسلوب خياراً ممتازا لمسارات رسم الخرائط في الجهاز العصبي المركزي. ناقل حرية يبين على وجه التحديد الامتصاص الانتقائي على المشبك العصبية22،،من2425، وتتبع السابقة مع المثل منظم نواقل أظهر أي انتشار في محاور عصبية المتضرر أو خلايا لا علاقة لها 34 , 35، وما يتسق مع النتائج التي تتميز ببنية حرية22،،من2325. وهكذا، هو الحقن المباشر من حرية الراسم إلى الوراء طريقة مثالية لاستكشاف إينتيرنيورونال الدوائر التي يخضع لها اللدونة بعد الإصابة.

هناك اثنين من المفاهيم الأساسية تشارك في ضخ ناجحة النواقل الفيروسية في الحبل الشوكي. الأول هو إنشاء الهدف الصحيح مع الإبرة الزجاج، والثاني هو ضمان تدفق كاف للفيروس من الإبرة إلى الأنسجة. كما ينطوي هذا البروتوكول على اقتفاء أثر رجعي، استهداف منطقة الصحيح يقتضي فهم شامل للاتصالات متشابك السكان الخلايا العصبية للفائدة. وتستهدف الخلايا العصبية بروبريوسبينال وريتيكولوسبينال الاتصال بالحبل الشوكي القطني هنا. وتنتشر هذه الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ وأجزاء الحبل الشوكي عنق الرحم والصدر، مع غالبية السندات الإذنية المترجمة إلى عن الخامس والسابع ضمن الرمادية. لضمان توصيل السكان كافية من الخلايا العصبية، تصنع حقن الفيروسية الست على مساحة تمتد أربعة أجزاء العمود الفقري. ويتم اختيار قطاعات L1-L4 نظراً لوجود مولدات النمط المركزي، وصلاتهم المعروفة إلى مجالات أخرى من الحبل الشوكي. بمجرد segment(s) الشوكي الصحيح وعن معروفة والموقع الفعلي لهذه الأهداف عن طريق المعالم التشريحية أمر حاسم. اﻷطالس عرض التفاصيل التشريحية هيكل وشكل العمود الفقري يمكن أن تكون مفيدة لتأكيد استهداف معالم8،36. تجدر الإشارة إلى أن غالبية هذا البروتوكول لا يزال هو نفسه ما إذا كان يتم إجراء حقنه واحدة أو ستة؛ والفرق فقط في عدد أجزاء العمود الفقري كشفها عن طريق الاستئصال، وحقيقة أن سوف تحتاج إلى إعادة تحميل الإبرة الزجاج مع فيروسات إضافية إذا كان الحقن أكثر من 4 ميليلتر. البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة للماوس. بسبب صغر حجمها، ينبغي تعديل حجم الفيروس يحقن الحبل إلى الأسفل وضبط القياسات اللازمة لضرب عن العمود الفقري الصحيح. وكانت العديد من أشرطة الفيديو لجراحات مماثلة على الماوس سابقا نشر37،38.

المقبل النظر في هو الانتشار الكافي إلى الأنسجة. التحضير بعناية للابرة ضروري للتأكد من أن الفتحة كافية لتعليق الفيروسية بالتدفق إلى الخارج، وأن لا يمنع الحطام نصيحة، والتصور للتدفق من الإبرة في الحبل الشوكي عبر جبهة صبغة ملونة مفيدة للتأكد من أن التعليق هو اختراق الأنسجة. مجرد التعليق وقد وزعت في الأنسجة، والحفاظ على الإبرة داخل النخاع الشوكي لمدة 2-5 دقائق سيكفل انتشارا كافياً.

