Summary
Denne protokol viser injektion af en retrogradely transportable viral vektor i rotte rygmarv væv. Vektor er taget på synapser og transporteres til cellen kroppen af target neuroner. Denne model er velegnet til retrograd sporing af vigtige spinal stier eller målretning celler for gen terapi programmer.
Abstract
At indføre proteiner af interesse i celler i nervesystemet er udfordrende på grund af medfødte biologiske barrierer, der begrænser adgang til de fleste molekyler. Kan injiceres direkte i rygmarven væv omgår disse barrierer, giver adgang til celle organer eller synapser, hvor molekyler kan indarbejdes. Kombinerer viral vektor teknologi med denne metode giver mulighed for indførelsen af mål gener nervevæv genterapi eller tarmkanalen sporing. Her er en virus, der er udviklet til højeffektive retrograd transport (HiRet) indført på synapser af propriospinal interneurons (PNs) at fremme specifikke transport til neuroner i rygmarven og hjernestammen kerner. Målretning PNs drager fordel af de mange forbindelser, de modtager fra motor veje som rubrospinal og reticulospinal skrifter, samt deres sammenkobling med hinanden gennem rygmarven segmenter. Repræsentative sporing ved hjælp af HiRet vektor med constitutively aktive grøn fluorescerende proteiner (NGL) viser high fidelity detaljer af celle organer, axoner og dendritiske Dorne i thorax PNs og reticulospinal neuroner i Pontinske retikulære formation. HiRet indarbejdet godt hjernestammen veje og PNs men viser alder afhængige integration i corticospinal tarmkanalen neuroner. I Resumé er rygmarven injektion ved hjælp af virale vektorer en velegnet metode til indførelse af proteiner af interesse i neuroner i målrettede skrifter.
Introduction
Virale vektorer er vigtige biologiske funktioner, som kan indføre genetisk materiale i cellerne for at kompensere for defekte gener, upregulate vigtigt vækst proteiner eller fremstille markør proteiner, der fremhæver strukturen og synaptiske forbindelser af deres mål. Denne artikel fokuserer på direkte injektion af en yderst effektiv retrogradely transportable lentiviral vektor i rygmarven rotte for at fremhæve større motor veje med fluorescerende sporing. Denne metode er også meget velegnet til cytoskeletale regenerering og genvækst undersøgelser at indføre proteiner af interesse i forskellige populationer af neuroner og er blevet brugt til tavshed neuroner for funktionel kortlægning undersøgelser1,2.
Mange af de anatomiske detaljer af spinal motor veje blev belyst gennem direkte indsprøjtning undersøgelser med klassisk sporstoffer såsom BDA og fluoro-guld3,4,5,6,7 , 8. disse røbestoffer betragtes som guldstandarden men kan have visse ulemper såsom optagelse af beskadigede axoner eller axoner i passage i den hvide substans omkring en indsprøjtning websted9,10,11 . Dette kunne føre til forkerte fortolkninger af sti connectivity og kan være en ulempe i regenerering undersøgelser hvor farvestof absorption af beskadigede eller afhuggede axoner kan forveksles med regenererende fibre under senere analyse12.
Lentiviral vektorerne er populære i gen terapi undersøgelser, da de giver et stabilt, langsigtet udtryk i neuronal populationer13,14,15,16,17,18 ,19. Men traditionelt pakket lentiviral vektorer kan have begrænset retrograd transport og kan udløse immunsystemet svar når det bruges i vivo4,20,21. En yderst effektiv retrograd transport vektor betegnes HiRet er blevet produceret af Kato et al. ved at ændre den virale kuvert med en rabies virus glycoprotein til at oprette en hybrid vektor, der forbedrer retrograd transport22,23.
Retrograd sporing introducerer en vektor ind i synaptic rummet af en target neuron, gør det muligt at blive taget ved at celle axon og transporteres til cellen kroppen. Vellykket transport af HiRet har påvist fra neuronal synapser i hjernen hos mus og primater23,24 og muskel i motoriske neuroner22. Denne protokol viser injektion i lumbal rygmarven, specifikt er rettet mod de synaptiske terminalerne i propriospinal interneurons og hjernestammen neuroner. PNs modtage forbindelser fra mange forskellige spinal stier og kan således bruges til at målrette en forskelligartet befolkning af neuroner i rygmarven og hjernestammen. Mærket neuroner i denne undersøgelse udgør kredsløb innerverer motorneuron puljer vedrørende hindlimb motorik. Robust mærkning er set i rygmarven og hjernestammen, herunder high fidelity detaljer af dendritiske Dorne og axon terminaler. Vi har også brugt denne metode i tidligere undersøgelser inden for den cervikale rygmarv til at mærke propriospinal og hjernestammen reticulospinal veje25.
