Summary
Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral marqués transportable dans les tissus de la moelle épinière de rat. Le vecteur est absorbé au niveau de la synapse et transporté vers le corps cellulaire des neurones de la cible. Ce modèle convient pour un traçage rétrograde des voies importantes de la colonne vertébrale ou ciblage des cellules pour des applications de la thérapie génique.
Abstract
Introduction des protéines d’intérêt dans les cellules du système nerveux est difficile en raison des barrières biologiques innées qui limitent l’accès à la plupart des molécules. Injection directement dans le tissu médullaire permet de contourner ces obstacles, donnant accès à des corps cellulaires ou synapses où les molécules peuvent être incorporés. Combinant la technologie vecteur viral avec cette méthode permet l’introduction de gènes cibles dans le tissu nerveux dans le but de la thérapie génique ou traçage des voies. Ici, un virus conçu pour le transport rétrograde très efficace (HiRet) est introduit au niveau des synapses des interneurones propriospinales (PNs) pour encourager le transport spécifique de neurones de la moelle épinière et les noyaux du tronc cérébral. Ciblage PNs tire parti des nombreuses connexions qu’ils reçoivent de voies motrices telles que les tracts rubrospinaux et réticulospinales, ainsi que leur interconnexion avec les autres dans l’ensemble des segments de la moelle épinière. Représentant suivi à l’aide du vecteur HiRet constitutivement actif protéine fluorescente verte (GFP) montre haute fidélité détails de corps cellulaires, les axones et les arbres dendritiques dans PNs thoraciques et dans les neurones réticulospinales dans la formation réticulée pontique. HiRet intègre bien dans les voies du tronc cérébral et PNs, mais montre l’intégration dépendant âge dans les neurones du faisceau pyramidal. En résumé, l’injection de la moelle épinière à l’aide de vecteurs viraux est une méthode appropriée pour l’introduction de protéines d’intérêt dans les neurones des secteurs ciblés.
Introduction
Vecteurs viraux sont des outils biologiques importants qui peuvent introduire le matériel génétique dans les cellules afin de compenser les gènes défectueux, protéines de croissance important de réguler positivement ou fabriquer des protéines de marqueur qui mettent en valeur la structure et les connexions synaptiques de leurs cibles. Cet article se concentre sur l’injection directe d’un vecteur lentiviral marqués transportable très efficace dans la moelle épinière de rat afin de faire ressortir les grandes voies motrices avec traçage fluorescente. Cette méthode est aussi très appropriée pour des études de régénération et repousse axonales d’introduire des protéines d’intérêt dans les diverses populations de neurones et a été utilisée pour faire taire les neurones pour cartographie fonctionnelle études1,2.
Nombreux détails anatomiques des voies motrices la colonne vertébrale ont été élucidées par des études de l’injection directe à traceurs classiques tels que BDA et fluoro-or3,4,5,6,7 , 8. ces traceurs sont considérées comme l’étalon-or mais peuvent avoir certains inconvénients tels que l’absorption par les axones endommagés, ou axones dans passage de la substance blanche entourant une injection site9,10,11 . Cela pourrait conduire à des interprétations erronées de la connectivité de la voie et peut être un inconvénient dans les études de régénération où absorption du colorant par des axones endommagés ou dissociées pourrait être confondu avec pour régénérer les fibres au cours de l’analyse ultérieure12.
Vecteurs lentiviraux sont populaires dans les études de thérapie génique, puisqu’elles fournissent une expression stable et à long terme dans les populations neuronales13,14,15,16,17,18 ,,19. Cependant, traditionnellement emballés vecteurs lentiviraux peut avoir limité transport rétrograde et peuvent déclencher la réponse du système immunitaire lorsqu’il est utilisé en vivo4,20,,21. Un vecteur de transport rétrograde très efficace appelé HiRet a été produit par Kato et al. en modifiant l’enveloppe virale avec une glycoprotéine de virus de la rage pour créer un vecteur hybride qui améliore le transport rétrograde22,23.
