Summary
Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.
Abstract
Introdução de proteínas de interesse em células do sistema nervoso é um desafio devido às barreiras biológicas inatas que limitam o acesso à maioria das moléculas. Injeção diretamente no tecido da medula espinhal ignora estas barreiras, fornecendo o acesso aos corpos celulares ou sinapses onde moléculas podem ser incorporadas. Combinando a tecnologia de vetor viral com este método permite a introdução de genes-alvo no tecido nervoso, com a finalidade de terapia genética ou rastreamento de trato. Aqui um vírus projetado para o transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) é introduzido nas sinapses dos interneurônios propriospinal (PNs) para incentivar o transporte específico de neurônios na medula espinhal e núcleos do tronco cerebral. Direcionamento de PNs tira proveito das inúmeras conexões que recebem de vias motoras como o trato rubrospinal e reticulospinal, bem como a sua interligação com os outros ao longo de segmentos da medula espinhal. Representante rastreamento usando o vetor de HiRet com constitutivamente ativo proteína verde fluorescente (GFP) mostra detalhes de alta fidelidade de corpos celulares, axônios e mandris dendríticas no PNs torácicas e nos neurônios reticulospinal na formação reticular Pontinas. HiRet incorpora bem em vias no tronco cerebral e PNs mas mostra integração dependente de idade nos neurônios do trato corticoespinhal. Em resumo, a medula espinhal injeção usando vetores virais é um método adequado para a introdução de proteínas de interesse em neurônios de extensões específicas.
Introduction
Vetores virais são importantes ferramentas biológicas que podem introduzir material genético em células a fim de compensar os genes defeituosos, proteínas de crescimento importante upregulate ou fabricar proteínas marcador que destacam a estrutura e as conexões sinápticas de seus alvos. Este artigo enfoca a injeção direta de um vetor de Lentivirus retrogradely transportável altamente eficiente para a medula espinhal de ratos a fim de destacar os principais vias motoras com rastreamento fluorescente. Esse método também é altamente adequado para estudos de regeneração e crescimento axonal introduzir proteínas de interesse em diversas populações de neurônios e tem sido usado para silenciar os neurônios para estudos de mapeamento funcional1,2.
Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras da coluna vertebral foram elucidados através de estudos de injeção direta com marcadores clássicos como BDA e fluoro-ouro3,4,5,6,7 , 8. estes marcadores são considerados padrão-ouro, mas podem ter alguns inconvenientes tais como captação por axônios danificados ou axônios na passagem na substância branca em torno de uma injeção local de9,10,11 . Isto poderia levar a interpretações incorrectas de conectividade via e pode ser uma desvantagem em estudos de regeneração onde a absorção de corante por axônios danificados ou cortados poderia ser confundida com regenerar fibras durante a posterior análise12.
Vetores de Lentivirus são populares em estudos de terapia de gene, que proporcionam uma expressão estável, a longo prazo em populações neuronal13,14,15,16,17,18 ,19. No entanto, tradicionalmente embalados vetores Lentivirus pode ter limitado transporte retrógrado e podem desencadear a resposta do sistema imunológico quando usado na vivo4,20,21. Um vetor de transporte retrógrado altamente eficiente, denominado HiRet foi produzido por Kato et al., modificando o envelope viral com uma glicoproteína do vírus da raiva para criar um vetor de híbrido que melhora o transporte retrógrado22,23.
Rastreamento retrógrado introduz um vetor no espaço sináptico de um neurônio alvo, permitindo que ele seja retomado pelo axônio da célula que e transportados para o corpo celular. Transporte bem sucedido de HiRet foi demonstrada de sinapses neuronais no cérebro de ratos e primatas23,24 e do músculo em neurônios motores22. Este protocolo demonstra injeção na medula espinhal lombar, alvejando especificamente os terminais sinápticos dos propriospinal interneurônios e neurônios do tronco cerebral. PNs recebem conexões de muitos diferentes caminhos da coluna vertebral e, assim, podem ser utilizados para atingir uma população diversa de neurônios na medula espinhal e tronco cerebral. Rotulada de neurônios neste estudo representam circuitos que inervam o neurônio motor piscinas relativas a função motora do membro posterior. Etiquetando robusto é visto na medula espinhal e tronco cerebral, incluindo detalhes de alta fidelidade de mandris dendríticas e axônio terminal. Também usamos este método em estudos anteriores no interior da medula espinhal cervical para rotular propriospinal e tronco cerebral reticulospinal vias25.
Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral na medula espinhal lombar de um rato. Como visto no filme 1, identificando a vértebra L1 localizada da última costela, destina-se a incisão. Isso é usado como um marco de caudal para uma incisão de 3-4 cm que expõe a musculatura ao longo da medula espinhal de L1-L4. Laminectomies dos aspectos dorsais das vértebras T11-T13 são executadas e uma agulha de vidro chanfrado é dirigida a 0.8 mm lateral da linha média e baixou 1,5 mm profundamente na matéria cinzenta para injetar o vírus.
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Protocol
Todos os procedimentos de cuidados cirúrgicos e animais a seguir foram aprovados pelo Animal cuidados e uso Comitê da Temple University.
1. pré-cirúrgicas preparações
- Prepare-se agulhas de vidro puxado para injeção viral alguns dias antes da cirurgia usando 3,5 nanolitros capilar pipeta de vidro projetada para injetores de nanolitros. Puxe cada pipeta um puxador de agulha de duas etapas de acordo com as instruções do fabricante para criar dois modelos de agulha.
- Refine a dica dos modelos de agulha cortando aproximadamente 1-2 mm do excesso de vidro com micro-tesouras. Tamanho de abertura aproximada de medida sob um microscópio com uma lâmina de microscópio de calibração para isolar as agulhas com aberturas de 30-40 µm.
- Com a agulha posicionada em 30°, use um chanfrador micropipeta para criar uma ponta com um 30-40 µm abertura e um ângulo de 45° chanfrada. Verifique se a largura de abertura com a escala Vernier do slide de calibração. Passe água e etanol através da agulha de vidro usando uma seringa com um acessório de agulha flexível para lavar os restos e marcar a agulha em intervalos regulares com um marcador preto.
- Coloque as agulhas em um prato coberto de Petri previamente limpado com 70% de etanol e esterilizar por 30 min em uma capa de biossegurança sob luz UV.
- Prepare HiRet lentivirus removendo um volume adequado do freezer imediatamente antes do procedimento.
Nota: Um volume adequado inclui a quantidade necessária para a injeção (1 µ l por injecção x número de injeções) e mais uma pequena quantidade de volume extra para dar conta pipetagem e perdas de carga. Transportar e armazenar o vírus no gelo quando não estiver em uso. - Prepare o injector, conectá-lo à microbomba e colocá-lo em um micromanipulador com escala Vernier.
- Para preparar a agulha de vidro, com cuidado, carregar um corante colorido como óleo vermelho com uma seringa, equipado com uma agulha flexível. Certifique-se de que não há bolhas permanecem na agulha. Utilizar técnica asséptica ao manusear a agulha e abster-se de tocar a ponta.
- Insira a agulha de vidro o injector, garantindo que a agulha está encaixada corretamente para as anilhas, tampa do injector é na apertadas e estende-se a agulha de aço injector aproximadamente ¾ do comprimento da agulha vidro. Vírus podem ser carregado na agulha em uma etapa posterior.
2. anestesia e preparação do local cirúrgico
- Pese o animal em uma balança digital. Registro do peso pré-operatório para determinar o volume de anestésico necessário e para permitir o acompanhamento do pós-operatório de peso. Femininos ratos Sprague-Dawley cerca de 200 – 250 g foram utilizados no presente protocolo.
- Anestesiar o rato usando uma solução de xilazina/cetamina injetada ou inalação de isoflurano (k / x). Aqui, a cetamina é injetada intraperitonealmente em 67 mg/kg de xilazina com uma dose de 6,7 mg/kg.
- Confirme um plano adequado de anestesia por beliscar o pé firmemente. Se ocorrer retirada reflexiva, espere alguns minutos adicionais antes de prosseguir.
Nota: Também observe os bigodes, olhos e taxa de respiração de sinais de consciência. Se os bigodes são espasmos, o olho pisca quando tocou suavemente, ou respiração é rápida e superficial, espere até que o plano anestésico é mais profundo para prosseguir com o protocolo. Também monitore estes sinais durante a cirurgia de laminectomia e injeção. Se o animal exibe um plano superficial de anestesia, administrar uma injeção de cetamina somente igual a ½ o original k / x dosagem. - Raspe o rato ao longo da linha média dorsal dos quadris para o ângulo inferior das escápulas. Puxe a pele do animal esticada para um barbear mais fácil e mais preciso.
- Aplica a pomada oftálmica de ambos os olhos.