Denne protokol viser injektion af en viral vektor i lumbal rygmarv fra en rotte. Som det ses i filmen 1, målrettet snit ved at identificere L1 hvirvel beliggende på den sidste ribben. Dette bruges som en caudale vartegn for en 3-4 cm incision, der udsætter muskulatur over rygmarven L1-L4. Laminectomies af de dorsale aspekter af T11-T13 ryghvirvler er udført og en skrå glas nål er instrueret 0,8 mm lateral fra midterlinjen og sænket 1,5 mm dybt ind i det grå materie til at injicere virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de følgende kirurgiske og dyrs pleje procedurer er blevet godkendt af dyrs pleje og brug Udvalget af Temple University.
1. præ-kirurgisk præparater
- Forberede trak glas nåle til viral injektion et par dage før operation ved hjælp af 3,5 nanoliter glas kapillær pipetter designet til nanoliter injektorer. Trække hver pipette på en to-trins nål puller ifølge producentens anvisninger til at oprette to nål skabeloner.
- Forfine spidsen af nålen skabeloner ved at afskære ca 1-2 mm af overskydende glas med microscissors. Foranstaltning omtrentlige blænde størrelse under et mikroskop med et mikroskop kalibrering dias at isolere nåle med 30-40 µm åbninger.
- Med nålen placeres på 30°, skal du bruge en mikropipette beveller til at oprette et tip med en 30-40 µm blænde og en skrå vinkel på 45°. Kontrollere aperture bredden med Vernier skala på diasset kalibrering. Passere vand og ethanol gennem glas nålen ved hjælp af en sprøjte med en fleksibel nål vedhæftet fil til at vaske væk snavs og markere nålen med jævne mellemrum med en sort tusch.
- Nåle i en overdækket petriskål tidligere rengøres med 70% ethanol og sterilisere for 30 min i en biosikkerhed hætte i UV-lys.
- Forberede HiRet lentivirus ved at fjerne et passende volumen fra fryseren umiddelbart før proceduren.
Bemærk: En passende mængde indeholder det beløb, der er nødvendige til injektion (1 µL pr. injektion x antal injektioner) plus en lille mængde ekstra volumen for at tage højde for pipettering og lastning tab. Transportere og opbevare virussen på is når den ikke er i brug. - Forbered injektoren ved at sætte det i micropump og placere det i en micromanipulator med en Vernier skala.
- At forberede glas nålen, omhyggeligt indlæse en farvet farvestof som rød olie med en sprøjte outfitted med en fleksibel nål. Sikre, at ingen bobler forbliver på nålen. Bruge aseptisk teknik, når du håndterer nålen, og afstå fra at røre spidsen.
- Indsæt glas nålen i injektoren, sikrer, at nålen sidder korrekt i skiver, injektor cap er skruet på stramt, og stål injektoren nål er udvidet ca ¾ længden af glas nålen. Virus kan indlæses i nålen i et senere trin.
2. anæstesi og operationsstedet forberedelse
- Veje dyret på en digital skala. Optage præoperativ vægt til at bestemme mængden af anæstesi kræves og give mulighed for overvågning af vægt efter operationen. Kvindelige Sprague-Dawley rotter ca 200-250 g blev brugt i denne protokol.
- Bedøver rotte ved hjælp af enten isofluran indånding eller en injiceret ketamin/xylazin løsning (k / x). Her, sprøjtes ketamin intraperitoneal på en 67 mg/kg og xylazin på en 6,7 mg/kg dosering.
- Bekræfte et passende bedøvelsesmiddel flyet ved at klemme fod fast. Hvis refleksiv tilbagetrækning opstår, vente flere ekstra minutter før du fortsætter.
Bemærk: Også iagttage whiskers, øjne og åndedræt sats for tegn på bevidsthed. Hvis knurhår trækninger, øjet blinker, når rørt forsigtigt eller vejrtrækning er hurtig og overfladisk, vent indtil det bedøvende flyet er dybere for at gå videre med protokollen. Også overvåge disse tegn i hele laminektomi og injektion kirurgi. Hvis dyret viser et lavvandet bedøvelsesmiddel fly, administrere en booster skud af ketamin, der kun lige til ½ den oprindelige k / x dosering. - Barbere rotte langs den dorsale midterlinjen fra hofterne til den ringere vinkel af scapulae. Træk huden af dyret stram for en lettere og mere præcis barbering.