Traçage rétrograde introduit un vecteur dans l’espace synaptique d’un neurone cible, lui permettant d’être absorbés par l’axone de la cellule et transportés vers le corps cellulaire. Transport avec succès des HiRet a été démontrée de synapses neuronales dans le cerveau des souris et des primates23,24 et du muscle dans les motoneurones22. Ce protocole montre l’injection dans la moelle lombaire, en ciblant spécifiquement les terminaux synaptiques de propriospinales interneurones et des neurones du tronc cérébral. PNs recevoir des connexions de plusieurs différentes voies spinales et peuvent donc être utilisés pour cibler une population diverse de neurones de la moelle épinière et du tronc cérébral. Neurones marqués dans cette étude représentent des circuits qui innervent les motoneurones piscines relatives à la fonction motrice du membre postérieur. Étiquetage robuste est vu dans la moelle épinière et le tronc cérébral, y compris des détails de haute fidélité de tonnelles dendritiques et terminaisons axonales. Nous avons aussi utilisé cette méthode dans les études précédentes au sein de la moelle épinière cervicale d’étiqueter propriospinales et tronc cérébral de voies réticulospinales25.
Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral dans la moelle épinière lombaire d’un rat. Comme on le voit dans le film 1, l’incision est ciblée en identifiant la vertèbre L1 située à la dernière côte. Cela est utilisé comme un point de repère caudale pour une incision de 3-4 cm qui expose la musculature sur la moelle épinière L1-L4. Laminectomies des aspects dorsales des vertèbres T11-T13 sont effectués et une aiguille de verre biseauté est réalisée 0,8 mm latéral de la ligne médiane et abaissé de 1,5 mm profondément dans la matière grise pour injecter le virus.
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Protocol
Toutes les procédures de soins chirurgicaux et animaux suivants ont été approuvés par la protection des animaux et utilisation Committee de la Temple University.
1. pré-chirurgicale préparations
- Préparer le verre tiré aiguilles pour injection virale quelques jours avant une intervention chirurgicale à l’aide de 3,5 nanolitres verre pipettes capillaires conçus pour injecteurs nanolitre. Tirez chaque pipette sur un extracteur d’aiguille en deux étapes selon les instructions du fabricant pour créer deux modèles d’aiguille.
- Affiner la pointe des modèles aiguille en coupant environ 1 à 2 mm de verre excès avec microciseaux. Taille de l’ouverture approximative mesure sous un microscope avec une lame de microscope d’étalonnage pour isoler les aiguilles avec des ouvertures de 30 à 40 µm.
- Avec l’aiguille positionnée à 30°, utilisez une chanfreineuse micropipette pour créer une pointe avec une ouverture de 30 à 40 µm et un angle de biseau 45°. Vérifiez la largeur de l’ouverture avec le vernier sur la diapositive de calibration. Passer l’eau et l’éthanol par l’aiguille de verre avec une seringue avec un attachement aiguille flexible pour évacuer les débris et marquer l’aiguille à intervalles réguliers avec un marqueur noir.
- Placer les aiguilles dans une boîte de pétri couvert préalablement nettoyés avec l’éthanol à 70 % et stériliser pendant 30 min dans une hotte de sécurité biologique sous la lumière UV.
- Préparer les lentivirus HiRet en enlevant un volume convenable du congélateur immédiatement avant l’intervention.
Remarque : Un volume convenable comprend le montant nécessaire pour l’injection (1 µL par injection x nombre d’injections) plus une petite quantité de volume supplémentaire pour tenir compte de pipetage et de pertes de charge. Transporter et stocker le virus sur la glace quand pas en service. - Préparer l’injecteur en branchant dans la micropompe et en le plaçant dans un micromanipulateur avec une échelle de Vernier.
- Pour préparer l’aiguille de verre, soigneusement charger un colorant de couleur tels que l’huile rouge avec une seringue munie d’une aiguille souple. Veiller à ce qu’aucune bulle ne reste dans l’aiguille. Utiliser une technique aseptique lors de la manipulation de l’aiguille et s’abstenir de toucher la pointe.
- Introduire l’aiguille de verre dans l’injecteur, s’assurer que l’aiguille est enfoncée correctement dans les rondelles, le bouchon de l’injecteur est vissé sur l’aiguille de l’injecteur en acier est étendu usées aux ¾ environ la longueur de l’aiguille de verre. Virus peut être chargé dans l’aiguille à une étape ultérieure.
