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Neuroscience

Direkter Einspritzung von Lentivirale Vektor zeigt mehrere motorische Bahnen im Rückenmark Ratte

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/59160

Summary

Dieses Protokoll zeigt Injektion von Doppelthebel transportable viralen Vektoren in Ratte Rückenmark Gewebe. Der Vektor wird an der Synapse aufgegriffen und zum Zellkörper von Neuronen Ziel transportiert. Dieses Modell eignet sich für retrograde Tracing wichtige spinalen Bahnen oder gezielt Zellen für Gen-Therapie-Anwendungen.

Abstract

Einführung der interessierenden Proteine in Zellen im Nervensystem ist schwierig wegen angeborenen biologischen Barrieren, die den Zugriff auf die meisten Moleküle beschränken. Injektion direkt ins Rückenmark Gewebe umgeht diese Barrieren, den Zugang zum Zellkörper oder Synapsen, wo Moleküle eingebaut werden können. Kombination von viralen Vektoren Technologie mit dieser Methode ermöglicht die Einführung von Zielgenen in Nervengewebe zum Zwecke der Gentherapie oder Trakt Ablaufverfolgung. Hier ist ein Virus entwickelt für hocheffiziente retrograder Transport (HiRet) an den Synapsen der Propriospinal Interneuronen (PNs) den spezifischen Verkehr zu Nervenzellen im Rückenmark und Hirnstamm Kerne fördern eingeführt. PNs-Targeting nutzt die zahlreichen Verbindungen erhalten sie von motorischen Bahnen wie die Rubrospinal und Reticulospinal Flächen sowie deren Verschaltung untereinander im gesamten Rückenmarkssegmente. Repräsentative Ablaufverfolgung konstitutiv aktiv grün fluoreszierendes Protein (GFP) zeigt High Fidelity Details der Zellkörper, Axone und dendritischer Dorne in thorakalen PNs und Reticulospinal Neuronen in die pontine Formatio Bildung der HiRet Vektor mit. HiRet integriert in Hirnstamm Wege und PNs sondern zeigt Alter abhängigen Integration in kortikospinalen Trakts Neuronen. Zusammenfassend lässt sich sagen ist Rückenmark Injektion mittels virale Vektoren eine geeignete Methode für die Einführung der interessierenden Proteine in Nervenzellen gezielt Tracts.

Introduction

Virale Vektoren sind wichtige biologische Hilfsmittel, die genetisches Material in Zellen um defekte Gene, Upregulate wichtigen Wachstumsmärkten Proteine kompensieren oder fertigen Marker-Proteine, die die Struktur und die synaptischen Verbindungen von hervorheben einführen können Ihre Ziele. Dieser Artikel konzentriert sich auf direkte Einspritzung eines hocheffizienten Doppelthebel transportable Lentivirale Vektors ins Rückenmark Ratte um großen motorischen Bahnen mit fluoreszierenden Ablaufverfolgung zu unterstreichen.  Diese Methode eignet sich auch sehr für axonalen Regeneration und nachwachsen Studien zur Einführung von interessierender Proteine in unterschiedlichen Populationen von Neuronen und wurde verwendet, um Neuronen für funktionale Zuordnung Studien1,2zum Schweigen zu bringen.

Viele anatomische Details der spinalen motorischen Bahnen wurden aufgeklärt durch Direkteinspritzung Studien mit klassischen Tracer wie BDA und Fluoro-Gold3,4,5,6,7 , 8. diese Tracer gelten als Goldstandard aber können gewisse Nachteile wie Aufnahme durch beschädigte Axone oder Axone in Durchgang in der weißen Substanz umgibt eine Injektion Seite9,10,11 . Dies könnte zu Fehlinterpretationen der Weg Konnektivität und möglicherweise ein Nachteil in Regeneration Studien wo könnte Farbstoff Absorption durch beschädigte oder abgetrennten Axone verwechselt werden, für die Regeneration der Fasern während der späteren Analyse12.

Lentivirale Vektoren sind in Gentherapiestudien, beliebt, da sie stabile, langfristige Ausdruck in neuronalen Populationen13,14,15,16,17,18 bieten ,19. Jedoch traditionell verpackte Lentivirale Vektoren können haben begrenzte retrograden Transport und Reaktion des Immunsystems bei auslösen können in Vivo4,20,21. Ein hocheffizientes retrograder Transport Vektor bezeichnet HiRet wurde produziert von Kato Et Al. durch Ändern der Virushülle mit ein Tollwut-Virus Glykoprotein, einen Hybrid-Vektor erstellen, der retrograder Transport22,23verbessert.