- Anvende oftalmologiske salve på begge øjne.
- Anvende antiseptiske til området glatbarberet at sterilisere sitet. For den første krat, sættetid steril gaze med en 5% jodopløsning og tørre væk alle hår og debris. Følg dette med en ensrettet knalde med steril gaze gennemblødt i 70% ethanol, således at intet område er kontaktet to gange. Bruge samme teknik med skiftevis jod og ethanol-gennemblødt gaze to gange mere.
3. kirurgisk instrument og felt forberedelse
- Forberede et sæt autoklaveres kirurgiske værktøjer, der omfatter en skalpel, rongeurs, rotte tand pincet, foråret saks, hemostats, mellemlang punkt buet pincet og retraktor eller vejede kroge af udpakning den sterile wrap for at oprette et sterilt felt.
- Åbne en pakke af steril kirurgiske handsker og placere steril handske wrap på bordet. Bruge dette som en yderligere sterilt felt for anvendte redskaber til at forhindre forurening af sterile wrap.
- Slip en #10 skalpel klinge til feltet steril. Fastgør klingen til et håndtag med hemostats. Position sterilt saltvand, 4.0 krom Tarmstrenge sutur, og materialer til at styre blødning som en cauterizer, steril gaze, steril bomuld tippes applikatorer (for muskel beskæringer), eller gelfoam eller bonewax (for knogle beskæringer) i et let tilgængeligt sted.
- Hente dyret og sæt den på en steril klud. Placer gaze nedenunder blære til at indsamle urin. Afstive målområde med en sammenrullet håndklæde under maven. Hvis det er tilgængeligt, placere en kirurgisk varmepude nedenunder den sterile klud, især for længere procedurer.
Bemærk: Sterilitet er vigtigt under overlevelse kirurgi. Hold en sprayflaske med 70% ethanol på side at bevare steriliteten behandskede hænder, og en brug perle sterilizer hvis instrument sterilitet er kompromitteret, eller mellem individuelle operationer.
4. udsætter rygsøjlen og identificere webstedet laminektomi
- Identificer det område, hvor en hud indsnit vil blive gjort ved at trykke på fingrene forsigtigt på den sidste ribben at lokalisere L1 hvirvel. Bruge dette som et vartegn, lave en 3-4 cm hud snit med en #10 kirurgisk skalpel slutter bare ringere end L1 til udsætter musklen. Holde huden stram af blid spredning og tryk fast med skalpel blade til at sikre et rent snit.
- Skære og sprede overfladiske fedt med pincet og saks hvis nødvendigt. (Afhængigt af målet ryghvirvel, kan der eller være ikke et stort fedt pad overfladisk til muskel).
- Føle for spinosus processer med flad skalpel blade eller en finger. Ofte vil blive skitseret området midterlinjen af en "V" i hvid fascie på begge sider. Foretage en lille rostralt cut at give plads til at gribe sikkert ind på en øverste proces med rotte tand pincet, så laver 2 lange, dybe nedskæringer så tæt på processerne som muligt. På det dybeste punkt i snittet, kan den dorsale overflade af ryghvirvler mærkes med skalpel klinge.
- Hold de laterale muskler til side med retraktor eller vejede kroge til at forbedre synligheden. Tydelige muskler omkring processer med en skalpel, foråret saks eller rongeurs til at bestemme formen af hovedet.
Bemærk: Husk at rygmarven ikke udvider den fulde længde af rygsøjlen, som rygmarven væv stopper voksende tidligere i udvikling end knogle. Det betyder, at spinal målniveauet kan være under en anderledes navngivne ryghvirvel. - Find T11 og de tilstødende T12 og T13 processer.
Bemærk: Bistand i målretning korrekte vertebrale niveau kan findes i en rotte rygmarven atlas og tidligere undersøgelser skitserer vartegn i mus, som har en meget lignende vertebrale struktur6,33. Forlade en rostralt spinosus proces såsom T9 uforstyrret at give en midterlinjen vartegn.
5. udføre en laminektomi
- Når målområdet er blevet korrekt identificeret, udføre laminectomies af de dorsale aspekter af T11-T13. Forsigtigt sprede ryghvirvler at afsløre intervertebrale ledbånd, der er gode steder at indsætte rongeurs for den første bid af knoglen. Hold rongeurs i en halvt lukkede position at øge fin kontrol.
- Fjerne torntappene, og den dorsale aspekt af ryghvirvler ved at tage små bidder med rongeurs. Vær omhyggelig med ikke at beskadige rygmarven eller forstyrre dura. Løft lidt med rotte tand pincet til at trække rygmarv fra ryghvirvler og mindske tendensen til at ramme rygmarv væv.
- Klart knogle væk fra midterlinjen så midterlinjen blodkar kan observeres. Forlade et vindue, der klart viser rygmarven væv og er fri for snavs.
- Blidt røre rygmarven med pincet. Nogle dyr kan refleksivt hoppe selv om deres bedøvelsesmiddel flyet er dyb. Anvende et par dråber af en bedøvende agent såsom lidocain direkte på rygmarven at forhindre hoppe under proceduren injektion.
- Sikre dyret i en spinal indehaveren af fastgørelse stabiliserende pincet til torntappene rostralt og caudale til vinduet laminectomy. Rejse i maven af dyret ved hjælp af spinal indehaveren til at ophæve effekten af vejrtrækning bevægelser. Dette vil øge nål stabilitet og sikre passende dybde af injektion.
6. læsning virus og positionering injektoren
- Indlæse virus i injektoren af pipettering ca 5 µL på et stykke af parafilm og positionering nålen, således at spidsen er inde i drop.
- Bruge micropump til at hæve op til 4 µL af virus med en hastighed på 20-100 nL/s.
- Angiv den registeransvarlige at injicere og frigive en lille mængde af virus fra nål til at sikre, at spidsen af nålen ikke er blokeret. Aftørre overskydende virus med et laboratorium tørre.
Bemærk: En Hamilton sprøjte med en stål nål kan bruges som et alternativ til trak glas pipetter. - Placer micromanipulator, så Vernier skala er synlige og Placer nålen på midterlinjen af rygmarven.
Bemærk: Midterlinjen kan undertiden være placeret ved et stort blodkar kører på den forreste overflade af rygmarven. Men dette kan variere i individuelle rotter, og midterlinjen målretning bør bekræftes ved sammenligning med en intakt spinosus proces. - Direkte nålen lateralt ved 0,8 mm ved hjælp af Vernier skalaen på micromanipulator.
- Sænke nålen til rygmarven, indtil det indrykning, men ikke punktering, dura. Ved hjælp af en hurtig vride bevægelse, punktere dura med kanylen, indtil det er sunket til en dybde af 1,5 mm.
7. indsprøjtning virus i rygmarven
- Når nålen er på plads, er programmet injektor til at injicere med en hastighed på 400 nL/min. Bekræft at virus ind rygmarven ved at observere forløbet af farvestof front. Der bør være nogen indlysende lækage eller udbuling af rygmarven væv. Hvis lækage er observeret, kan dette undertiden afhjælpes ved at reducere injektion hastighed til 200 nL/min.
- Når injektionen er færdig, tillade nål til at hvile i rygmarven i 2 – 5 min. (afhængigt af volume injiceres) at lette udbredelsen af virussen.
- Langsomt trække nålen og flytte til det næste injektionsstedet. Injicér 1 µL af virus i hver af 6 jævnt fordelt steder ca 1 mm fra hinanden langs længden af L1-L4 spinal væv. Den samme nål kan anvendes til hver injektion, så længe det fortsætter med at fungere korrekt.
8. sår lukning og postoperativ pleje
- Fjerne dyret fra spinal indehaveren og tegne en retraktor eller kroge anvendes til at sprede lateral muskel. Sikre, at såret er klart for alle rester før lukketid.
- Sutur musklen ved hjælp af en 4.0 krom Tarmstrenge sutur. Skære sutur tråde tæt på knude til at reducere sandsynligheden for intern hudirritation.
- Hæft huden lukket med 9 mm sår klip. For at muliggøre optimal healing, line op i kanten af huden før hæftning.
- Placere dyret på en vand konvektion opvarmning pad og overvåge indtil vågen.
- Indsprøjtes 5-10 mL sterilt saltvand subkutant til at genopbygge væsker og et antibiotikum som cefazolin at forhindre infektion. Når dyret er ambulante, læg den tilbage i sit hjem bur og leverer indledende analgetika. Overvåge rotter for eventuelle tegn på smerte og lidelse og behandles i overensstemmelse med din IACUC godkendt procedure for lindring af smerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket injektion og transport af den virale vektor bør resultere i transduktion af en robust population af ensidige neuroner i rygmarven og i visse hjernestammen kerner. Figur 1 viser stereotype mærkning af neuroner og axoner i thorax rygmarven og de Pontinske retikulære formation af hjernestammen på fire uger efter injektion. Betydelig normal god landbrugspraksis udtryk ses i neuroner i den grå substans i thorax rygmarven side ipsilaterale til injektion (figur 1A, boxed område). Nogle neuroner er også observeret på de kontralaterale side, især nær midterlinjen. I den hvide substans, er normal god landbrugspraksis udtryk observeret i axoner i ipsilaterale ledningen (figur 1A, pile og pilespidser), især i områder typisk til propriospinal axoner (pilespidser). Figur 1A' viser en højere forstørrelse af den boxed område i A, demonstrerer typiske udtryk i neuronal celle organer og dendritter. Normal god landbrugspraksis udtryk i neuroner kan også observeres i hjernestammen kerner såsom Pontinske retikulære formation (figur 1B, højere forstørrelse af den boxed område i figur 1B').
Figur 1: transduktion af neuroner i rygmarven og hjernestammen. (A) NGL udtryk i neuroner (boxed område), axoner af propriospinal neuroner (pilespidser) og axoner af andre skrifter (pile) i thorax rygmarven. (A') Højere forstørrelse af neuronal udtryk i en boxed område af A. (B) Pontinske retikulære formation i hjernestammen udtryk for normal god landbrugspraksis-mærket neuroner og dendritter. (B) Højere forstørrelse af den boxed område i B. Skalere barer: (A) = 500 μm; (B) = 1 mm; (A'), (B) = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Rettet mod indsprøjtning i lumbal rygmarven af rotten. Denne video Resumeer grundlæggende målretning og injektion af en viral vektor i rygmarven rotte. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genmanipulation af neuroner i hjernen og rygmarven har tjent til at fremhæve sensoriske, motoriske og autonome veje via fluorescerende sporing og at udforske genvækst potentiale af neuronal skrifter efter skade27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direkte injektion af en retrogradely transportable viral vektor i rygmarven kan målrette neuronal populationer via deres synaptiske forbindelser, hvilket gør denne metode et glimrende valg for kortlægning veje i det centrale nervesystem. HiRet vektor viser specifikt selektive optagelse på neuronal synapse22,24,25, og tidligere sporing med tilsvarende struktureret vektorer viste ingen spredning til tilskadekomne axoner eller ikke-forretningsmæssigt forbundne celler 34 , 35, som er konsistent med resultater byder HiRet konstruere22,23,25. Direkte indsprøjtning af HiRet som en retrograd tracer er således en ideel metode til at udforske interneuronal kredsløb, der undergår plasticitet efter skade.
Der er to vigtige begreber involveret i vellykket injektion af en viral vektor i rygmarven. Først er om oprettelse af det korrekte mål med glas nålen, og andet er at sikre tilstrækkelig strøm af virus fra nålen ind i vævet. Som denne protokol omfatter retrograd sporing, kræver rettet mod det korrekte område en grundig forståelse af de synaptiske forbindelser neuronal befolkningens interesse. Propriospinal og reticulospinal neuroner tilslutning til lumbal rygmarven er målrettet her. Disse neuroner er spredt i hele hjernestammen og livmoderhalskræft og brysthule rygmarven segmenter, med fleste af PNs lokaliseret til bladplader V-VII i det grå materie. For at sikre transduktion af en passende befolkning af neuroner, er seks viral injektioner lavet over et område, der strækker sig over fire spinale segmenter. L1-L4 segmenter er valgt på grund af tilstedeværelsen af den centrale mønster generatorer, og deres kendte forbindelser til andre områder af rygmarven. Når den korrekte spinal segmentet(med) og bladplader er kendt, er fysiske placering af disse mål via anatomiske landemærker afgørende. Atlas viser detaljer om anatomiske struktur og vertebrale form kan være nyttigt at bekræfte målretning vartegn8,36. Det skal bemærkes, at størstedelen af denne protokol forbliver den samme om en injektion eller seks; forskellen er kun i antallet spinale segmenter eksponeret via laminektomi, og det faktum, at du bliver nødt til at genindlæse glas nålen med yderligere virus hvis indsprøjtning mere end 4 µL. Protokollen kan også tilpasses nemt for musen. På grund af sin mindre størrelse, mængden af virus indsprøjtes i ledningen skal justeres nedad og målingerne skulle ramme de korrekte spinal bladplader justeret. Flere videoer af lignende operationer på musen har tidligere været udgivet37,38.
Den næste overvejelse er tilstrækkelig diffusion ind i vævet. Omhyggelig forberedelse af nålen er nødvendige for at sikre, at blænde er tilstrækkelig for den virale suspension til flow passiv og at snavs blokerer ikke spidsen, og visualisering af strømmen fra nålen til rygmarven via en front af farvet farvestof er nyttigt at bekræfte, at suspensionen er gennemtrængende væv. Når suspensionen er blevet distribueret til vævet, vil fastholde nålen i rygmarven i 2-5 minutter sikre passende diffusion.
Vellykket transduktion af en målgruppe kan også afhænge af virus indsprøjtes som titer, serotype og infektion effektivitet iboende egenskaber. Vi finde en genomisk kopi titer på mindst 1010 GC/mL for HiRet lentivirus at fungere godt for in vivo forsøg. Højere titers eller injektionsvolumener kan vise højere mærkning indeks, men pleje skal tages, da virus kan diffuse ud af det planlagte område eller i de kontralaterale rygmarven. Også bør tages hensyn til typen af vektor passende for mærkning celler af interesse baseret på deres tropisme. Visse virale serotyper kan have bedre infektion og transduktion priser i forskellige populationer af neuroner39. Traditionelle lentiviral vektorer er kendt for at inficere en lang række celletyper på grund af VSV-G kuvert protein, imidlertid modifikationer til denne vektor kan påvirke dets tropisme40. HiRet konstruktion ændrer konvolutten ved pseudotyping med en fusion glycoprotein (FuG-B) af rabiesvirus, som giver mulighed for særdeles effektiv retrograd transport22,23 og er effektiv i transducing propriospinal og reticulospinal skrifter, med neuronal tal sammenlignes med tarmkanalen sporing via metoder såsom fluorogold og microruby4,41 (for detaljer af konstruktionen af HiRet vektor Se Hirano mfl.) 22. men det ikke tilstrækkeligt mærke den voksne corticospinal tarmkanalen i disse forsøg, selvom det etiket CST i nyfødte med høj effektivitet i andre undersøgelser1. Det er muligt at receptorer, der er nødvendige for HiRet optagelse på de målrettede synapser, såsom NCAM eller p75NTR, er kun svagt udtrykt på voksen CST neuroner42,43, selvom det stadig er under efterforskning. Under alle omstændigheder, viser dette betydningen af at fastslå, om den vektor, der anvendes er passende for de målrettede celler. I dette eksperiment, blev hjernen og rygmarven væv behandlet og aftestede efter fire uger til at sikre rigelig tid til forstærkning og transport fra lumbal ledningen til alle områder i hjernen. HiRet er transporteret via hurtigt retrograd cytoskeletale transport, og dermed en kortere forsøgsperioden kan være hensigtsmæssigt, hvis den afstand, er mindre, såsom hvis området injektion er i den cervikale rygmarv.
Direkte indsprøjtning kirurgi er et nyttigt redskab for indførelse af viral vektor teknologi i rygmarven. Brug af HiRet for genetiske eksperimenter er fordelagtig, da det tillader stabil, lang varig transgen udtryk og er ikke-giftige til neuroner. I dette eksperiment, blev ingen normal god landbrugspraksis mærkning set i neuroner, der ikke gør direkte synaptiske forbindelser til området injektion. Dette var også tilfældet i tidligere undersøgelser i dyr med en thorax kontusion skade25. Derudover var HiRet-normal god landbrugspraksis ude af stand til at mærke spinal motor neuroner eller dorsalrods ganglion neuroner når injiceres de forbigående demyelinated iskiasnerven (upublicerede observationer). Sammen, tyder disse data på at HiRet kommer ikke let gennem axoner og effektivt transduces neuroner ved optagelsen af vektor på synapser, giver en mere detaljeret og high-fidelity kort af neuronal forbindelser af målgruppen. Dette er en fordel over andre retrogradely transportable virale vektorer som retrograd adeno-associeret virus (rAAV-retro), som er kendt for at blive taget op af axoner i passage44 og gør HiRet særligt nyttigt i undersøgelser kortlægning regenererende og gentilslutning kredsløb i den skadede rygmarven. Hirets fordele kan også give mulighed for specifikke målretning af neuronal befolkninger til tavshed eller ablation undersøgelser25,44,45,46,47.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra det nationale Institut for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde R01 R01NS103481 og Shriners Hospital for pædiatrisk forskning tilskud SHC 84051 og SHC 86000 og Department of Defense (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