- Aplica anti-séptico para a área depilada para esterilizar o local. Para o esfoliante primeiro, embeba gaze estéril com uma solução de iodo 5% e limpe afastado todo o cabelo e detritos. Siga isto com um furto unidirecional com gaze estéril embebida em álcool 70%, para que nenhuma área é contactada duas vezes. Use essa mesma técnica com a alternância de iodo e gaze embebida em álcool etílico mais duas vezes.
3. cirúrgico campo e instrumento de preparação
- Prepare um conjunto de instrumentos cirúrgicos esterilizados em autoclave que incluem um bisturi, ruginas, pinça dente de rato, tesoura de mola, hemostatos, fórceps de ponto médio curvado e retractores ou ganchos ponderados por desembrulhar o envoltório estéril para criar um campo estéril.
- Abrir um pacote de luvas cirúrgicas estéreis e colocar o envoltório da luva estéril sobre a mesa. Use isto como um campo estéril adicional para ferramentas usadas para evitar a contaminação do envoltório estéril.
- Solte uma lâmina de bisturi de #10 no campo estéril. Fixe a lâmina de um identificador com hemostatos. Soro fisiológico estéril de posição, 4,0 sutura catgut crómico e materiais para controle do sangramento como um cauterizador, gaze estéril, estéril aplicadores com ponta de algodão (para hemorragias musculares), ou gelfoam ou bonewax (para sangramentos de osso), em local acessível.
- Recuperar o animal e defini-la em um pano estéril. Coloque gaze por baixo da bexiga para coletar a urina. Escorar a área do alvo com uma toalha enrolada sob o abdômen. Se estiver disponível, coloque uma compressa cirúrgica por baixo do pano estéril, especialmente para procedimentos mais longos.
Nota: A esterilidade é importante durante a cirurgia de sobrevivência. Mantenha uma garrafa de spray de etanol a 70% na mão para manter a esterilidade de mãos enluvadas e um esterilizador de grânulo de uso se a esterilidade do instrumento está comprometida, ou entre cirurgias individuais.
4. expor a coluna vertebral e identificando o site laminectomia
- Identifica a área onde uma incisão de pele será feita pressionando suavemente os dedos da última costela para localizar a vértebra L1. Usando isto como um marco, faça uma incisão de pele de 3-4 cm com um bisturi cirúrgico #10 terminando apenas inferior ao L1 para expor o músculo. Estique a pele espalhando suave e pressione firmemente com a lâmina de bisturi para garantir uma incisão limpa.
- Corte e espalhar a gordura superficial com fórceps e a tesoura, se necessário. (Dependendo da vértebra alvo, lá pode ou não ser um grande do tecido superficial ao músculo).
- Sente-se para os processos espinhosos com o apartamento de um dedo ou a lâmina de bisturi. Muitas vezes a área de linha média vai ser esboçada por um "V" da fáscia branco em ambos os lados. Fazer um pequeno corte rostral para permitir espaço agarrar firmemente um processo superior com pinça dente de rato e, em seguida, fazer 2 cortes longas e profundas mais próximo dos processos quanto possível. No ponto mais profundo do corte, a superfície dorsal das vértebras pode ser sentida com a lâmina de bisturi.
- Mantenha os músculos laterais lado com retractores ou ganchos ponderados para melhorar a visibilidade. Clara muscular em torno dos processos com um bisturi, tesoura de mola ou ruginas para determinar a forma de suas cabeças.
Nota: Lembre-se que a medula espinhal não abrange todo o comprimento da coluna vertebral, como paradas de tecido de medula espinhal crescendo mais cedo no desenvolvimento do osso. Isto significa que o nível da coluna vertebral do alvo pode ser por baixo de uma forma diferente nomeada vértebra. - Localize a T11 e os processos de T12 e T13 adjacentes.
Nota: A assistência no direcionamento corretos níveis vertebrais pode ser encontrada em anteriores estudos delineando Marcos no mouse, que tem um muito semelhante e um atlas da medula espinhal de ratos estrutura vertebral6,33. Um processo espinhoso rostral como T9 deixe intacta a dar um marco na linha média.
5. executar uma laminectomia
- Uma vez que o alvo foi identificado corretamente, execute laminectomies aspectos dorsal do T11-T13. Espalhe suavemente as vértebras para revelar os ligamentos intervertebrais, que são bons locais para inserir ruginas para a mordida inicial do osso. Segure as ruginas numa posição semi-cerrados para aumentar o controle fino.
- Remova os processos espinhosos e a face dorsal das vértebras, tendo pequenas mordidas com as ruginas. Tenha cuidado para não danificar a medula espinhal ou perturbar a dura-máter. Levante ligeiramente com a pinça dente de rato para ajudar a puxar a medula espinhal, longe das vértebras e diminuir a tendência de bater o tecido da medula espinhal.
- Limpe osso fora da linha média para que o vaso sanguíneo da linha média pode ser observado. Deixe uma janela que claramente mostra o tecido da medula espinhal e é livre de detritos.
- Toca suavemente a medula espinhal com fórceps. Alguns animais podem pular reflexivamente mesmo se seu plano anestésico é profundo. Aplica algumas gotas de um anestésico como a lidocaína diretamente para a medula espinhal para evitar saltar durante o procedimento de injeção.
- Prenda o animal em um suporte da coluna vertebral, estabilização fórceps para processos espinhosos rostrais e caudais para a janela de laminectomia de fixação. Levante o abdômen do animal usando o titular da coluna vertebral para anular o efeito de movimentos de respiração. Isto aumentará a agulha estabilidade e garantir a adequada profundidade de injeção.
6. carregar vírus e posicionamento do injector
- Carregar vírus para o injector de pipetagem aproximadamente 5 µ l em um pedaço de parafilm e posicionando a agulha para que a ponta está dentro da gota.
- Use a microbomba para retirar até 4 µ l do vírus a uma taxa de 20-100 nL/s.
- Coloque o controlador para injetar e liberar uma quantidade pequena de vírus da agulha para garantir que a ponta da agulha não está bloqueada. Limpe o excesso vírus com uma limpeza de laboratório.
Nota: Uma seringa com uma agulha de aço de Hamilton pode ser usada como uma alternativa para pipetas de vidro puxado. - Posicione o micromanipulador, de modo que a escala Vernier é visível e posicione a agulha à linha média da medula espinhal.
Nota: A linha média às vezes pode ser localizada por um grande vaso sanguíneo, correndo na superfície anterior da medula espinhal. No entanto, isso pode variar em ratos individuais e direcionamento da linha média deve ser confirmada por comparação com um processo espinhoso intacto. - Direto da agulha lateralmente por 0,8 mm, utilizando a escala Vernier sobre o micromanipulador.
- Abaixe a agulha até a medula espinhal até é recuo, mas não à punção, a dura-máter. Usando um rápido movimento de torção, perfure a dura-máter com a agulha até que tem afundado a uma profundidade de 1,5 mm.
7. injectar vírus da medula espinhal
- Quando a agulha estiver em vigor, programa o injector para injetar a uma taxa de 400 nL/min. confirmar que o vírus está entrando a medula espinhal, observando o andamento da parte dianteira de tintura. Deve haver nenhum escapamento óbvio ou abaulamento do tecido da medula espinhal. Se for observado vazamento, isso às vezes pode ser atenuado, reduzindo a velocidade de injeção para 200 nL/min.
- Finalizada a injeção, permitir que a agulha descansar na medula espinhal por 2 – 5 min (dependendo do volume injetado) para facilitar a difusão do vírus.
- Lentamente, retirar a agulha e mover para o próximo local da injeção. Injete 1 µ l de vírus em cada um dos 6 sites uniformemente espaçados aproximadamente 1 mm de distância ao longo do comprimento do tecido na coluna L1-L4. A mesma agulha pode ser utilizada para cada injecção, enquanto continua a funcionar corretamente.
8. fechamento e pós-operatório cuidados da ferida
- Remova o animal do suporte da coluna vertebral e tirar retractores ou ganchos utilizados para espalhar o músculo lateral. Certifique-se de que a ferida é clara de todos os detritos antes de fechar.
- Suture o músculo usando uma sutura catgut crómico 4.0. Corte fios de sutura, perto do nó para reduzir a probabilidade de irritação da pele interna.
- Grampeie a pele fechada usando clipes de 9mm a ferida. Para permitir a cura ideal, alinhe as bordas da pele antes de grampeamento.
- Coloque o animal em uma convecção da água aquecimento pad e monitor até sono.
- Injete 5 – 10 mL de solução salina estéril por via subcutânea para repor líquidos e um antibiótico como a cefazolina para prevenir a infecção. Quando o animal é ambulatório, colocá-lo de volta à sua jaula em casa e fornecer analgésicos iniciais. Monitorar os ratos para qualquer sinal de dor e angústia e tratar de acordo com seu procedimento IACUC aprovado para alívio da dor.
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Representative Results
Bem sucedida injeção e transporte do vetor viral devem resultar na transdução de uma população robusta de unilaterais neurônios na medula espinhal e em certos núcleos do tronco cerebral. A Figura 1 demonstra rotulagem estereotipada dos neurônios e axônios na medula espinhal torácica e na Pontinas formação reticular do tronco cerebral no pós-injeção de quatro semanas. Expressão significativa de GFP é visto nos neurônios na massa cinzenta da medula espinhal torácica no lado ipsilateral à injecção (figura 1A, área in a box). Alguns neurônios são também observados no lado contralateral, especialmente perto da linha mediana. Na substância branca, expressão de GFP é observada em axônios na medula ipsilateral (figura 1A, flechas e pontas de seta), especialmente em áreas típica de axônios propriospinal (setas). Figura 1A' mostra uma maior ampliação da área de box em A, demonstrando típica expressão neuronais corpos celulares e dendritos. Expressão de GFP em neurônios também pode ser observada em núcleos do tronco cerebral como a formação reticular Pontinas (figura 1B, maior ampliação da área de box em figura 1B').
Figura 1: transdução de neurônios na medula espinhal e tronco cerebral. (A) GFP expressão em neurônios (área in a box), axônios de neurônios propriospinal (setas) e de outras áreas (setas) na medula espinhal torácica. (A') Maior ampliação da expressão neuronal na área de box de r. (B) a formação reticular Pontinas no tronco cerebral expressando dendrites e GFP-etiquetado neurônios. (B') Maior ampliação da área de box em B. Barras de escala: (A) = 500 μm; (B) = 1 mm; (A'), (B') = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Visando a injeção na medula espinhal lombar do rato. Este vídeo resumos as noções básicas da segmentação e a injeção de um vetor viral na medula espinhal de ratos. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Manipulação genética de neurônios do cérebro e da medula espinhal tem servido para destaque sensorial, motor e autonômicos caminhos via rastreamento fluorescente e para explorar o potencial de rebrota dos tratos neuronais após lesões27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direto a injeção de um vetor viral retrogradely transportável na medula espinhal pode ter como alvo populações neuronais através de suas conexões sinápticas, tornando este método uma excelente escolha para vias de mapeamento no sistema nervoso central. O vetor de HiRet mostra especificamente a absorção seletiva na sinapse neuronal22,24,25e rastreamento anterior com vetores da mesma forma estruturadas não mostrou nenhuma propagação em axônios feridos ou células independentes 34 , 35, que é consistente com resultados apresentando o HiRet construir22,23,25. Assim, a injeção direta de HiRet como um traçador retrógrado é um método ideal para explorar interneuronal circuitos que passam por plasticidade após lesão.
Existem dois conceitos críticos envolvidos no sucesso injeção de um vetor viral na medula espinhal. O primeiro é estabelecer o alvo correto com a agulha de vidro, e o segundo é garantir o fluxo adequado do vírus da agulha no tecido. Como este protocolo envolve rastreamento retrógrado, direcionando a área correta exige uma compreensão completa das conexões sinápticas da população neuronal de interesse. Neurônios Propriospinal e reticulospinal, conexão com a medula espinhal lombar são alvo aqui. Estes neurônios espalhados por todo o tronco encefálico e segmentos da medula cervical e torácica, com a maioria dos PNs localizadas para lâminas V-VII dentro a massa cinzenta. Para garantir a transdução de uma população adequada de neurônios, seis injecções virais são feitas sobre uma área abrangendo quatro segmentos da coluna vertebral. Os segmentos de L1-L4 são escolhidos devido à presença de geradores de padrão central e suas conexões conhecidas para outras áreas da medula espinhal. Uma vez que os segmentos da coluna vertebral corretos e lâminas são conhecidas, localização física dessas metas através de pontos anatômicos é crucial. Atlas mostrando detalhes da estrutura anatômica e forma vertebral podem ser úteis para confirmar o direcionamento Marcos8,36. Deve-se notar que a maioria deste protocolo permanece a mesma se uma injeção ou seis são feitas; a diferença é apenas no número de segmentos da coluna vertebral exposta através de laminectomia e o fato de que você precisa recarregar a agulha de vidro com vírus adicionais se injetando mais de 4 µ l. O protocolo também pode ser facilmente adaptado para o mouse. Devido ao seu menor tamanho, o volume de vírus injetado o cabo deve ser ajustado para baixo e as medidas necessárias para bater as lâminas da coluna vertebral corretas ajustada. Vários vídeos de cirurgias semelhantes no mouse foram anteriormente publicados37,38.
A próxima consideração é adequada difusão no tecido. A preparação cuidadosa da agulha é necessária para garantir que a abertura é suficiente para a suspensão viral a fluir para o exterior e que os restos não bloqueia a ponta, e visualização do fluxo da agulha para a medula espinhal através de uma frente de tintura colorida é útil para confirmar que a suspensão está penetrando o tecido. Uma vez que a suspensão foi distribuída no tecido, mantendo a agulha no interior da medula espinhal para 2-5 minutos irá garantir a difusão adequada.
Transdução de sucesso de uma população-alvo também pode depender de propriedades intrínsecas do vírus injetado como título, sorotipo e infecção de eficiência. Encontramos um título de genômica cópia de pelo menos 1010 GC/mL para HiRet lentivirus funcionar bem para a experimentação in vivo. Maior concentração ou volumes de injeção podem mostrar maior índice de rotulagem, mas cuidado deve ser tomado uma vez que o vírus poderiam difundir fora da área pretendida ou na medula espinhal contralateral. Deve também considerar o tipo de vetor apropriado para rotulagem de células de interesse, com base no seu tropismo. Certos sorotipos virais podem ter melhor infecção e taxas de transdução em diferentes populações de neurônios39. Vetores de Lentivirus tradicionais são conhecidas por infectar uma ampla gama de tipos de células, devido a proteína de envelope de VSV-G, no entanto, as modificações a este vetor podem influenciar seu tropismo40. A construção de HiRet modifica o envelope por pseudotyping com uma glicoproteína de fusão (FuG-B) do vírus da raiva, que permite o transporte retrógrado altamente eficiente22,23 e é eficaz em transducing propriospinal e tratos reticulospinal, com números neuronais comparáveis ao rastreamento do trato através de métodos como fluorogold e microruby4,41 (para detalhes da construção da Sé vector HiRet Hirano et al.) 22. no entanto, ele não suficientemente rotular o trato corticoespinhal adulto nesses experimentos, embora que rotular o CST em recém-nascidos com alta eficiência em outros estudos1. É possível que os receptores necessários para a absorção de HiRet nas sinapses específicas, tais como NCAM ou p75NTR, são apenas fracamente expressado em adultos CST neurônios42,43, embora isto ainda está sendo investigado. De qualquer forma, isso demonstra a importância de determinar se o vetor a ser utilizado é apropriado para as células alvo. Neste experimento, cérebro e medula espinhal tecido foram processados e analisados depois de quatro semanas para garantir tempo abundante para amplificação e transporte da medula lombar para todas as áreas do cérebro. HiRet é transportado através do transporte axonal retrógrado rápido, e, portanto, a redução do período experimental pode ser apropriado se a distância percorrida é menor, como se a área de injeção é na medula espinhal cervical.
Cirurgia de injeção direta é uma ferramenta útil para a introdução da tecnologia de vetor viral na medula espinhal. Usar de HiRet para experiências genéticas é vantajosa, pois permite estável, muito duradoura expressão do transgene e não é tóxico para os neurônios. Neste experimento, sem rotulagem de GFP foi visto nos neurônios que não fazem directas conexões sinápticas para a área de injeção. Isso também foi verdadeiro em estudos anteriores em animais com uma lesão de contusão torácica25. Além disso, HiRet-GFP foi incapaz de rotular espinhais neurônios motores ou neurônios do gânglio de raiz dorsal quando injetado o nervo ciático transitoriamente desmielinizado (observações não publicadas). Juntos, esses dados sugerem que a HiRet não entra facilmente através de axônios e eficientemente transduces neurônios pela utilização do vetor em sinapses, fornecendo um mapa mais detalhado e de alta-fidelidade de conexões neuronais da população alvo. Isso é uma vantagem sobre outros vetores virais retrogradely transportáveis como retrógrada vírus adeno-associado (rAAV-retro), que é conhecido por ser tomadas pelos axônios na passagem44 e faz HiRet especialmente útil em estudos de mapeamento de regeneração e reconectando o circuito na medula espinhal lesada. Vantagens do HiRet podem também permitir direcionamento específico das populações neuronais para silenciar ou ablação estudos25,44,,45,46,47.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma concessão do Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso R01 R01NS103481 e o Shriners Hospital para investigação pediátrica concede SHC 84051 e SHC 86000 e o departamento de defesa (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