Retrograde Ablaufverfolgung stellt einen Vektor in den synaptischen Raum eines Ziel-Neurons, so dass sie von dieser Zelle Axon aufgegriffen und zum Zellkörper transportiert werden. Erfolgreiche Transport von HiRet wurde von neuronalen Synapsen in die Gehirne von Mäusen und Primaten23,24 und vom Muskel in Motoneuronen22nachgewiesen. Dieses Protokoll zeigt die Injektion in die Lendenwirbelsäule Rückenmark, gezielt an den synaptischen Terminals Propriospinal Interneuronen und Hirnstamm Neuronen. PNs Empfangs-Verbindungen aus vielen verschiedenen spinalen Bahnen und können so genutzt werden, um gezielt eine vielfältige Bevölkerung von Nervenzellen im Rückenmark und Hirnstamm. Beschriftete Neuronen in dieser Studie stellen Schaltungen innervieren Motoneuron Pools in Bezug auf Megalosauridae Motorik. Robuste Kennzeichnung sieht in Rückenmark und Hirnstamm, einschließlich High Fidelity Details dendritischer Dorne und Axon Klemmen. Wir haben diese Methode auch in früheren Studien innerhalb des zervikalen Rückenmarks verwendet, um Propriospinal und Hirnstamm Reticulospinal Wege25beschriften.

Dieses Protokoll zeigt Injektion von viralen Vektoren in der Lendenwirbelsäule Rückenmark einer Ratte. Wie im Film 1, richtet sich der Schnitt durch die Identifizierung des L1-Wirbels befindet sich an der letzten Rippe. Dies dient als ein kaudalen Wahrzeichen für einen ca. 3-4 cm Schnitt, die Muskulatur über das Rückenmark L1-L4 verfügbar macht. Laminektomien der dorsalen Aspekte der Wirbel T11 T13 durchgeführt und eine abgeschrägte Glasnadel richtet sich 0,8 mm seitlich von der Mittellinie und 1,5 mm abgesenkt tief in der grauen Substanz, Virus zu injizieren.

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Protocol

Alle folgenden chirurgischen und tierischen Versorgung Verfahren haben die Tier Pflege und Nutzung Ausschuss der Temple University gebilligt.

1. präoperative Vorbereitungen

  1. Bereiten Sie gezogenem Glas Nadeln für virale Injektion ein paar Tage vor der Operation mit 3,5 Nanoliter Kapillare Glaspipetten für Nanoliter Injektoren entwickelt. Ziehen Sie jede Pipette auf eine zweistufige Nadel Puller gemäß den Anweisungen des Herstellers, zwei Nadel Vorlagen zu erstellen.
  2. Verfeinern Sie die Spitze der Nadel Vorlagen durch das abschneiden ca. 1-2 mm überschüssige Glas mit Microscissors. Maßnahme ungefähre Maschenweite unter dem Mikroskop mit einer Kalibrierung Objektträger, Nadeln mit 30-40 µm Öffnungen zu isolieren.
  3. Mit der Nadel positioniert bei 30 Grad mithilfe einer Mikropipette Schweißkantenformer um einen Tipp mit einer 30-40 µm Blende und eine abgeschrägte Winkel von 45° zu erstellen. Breite der Blende mit der Nonius-Skala auf der Kalibrierungs-Dias zu überprüfen. Die Glasnadel mit einer Spritze mit einer flexiblen Nadel Anlage Schmutz wegspülen und markieren Sie die Nadel in regelmäßigen Abständen mit einem schwarzen Marker durchlaufen Sie Wasser und Ethanol.
  4. Legen Sie die Nadeln in einer bedeckten Petrischale zuvor mit 70 % igem Ethanol gereinigt und für 30 min. in eine biologische Sicherheit Haube unter UV-Licht sterilisiert.
  5. Bereiten Sie HiRet Lentivirus, indem eine angemessene Lautstärke aus der Tiefkühltruhe unmittelbar vor dem Eingriff.
    Hinweis: Eine angemessene Lautstärke umfasst den Betrag, der für die Injektion (1 µL pro Injektion x Anzahl der Injektionen) plus eine kleine Menge extra Volumen, zum pipettieren und laden Verluste zu berücksichtigen. Transportieren Sie und lagern Sie das Virus auf Eis bei Nichtgebrauch.
  6. Bereiten Sie den Injektor durch Einstecken in die Mikropumpe und platzieren es in einem Mikromanipulator mit einem Nonius-Skala.
  7. Für die Vorbereitung der Glasnadel, sorgfältig laden einen farbigen Farbstoff wie rotes Öl mit einer Spritze mit einer flexiblen Nadel ausgestattet. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Nadel bleiben. Verwenden Sie aseptischen Technik zu, beim Umgang mit der Nadelöhrs, und Berührung der Spitze unterlassen.
  8. Glas Nadel in den Injektor, um sicherzustellen, dass die Nadel korrekt in die Unterlegscheiben sitzt, Injektor GAP fest verschraubt ist und Stahl Injektor Nadel erstreckt sich ca. ¾ der Länge der Glasnadel. Virus kann in die Nadel in einem späteren Schritt geladen werden.