توصيل ناجحة لفئة مستهدفة من السكان يمكن أن تعتمد أيضا على الخصائص الجوهرية لحقن مثل كفاءة عيار والنمط المصلي المسيطر والإصابة بالفيروس. أننا نجد من عيار الجينوم نسخة على الأقل 1010 GC/مليلتر بالنسبة لينتيفيروس حرية العمل بشكل جيد للتجارب المجراة في. قد تعرض التتر أعلى أو حقن كميات أعلى مؤشر وضع العلامات، ولكن الرعاية يجب أن يؤخذ منذ الفيروسات يمكن منتشر خارج المنطقة المقصودة أو في الحبل الشوكي كونترالاتيرال. وينبغي أيضا النظر في نوع ناقل مناسب لخلايا التوسيم للفائدة استناداً على انتحاء. قد يكون بعض اللقاح الفيروسي العدوى أفضل ومعدلات توصيل في مختلف قطاعات السكان من الخلايا العصبية39. ناقلات لينتيفيرال التقليدية معروفة لتصيب مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بسبب البروتين المغلف منظمة-ز، ولكن إدخال تعديلات على هذه الموجه قد تؤثر به انتحاء40. يعدل بناء حرية المغلف بسيودوتيبينج مع انصهار بروتين سكري (فوغ-ب) فيروس داء الكلب، الذي يسمح للنقل إلى الوراء ذات كفاءة عالية22،23 وهو فعال في ترانسدوسينج بروبريوسبينال و مساحات ريتيكولوسبينال، مع الخلايا العصبية الأرقام المقارنة لتتبع المسالك عبر طرق مثل فلوروجولد وميكروروبي4،41 (للاطلاع على تفاصيل البناء انظر ناقل حرية هيرانو et al.) 22-بيد أنه لا بما فيه الكفاية وصف المسالك كورتيكوسبينال الكبار في هذه التجارب، على الرغم من أنها تسمية لجنة العلم والتكنولوجيا في الولدان بكفاءة عالية في الدراسات الأخرى1. فمن الممكن أن المستقبلات الضرورية لامتصاص حرية عند نهايات المستهدفة، مثل نكام أو p75NTR، وهي ضعيفة فقط عن الكبار لجنة العلم والتكنولوجيا الخلايا العصبية42،43، على الرغم من أن هذا يزال يجري التحقيق. على أي حال، وهذا يدل على أهمية تحديد ما إذا كانت متجه المستخدمة مناسبة للخلايا المستهدفة. في هذه التجربة، معالجة المخ وأنسجة النخاع الشوكي وسبر بعد أربعة أسابيع لضمان وفرة الوقت للتضخيم والنقل من الحبل القطني إلى جميع مناطق الدماغ. ويتم نقل حرية عن طريق النقل محواري سريعة إلى الوراء، والتي قد يكون من المناسب إذا كانت المسافة التي سافر أقل، كما هو الحال إذا كانت منطقة الحقن في النخاع الشوكي عنق الرحم وبالتالي تقصير فترة تجريبية.

جراحة الحقن المباشر أداة مفيدة لإدخال التكنولوجيا النواقل الفيروسية في الحبل الشوكي. استخدام حرية للتجارب الجينية مفيد إذ أنه يسمح مستقر ودائم التحوير التعبير بوقت طويل وغير سامة للخلايا العصبية. في هذه التجربة، لا التجارة والنقل وسم كان ينظر في الخلايا العصبية التي لا تجعل مباشرة اتصالات متشابك لمنطقة الحقن. وهذا ينطبق أيضا في دراسات سابقة في الحيوانات كدمة الصدر إصابة25. بالإضافة إلى ذلك، كان غير قادر على تسمية العمود الفقري الخلايا العصبية الحركية أو الجذرية الظهرية العقدة العصبية عند حقن العصب الوركي ديميليناتيد عابر (الملاحظات غير منشورة) حرية-التجارة والنقل. معا، هذه البيانات تشير إلى أن حرية لا تدخل عن طريق محاور عصبية سهولة وكفاءة ترانسدوسيس الخلايا العصبية بالاقبال على ناقلات في الاشتباكات العصبية، توفير خريطة أكثر تفصيلاً ودقة عالية للاتصالات العصبية للسكان المستهدفين. هذا هو ميزة أخرى النواقل الفيروسية ريتروجراديلي قابلة للنقل مثل رجعية الفيروسات المرتبطة بالغدة (راف--ريترو)، التي من المعروف أن يتخذها محاور عصبية في مرور44 ويجعل حرية مفيدة بشكل خاص في دراسات الخرائط تجديد و إعادة ربط الدوائر في الحبل الشوكي المصاب. المزايا في حرية قد تسمح أيضا لاستهداف محددة من السكان الخلايا العصبية لإسكات أو الاجتثاث الدراسات25،44،45،،من4647.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل بمنحه مقدمة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R01 R01NS103481 ومستشفى شرينيرس "بحوث طب الأطفال" منح برنامج العسر الشديد 84051 وحالات العسر الشديد 86000 ووزارة الدفاع (SC140089).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309604 For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin) West-Ward Pharmaceuticals NPC 0143-9924-90 To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax Fine Science Tools 19009-00 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00 To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam Pfizer H68079 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers Oster 111038-060-000 For clearing the surgical site of hair.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Kimwipes Kimtech 34155 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment Dechra Veterinary Products RAC 0119 To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets Bio Serv MP275-050 For pain management post-surgery.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips CellPoint 201-1000 To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump Gaymar TP500C To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

Tags

علم الأعصاب، 145 قضية، النواقل الفيروسية، واقتفاء أثر رجعي، حقن الحبل الشوكي، lentivirus، والعلاج الجيني، وعلم الأعصاب
الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, More

Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord. J. Vis. Exp. (145), e59160, doi:10.3791/59160 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter