Summary
Denne protokollen demonstrerer injeksjon av en retrogradely transportable viral vektor i rotte ryggmargen vev. Vektoren er tatt opp på synapse og fraktet til celle kroppen av målet neurons. Denne modellen er egnet for retrograd sporing av viktige spinal veier eller målretting celler for gene terapi programmer.
Abstract
Innføre proteiner av interesse i cellene i nervesystemet er utfordrende på grunn av medfødte biologiske barrierer som begrenser tilgang til de fleste molekyler. Injeksjon direkte i ryggmargen vev utenom disse barrierene, gir tilgang til cellen legemer eller synapser der molekyler kan innlemmes. Kombinerer viral vektor teknologi med denne metoden gir mulighet for innføring av målet gener i nervøse vev for å genterapi eller tarmkanalen sporing. Her er et virus som er utviklet for svært effektiv retrograd transport (HiRet) innført på synapser av propriospinal interneurons (PNs) å oppmuntre bestemt transport til nerveceller i ryggmargen og hjernestammen kjerner. Målretting PNs utnytter mange tilkoblinger de mottar fra motor trasé som rubrospinal og reticulospinal områder, samt deres samtrafikk med hverandre gjennom ryggmargen segmenter. Representant sporing HiRet vektoren med constitutively aktive grønne fluorescerende protein (GFP) viser Hi-Fi detaljer cellen legemer, axons og dendrittiske arbors i thorax PNs og reticulospinal nerveceller i pontine reticular dannelsen. HiRet inneholder også til hjernestammen stier og PNs men viser alder avhengig integrering i corticospinal skrift neurons. Oppsummert er ryggmargen injeksjon ved hjelp av viral vektorer en egnet metode for innføring av proteiner av interesse i nevroner i målrettede traktater.
Introduction
Viral vektorer er viktige biologiske verktøy som kan innføre genetisk materiale i cellene for å kompensere for defekte gener, upregulate viktig vekst proteiner eller produserer markør proteiner som fremhever struktur og synaptic tilkoblinger av sine mål. Denne artikkelen fokuserer på direkte injeksjon av en svært effektiv retrogradely transportable lentiviral vektor i ryggmargen rotte for å markere større motor veier med fluorescerende sporing. Denne metoden er også svært hensiktsmessig for axonal regenerasjon og gjenvekst studier å innføre proteiner rundt i forskjellige befolkningsgrupper neurons og har vært brukt til taushet neurons for funksjonell kartlegging studier1,2.
Mange av de anatomiske detaljene av spinal motor var belyst gjennom direkte injeksjon studier med klassisk tracers som BDA og fluoro-gull3,4,5,6,7 , 8. disse tracers anses gull standard, men kan ha visse ulemper som opptak av skadet axons eller axons i passasjen i hvit saken rundt en injeksjon området9,10,11 . Dette kan føre til feil tolkninger av veien kan være en ulempe i gjenfødelse studier der fargestoff absorpsjon av skadet eller kuttet axons kan forveksles med regenererer fiber under senere analyse12.
Lentiviral vektorer er populære i gene terapi studier, som de gir stabil, langsiktig uttrykk i neuronal bestander13,14,15,16,17,18 ,19. Men tradisjonelt pakket lentiviral vektorer kan ha begrenset retrograd transport og kan utløse immunsystem respons når de brukes i vivo4,20,21. En høyeffektiv retrograd transport vektor kalt HiRet er produsert av Kato et al. ved å endre viral konvolutten med en rabiat virus glykoprotein å opprette en hybrid vektor som forbedrer retrograd transport22,23.
Retrograd sporing introduserer en vektor i synaptic plass av en målet Nevron, slik at det å bli tatt av cellens axon og transportert til celle kroppen. Vellykket transport av HiRet har blitt demonstrert fra neuronal synapser i hjernen av mus og primater23,24 og muskler i motor neurons22. Denne protokollen demonstrerer injeksjon i lumbal ryggmargen, spesielt rettet mot synaptic terminalene på propriospinal interneurons og hjernestammen neurons. PNs motta tilkoblinger fra mange ulike spinal veier og kan dermed brukes til å målrette en mangfoldig befolkning av nerveceller i ryggmargen og hjernestammen. Merket nerveceller i denne studien representerer kretser innervating motor neuron bassengene om hindlimb funksjon. Robust merking er sett i ryggmargen og hjernestammen, inkludert Hi-Fi detaljer om dendrittiske arbors og axon terminaler. Vi har også brukt denne metoden i tidligere studier innen cervical ryggmargen merke propriospinal og hjernestammen reticulospinal veier25.
Denne protokollen demonstrerer injeksjon av en viral vektor i lumbal ryggmargen av rotte. Som sett i filmen 1, snittet skal identifisere L1 vertebra på siste vrborden. Dette er brukt som et caudal landemerke for en 3-4 cm snitt som eksponerer muskulaturen over L1-L4 ryggmargen. Laminectomies av dorsal aspekter av T11-T13 ryggvirvlene utføres og en skrå nål er rettet 0,8 mm lateral fra midtlinjen og senket 1,5 mm dypt inn i grå substans å injisere virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle følgende kirurgiske og dyr har blitt godkjent av dyr omsorg og bruk komiteen av Temple University.
1. pre-kirurgisk forberedelser
- Forberede trakk glass nåler for viral injeksjon noen dager før operasjonen bruker 3,5 nanoliter glass kapillær Pipetter designet for nanoliter sprøytebrukere. Trekk hver pipette på en to-trinns nål avtrekker i henhold til produsentens instruksjoner å opprette to p-maler.
- Forbedre spissen av nålen malene ved å kutte av ca 1-2 mm av overflødig glass med microscissors. Mål omtrentlig blenderåpningen under et mikroskop med en mikroskop kalibrering å isolere nåler med 30-40 µm blenderåpninger.
- Med nålen på 30°, bruk en brønnene beveller opprette et tips med en 30-40 µm blenderåpning og en skrå vinkel på 45 grader. Kontrollere blenderåpning bredde med Vernier skalaen på kalibrering lysbildet. Passere vann og etanol gjennom glass nålen bruker en sprøyte med en fleksibel nål vedlegg vaske bort rusk og merke nålen regelmessig med en svart markør.
- Sett pinnene i en dekket Petriskål tidligere renset med 70% etanol og sterilisere i 30 min i biosikkerhet hette under UV-lys.
- Forberede HiRet lentivirus ved å fjerne et egnet volum fra fryseren umiddelbart før prosedyren.
Merk: En egnet volumet inneholder beløpet som er nødvendig for injeksjon (1 µL per injeksjon x antall injeksjoner) pluss litt ekstra volum rede for pipettering og lasting tap. Transportere og lagre viruset på is når den ikke er i bruk. - Klargjør injektoren ved å plugge den inn i micropump og plassere det i en micromanipulator med Vernier skala.
- Å forberede glass nålen, nøye laste et fargestoff som røde olje med en sprøyte utstyrt med en fleksibel nål. Sikre at ingen bobler forblir i nålen. Bruk steril teknikk ved håndtering av nålen, og avstå fra å berøre tuppen.
- Glass nålen inn injektoren, sikre at nålen sitter riktig i skivene injektor hetten er skrudd på stramt og stål injektor nålen er utvidet omtrent ¾ lengden på glass nålen. Virus kan lastes inn nålen i et senere trinn.
2. anestesi og kirurgisk klargjøring
- Veie dyret i digitale skala. Registrere pre-operative vekten til å finne volumet av narkosen krevde og tillate overvåking av vekt etter operasjonen. Sprague-Dawley hunnrotter ca 200-250 g brukt i denne protokollen.
- Bedøve rotta isoflurane innånding eller en innsatt ketamin/xylazine løsning (k / x). Her, injiseres ketamin intraperitoneally 67 mg/kg og xylazine på en 6,7 mg/kg dosering.
- Bekrefte en passende bedøvende flyet ved pinching foten fast. Hvis refleksiv tilbaketrekning oppstår, vente flere flere minutter før du fortsetter.
Merk: Se også kinnskjegg, øyne og pustefrekvens for underskriver av bevissthet. Hvis kinnskjegg rykning øyet blinker når rørt forsiktig og puste er rask og grunne, vente til anestesi flyet er dypere fortsette med protokollen. Også overvåke disse tegn gjennom laminectomy og injeksjon kirurgi. Hvis dyret viser et grunt bedøvende fly, administrere en booster shot av ketamin bare like til ½ opprinnelige k / x dosering. - Barbere rotta langs dorsal midtlinjen fra hoftene til dårligere vinkel av scapulae. Dra huden av dyret stram en enklere og mer nøyaktig barbering.
- Ophthalmica salve gjelde begge øynene.
- Bruke antiseptisk barberte området å sterilisere området. For det første skure, suge sterilt gasbind med 5% joden løsning og tørke bort alle hår og rusk. Følg dette med en enveis hugge med sterilt gasbind dynket i 70% etanol, slik at ingen område kontaktet to ganger. Bruke denne samme teknikken med vekslende jod og etanol-gjennomvåt gasbind to ganger mer.
3. kirurgiske feltet og instrument forberedelse
- Forberede en rekke autoklaveres kirurgiske verktøy som inkluderer en skalpell, rongeurs, rotte tann tang, våren saks, hemostats, medium punkt buet tang og retractors eller avveid kroker av pakke dem ut det sterile Bryt for å opprette et sterilt felt.
- Åpne en pakke med sterilt kirurgiske hansker og plasser den sterile hanske wrap på bordet. Bruk dette som et sterilt felt for brukte verktøy for å hindre forurensning av sterile flyten.
- Slipp en #10 skalpell blad på det sterile feltet. Sikre bladet til et håndtak med hemostats. Posisjon sterilt saltvann 4.0 chromic catgut Sutur og materialer å kontrollere blødning som en cauterizer, sterilt gasbind, steril bomull-tipped påføring (for muskel utfallende), eller gelfoam eller bonewax (for bein utfallende) i en tilgjengelig plass.
- Hente dyret og sette den på en steril klut. Plasserer gasbind under blæren samle urin. Rekvisitt opp målområdet med en rullet håndkle under abdomen. Hvis tilgjengelig, Plasser en kirurgisk varmeputen under sterilt kluten, spesielt for lengre prosedyrer.
Merk: Sterilitet er viktig i overlevelse kirurgi. Holde en sprayflaske med 70% etanol på hånden for å opprettholde sterilitet hansker hender, og en bruk perle sterilisere Hvis apparatet sterilitet er kompromittert, eller mellom individuelle operasjoner.
4. utsette virvelsøylen og identifisere webområdet laminectomy
- Identifisere området der en huden snitt vil bli gjort ved å trykke fingrene forsiktig på siste vrborden finne L1 vertebra. Bruker dette som et landemerke, gjøre en 3-4 cm huden snitt med #10 kirurgisk skalpell slutter bare underlegne L1 å avsløre muskelen. Holde huden stram ved å forsiktig spre og trykk fast med skalpell blad å sikre et rent snitt.
- Klipp og spre overfladisk fett med tang og saks Hvis nødvendig. (Avhengig av målet vertebra, kan det eller være ikke en stor feit pad overfladiske til muskel).
- Føle for spinous prosesser med flat av skalpell bladet eller en finger. Midtlinjen området blir ofte skissert av en "V" av hvite konseptet på hver side. Gjør en liten rostral kutt å tillate å ta sikkert på en øvre prosess med rotte tann tang, så gjøre 2 lang, dype kutt så nær prosessene som mulig. Det dypeste punktet på kuttet, kan dorsal overflaten av ryggsøylen merkes med skalpell blad.
- Hold laterale musklene med retractors eller avveid kroker å forbedre synligheten. Klart muskler rundt prosesser med en skalpell, våren saks eller rongeurs å bestemme formen på hodet.
Merk: Husk at ryggmargen ikke utvide hele lengden av virvelsøylen, som ryggmargen vev stopper voksende tidligere i utvikling enn bein. Dette betyr at spinal målnivået kan være under en forskjellig navn vertebra. - Finn T11 og de tilgrensende T12 og T13.
Merk: Hjelp målretting riktige ryggvirvel nivåer kan finnes i en rotte ryggmargen atlas og tidligere studier som beskriver landemerker i musen, som har en svært lik ryggvirvel struktur6,33. La en rostral spinous prosess som T9 uforstyrret å gi et midtlinjen landemerke.
5. utføre en laminectomy
- Når målet har blitt korrekt identifisert, kan du utføre laminectomies av de dorsal aspektene av T11-T13. Forsiktig spre ryggvirvlene å avsløre intervertebral leddbånd, noe som er gode steder å sette inn rongeurs for den første bit av bein. Hold rongeurs i halve-lukket posisjon til å øke fin kontroll.
- Fjerne spinous prosesser og dorsal aspektet av ryggsøylen ved å ta små biter med rongeurs. Vær forsiktig så du ikke skader i ryggmargen eller forstyrre dura. Løft litt med rotte tann tang for å dra ryggmargen fra ryggvirvlene og redusere tendensen å treffe ryggmargen vev.
- Fjerne bein bort fra midtlinjen slik at blodkaret midtlinjen kan observeres. La et vindu som tydelig viser ryggmargen vevet og er fri for rusk.
- Forsiktig trykk ryggmargen med tang. Noen dyr kan refleksivt hoppe selv om deres bedøvende flyet er dyp. Bruke noen dråper en lammende agent som lidocaine direkte på ryggmargen å hindre hoppe under innsetting prosedyren.
- Sikre dyr i spinal innehaver av festing stabiliserende tang spinous prosesser rostral og caudal vinduet laminectomy. Øke magen på dyret ved hjelp av spinal innehaveren til å oppheve effekten av pusting bevegelser. Dette vil øke p stabilitet og sikre riktig dybde av injeksjon.
6. lasting virus og posisjonering injektoren
- Legg virus i injektoren ved pipettering ca 5 µL på et stykke parafilm og plassere nålen slik at tipset i rullegardinlisten.
- Bruk micropump for å trekke opp til 4 µL av virus med en hastighet på 20-100 nL/s.
- Angi kontrolleren å injisere og slippe en liten mengde virus på p slik tuppen av nålen ikke er blokkert. Tørk av overflødig virus med et laboratorium tørke.
Merk: Hamilton sprøyte med en stål nål kan brukes som et alternativ til trakk glass pipetter. - Plasser micromanipulator slik at Vernier skalaen er synlig og plasser nålen på midtlinjen i ryggmargen.
Merk: Midtlinjen kan noen ganger bli funnet av en stor blodåre kjører på fremre overflaten av ryggmargen. Men dette kan variere i individuelle rotter, og midtlinjen målretting skal bekreftes sammenliknet med en intakt spinous prosess. - Direkte nålen lateralt 0,8 mm ved hjelp av Vernier skalaen på micromanipulator.
- Senk nålen i ryggmargen til den innrykk, men ikke punktering, dura. Bruker en rask krølle forslag, punktering dura med nålen før det har sunket til en dybde av 1,5 mm.
7. injisere virus i ryggmargen
- Når nålen er på plass, er programmet injektoren å injisere med en hastighet på 400 nL/min. Bekreft at viruset inn ryggmargen ved å observere utviklingen av fargestoff foran. Det skal ingen åpenbare lekkasje eller svulmende av ryggmargen vev. Hvis lekkasje er observert, kan dette noen ganger lindres ved å redusere injeksjon hastigheten til 200 nL/min.
- Når injeksjon er ferdig, tillate at nålen skal lande i ryggmargen i 2-5 min (avhengig av volumet injisert) å lette spredningen av virus.
- Sakte trekke nålen og Flytt til neste injeksjonsstedet. Injisere 1 µL av virus i hver av 6 likt mellomrom nettsteder ca 1 mm fra hverandre langs L1-L4 spinal vevet. P. kan brukes for hver injeksjon som det fortsetter å fungere.
8. sår lukking og post-operativ
- Dyret fra spinal abonnenten og ta ut retractors eller kroker å spre laterale muskler. Kontroller at såret er klar av alt avfall før stengetid.
- Sutur muskelen bruker en 4.0 chromic catgut Sutur. Cut Sutur tråder nær knute å redusere sannsynligheten for interne hudirritasjon.
- Stift huden lukkes med 9 mm sår klipp. For å gi optimal healing, linje opp kantene på huden før stifting.
- Plassere dyret på et vann konveksjon oppvarming pad og skjermen til våken.
- Injisere 5-10 mL steril saltoppløsning subcutaneously å etterfylle væsker og en antibiotika som cefazolin å hindre infeksjon. Når Dyret er ambulerende, sett den tilbake i buret sitt hjem og gi første smertestillende. Overvåke rotter for alle kvittere av smerte og nød og behandle ifølge IACUC godkjent prosedyren for å lindre smerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket injeksjon og transport av viral vektoren bør føre Albin på robust innbyggere ensidige nerveceller i ryggmargen og visse hjernestammen kjerner. Figur 1 viser stereotype merking av neurons og axons i thorax ryggmargen og i pontine reticular dannelsen av hjernestammen på fire uker etter injeksjon. Betydelig GFP uttrykk er sett i nervecellene i grå materie i thorax ryggmargen på side ipsilateral til injeksjon (figur 1A, innrammet område). Få neurons er også observert på kontralateral side, spesielt nær midtlinjen. I hvit substans, er GFP uttrykk observert i axons i ipsilateral ledningen (figur 1A, piler og pilspisser), spesielt i områder typisk til propriospinal axons (pilspisser). Figur 1A' viser en høyere forstørrelse av området innrammet i A, demonstrere typisk uttrykk i neuronal cellen legemer og dendrites. GFP uttrykk i neurons kan også observeres i hjernestammen kjerner som pontine reticular dannelse (figur 1B, høyere forstørrelse av området innrammet i figur 1B').
Figur 1: Albin på nerveceller i ryggmargen og hjernestammen. (A) GFP uttrykk i neurons (innrammet område), axons propriospinal neurons (pilspisser) og axons av andre områder (piler) i thorax ryggmargen. (A') Høyere forstørrelsen av neuronal uttrykk i området innrammet av A. (B) pontine reticular dannelsen i hjernestammen uttrykke GFP-merket nevroner og dendrites. (B') Høyere forstørrelse av området innrammet i B. Skalere barer: (A) = 500 μm; (B) = 1 mm; (A'), (B') = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: Rettet mot injeksjon inn i lumbar ryggmargen av rotte. Denne video Sammendrag grunnleggende målretting og injeksjon av en viral vektor i ryggmargen rotte. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk manipulasjon av nerveceller i hjernen og ryggmarg har tjent til å markere sensoriske, motoriske og autonome trasé via fluorescerende sporing og å utforske gjenvekst potensialet i nevrale trakter etter skade27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direkte injeksjon av en retrogradely transportable viral vektor i ryggmargen kan målrette neuronal bestander via deres synaptic tilkoblinger, gjør denne metoden et utmerket valg for kartlegging veier i sentralnervesystemet. HiRet vektoren viser spesielt selektiv opptak på neuronal synapse22,24,25og tidligere sporing med tilsvarende strukturert vektorer viste ingen spredd seg til skadde axons eller urelaterte celler 34 , 35, som er i samsvar med resultater med HiRet konstruere22,23,25. Dermed er direkte injeksjon av HiRet som en retrograd tracer en ideell metode for å utforske interneuronal kretser som gjennomgå plastisitet etter skader.
Det er to viktige begreper involvert i vellykkede injeksjon av en viral vektor i ryggmargen. Først er å etablere de riktige målet med glass nålen, og andre er å sikre tilstrekkelig flyt virus fra nålen inn i vevet. Som denne protokollen innebærer retrograd sporing, nødvendiggjør målretting riktige området en grundig forståelse av synaptic tilkoblinger av neuronal befolkningen av interesse. Propriospinal og reticulospinal neurons kobler til lumbale ryggmargen målrettes her. Disse neurons er spredt over hele hjernestammen og cervical og thoracic ryggmargen segmenter, med fleste PNs lokalisert til laminae V-VII i grå materie. For å sikre signaltransduksjon til en tilstrekkelig befolkning av neurons, er seks viral injeksjoner laget over et område som strekker seg over fire spinal segmenter. L1-L4 segmentene er valgt på grunn av den sentrale mønster generatorer og sine kjente forbindelser til andre områder i ryggmargen. Når de riktige spinal segment (e) og laminae er kjent, er fysiske plasseringen av disse målene via anatomiske landemerker avgjørende. Atlas viser detaljer om anatomiske struktur og ryggvirvel form kan være nyttig å bekrefte målretting landemerker8,36. Det bør bemerkes at flertallet av denne protokollen er det samme om en injeksjon eller seks er gjort; forskjellen er bare i antall spinal segmenter utsatt via laminectomy, og at du må laste glass nålen med flere virus hvis sprøytebruk mer enn 4 µL. Protokollen kan også være enkelt tilpasses for musen. Volumet av virus injisert i ledningen skal justeres nedover den mindre størrelsen, og målene som trengs for å treffe de riktige spinal laminae justert. Flere videoer av lignende operasjoner på musen har tidligere blitt publisert37,38.
Den neste hensynet er tilstrekkelig spredningen i vevet. Nøye planlegging av nålen er nødvendig for å sikre at blenderåpning er tilstrekkelig for viral suspensjon å strømme utover og at rusk blokkerer ikke spissen, og visualisere flyten på p i ryggmargen via en foran fargestoff er nyttig å bekrefte at suspensjon er gjennomtrengende vevet. Når suspensjonen er distribuert i vevet, vil opprettholde nålen i ryggmargen i 2-5 minutter sikre tilstrekkelig spredning.
Vellykket Albin på en målgruppen kan også avhenge av iboende egenskaper av viruset injisert som titer, serotype og smitte effektivitet. Vi finner en genomisk kopi titer på minst 1010 GC/mL for HiRet lentivirus å fungere godt for i vivo eksperimentering. Høyere titers eller injeksjon volumer kan vise høyere merking indeksen, men omsorg må tas siden virus kan spre ut av beregnet eller kontralateral ryggmargen. Hensynet bør også gis for vektor passer for merking celler på rente basert på deres tropism. Visse viral serotyper kan ha bedre infeksjon og signaltransduksjon priser i forskjellige populasjoner av neurons39. Tradisjonelle lentiviral vektorer er kjent for å infisere en rekke celletyper på grunn av VSV-G konvolutt protein, men endringer denne vektoren kan påvirke sin tropism40. Den HiRet konstruere endrer konvolutten ved pseudotyping med en fusion glykoprotein (FuG-B) av rabiat viruset, som tillater svært effektiv retrograd transport22,23 og er effektive i transducing propriospinal og reticulospinal traktater, med neuronal tall sammenlignes med skrift sporing via metoder som fluorogold og microruby4,41 (for detaljer om bygging av HiRet vektor se Hirano et al.) 22. men det ikke tilstrekkelig etiketten den voksne corticospinal skrift i disse eksperimentene, selv om den merke CST i nyfødte med høy effektivitet i andre studier1. Det er mulig at reseptorer nødvendig for HiRet opptak på de målrettede synapser, for eksempel NCAM eller p75NTR, er svakt uttrykt på voksen CST neurons42,43, selv om dette fortsatt blir etterforsket. I alle fall demonstrerer dette viktigheten av å avgjøre om vektoren som brukes er riktig for målrettet cellene. I dette eksperimentet, ble hjernen og ryggmarg vev behandlet og analysert etter fire uker å sikre rikelig tid til forsterkning og transport fra lumbale ledningen til alle hjernen områder. HiRet føres via rask retrograd axonal transport, og dermed en kortere eksperimentelle periode kan være riktig hvis avstanden reist er mindre, som hvis injeksjonsstedet området i cervical ryggmargen.
Direkte injeksjon kirurgi er et nyttig verktøy for innføring av viral vektor teknologi i ryggmargen. Bruk av HiRet for genetisk eksperimentering er en fordel som det tillater stabil lang varig transgene uttrykk og er giftfri til neurons. I dette eksperimentet, ble ingen GFP merking sett i nerveceller som ikke gjør direkte synaptic tilkoblinger til injeksjonsstedet området. Dette var også sant i tidligere studier i dyr med en thorax contusion skade25. I tillegg kunne HiRet-GFP ikke merke spinal motor neurons eller dorsal root ganglion neurons når injiseres i transiently demyelinated sciatic nerve (upubliserte observasjoner). Sammen tyder disse data på at HiRet ikke lett inn gjennom axons og effektivt transduces neurons ved opptak av vektoren på synapser, gir en mer detaljert og nøyaktig kart over nevrale forbindelser av målrettet befolkningen. Dette er en fordel over andre retrogradely transportable viral vektorer som retrograd adeno-assosiert virus (rAAV-retro), som er kjent for å bli tatt opp av axons i passasjen44 og gjør HiRet spesielt nyttig i studier kartlegging fornyende og kobler krets i skadet ryggmargen. Hirets fordeler kan også tillate bestemt målretting av neuronal befolkninger stanse eller ablasjon studier25,44,45,46,47.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra National Institute av nevrologiske lidelser og slag R01 R01NS103481 og Shriners sykehus for Pediatric forskning tilskudd SHC 84051 og SHC 86000 og Forsvarsdepartementet (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
