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Neuroscience

एक मसूर का सीधा इंजेक्शन वेक्टर चूहे रीढ़ की हड्डी में कई मोटर रास्ते पर प्रकाश डाला गया

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/59160
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Shriner's Pediatric Research Center, Temple University

Summary

यह प्रोटोकॉल एक retrogradely परिवहनीय वायरल वेक्टर का चूहा रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में इंजेक्शन को दर्शाता है । सदिश को synapse पर ले जाया जाता है और लक्ष्य न्यूरॉन्स के सेल शरीर में पहुँचाया जाता है । इस मॉडल महत्वपूर्ण रीढ़ की पगडंडियां या जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए लक्ष्यीकरण कोशिकाओं के प्रतिगामी अनुरेखण के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

तंत्रिका तंत्र में कोशिकाओं में ब्याज के प्रोटीन का परिचय सहज जैविक बाधाओं के कारण चुनौतीपूर्ण है कि सबसे अणुओं के लिए उपयोग की सीमा । रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में सीधे इंजेक्शन इन बाधाओं को नजरअंदाज, सेल निकायों या synapses जहां अणुओं को शामिल किया जा सकता है के लिए पहुंच प्रदान । इस विधि के साथ वायरल वेक्टर प्रौद्योगिकी के संयोजन जीन थेरेपी या पथ ट्रेसिंग के उद्देश्य के लिए तंत्रिका ऊतक में लक्ष्य जीन की शुरुआत के लिए अनुमति देता है । यहां एक वायरस अत्यधिक कुशल प्रतिगामी परिवहन (HiRet) के लिए इंजीनियर proprioस्पाइनल interneurons (PNs) के synapses पर शुरू की रीढ़ की हड्डी और ब्रेंहेम नाभिक में ंयूरॉंस के लिए विशिष्ट परिवहन को प्रोत्साहित करने के लिए । लक्ष्यीकरण PNs कई कनेक्शन वे ऐसे rubroस्पाइनल और रेटिकुलोस्पाइनल ट्रैक्ट के रूप में मोटर रास्ते से प्राप्त का लाभ लेता है, साथ ही रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों भर में एक दूसरे के साथ उनके परस्पर संबंध । प्रतिनिधि का उपयोग कर के साथ HiRet वेक्टर का प्रयोग कर संवैधानिकता से सक्रिय हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) सेल निकायों के उच्च निष्ठा विवरण, वक्ष PNs में axons और डेन्ड्रोटिक arbors से पता चलता है और पोन्टाइन में रेटिकुलोस्पाइनल ंयूरॉंस के गठन में । HiRet ब्रेंहेम रास्ते और PNs में अच्छी तरह से शामिल है, लेकिन corticospinal पथ ंयूरॉंस में उंर निर्भर एकीकरण से पता चलता है । सारांश में, वायरल वैक्टर का उपयोग रीढ़ की हड्डी इंजेक्शन लक्षित tracts के ंयूरॉंस में रुचि के प्रोटीन की शुरुआत के लिए एक उपयुक्त तरीका है ।

Introduction

वायरल वैक्टर महत्वपूर्ण जैविक उपकरण है कि कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री का परिचय करने के लिए दोषपूर्ण जीन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कर सकते हैं, महत्वपूर्ण वृद्धि प्रोटीन या विनिर्माण मार्कर प्रोटीन है कि संरचना और synaptic कनेक्शन पर प्रकाश डाला अपने लक्ष्य । इस अनुच्छेद के एक अत्यधिक कुशल retrogradely परिवहनीय मसूरी वायरल वेक्टर के सीधे इंजेक्शन पर ध्यान केंद्रित करने में चूहा रीढ़ की हड्डी में फ्लोरोसेंट ट्रेसिंग के साथ प्रमुख मोटर रास्ते को उजागर करने के लिए ।  इस विधि भी axonal पुनर्जनन और regrowth अध्ययन के लिए अत्यधिक उपयुक्त है ंयूरॉंस की विभिंन आबादी में रुचि के प्रोटीन परिचय और कार्यात्मक मानचित्रण अध्ययन1,2के लिए ंयूरॉंस मौन के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

रीढ़ की हड्डी के मोटर मार्ग के कई संरचनात्मक विवरण जैसे bda और fluoro-गोल्ड3,4,5,6,7 के रूप में शास्त्रीय tracers के साथ प्रत्यक्ष इंजेक्शन अध्ययन के माध्यम से आविर्भाव किया गया , 8. इन tracers सोने के मानक माना जाता है, लेकिन इस तरह के क्षतिग्रस्त axons द्वारा उत्साहित के रूप में कुछ नुकसान हो सकता है, या सफेद एक इंजेक्शन साइट आसपास के मामले में मार्ग में axons9,10,11 . यह मार्ग कनेक्टिविटी की गलत व्याख्याओं को जंम दे सकता है और पुनर्जनन अध्ययन में एक खामी है जहां क्षतिग्रस्त या विच्छेद axons द्वारा डाई अवशोषण बाद में12विश्लेषण के दौरान फाइबर regenerating के लिए गलत हो सकता है हो सकता है ।

वे स्थिर प्रदान करते हैं, के रूप में वे न्यूरोनल आबादी में दीर्घकालिक अभिव्यक्ति13,14,15,16,17,18 ,19. हालांकि, पारंपरिक रूप से पैक की गई मसूर की दाल में सीमित प्रतिगामी परिवहन हो सकता है और vivo4,20,21में इस्तेमाल होने पर इम्यून सिस्टम रिस्पांस ट्रिगर हो सकता है । एक उच्च कुशल प्रतिगामी परिवहन वेक्टर कहा जाता है काटो एट अल द्वारा उत्पादित किया गया है एक रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन के साथ वायरल लिफाफा संशोधित करने के लिए एक संकर वेक्टर कि प्रतिगामी परिवहन में सुधार22,23बनाने के लिए ।

प्रतिगामी अनुरेखण एक लक्ष्य ंयूटन के synaptic अंतरिक्ष में एक सदिश परिचय, यह है कि कोशिका axon द्वारा लिया और सेल शरीर को ले जाया जा करने के लिए अनुमति दी । hiret के सफल परिवहन चूहों और रहनुमाओं23,24 और मोटर ंयूरॉंस में पेशी से22के दिमाग में न्यूरोनल synapses से प्रदर्शित किया गया है । यह प्रोटोकॉल काठ का रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन को दर्शाता है, विशेष रूप से proprioस्पाइनल interneurons और ब्रेंहेम ंयूरॉंस के synaptic टर्मिनलों को लक्षित । PNs कई अलग रीढ़ की हड्डी से कनेक्शन प्राप्त करते है और इस प्रकार रीढ़ की हड्डी और ब्रेंटम में ंयूरॉंस की एक विविध जनसंख्या को लक्षित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस अध्ययन में लेबल ंयूरॉंस सर्किट innervating मोटर ंयूरॉंस पूल हिंदलिंब मोटर समारोह से संबंधित का प्रतिनिधित्व करते हैं । मजबूत लेबलिंग रीढ़ की हड्डी और ब्रेनहेम में देखा जाता है, जिसमें डेन्ट्रटिक अरबेर्स और axon टर्मिनलों के उच्च निष्ठा विवरण शामिल हैं । हम भी गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के भीतर पिछले अध्ययनों में इस विधि का इस्तेमाल किया है proprioस्पाइनल और ब्रेंहेम रेटिकुलोमेरु रास्ते25लेबल ।

यह प्रोटोकॉल एक वायरल वेक्टर के एक चूहे की काठ की रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन को दर्शाता है । के रूप में 1 मूवी में देखा, चीरा पिछले रिब पर स्थित L1 कशेरुका की पहचान द्वारा लक्षित है । यह एक 3-4 सेमी चीरा कि L1-L4 रीढ़ की हड्डी पर मांसपेशियों को उजागर के लिए एक पुच्छ मील का पत्थर के रूप में प्रयोग किया जाता है । टी11-T13 कशेरुका के पृष्ठीय पहलुओं के Laminectomies प्रदर्शन कर रहे है और एक beveled कांच की सुई मिडलाइन से ०.८ mm पार्श्व का निर्देशन किया है और ग्रे मामले में गहरी १.५ mm कम करने के लिए वायरस सुई ।

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Protocol

सभी निंनलिखित शल्य चिकित्सा और पशु देखभाल प्रक्रियाओं के पशु देखभाल और मंदिर विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. प्री-सर्जिकल तैयारी

  1. तैयार सर्जरी से पहले कुछ दिनों के वायरल इंजेक्शन के लिए ग्लास सुई खींचा ३.५ नैनोलिटर ग्लास केशिका नानोलिटर इंजेक्टर के लिए डिजाइन किए गए पिपेट का उपयोग कर । दो सुई टेम्पलेट्स बनाने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक दो कदम सुई डांड़ी पर प्रत्येक पिपेट खींचो ।
  2. सूक्ष्म कैंची के साथ अतिरिक्त कांच के लगभग 1-2 मिमी काटने से सुई टेम्पलेट्स की नोक को परिष्कृत करें । एक माइक्रोस्कोप अंशांकन स्लाइड के साथ एक खुर्दबीन के तहत अनुमानित एपर्चर आकार को मापने 30-40 μm apertures के साथ सुई को अलग ।
  3. 30 ° पर तैनात सुई के साथ, एक micropipette बेवेलर का उपयोग करने के लिए एक 30-40 μm एपर्चर और एक ४५ ° beveller कोण के साथ एक टिप बनाने के लिए । अंशांकन स्लाइड पर वर्नियर स्केल के साथ एपर्चर चौड़ाई की जांच करें । ग्लास सुई के माध्यम से पानी और इथेनॉल एक लचीला सुई लगाव के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर दूर मलबे धोने और एक काला मार्कर के साथ नियमित अंतराल पर सुई निशान के माध्यम से गुजरती हैं ।
  4. एक कवर पेट्री डिश में सुइयों प्लेस पहले ७०% इथेनॉल के साथ साफ और यूवी प्रकाश के तहत एक Biosafety हुड में 30 मिनट के लिए ।
  5. फ्रीजर से एक उपयुक्त मात्रा में तुरंत प्रक्रिया से पहले निकाल कर हाइरेट लेंसीवायरस तैयार करें ।
    नोट: एक उपयुक्त मात्रा इंजेक्शन के लिए आवश्यक राशि (इंजेक्शन की एक्स संख्या के अनुसार 1 μL) अधिक अतिरिक्त मात्रा की एक छोटी राशि के लिए खाते में शामिल है और नुकसान के लिए । परिवहन और बर्फ पर वायरस स्टोर जब उपयोग में नहीं है ।
  6. यह माइक्रोपंप में plugging और यह एक वर्नियर पैमाने के साथ एक माइक्रोनिपुलेटर में रखने के द्वारा सुई लगानेवाला तैयार ।
  7. कांच सुई तैयार करने के लिए, ध्यान से एक लचीला सुई के साथ outfitted सिरिंज के साथ लाल तेल के रूप में एक रंग डाई लोड । सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले सुई में रहते हैं । सुई से निपटने, और टिप को छूने से बचना जब अपूतित तकनीक का प्रयोग करें ।
  8. सुई लगानेवाला में ग्लास सुई डालें, सुनिश्चित करना है कि सूची सही ढंग से वाशर में बैठा है, सुई लगानेवाला टोपी तंग पर खराब कर दिया है, और इस्पात सुई लगानेवाला सूई लगभग 3/4 ग्लास सुई की लंबाई विस्तारित है । वायरस बाद में एक कदम में सुई में लोड किया जा सकता है ।

2. संवेदनाहरण और शल्य साइट की तैयारी

  1. एक डिजिटल पैमाने पर जानवर वजन । आवश्यक संवेदनाहारी की मात्रा निर्धारित करने के लिए और वजन के बाद सर्जरी की निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए पूर्व ऑपरेटिव वजन रिकॉर्ड । मादा Sprague-Dawley चूहों लगभग 200-250 ग्राम इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया ।
  2. Anesthetize चूहा या तो isoflurane साँस लेना या एक इंजेक्शन ketamine का उपयोग कर/xylazine समाधान (k/एक्स) । यहां, ketamine एक ६७ मिलीग्राम/किलो और xylazine पर एक ६.७ मिलीग्राम/किलो खुराक में intraperitoneally इंजेक्शन है ।
  3. पैर दृढ़ता से चुटकी लेते हुए एक उचित संवेदनाहारी विमान की पुष्टि करें । स्वतुल्य वापसी होती है, तो आगे बढ़ने से पहले कई अतिरिक्त मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
    नोट: इसके अलावा चेतना के संकेत के लिए मूंछे, आंखों और श्वास दर का निरीक्षण । अगर मूंछ हिल रहे हैं, आंख झपकाए जब धीरे से छुआ, या सांस तेज और उथले, संवेदनाहारी विमान के लिए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना गहरा है जब तक इंतज़ार । यह भी laminectomy और इंजेक्शन सर्जरी भर में इन संकेतों की निगरानी । यदि पशु एक उथले संवेदनाहारी विमान को प्रदर्शित करता है, ketamine के एक बूस्टर शॉट प्रशासन-केवल 1/2 मूल कश्मीर के बराबर/
  4. कूल्हों से कंधे के नीचे के कोण पर पृष्ठीय मिडलाइन के साथ चूहा दाढ़ी । एक आसान और अधिक सटीक दाढ़ी के लिए तना हुआ जानवर की त्वचा खींचो ।
  5. दोनों आंखों में ऑप्थैल्मिक मरहम लागू करें ।
  6. साइट करने के लिए मुंडा क्षेत्र के लिए एंटीसेप्टिक लागू करें । पहली सफ़ाई के लिए, एक 5% आयोडीन समाधान के साथ बाँझ धुंध सोख और सभी बाल और मलबे मिटा । बाँझ धुंध के साथ एक यूनिडायरेक्शनल कड़ी चोट के साथ इस का पालन करें ७०% इथेनॉल में लथपथ है, ताकि कोई क्षेत्र दो बार संपर्क किया है । आयोडीन और इथेनॉल से लथपथ धुंध दो बार और बारी के साथ इस तकनीक का प्रयोग करें ।

3. सर्जिकल फील्ड और इंस्ट्रूमेंट की तैयारी

  1. autoclaved शल्य चिकित्सा उपकरण है कि एक स्केलपेल, rongeurs, चूहा दांत संदंश, वसंत कैंची, hemostats, मध्यम बिंदु घुमावदार संदंश और retractors या भारित हुक को बाँझ लपेटो unलपेटन एक बाँझ क्षेत्र बनाने के लिए शामिल का एक सेट तैयार करें ।
  2. बाँझ सर्जिकल दस्ताने का एक पैकेज खोलें और बाँझ दस्ताने लपेटें मेज पर रखें । बाँझ रैप के संदूषण को रोकने के लिए प्रयुक्त उपकरणों के लिए एक अतिरिक्त बाँझ फ़ील्ड के रूप में इसका उपयोग करें.
  3. बाँझ क्षेत्र पर एक #10 स्केलपेल ब्लेड ड्रॉप. hemostats के साथ एक संभाल करने के लिए ब्लेड सुरक्षित । स्थिति बाँझ खारा, ४.० क्रोमिक catgut सीवन, और सामग्री इस तरह के रूप में खून बह रहा नियंत्रण करने के लिए एक cauterizer, बाँझ धुंध, बाँझ कपास-tipped applicators (मांसपेशी bleeds के लिए), या जिलेफोम या bonewax (अस्थि bleeds के लिए) एक सुलभ जगह में.
  4. पशु को पुनः प्राप्त और एक बाँझ कपड़े पर सेट. मूत्र इकट्ठा करने के लिए मूत्राशय के नीचे धुंध रखें । पेट के नीचे एक लुढ़का तौलिया के साथ लक्ष्य क्षेत्र को सहारा । यदि उपलब्ध हो, तो कपड़े के नीचे एक सर्जिकल हीटिंग पैड रखें, विशेष रूप से लंबी प्रक्रियाओं के लिए ।
    नोट: जीवन रक्षा सर्जरी के दौरान बाँझपन महत्वपूर्ण है । हाथ पर ७०% इथेनॉल की एक स्प्रे बोतल रखो दस्ताने हाथों की बाँझपन बनाए रखने के लिए, और एक का उपयोग मनका स्टरलाइजर अगर साधन बाँझपन समझौता किया है, या व्यक्तिगत सर्जरी के बीच.

4. कशेरुका स्तंभ को उजागर करने और laminectomy साइट की पहचान

  1. क्षेत्र की पहचान जहां एक त्वचा चीरा उंगलियों को धीरे से अंतिम पसली में दबाकर L1 कशेरुका का पता लगाने के द्वारा किया जाएगा । एक मील का पत्थर के रूप में इस का उपयोग कर, एक #10 सर्जिकल बस L1 को अवर समाप्त करने के लिए मांसपेशियों को बेनकाब स्केलपेल के साथ एक 3-4 सेमी त्वचा चीरा बनाओ । कोमल फैलने और एक साफ चीरा सुनिश्चित करने के लिए स्केलपेल ब्लेड के साथ मजबूती से प्रेस द्वारा तना हुआ त्वचा पकड़ो ।
  2. कट और यदि आवश्यक हो तो संदंश और कैंची के साथ सतही वसा फैल. (लक्ष्य कशेरुका पर निर्भर करता है, वहां हो सकता है या मांसपेशी के लिए एक बड़ी मोटी पैड सतही नहीं) ।
  3. स्केलपेल ब्लेड या एक उंगली के फ्लैट के साथ spinous प्रक्रियाओं के लिए लग रहा है । प्रायः मिडलाइन क्षेत्र दोनों ओर के श्वेत प्रावरणी के एक ' वी ' द्वारा रेखांकित किया जाएगा. एक छोटे से रोस्ट्रल कट बनाने के लिए कमरे में चूहे दांत forceps के साथ एक ऊपरी प्रक्रिया पर सुरक्षित रूप से हड़पने के लिए अनुमति देते हैं, तो संभव के रूप में प्रक्रियाओं के करीब के रूप में 2 लंबी, गहरी कटौती करते हैं । कट के गहरे बिंदु पर, कशेरुका की पृष्ठीय सतह स्केलपेल ब्लेड के साथ महसूस किया जा सकता है ।
  4. पार्श्व मांसपेशियों retractors या भारित हुक के साथ एक तरफ पकड़ो दृश्यता में सुधार होगा । एक स्केलपेल, वसंत कैंची या rongeurs के साथ प्रक्रियाओं के आसपास स्पष्ट मांसपेशी उनके सिर के आकार का निर्धारण करने के लिए ।
    ध्यान दें: याद रखें कि रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के रूप में मेरुरज्जु की पूरी लंबाई का विस्तार नहीं करता है, के रूप में स्पाइनल कॉर्ड ऊतक अस्थि से विकास में पहले से बढ़ बंद हो जाता है । इसका मतलब यह है कि लक्ष्य रीढ़ की हड्डी का स्तर एक अलग नाम कशेरुका नीचे हो सकता है ।
  5. टी11 और आसपास के T12 और T13 प्रक्रियाओं की स्थिति जानें ।
    नोट: लक्ष्यीकरण में सहायता सही कशेरुका स्तर एक चूहा रीढ़ की हड्डी एटलस में पाया जा सकता है और पिछले अध्ययन माउस, जो एक बहुत ही कशेरुका संरचना है6,३३में स्थलों रूपरेखा । ऐसे T9 के रूप में एक सूक्ष्म spinous प्रक्रिया छोड़ एक मिडलाइन मील का पत्थर देने के लिए अबाधित ।

5. एक laminectomy प्रदर्शन

  1. एक बार लक्ष्य क्षेत्र को सही ढंग से पहचाना गया है, टी11-T13 के पृष्ठीय पहलुओं के laminectomies प्रदर्शन । धीरे रीढ़ की हड्डी के प्रारंभिक काटने के लिए rongeurs डालने के लिए अच्छा साइटों रहे हैं, जो intervertebral बंधन, प्रकट करने के लिए कशेरुक फैल. ठीक नियंत्रण बढ़ाने के लिए आधे बंद स्थिति में रोंगे्रस को होल्ड करें ।
  2. spinous प्रक्रियाओं और रीढ़ की पृष्ठीय पहलू को दूर rongeurs के साथ छोटे से काटने लेने के द्वारा । रीढ़ की हड्डी को नुकसान या दउरा परेशान नहीं सावधान रहना । चूहा दांत संदंश के साथ थोड़ा लिफ्ट मदद रीढ़ की हड्डी को कशेरुका से दूर खींचने के लिए और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को हिट करने की प्रवृत्ति में कमी ।
  3. मिडलाइन से दूर स्पष्ट अस्थि इतनी है कि मिडलाइन रक्त वाहिका मनाया जा सकता है. एक खिड़की है कि स्पष्ट रूप से रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से पता चलता है और मलबे से मुक्त है छोड़ दें ।
  4. धीरे से संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी को छूने. कुछ जानवरों reflexively भले ही उनके संवेदनाहारी विमान गहरी है कूद सकता है । इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान कूद को रोकने के लिए रीढ़ की हड्डी के लिए सीधे लाइडोकेन के रूप में एक स्तब्ध एजेंट की कुछ बूंदें लागू करें ।
  5. एक रीढ़ की हड्डी के धारक में जानवर सुरक्षित करने के लिए स्थिर संदंश स्थिरता के लिए के रूप में एक नरम और पुच्छ laminectomy खिड़की की प्रक्रिया । श्वास आंदोलनों के प्रभाव को नकारने के लिए स्पाइनल होल्डर का इस्तेमाल कर जानवर का पेट बढ़ाएं । इससे सुई की स्थिरता बढ़ेगी और इंजेक्शन की उपयुक्त गहराई सुनिश्चित होगी ।

6. लोड हो रहा है वायरस और स्थिति सुई लगानेवाला

  1. लगभग 5 μL का एक टुकड़ा पर पराफ़ल और सुई स्थिति है कि टिप ड्रॉप के अंदर है द्वारा सुई लगानेवाला में लोड वायरस ।
  2. माइक्रोपंप का उपयोग 4 μL वायरस को 20 – 100 nL/s की दर से वापस लेने के लिए करें ।
  3. सुई की नोक अवरुद्ध नहीं है सुनिश्चित करने के लिए सुई से वायरस की एक छोटी राशि को इंजेक्शन और रिहाई के लिए नियंत्रक सेट करें । एक प्रयोगशाला पोंछ के साथ अतिरिक्त वायरस पोंछ ।
    नोट: एक इस्पात सुई के साथ एक हैमिल्टन सिरिंज कांच पिपेट खींचा के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. माइक्रोमेनिपुलेटर की स्थिति ताकि वर्नियर स्केल दिखाई दे और रीढ़ की हड्डी की मिडलाइन पर सुई की स्थिति हो ।
    नोट: मिडलाइन कभी-कभार रीढ़ की हड्डी के अग्रवर्ती सतह पर चल रहे एक बड़े रक्त वाहिका द्वारा स्थित हो सकता है । हालांकि, यह व्यक्तिगत चूहों में भिंन हो सकते हैं, और मिडलाइन लक्ष्यीकरण एक बरकरार spinous प्रक्रिया के साथ तुलना द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए ।
  5. माइक्रोनिपुलेटर पर वर्नियर स्केल का उपयोग करके ०.८ mm द्वारा सुई को सीधा किया जाता है ।
  6. रीढ़ की हड्डी के लिए सुई कम जब तक यह इंडेंट है, लेकिन नहीं पंचर, बाडी । एक त्वरित घुमा गति का उपयोग करना, जब तक यह १.५ मिमी की गहराई तक डूब गया है सुई के साथ दउरा पंचर ।

7. रीढ़ की हड्डी में वायरस इंजेक्शन

  1. एक बार सुई के स्थान पर, प्रोग्राम इंजेक्शन के लिए ४०० nL/मिनट की दर से सुई । पुष्टि करें कि वायरस डाई सामने की प्रगति को देख कर रीढ़ की हड्डी में प्रवेश कर रहा है । कोई स्पष्ट रिसाव या रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के उभड़ा होना चाहिए । यदि रिसाव मनाया जाता है, तो यह कभी-कभार इंजेक्शन की गति को २०० nL/मिनट तक कम करके क्रमशः समाप्त किया जा सकता है ।
  2. एक बार इंजेक्शन समाप्त हो गया है, सुई के लिए रीढ़ की हड्डी में आराम करने की अनुमति 2 – 5 मिनट (इंजेक्शन की मात्रा पर निर्भर करता है) वायरस के प्रसार की सुविधा के लिए.
  3. धीरे से सुई वापस ले और अगले इंजेक्शन साइट के लिए कदम । 6 समान स्थान वाली साइटों में से प्रत्येक में 1 μL वायरस का इंजेक्ट लगभग 1 मिमी के अलावा L1-L4 रीढ़ की हड्डी ऊतक की लंबाई के साथ । एक ही सुई के रूप में लंबे समय के रूप में यह ठीक से काम जारी है प्रत्येक इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

8. घाव बंद करने और पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल

  1. रीढ़ की हड्डी धारक से जानवर निकालें और retractors या हुक पार्श्व पेशी प्रसार करने के लिए इस्तेमाल बाहर ले । यह सुनिश्चित करें कि घाव बंद करने से पहले सभी मलबे के स्पष्ट है ।
  2. एक ४.० क्रोमिक catgut सीवन का उपयोग मांसपेशी सीवन । काट सीवन धागे गाँठ के करीब आंतरिक त्वचा जलन की संभावना को कम करने के लिए ।
  3. प्रधान त्वचा 9 मिमी घाव क्लिप का उपयोग बंद कर दिया । इष्टतम उपचार के लिए अनुमति देने के लिए, stapling से पहले त्वचा के किनारों को लाइन ।
  4. एक पानी संवहन वार्मिंग पैड पर जानवर प्लेस और जाग्रत तक की निगरानी ।
  5. 5-10 मिलीलीटर के बाँझ खारा उपचर्म के तरल पदार्थ और एक एंटीबायोटिक जैसे cefazolin संक्रमण को रोकने के लिए फिर से भरना करने के लिए सुई । जब पशु एम्बूलेंस है, इसे वापस अपने घर पिंजरे में जगह और प्रारंभिक दर्दनाशक दवाओं प्रदान करते हैं ।  दर्द और संकट के किसी भी संकेत के लिए चूहों पर नजर रखने और अपने IACUC दर्द के उन्मूलन के लिए प्रक्रिया को मंजूरी दे दी के अनुसार इलाज ।

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Representative Results

वायरल वेक्टर के सफल इंजेक्शन और परिवहन के परिणामस्वरूप रीढ़ की हड्डी में और कुछ ब्रेंहेम नाभिक में एकतरफा ंयूरॉंस की एक मजबूत आबादी का स्थानांतरण होना चाहिए । चित्रा 1 को दर्शाता है टकसाली रीढ़ की हड्डी में ंयूरॉंस और axons के लेबलिंग और चार सप्ताह के बाद इंजेक्शन पर ब्रेंहेम के पोंटाइन में जालीदार गठन । महत्वपूर्ण GFP अभिव्यक्ति न्यूरॉंस में वक्ष रीढ़ की हड्डी के भूरे रंग के मामले में पाया जाता है ओर ipsilateral इंजेक्शन के लिए (चित्र 1a, बॉक्स्ड क्षेत्र) । कुछ ंयूरॉंस भी contralateral पक्ष पर देखा जाता है, विशेष रूप से मिडलाइन के पास । सफेद पदार्थ में, GFP अभिव्यक्ति ipsilateral कॉर्ड में axons में मनाया जाता है (चित्रा 1a, तीर और ऐरोहेड), विशेष रूप से proprioस्पाइनल axons के लिए विशिष्ट क्षेत्रों में (आरोहेडस). चित्रा 1a ' एक में बॉक्स्ड क्षेत्र के एक उच्च इज़ाफ़ा दिखाता है, न्यूरोनल सेल निकायों और dendrites में विशिष्ट अभिव्यक्ति का प्रदर्शन । न्यूरॉन्स में जीएफपी एक्सप्रेशन को पोन्टाइन गालीदार संरचना (चित्र 1bमें बॉक्स्ड क्षेत्र का अधिक आवर्धन) के रूप में ब्रेंहेम नाभिक में भी देखा जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: रीढ़ की हड्डी और ब्रेंहेम में ंयूरॉंस के Transduction। (क) न्यूरॉन्स (बॉक्स्ड एरिया) में जीएफपी एक्सप्रेशन, स्वरोस्पाइनल न्यूरॉन्स (ऐरोहेड) और वक्ष रीढ़ की हड्डी में अन्य ट्रैक्ट (एरो) के एक्सोंस । (क ') एक के बॉक्स्ड क्षेत्र में न्यूरोनल अभिव्यक्ति का अधिक इज़ाफ़ा । (ख) ब्रेनहेम में पोन्टाइन जालीदार संरचना जीएफपी लेबल वाले न्यूरॉन्स और डेन्राइट्स को अभिव्यक्त करता है । (ख ') बीमें बॉक्स्ड क्षेत्र का उच् च आवर्धन । स्केल पट्टियां: (A) = ५०० μm; (ख) = 1 मिमी; (A '), (B ') = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
चलचित्र 1: चूहे की काठ की रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन को लक्षित. इस वीडियो को लक्ष्यीकरण और चूहा रीढ़ की हड्डी में एक वायरल वेक्टर के इंजेक्शन की मूल बातें सारांश । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में ंयूरॉन्स के आनुवंशिक हेरफेर फ्लोरोसेंट ट्रेसिंग के माध्यम से संवेदी, मोटर और स्वायत्त रास्ते को उजागर करने के लिए और चोट के बाद न्यूरोनल ट्रैक्ट के regrowth क्षमता का पता लगाने के लिए सेवा की है27,28, 29 , 30 , 31 , ३२ , ३३. रीढ़ की हड्डी में एक retrogradely परिवहनीय वायरल वेक्टर के प्रत्यक्ष इंजेक्शन उनके synaptic कनेक्शन के माध्यम से न्यूरोनल आबादी को लक्षित कर सकते हैं, इस विधि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में रास्ते मानचित्रण के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प बना रही है । हाइरेट वेक्टर विशेष रूप से न्यूरोनल synapse22,24,25पर चयनात्मक ऊपर से पता चलता है, और इसी तरह संरचित वैक्टर के साथ पिछले पता लगाने घायल axons या असंबंधित कोशिकाओं में कोई प्रसार नहीं दिखाया ३४ , ३५, जो हिरेट की विशेषता परिणामों के साथ संगत है22,23,25का निर्माण । इस प्रकार, एक प्रतिगामी अनुरेखक के रूप में hiret के प्रत्यक्ष इंजेक्शन interneuronal सर्किट है कि चोट के बाद सुघट्यता से गुजरना की खोज के लिए एक आदर्श विधि है ।

रीढ़ की हड्डी में एक वायरल वेक्टर के सफल इंजेक्शन में शामिल दो महत्वपूर्ण अवधारणाओं रहे हैं । पहले कांच की सुई के साथ सही लक्ष्य की स्थापना है, और दूसरा ऊतक में सुई से वायरस के पर्याप्त प्रवाह सुनिश्चित कर रहा है । के रूप में इस प्रोटोकॉल प्रतिगामी अनुरेखण शामिल है, सही क्षेत्र लक्ष्यीकरण ब्याज की न्यूरोनल जनसंख्या के synaptic कनेक्शन की एक पूरी तरह से समझ आवश्यक है । काष्ठ रीढ़ की हड्डी को जोड़ने के लिए Proprioस्पाइनल और रेटिकुलोस्पाइनल ंयूरॉंस यहां लक्षित कर रहे हैं । ये न्यूरॉन्स ब्रेनहेम और गर्भाशय ग्रीवा और वक्ष रीढ़ की हड्डी के खंडों में फैले होते हैं, जिनमें ग्रे मैटर के भीतर लेमिनाइन वी-VII को स्थानीयकृत करने वाले अधिकांश पीएनएस होते हैं । न्यूरॉन्स की पर्याप्त आबादी का ट्रांसलेशन सुनिश्चित करने के लिए, चार स्पाइनल सेगमेंट में फैले एक क्षेत्र में छह वायरल इंजेक्शन लगाए जाते हैं । L1-L4 खंडों केंद्रीय पैटर्न जनरेटर की उपस्थिति के कारण चुना जाता है, और रीढ़ की हड्डी के अंय क्षेत्रों के लिए उनके ज्ञात कनेक्शन । एक बार सही रीढ़ की हड्डी खंड (ओं) और laminae जाना जाता है, शारीरिक स्थलों के माध्यम से इन लक्ष्यों के भौतिक स्थान महत्वपूर्ण है । संरचनात्मक संरचना और कशेरुका आकृति का विवरण दर्शाने वाला एटलेसिस लैंडमार्क्स8,३६को लक्षित करने की पुष्टि करने में मददगार हो सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल के बहुमत ही रहता है कि एक इंजेक्शन या छह बना रहे हैं; अंतर केवल laminectomy के माध्यम से उजागर रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों की संख्या में है, और तथ्य यह है कि आप अतिरिक्त वायरस के साथ कांच की सुई पुनः लोड अगर अधिक से अधिक 4 μL इंजेक्शन की आवश्यकता होगी । प्रोटोकॉल भी आसानी से माउस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । अपने छोटे आकार के कारण, गर्भनाल में इंजेक्शन वायरस की मात्रा नीचे समायोजित किया जाना चाहिए और सही रीढ़ की हड्डी laminae हिट करने के लिए आवश्यक माप समायोजित । माउस पर इसी तरह की सर्जरी के कई वीडियो पहले३७,३८प्रकाशित किया गया है ।

अगले विचार ऊतक में पर्याप्त प्रसार है । सुई की सावधानी से तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें कि एपर्चर वायरल निलंबन के लिए पर्याप्त है जावक प्रवाह और है कि मलबे टिप ब्लॉक नहीं करता है, और रीढ़ की हड्डी में सुई से रंग डाई के सामने के माध्यम से प्रवाह के दृश्य है आवश्यक है पुष्टि करने के लिए मददगार है कि निलंबन ऊतक मर्मज्ञ है । एक बार निलंबन ऊतक में वितरित किया गया है, 2-5 मिनट के लिए रीढ़ की हड्डी के भीतर सुई बनाए रखने के लिए पर्याप्त प्रसार सुनिश्चित करेगा ।

एक लक्ष्य की जनसंख्या का सफल पारक्रमण भी वायरस के आंतरिक गुणों पर निर्भर कर सकते है जैसे कि टीटर, सीरोटाइप और संक्रमण दक्षता इंजेक्शन । हम विवो प्रयोग में अच्छी तरह से काम करने के लिए हीरेट लेंटिवायरस के लिए कम से 1010 जीसी/mL की एक जीनोमिक कॉपी टीटर पाते हैं । उच्च titers या इंजेक्शन संस्करणों उच्च लेबलिंग सूचकांक दिखा सकता है, लेकिन देखभाल की जरूरत है क्योंकि वायरस इरादा क्षेत्र से बाहर फैलाना या contralateral रीढ़ की हड्डी में ले सकता है । उनके अनुवर्तन के आधार पर ब्याज की लेबलिंग कोशिकाओं के लिए उपयुक्त वेक्टर के प्रकार पर भी विचार किया जाना चाहिए । कुछ वायरल सीरोटाइप ंयूरॉंस३९के विभिंन आबादी में बेहतर संक्रमण और पारक्रमण दर हो सकता है । पारंपरिक लेंटीवायरल वैक्टर VSV-G लिफ़ाफ़ा प्रोटीन के कारण सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करने के लिए जाना जाता है, लेकिन इस सदिश में संशोधन इसके अनुवर्तन४०को प्रभावित कर सकते हैं । hiret का निर्माण एक फ्यूजन ग्लाइकोप्रोटीन (fug-बी) रेबीज वायरस है, जो उच्च कुशल प्रतिगामी22,23 परिवहन के लिए अनुमति देता है और proprioस्पाइनल पारक्रमी में प्रभावी है के साथ कूटलेखन द्वारा लिफाफे संशोधित करता है और रेटिकुलोस्पाइनल ट्रैक्ट, न्यूरोनल संख्या के साथ ट्रैक्ट ट्रेसिंग के लिए तुलनीय हैं, जैसे कि फ्लुओरोओल्ड और माइक्रोर्बाय4,४१ (हाइरेट वेक्टर के निर्माण के विवरण के लिए हिरनो एट अल.) 22. हालांकि, यह पर्याप्त रूप से इन प्रयोगों में वयस्क corticospinal पथ लेबल नहीं था, हालांकि यह अंय अध्ययनों में उच्च दक्षता के साथ नवजात शिशुओं में सीएसटी लेबल है1। यह संभव है कि इस तरह के ncam या p75ntrके रूप में लक्षित synapses, पर ऊपर उठाने के लिए आवश्यक रिसेप्टर्स, केवल कमजोर वयस्क सीएसटी ंयूरॉंस४२,४३पर व्यक्त कर रहे हैं, हालांकि यह अभी भी जांच की जा रही है । किसी भी मामले में, यह निर्धारित करने के महत्व को दर्शाता है कि क्या उपयोग किया जा रहा वेक्टर लक्षित कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है । इस प्रयोग में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को संसाधित किया गया और चार सप्ताह के बाद जांच की प्रवर्धन और सभी मस्तिष्क क्षेत्रों को काठ की रस्सी से परिवहन के लिए प्रचुर मात्रा में समय सुनिश्चित करने के लिए । HiRet तेजी से प्रतिगामी axonal परिवहन के माध्यम से पहुंचाया जाता है, और इस प्रकार एक छोटी प्रयोगात्मक अवधि उचित हो सकता है अगर दूरी कूच कम है, जैसे कि अगर इंजेक्शन क्षेत्र ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में है ।

स्पाइनल कॉर्ड में वायरल वेक्टर तकनीक की शुरुआत के लिए डायरेक्ट इंजेक्शन सर्जरी एक उपयोगी उपकरण है । आनुवंशिक प्रयोग के लिए हाइरेट का उपयोग लाभप्रद है क्योंकि यह स्थिर, लंबे समय तक चलने transgene अभिव्यक्ति परमिट, और गैर है ंयूरॉंस के लिए विषाक्त । इस प्रयोग में, कोई GFP लेबलिंग ंयूरॉंस में देखा गया है कि इंजेक्शन क्षेत्र के लिए प्रत्यक्ष synaptic कनेक्शन नहीं करते । यह भी एक वक्ष चोट चोट25के साथ पशुओं में पिछले अध्ययनों में सच था । इसके अतिरिक्त, HiRet-GFP को रीढ़ की हड्डी मोटर ंयूरॉंस या पृष्ठीय जड़ गुच्छिका ंयूरॉंस लेबल जब सकर्मतापूर्वक demyelinated sciatic तंत्रिका में इंजेक्शन (अप्रकाशित टिप्पणियों) में असमर्थ था । साथ में, इन आंकड़ों का सुझाव है कि hiret आसानी से axons के माध्यम से प्रवेश नहीं करता है और कुशलता से synapses पर वेक्टर के तेज द्वारा ंयूरॉंस transduces, एक अधिक विस्तृत और उच्च विश्वस्तता लक्षित जनसंख्या के ंयूरॉंस कनेक्शन के नक्शे प्रदान । इस तरह के प्रतिगामी adeno के रूप में अन्य retrogradely परिवहनीय वायरल वैक्टर पर एक फायदा है-एसोसिएटेड वायरस (raav-रेट्रो), जो४४ पारित होने में axons द्वारा लिया जा करने के लिए जाना जाता है और बनाता है हाइरेट अध्ययन मानचित्रण में विशेष रूप से उपयोगी regenerating और घायल रीढ़ की हड्डी में circuitry को पुनः कनेक्ट । है hiret लाभ भी विशेष मुंह बंद या अपक्षरण अध्ययन के लिए न्यूरोनल आबादी का लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति दे सकते है25,४४,४५,४६,४७।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक R01 R01NS103481 के संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और बाल चिकित्सा अनुसंधान अनुदान SHC ८४०५१ और SHC ८६००० और रक्षा विभाग (SC140089) के लिए Shriners अस्पताल ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309604 For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin) West-Ward Pharmaceuticals NPC 0143-9924-90 To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax Fine Science Tools 19009-00 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00 To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam Pfizer H68079 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers Oster 111038-060-000 For clearing the surgical site of hair.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Kimwipes Kimtech 34155 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment Dechra Veterinary Products RAC 0119 To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets Bio Serv MP275-050 For pain management post-surgery.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips CellPoint 201-1000 To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump Gaymar TP500C To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.

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References

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Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, … More

Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord. J. Vis. Exp. (145), e59160, doi:10.3791/59160 (2019).

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