(2) Anästhesie und chirurgische Baustellenvorbereitung

  1. Wiegen Sie das Tier auf eine digitale Waage. Nehmen Sie die präoperative Gewicht zu bestimmen, das Volumen der Narkose erforderlich und für die Überwachung des Gewichts nach der Operation zu ermöglichen. Weiblicher Sprague-Dawley Ratten ca. 200 – 250 g wurden in dieses Protokoll verwendet.
  2. Die Ratte mit Isofluran Inhalation oder ein injiziertes Ketamin/Xylazin-Lösung zu betäuben (k / x). Hier wird Ketamin intraperitoneal 67 mg/kg und Xylazin bei einer 6,7 mg/kg Dosierung gespritzt.
  3. Bestätigen Sie eine geeignete Narkose Flugzeug durch Kneifen den Fuß fest. Tritt reflexive Rückzug, warten Sie einige zusätzliche Minuten, bevor Sie fortfahren.
    Hinweis: Beachten Sie auch die Schnurrhaare, die Augen und die Atemfrequenz auf Anzeichen von Bewusstsein. Wenn die Schnurrhaare zucken, das Auge blinkt, wenn sanft berührt oder Atmung schnell und flach ist, warten Sie, bis die Narkose Ebene tiefer mit dem Protokoll vorzugehen ist. Auch diese Zeichen während der Operation Laminektomie und Injektion zu überwachen. Wenn das Tier eine flache Narkose Ebene angezeigt wird, Verwalten einer Auffrischungsimpfung von Ketamin nur gleich zu ½ der ursprüngliche k / x Dosierung.
  4. Rasieren Sie die Ratte entlang der dorsalen Mittellinie aus der Hüfte zu den minderwertigen Winkel der Scapulae. Ziehen Sie die Haut des Tieres für eine einfachere und präzisere Rasur straff.
  5. Ophthalmologische Salbe auf beide Augen anwenden.
  6. Gelten Sie antiseptisch zu den rasierten Bereich um die Website zu sterilisieren. Genießen Sie für die erste Peeling sterilem Gaze mit einer 5 %-Jod-Lösung und Wischen entfernt alle Haare und Schmutz. Folgen Sie dieser mit einem unidirektionalen Wisch mit steriler Gaze getränkt in 70 % igem Ethanol, so dass kein Bereich zweimal kontaktiert wird. Verwenden Sie die gleiche Technik mit abwechselnden Jod und Ethanol getränkten Gaze zweimal mehr.

3. chirurgische Feld und Instrument Vorbereitung

  1. Bereiten Sie eine Reihe von autoklaviert chirurgische Werkzeuge, die ein Skalpell, Rongeurs, Ratte Zahn Zange, Frühling Schere, Arterienklemmen, mittlerer Punkt gebogene Pinzetten und Retraktoren oder gewichteten Haken enthalten durch Auspacken die sterile Verpackung um einem sterilen Bereich zu erstellen.
  2. Öffnen Sie ein Paket von sterilen OP-Handschuhe und legen Sie die sterilen Handschuh-Packung auf den Tisch. Verwenden Sie diese als zusätzliches sterile Feld für die verwendeten Werkzeuge auf um die sterile Verpackung zu vermeiden.
  3. Legen Sie eine #10 Skalpellklinge auf den sterilen Bereich. Sichern Sie die Klinge zum Griff mit Arterienklemmen. Stellung sterile Kochsalzlösung, 4,0 Chromsäure Darmsaite Naht und Materialien zu kontrollieren wie einen linken, sterile Gaze, sterile Baumwolle Spitze Applikatoren (für Muskel blutet), oder Gelfoam oder Bonewax (für Knochen blutet) an einem zugänglichen Ort Blutungen.
  4. Rufen Sie das Tier und setzen Sie ihn auf einem sterilen Tuch ab. Legen Sie die Gaze unterhalb der Blase, Urin zu sammeln. Stützen Sie das Zielgebiet mit einem gerollten Handtuch unter den Bauch. Falls vorhanden, legen Sie eine chirurgische Heizkissen unter sterilen Tuch, vor allem für längere Verfahren.
    Hinweis: Sterilität ist während der Operation Überleben wichtig. Halten Sie eine Sprühflasche mit 70 % igem Ethanol zur Verfügung, um Sterilität der behandschuhten Händen und einem Einsatz Wulst Sterilisator Wenn Instrument Sterilität gefährdet ist, oder zwischen einzelnen Operationen zu erhalten.

(4) Freilegung der Wirbelsäule und Identifizierung der Laminektomie-Website

  1. Identifizieren Sie den Bereich, wo ein Hautschnitt erfolgt durch Drücken der Finger sanft an der letzten Rippe, die L1-Wirbel zu finden. Verwenden Sie dies als ein Wahrzeichen, machen Sie einen ca. 3-4 cm Hautschnitt mit einem #10 chirurgischen Skalpell endet nur schlechter als L1, den Muskel verfügbar zu machen. Halten Sie die Haut straff durch die Verbreitung von sanften und drücken Sie fest mit der Skalpellklinge um einen sauberen Schnitt zu gewährleisten.
  2. Schneiden und oberflächliche Fett mit Zange und Schere bei Bedarf zu verbreiten. (Je nach Ziel Wirbel, es kann oder keine große Fettpolster oberflächlich, um den Muskel).
  3. Gespür für die Dornfortsätze mit der flachen der Skalpellklinge oder einen Finger. Oft werden durch ein "V" der weißen Faszie auf beiden Seiten der Mittellinie Bereich skizziert. Machen Sie einen kleinen rostral Schnitt erlauben Raum sicher auf einem oberen Prozess mit Ratte Zahn Zange greifen, dann 2 lange, tiefe Einschnitte möglichst nahe an die Prozesse wie möglich zu machen. An der tiefsten Stelle des Schnittes kann die dorsale Oberfläche der Wirbel mit der Skalpellklinge zu spüren.
  4. Halten Sie die seitlichen Muskeln beiseite mit Retraktoren oder gewichteten Haken, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Klar Muskeln rund um die Prozesse mit einem Skalpell, Feder Schere oder Rongeurs die Form des Kopfes zu bestimmen.
    Hinweis: Denken Sie daran, dass das Rückenmark nicht die volle Länge der Wirbelsäule als Rückenmark Gewebe hält bereits in der Entwicklung als Knochen wachsen erstreckt. Dies bedeutet, dass der Ziel spinaler Ebene unter einem anders benannten Wirbel sein kann.
  5. Suchen Sie die T11 und die angrenzenden T12 und T13 Prozesse.
    Hinweis: Unterstützung bei der Ausrichtung der richtigen Wirbelkörper Ebenen finden Sie in einer Ratte Rückenmark Atlas und frühere Studien skizziert Orientierungspunkte: die Maus, die hat eine sehr ähnliche Wirbelsäule Struktur6,33. Lassen Sie eine rostral Dornfortsatz wie T9 ungestört eine Mittellinie Wahrzeichen geben.