2. anesthésie et préparation du site opératoire
- Peser l’animal sur une échelle numérique. Noter le poids préopératoire pour déterminer le volume d’anesthésie nécessaire et permettant le suivi de post-chirurgie de poids. Rats Sprague-Dawley femelles environ 200 et 250 g ont été utilisés dans le présent protocole.
- Anesthésier le rat en utilisant une solution injectée de kétamine/xylazine ou inhalation isoflurane (k / x). Ici, la kétamine est injectée par voie intrapéritonéale à 67 mg/kg et de xylazine à une posologie de 6,7 mg/kg.
- Confirmer un plan anesthésique approprié en pinçant le pied fermement. En cas de retrait réflexive, attendre quelques minutes supplémentaires avant de procéder.
Remarque : Respectez aussi les moustaches, les yeux et les rythme de la respiration des signes de conscience. Si les moustaches sont secousses, l’oeil clignote quand on la touche doucement ou la respiration est rapide et peu profonde, attendez que le plan anesthésique est plus loin pour aller de l’avant avec le protocole. Aussi surveiller ces signes tout au long de la chirurgie laminectomie et injection. Si l’animal affiche un plan anesthésique peu profond, administrer une piqûre de rappel de kétamine seule égale à la moitié l’original k / x dosage. - Raser le rat le long de la ligne dorsale médiane de la hanche jusqu'à l’angle inférieur de l’omoplates. Tendre la peau de l’animal pour un rasage plus facile et plus précis.
- Pommade ophtalmique à deux yeux.
- Appliquer l’antiseptique sur la zone rasée à stériliser le site. Pour le premier gommage, faire tremper de gaze stérile avec une solution de 5 % d’iode et essuyer de suite tous les cheveux et les débris. Suivez ce avec un balayage unidirectionnel avec une gaze stérile imbibée d’éthanol à 70 %, afin qu’aucune zone n’est contacté deux fois. Utiliser cette même technique avec une alternance de deux fois plus l’iode et gaze imbibé d’éthanol.
3. préparation de terrain et instrument chirurgicale
- Préparer une série des outils chirurgicaux stérilisés à l’autoclave qui incluent un scalpel, pinces-gouges, pinces de dent de rat, printemps ciseaux, une pince hémostatique, pointe moyenne curved forceps et rétracteurs ou hameçons lestés par déballer l’emballage stérile pour créer un champ stérile.
- Ouvrir un paquet de gants chirurgicaux stériles et placer l’écharpe gant stérile sur la table. L’utiliser comme un champ stérile supplémentaire pour les outils utilisés pour prévenir la contamination de l’emballage stérile.
- Déposez une lame de bistouri #10 dans le champ stérile. Fixez la lame à un manche avec une pince hémostatique. Sérum physiologique stérile position 4,0 suture catgut chromique et matériaux pour contrôler le saignement comme un cauterizer, gaze stérile, stériles cotons-tiges (pour les saignements de muscle), ou gélatine ou bonewax (pour les saignements de l’OS) dans un endroit accessible.
- Récupérer l’animal, puis définissez-la sur un chiffon stérile. Placez la gaze sous la vessie pour recueillir l’urine. Soulever la zone ciblée avec une serviette roulée sous l’abdomen. Si possible, placez un coussin de chauffage chirurgicale sous le tissu stérile, surtout pour des procédures plus longues.
Remarque : La stérilité est importante pendant l’opération de survie. Garder un flacon pulvérisateur de l’éthanol à 70 % sur la main pour maintenir la stérilité des mains gantées et un stérilisateur de perle d’utilisation si la stérilité de l’instrument est compromise, ou entre différentes chirurgies.
4. exposer la colonne vertébrale et l’identifiant une laminectomie
- Repérer la zone où une incision de la peau se fera en appuyant les doigts doucement à la dernière côte pour localiser la vertèbre L1. En utilisant ce monument, faire une incision cutanée de 3 à 4 cm avec un bistouri #10 se terminant juste inférieure à la L1 pour exposer le muscle. Tendez la peau tendue par la diffusion douce et appuyez fermement avec la lame de bistouri pour assurer une incision propre.
- Couper et répandre les graisses de surface avec pinces et ciseaux si nécessaire. (Selon sur la vertèbre de cible, il peut ou ne pas être un gros coussinets adipeux superficielle du muscle).
- Ressentez les apophyses épineuses avec le plat de la lame de bistouri ou un doigt. La zone médiane sera souvent décrit par un « V » de carénage blanc de chaque côté. Faire une petite coupure rostrale de laisser la place à accrocher solidement à un processus supérieur avec une pince de dent de rat, puis faire 2 longues coupes profondes au plus près les processus que possible. Au plus profond de la coupe, la face dorsale de la vertèbre peut se faire sentir avec la lame de bistouri.
- Tenir les muscles latéraux côté avec rétracteurs ou hameçons lestés pour améliorer la visibilité. Muscle clair autour des processus avec un scalpel, des ciseaux de printemps ou des pinces-Gouges pour déterminer la forme de leur tête.
Remarque : N’oubliez pas que la moelle épinière ne couvre pas toute la longueur de la colonne vertébrale, la moelle épinière tissu s’arrête plus tôt dans le développement de l’os de plus en plus. Cela signifie que le niveau cible de la colonne vertébrale peut être sous une vertèbre nommée différemment. - Localiser le T11 et les processus de T12 et de T13 attenants.
Remarque : Aide pour cibler les bons niveaux vertébraux se trouvent dans un atlas de la moelle épinière de rat et de précédentes études décrivant des points de repère dans la souris, ce qui a un très similaire structure vertébrale6,,33. Laisser une apophyse rostral tels que T9 pour donner un point de repère de la ligne médiane.
5. effectuer une laminectomie
- Une fois que la zone cible a été correctement identifiée, effectuer les laminectomies des aspects dorsales de T11-T13. Délicatement étalées les vertèbres pour révéler les ligaments intervertébraux, qui sont de bons sites pour insérer les pinces-Gouges pour la morsure initiale de l’os. Tenez les pinces-gouges en position mi-clos pour augmenter un contrôle précis.
- Supprimer les apophyses épineuses et l’aspect dorsal des vertèbres en prenant de petites bouchées avec les pinces-gouges. Veillez à ne pas endommager la moelle épinière ou de déranger le dura. Soulevez légèrement avec la pince de dent de rat pour aider à tirer de la moelle épinière de la vertèbre et diminuer la tendance à frapper les tissus de la moelle épinière.
- Nettoient les os de la ligne médiane pour que le vaisseau sanguin de la ligne médiane peut être observé. Laissez une fenêtre qui clairement les tissus de la moelle épinière et sont exempts de débris.
- Toucher doucement la moelle épinière avec une pince. Certains animaux peuvent sauter par réflexe même si leur avion anesthésique est profonde. Appliquer quelques gouttes d’un agent anesthésiant comme la lidocaïne directement à la moelle épinière pour empêcher sauter pendant la procédure d’injection.
- Fixez l’animal dans un support de la colonne vertébrale en serrant la pince stabilisateur d’apophyses épineuses rostrales et caudales vers la fenêtre de laminectomie. Soulever l’abdomen de l’animal à l’aide de la titulaire de la colonne vertébrale pour annuler l’effet des mouvements de respiration. Cela sera augmenter la stabilité de l’aiguille et la profondeur appropriée d’injection.
6. chargement de virus et de positionnement de l’injecteur
- Charger le virus dans l’injecteur par pipetage environ 5 µL sur un morceau de parafilm et le positionnement de l’aiguille pour que la pointe soit à l’intérieur de la goutte.
- La micropompe permet de retirer jusqu'à 4 µL du virus à un taux de 20 à 100 nL/s.
- Placez le contrôleur à injecter et à libérer une petite quantité de virus de l’aiguille afin d’assurer que la pointe de l’aiguille n’est pas bloquée. Essuyez l’excès virus avec une lingette de laboratoire.
Remarque : Une seringue de Hamilton avec une aiguille d’acier peut servir comme alternative aux pipettes en verre tiré. - Positionner le micromanipulateur afin que le vernier est visible et placez l’aiguille à la ligne médiane de la moelle épinière.
Remarque : La ligne médiane peut parfois se trouver par un gros vaisseau sanguin en cours d’exécution sur la surface antérieure de la moelle épinière. Toutefois, cela peut varier chez les rats individuels et ciblage de la ligne médiane doit être confirmée par comparaison avec une apophyse intact. - Diriger l’aiguille latéralement de 0,8 mm à l’aide de l’échelle de Vernier sur le micromanipulateur.
- Piquez l’aiguille à la moelle épinière jusqu'à ce qu’elle est mise en retrait, mais ne pas de perforation, la dure-mère. À l’aide d’un rapide mouvement de torsion, perforer la dura avec l’aiguille jusqu'à ce qu’il a coulé à une profondeur de 1,5 mm.
7. injection de virus dans la moelle épinière
- Une fois que l’aiguille est en place, programme l’injecteur à injecter à un taux de 400 nL/min. confirmer que le virus pénètre dans la moelle épinière en observant l’état d’avancement de la façade de colorant. Il devrait y avoir aucune fuite évidente ou gonflement du tissu médullaire. Si la fuite est observée, cela parfois peut être atténué en réduisant la vitesse d’injection élevée à 200 nL/min.
- Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille se reposer dans la moelle épinière pour 2 à 5 min (selon le volume injecté) afin de faciliter la diffusion du virus.
- Lentement, retirer l’aiguille et déplacer vers le prochain point d’injection. Injecter 1 µL de virus dans chacun des 6 sites également espacés le long de la longueur du tissu spinal L1-L4 environ 1 mm. La même aiguille sont utilisables pour chaque injection, tant qu’il continue à fonctionner correctement.
8. wound care fermeture et post-operative
- Retirer le support de la colonne vertébrale de l’animal et souscrire à enrouleurs ou crochets utilisés pour propager le muscle latéral. Veiller à ce que la plaie est exempte de tous les débris avant de se fermer.
- Suture du muscle à l’aide d’une suture catgut chromique 4.0. Couper les fils de suture près du noeud à réduire le risque d’irritation de la peau interne.
- Agrafez la peau fermée à l’aide de clips 9 mm enroulé. Pour permettre une cicatrisation optimale, alignez les bords de la peau avant d’agrafer.
- Placez l’animal sur une convection de l’eau réchauffement pad et moniteur jusqu'à ce qu’éveillée.
- Injecter 5 à 10 mL de sérum physiologique par voie sous-cutanée pour reconstituer des fluides et un antibiotique comme la céfazoline pour prévenir l’infection. Lorsque l’animal est ambulatoire, placez-le dans sa cage maison et fournir des analgésiques initiales. Surveiller les rats pour tout signe de douleur et de détresse et traiter selon votre procédure IACUC approuvé pour soulager les douleurs.
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Representative Results
Transport du vecteur viral et injection réussie devraient aboutir à la transduction d’une population robuste de neurones unilatérales dans la moelle épinière et dans certains noyaux du tronc cérébral. Figure 1 montre un étiquetage stéréotypée des neurones et des axones dans la moelle épinière thoracique et dans la formation réticulée pontine du tronc cérébral après l’injection quatre semaines. Expression importante de la GFP est vu dans les neurones de la substance grise de la moelle épinière thoracique du côté homolatéral à l’injection (Figure 1 a, zone boxed). On observe également quelques neurones du côté controlatéral, surtout près de la ligne médiane. Dans la substance blanche, expression de la GFP est observée dans les axones dans le cordon ipsilatéral (Figure 1 a, flèches et pointes de flèches), surtout dans les zones typique aux axones propriospinales (pointes de flèche). Figure 1 a ' montre un grossissement plus élevé de la zone boxed a, mettant en évidence l’expression typique dans des corps cellulaires neurones et les dendrites. Expression de la GFP dans des neurones peut également être observée dans les noyaux du tronc cérébral tels que la formation réticulaire pontique (Figure 1 b, un grossissement supérieur de la zone boxed dans Figure 1 b ').
Figure 1 : Transduction des neurones de la moelle épinière et le tronc cérébral. (A), GFP expression dans les neurones (zone en boîte), les axones des neurones propriospinales (flèches) et axones d’autres étendues (flèches) dans la moelle épinière thoracique. (A') Grossissement supérieur d’expression neuronale dans la zone boxed d’a. (B) la formation réticulaire pontique dans le tronc cérébral exprimant les dendrites et les neurones marqués GFP. (B') Grossissement supérieur de la zone boxed dans B. Barreaux de l’échelle : (A) = 500 μm ; (B) = 1 mm ; (A'), (B') = 50 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Film 1 : Ciblant l’injection dans la moelle épinière lombaire du rat. Cette vidéo résumés les rudiments du ciblage et l’injection d’un vecteur viral dans la moelle épinière de rat. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
La manipulation génétique des neurones dans le cerveau et la moelle épinière a servi à point culminant sensoriel, motrices et voies autonomes par l’intermédiaire de traçage fluorescente et d’explorer le potentiel de repousse des voies neuronales après blessure27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direct injection d’un vecteur viral marqués transportable dans la moelle épinière peut cibler des populations neuronales via leurs connexions synaptiques, rendant cette méthode un excellent choix pour les voies de la cartographie dans le système nerveux central. Le vecteur HiRet indique spécifiquement la captation sélective à la synapse neuronale22,24,25et traçage précédent avec vecteurs de même structurés a montré aucune propagation dans les axones lésés ou cellules non liées 34 , 35, qui correspond aux résultats mettant en vedette le HiRet construire22,23,25. Ainsi, l’injection directe de HiRet comme traceur rétrograde est une méthode idéale pour explorer les circuits interneuronales qui subissent une plasticité après une blessure.
Il y a deux concepts essentiels impliqués dans l’injection réussie d’un vecteur viral dans la moelle épinière. Le premier met en place la bonne cible avec l’aiguille de verre, et la seconde est d’assurer un débit adéquat du virus de l’aiguille dans le tissu. Comme ce protocole implique traçage rétrograde, ciblant la zone correcte nécessite une compréhension approfondie des connexions synaptiques de la population neuronale d’intérêt. Les neurones Propriospinales et réticulospinales reliant à la moelle épinière lombaire s’adressent ici. Ces neurones sont répartis dans le tronc cérébral et les segments de la moelle épinière cervicale et thoracique, avec la majorité des PNs localisée vers les lames V-VII au sein de la matière grise. Pour assurer la transduction d’une population adéquate des neurones, six injections virales sont faites sur une zone s’étendant sur quatre segments spinaux. Les segments L1-L4 sont choisis en raison de la présence des générateurs de patron central et leurs connexions connues à d’autres régions de la moelle épinière. Une fois que le segment spinal correcte et les limbes sont connus, l’emplacement physique de ces cibles par l’intermédiaire de repères anatomiques est crucial. Atlas montrant des détails de structure anatomique et forme vertébral peuvent être utiles pour confirmer le ciblage repères8,36. Il est à noter que la majorité de ce protocole reste le même, si une seule injection ou six sont faites ; la différence n'est que dans le nombre de segments spinaux exposées via une laminectomie et le fait que vous devez recharger l’aiguille de verre avec une souche du virus si l’injection de plus de 4 µL. Le protocole peut également être facilement adapté pour la souris. En raison de sa petite taille, le volume du virus injecté dans le cordon doit être ajusté à la baisse et les mesures nécessaires pour frapper les limbes de la colonne vertébrale corrects ajusté. Plusieurs vidéos des chirurgies semblables sur la souris ont été précédemment publiés37,38.
L’examen prochain est la diffusion adéquate dans le tissu. Une préparation minutieuse de l’aiguille n’est nécessaire pour s’assurer que l’ouverture est suffisante pour la suspension virale à s’écouler vers l’extérieur et que les débris ne bloque pas la pointe, et visualisation de l’écoulement de l’aiguille dans la moelle épinière via un front de colorant coloré est utile pour confirmer que la suspension est de pénétrer le tissu. Une fois que la suspension a été distribuée dans les tissus, maintenir l’aiguille dans la moelle épinière pour 2-5 minutes assurera une diffusion adéquate.
Transduction réussie d’une population cible peut aussi dépendre des propriétés intrinsèques du virus injecté tels que titre, sérotype et l’infection de l’efficacité. Nous trouvons un titre génomique copie d’au moins 1010 GC/mL pour les lentivirus HiRet bien fonctionner pour une expérimentation in vivo. Des titres plus élevés ou des volumes d’injection pourraient montrer indice étiquetage plus élevé, mais soins doivent être prise étant donné que le virus pourrait diffuser hors de la zone prévue, ou dans la moelle épinière controlatérale. Il faudrait également au type de vecteur approprié pour marquage de cellules d’intérêt basé sur leur tropisme. Certains sérotypes virus peuvent avoir mieux infection et taux de transduction dans différentes populations de neurones,39. Vecteurs lentiviraux traditionnels sont connus pour infecter un large éventail de types de cellules due à la protéine d’enveloppe de VSV-G, mais les modifications apportées à ce vecteur peuvent influencer son tropisme40. La construction HiRet modifie l’enveloppe en pseudotypage avec une glycoprotéine de la fusion (FuG-B) du virus de la rage, qui permet très efficace de transport rétrograde22,23 et est efficace dans la transduction propriospinales et réticulospinales étendues, avec des numéros neuronales comparables au traçage des voies grâce à des méthodes telles que fluorogold et microruby4,41 (pour plus de détails de construction de la voir de vecteur HiRet Hirano et al.) 22. Toutefois, il a fait pas suffisamment étiqueter le tractus corticospinal adult dans ces expériences, si il étiqueter le CST chez les nouveau-nés à haut rendement dans d’autres études1. Il est possible que les récepteurs nécessaires pour HiRet absorption au niveau des synapses ciblées, telles que la NCAM ou p75NTR, sont seulement faiblement exprimée sur42,de neurones de CST43adultes, même si c’est encore à l’étude. En tout cas, cela démontre l’importance de déterminer si le vecteur utilisé est approprié pour les cellules ciblées. Dans cette expérience, cerveau et les tissus de la moelle épinière ont été traitées et sondés après quatre semaines pour assurer un temps abondant pour l’amplification et le transport de l’épinière lombaire à toutes les zones du cerveau. HiRet est transportée par l’intermédiaire de transport axonal rétrograde rapide et donc une plus courte période expérimentale peut être appropriée si la distance parcourue est moindre, comme si la zone d’injection est dans la moelle épinière cervicale.
Chirurgie de l’injection directe est un outil utile pour l’introduction de la technologie vecteur viral dans la moelle épinière. Utiliser de HiRet pour expérimentations génétiques sont avantageuse car elle permet stable, durable transgene expression de long et est non toxique pour les neurones. Dans cette expérience, aucun étiquetage de GFP a été observée dans les neurones qui ne font pas directement les connexions synaptiques à la zone d’injection. C’était également vrai dans les précédentes études chez les animaux souffrant d’une contusion thoracique blessure25. En outre, HiRet-GFP a été incapable d’étiqueter les neurones moteurs spinaux ou des neurones des ganglions de la racine dorsale lorsqu’elle est injectée dans le nerf sciatique transitoirement démyélinisé (données inédites). Ensemble, ces résultats suggèrent que HiRet n’entre pas facilement dans les axones et efficacement transduit neurones par absorption du vecteur aux synapses, fournissant une carte détaillée et haute fidélité de connexions neuronales de la population ciblée. Ceci est un avantage sur les autres vecteurs viraux marqués transportables comme rétrograde virus adeno-associé (rAAV-rétro), qui est connu pour être repris par les axones au passage44 et rend HiRet particulièrement utiles dans les études cartographie régénérant et reconnecter les circuits dans la moelle épinière lésée. Avantages de HiRet peuvent également permettre un ciblage spécifique des populations neuronales pour silencieux d’échappement ou l’ablation des études25,44,45,46,47.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par une subvention de la National Institute of Neurological Disorders and Stroke R01 R01NS103481 et l’hôpital Shriners pour Pediatric Research accorde SHC 84051 et SHC 86000 et le ministère de la défense (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
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