(5) Durchführung einer Laminektomie

  1. Sobald das Zielgebiet korrekt identifiziert wurde, führen Sie Laminektomien der dorsalen Aspekte der T11 T13. Sanft verteilt die Wirbel intervertebralen Bänder gute Seiten zum Einfügen von Rongeurs für den ersten Biss des Knochens sind an Dritte weiterzugeben. Halten Sie die Rongeurs in einer halb geschlossene Position Feinsteuerung zu erhöhen.
  2. Der Dornfortsätze und der dorsalen Aspekt der Wirbel zu entfernen, indem man kleine Snacks mit den Rongeurs. Achten Sie darauf, das Rückenmark schädigen oder stören die Dura. Mit der Ratte Zahn Pinzette helfen, ziehen heben Sie das Rückenmark vom Wirbel leicht an und verringern Sie die Tendenz, Rückenmark Gewebe zu schlagen.
  3. Deaktivieren Sie Knochen entfernt von der Mittellinie, sodass die Mittellinie Blutgefäß beobachtet werden kann. Lassen Sie ein Fenster, das eindeutig zeigt das Rückenmark Gewebe und ist frei von Verschmutzungen.
  4. Berühren Sie sanft das Rückenmark mit der Pinzette. Einige Tiere können reflexiv springen, auch wenn ihre Narkose Flugzeug tief ist. Wenden Sie ein paar Tropfen von einem betäubenden Mittel wie Lidocain direkt auf das Rückenmark zu verhindern, während das Injektionsverfahren springen an.
  5. Sichern Sie das Tier in einer spinalen Halterung durch stabilisierende Pinzette Dornfortsätze rostral und kaudalen zum Fenster Laminektomie Befestigung. Heben Sie den Bauch des Tieres mit dem spinalen Halter, um die Wirkung der Atembewegungen zu negieren. Dies erhöht Nadel Stabilität und entsprechende Tiefe der Injektion zu gewährleisten.

6. Laden Virus und Positionierung des Injektors

  1. Laden Sie Virus in den Injektor ca. 5 µL auf ein Stück Parafilm pipettieren und Positionierung der Nadelöhrs so, dass die Spitze in der Drop.
  2. Verwenden Sie die Mikropumpe, bis zu 4 µL des Virus mit einer Rate von 20 – 100 nL/s zurückzuziehen.
  3. Stellen Sie den Regler zu injizieren und lassen Sie eine kleine Menge des Virus von der Nadel um sicherzustellen, dass die Spitze der Nadel nicht verstopft ist. Wischen Sie überschüssiges Virus mit einem Labor-abwischen.
    Hinweis: Eine Hamilton-Spritze mit einer Stahlnadel kann als Alternative zu gezogenem Glaspipetten verwendet werden.
  4. Positionieren Sie der Mikromanipulator zu, so dass die Nonius-Skala sichtbar ist und positionieren Sie die Nadel auf der Mittellinie des Rückenmarks zu.
    Hinweis: Die Mittellinie kann manchmal durch ein großes Blutgefäß läuft auf der Vorderfläche des Rückenmarks befinden. Jedoch kann dies in einzelnen Ratten, und Mittellinie targeting sollte im Vergleich zu einer intakten Dornfortsatz bestätigt werden.
  5. Richten Sie die Nadel seitlich um 0,8 mm mit dem Nonius-Skala auf dem Mikromanipulator.
  6. Senken Sie die Nadel auf das Rückenmark, bis er einrücken, aber nicht durchstechen, die Dura. Mit einer schnellen Drehbewegung, Punktion der Dura mit der Nadel, bis es zu einer Tiefe von 1,5 mm versenkt hat.

(7) Injektion von Virus ins Rückenmark

  1. Sobald die Nadel vorhanden ist, tritt Programm die Düse mit einer Geschwindigkeit von 400 nL/min bestätigen, dass Virus injizieren des Rückenmarks durch die Beobachtung der Fortschritte der Farbstoff Front. Es dürfen keine offensichtliche Leckage oder Vorwölbung des Rückenmarks Gewebes. Wenn Leckage beobachtet wird, kann dies manchmal durch die Reduzierung der Einspritzgeschwindigkeit auf 200 nL/min gelindert werden.
  2. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel in das Rückenmark für 2 – 5 min. (je nach Volumen injiziert) ruhen, Verbreitung des Virus zu erleichtern.
  3. Langsam ziehen Sie die Nadel heraus und bewegen auf die nächste Injektionsstelle. Injizieren Sie 1 µL des Virus in jedem der 6 gleichmäßig verteilte Standorte ca. 1 mm Abstand entlang der Länge des L1-L4 spinale Gewebes. Für jede Injektion kann die gleiche Nadel verwendet werden, solange es weiterhin ordnungsgemäß funktioniert.

(8) Wundversorgung Schließung und Post-operative

  1. Entfernen Sie das Tier aus der Wirbelsäule Halter und herausnehmen Sie Retraktoren oder Haken verwendet, um seitliche Muskel zu verbreiten. Stellen Sie sicher, dass die Wunde frei von allen Schmutz vor der Schließung.
  2. Den Muskel mit einer 4,0 Chromsäure Darmsaite Naht zu Naht. Schneiden Sie Naht Fäden in der Nähe des Knotens zur Wahrscheinlichkeit einer internen Hautreizungen zu verringern.
  3. Heften Sie die Haut mit 9 mm Wunde Clips geschlossen. Um für optimale Heilung zu ermöglichen, richten Sie die Kanten der Haut vor dem Heften.
  4. Legen Sie das Tier auf eine Wasser-Konvektion Erwärmung Pad und Monitor bis wach.
  5. Injizieren Sie 5 – 10 mL steriler Kochsalzlösung subkutan, Flüssigkeiten und ein Antibiotikum wie Cefazolin zur Vorbeugung von Infektionen wieder aufzufüllen. Wenn das Tier ist ambulant, legen Sie sie wieder zurück in seine Heimat Käfig und bieten erste Analgetika.  Die Ratten auf Anzeichen von Schmerzen und Qualen zu überwachen und nach Ihren IACUC genehmigte Verfahren zur Linderung von Schmerzen zu behandeln.

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Representative Results

Erfolgreiche Injektion und Transport von viralen Vektoren sollten Transduktion einer robusten Bevölkerung von einseitigen Nervenzellen im Rückenmark und in bestimmten Hirnstamm Kernen führen. Abbildung 1 zeigt Stereotype Etikettierung von Neuronen und Axonen im thorakalen Rückenmark und in die pontine Formatio Bildung der Hirnstamm bei vier Wochen nach der Injektion. GFP Ausdruck sieht in Neuronen in der grauen Substanz des thorakalen Rückenmarks auf der Seite ipsilateral auf die Injektion (Abbildung 1A, Box Bereich). Ein paar Neuronen werden auch auf der kontralateralen Seite, vor allem in der Nähe der Mittellinie beobachtet. In der weißen Substanz ist GFP Ausdruck Axone im ipsilateral Rückenmark (Abbildung 1A, Pfeile und Pfeilspitzen), vor allem in Bereichen typisch für Propriospinal Axone (Pfeilspitzen) beobachtet. Abbildung 1A " zeigt eine höhere Vergrößerung des Bereichs Box in A, Nachweis typischer Ausdruck in neuronale Zellkörper und Dendriten. GFP-Ausdruck in Neuronen lässt sich auch im Hirnstamm Kerne wie die pontine Formatio Bildung beobachten (Abbildung 1 b, höhere Vergrößerung des Bereichs Box im Abbildung 1 b ').

Figure 1
Abbildung 1: Transduktion von Nervenzellen im Rückenmark und Hirnstamm. (A) GLP Ausdruck in Neuronen (Box-Bereich), Axone der Propriospinal Neuronen (Pfeilspitzen) und Axone von anderen Traktaten (Pfeile) im thorakalen Rückenmark. (A') Höhere Vergrößerung der neuronalen Ausdruck im Bereich Box a (B) die pontine Formatio Bildung im Hirnstamm GFP-Label Neuronen und Dendriten auszudrücken. (B') Höhere Vergrößerung des Bereichs im BBox. Skalieren Sie Bars: (A) = 500 μm; (B) = 1 mm; (A'), (B') = 50 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Film 1: Für die Injektion in den lumbalen Rückenmarks der Ratte. Dieses video-Zusammenfassung der Grundlagen der Ausrichtung und Injektion von viralen Vektoren ins Rückenmark Ratte. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Genmanipulation von Neuronen im Gehirn und im Rückenmark hat Highlight sensorische, motorische und autonome Wege über fluoreszierende Tracing und nachwachsen Potenzial von neuronalen Traktaten nach Verletzungen27,28, gedient. 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direkte Injektion von Doppelthebel transportable viralen Vektoren ins Rückenmark kann gezielt neuronale Populationen über deren synaptischen Verbindungen, so dass diese Methode eine ausgezeichnete Wahl für Zuordnung Wege in das zentrale Nervensystem. Der HiRet Vektor zeigt speziell selektive Aufnahme an der neuronalen Synapsen22,24,25und früheren Ablaufverfolgung mit ähnlich strukturierten Vektoren zeigte keine Ausbreitung in geschädigte Axone oder unabhängigen Zellen 34 , 35, die im Einklang mit Ergebnissen, die mit der HiRet Konstrukt22,23,25. Direkter Einspritzung von HiRet als retrograde Tracer deshalb eine ideale Methode für die Erkundung interneuronale Schaltungen, die Plastizität nach Verletzung zu unterziehen.

Es gibt zwei wichtige Konzepte erfolgreiche Injektion von viralen Vektoren ins Rückenmark beteiligt. Die erste baut das richtige Ziel mit der Glasnadel, und die zweite gewährleistet ausreichende Strömung des Virus von der Nadel in das Gewebe. Da dieses Protokoll retrograde Ablaufverfolgung beinhaltet, erfordert auf den richtigen Bereich ein gründliches Verständnis der synaptischen Verbindungen der neuronalen Bevölkerung von Interesse. Propriospinal und Reticulospinal Neuronen verbinden des lumbalen Rückenmarks werden hier angesprochen. Diese Neuronen sind in den Hirnstamm und zervikalen und thorakalen Rückenmarkssegmente, mit der Mehrheit der PNs lokalisiert, V-VII Schichten innerhalb der grauen Substanz verteilt. Um Transduktion eine angemessene Bevölkerung der Neuronen zu gewährleisten, werden sechs virale Injektionen über einer Fläche von vier Wirbelsäulensegmente durchgeführt. Die L1-L4-Segmente sind aufgrund des Vorhandenseins von der zentralen Muster-Generatoren und ihre bekannten Verbindungen zu anderen Bereichen des Rückenmarks gewählt. Sobald die richtige spinalen Segmente und Schichten bekannt sind, unbedingt physischen Standort dieser Ziele über anatomischen Landmarken. Atlanten zeigen Details der anatomischen Struktur und Wirbelkörper Form kann targeting Wahrzeichen8,36zu bestätigen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Mehrheit dieses Protokolls gleich bleibt, ob eine Injektion oder sechs vorgenommen werden; der Unterschied besteht nur in der Anzahl der Wirbelsäulensegmente ausgesetzt über Laminektomie und die Tatsache, dass Sie die Glasnadel mit zusätzlichen Virus neu zu laden, wenn mehr als 4 µL zu injizieren. Das Protokoll kann auch für die Maus leicht angepasst werden. Aufgrund seiner geringeren Größe das Volumen des Virus injiziert das Kabel nach unten angepasst werden und die Messungen erforderlich, um die richtige Wirbelsäulen Schichten treffen eingestellt. Mehrere Videos von ähnlichen Operationen auf der Maus wurden zuvor veröffentlichten37,38.

Die folgende Betrachtung ist angemessene Verbreitung in das Gewebe. Eine sorgfältige Vorbereitung der Nadel ist notwendig, um sicherzustellen, dass die Blende für die virale Aussetzung reicht zu fließen nach außen und Trümmer blockiert nicht die Spitze, und Visualisierung der Strömung von der Nadel ins Rückenmark über eine Front von farbigen Farbstoff ist hilfreich, um zu bestätigen, dass die Aussetzung der Gewebe eindringt. Sobald die Suspension in die Gewebe verteilt wurde, wird die Aufrechterhaltung der Nadel innerhalb des Rückenmarks für 2-5 Minuten angemessene Verbreitung sichergestellt.

Erfolgreiche Transduktion von einer Zielbevölkerung kann auch von inhärenten Eigenschaften des Virus injiziert wie Titer, Serotyp und Infektion Effizienz abhängen. Wir finden einen genomic Kopie Titer von mindestens 1010 GC/mL für HiRet Lentivirus, gut für in-vivo-Experimente zu arbeiten. Höhere Titer oder Injektionsvolumina möglicherweise höheren Kennzeichnung Index zeigen, aber Sorge muß genommen werden, da der Virus aus den gewünschten Bereich oder in der kontralateralen Rückenmark diffundieren kann. Auch sollten die Art der Vektor für Kennzeichnung Zellen von Interesse, die basierend auf ihren Tropismus berücksichtigt werden. Bestimmte virale Serotypen haben bessere Infektion und Transduktion Preise in verschiedenen Populationen von Neuronen39. Traditionelle Lentivirale Vektoren sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Zelltypen aufgrund der VSV-G-Hüllprotein infizieren jedoch Änderungen auf diesen Vektor seine Tropismus40beeinflussen können. Das Konstrukt HiRet ändert den Umschlag von Pseudotyping mit einer Fusion Glykoprotein (FuG-B) des Tollwutvirus, das ermöglicht eine hocheffiziente retrograder Transport22,23 und ist wirksam bei der transducing Propriospinal und Reticulospinal Traktate mit neuronalen Zahlen vergleichbar mit Trakt Ablaufverfolgung über Methoden wie Fluorogold und Microruby4,41 (für Details der Konstruktion des HiRet Vektor Stuhls Hirano Et Al.) 22. jedoch es nicht ausreichend Beschriften des Erwachsenen kortikospinalen Trakts in diesen Experimenten, obwohl es die CST beim Neugeborenen mit hohem Wirkungsgrad in anderen Studien1beschriften. Es ist möglich, dass Rezeptoren für HiRet Aufnahme an den gezielten Synapsen wie NCAM oder p75NTR, sind nur schwach ausgedrückt auf Erwachsene CST Neuronen42,43, obwohl dies immer noch untersucht wird. Auf jeden Fall zeigt die Bedeutung der Bestimmung, ob der Vektor verwendet wird für die gezielte Zellen geeignet ist. In diesem Experiment wurden Gehirn und Rückenmark Gewebe verarbeitet und sondiert nach vier Wochen um reichlich Zeit für Verstärkung und den Transport von der Lendenwirbelsäule Schnur auf alle Gehirnbereiche zu gewährleisten. HiRet wird über schnell retrograde axonale Transport transportiert, und somit eine kürzere Probezeit kann angezeigt sein, wenn die zurückgelegte Strecke weniger, wie ist wenn die Injektion befindet sich im zervikalen Rückenmark.

Direkteinspritzung Chirurgie ist ein nützliches Werkzeug für die Einführung von viralen Vektoren Technologie in das Rückenmark. Nutzung von HiRet für genetische Experimente vorteilhaft ist, da es stabil und lang anhaltende Transgene Ausdruck ist ungiftig, Neuronen. In diesem Experiment wurde keine GFP Kennzeichnung gesehen in Neuronen, die keine direkte synaptische Verbindungen zum Bereich Injektion vornehmen. Dies galt auch in früheren Studien bei Tieren mit einem Thorax Prellung Verletzungen25. Darüber hinaus konnte HiRet-GFP label spinalen motorischen Neuronen oder Dorsal Root Ganglion Neuronen in den vorübergehend demyelinated Ischiasnerv (unveröffentlichte Beobachtungen) injiziert. Zusammen, empfehlen diese Daten HiRet tritt nicht ohne weiteres durch Axone und effizient transduces Neuronen durch Aufnahme des Vektors an Synapsen, eine detailliertere und High-Fidelity-Karte von neuronalen Verbindungen der gezielten Bevölkerung. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Doppelthebel transportablen virale Vektoren wie retrograde Adeno-assoziierte Virus (rAAV-Retro), die bekanntlich von Axonen in Passage44 aufgegriffen werden und macht HiRet besonders nützlich in Studien zuordnen, regenerierend und Wiederherstellen der Verbindung Schaltung im verletzten Rückenmark. Vorteile des HiRet kann auch für die spezifische Ausrichtung der neuronalen Populationen für Stummschaltung oder Ablation Studien25,44,45,46,47.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall R01 R01NS103481 finanziert und die Shriners Hospital für die pädiatrische Forschung gewährt SHC 84051 und SHC 86000 und dem Department of Defense (SC140089).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309604 For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin) West-Ward Pharmaceuticals NPC 0143-9924-90 To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax Fine Science Tools 19009-00 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00 To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam Pfizer H68079 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers Oster 111038-060-000 For clearing the surgical site of hair.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Kimwipes Kimtech 34155 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment Dechra Veterinary Products RAC 0119 To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets Bio Serv MP275-050 For pain management post-surgery.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips CellPoint 201-1000 To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump Gaymar TP500C To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.

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References

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Direkter Einspritzung von Lentivirale Vektor zeigt mehrere motorische Bahnen im Rückenmark Ratte
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Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord. J. Vis. Exp. (145), e59160, doi:10.3791/59160 (2019).

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