Summary
Этот протокол демонстрирует инъекции retrogradely переносные вирусный вектор в ткани спинного мозга крысы. Вектор take up в синапсе и перевезены в клетки тела нейронов целевой. Эта модель подходит для ретроградного отслеживания важных путей спинного мозга или ориентации клетки для генной терапии приложений.
Abstract
Представляя протеинов интереса в клетки нервной системы является сложной задачей из-за врожденной биологические барьеры, которые ограничивают доступ к большинство молекул. Инъекции непосредственно в ткани спинного обходит эти барьеры, обеспечивая доступ к Сотовые органов или синапсов, где молекулы могут быть включены. Сочетание вирусных векторной технологии с помощью этого метода позволяет для внедрения целевых генов в нервной ткани для генной терапии или тракта трассировки. Здесь вирус инженерии для высокоэффективных Ретроградная транспорта (HiRet) вводится в синапсах propriospinal интернейронов Латвийской почты (PNs) для поощрения конкретных видов транспорта для нейронов спинного мозга и ядрах ствола головного мозга. Ориентация ПНС использует многочисленные соединения, которые они получают из мотора, таких как rubrospinal и вставочные участки, а также их взаимосвязи друг с другом на протяжении сегментов спинного мозга. Представитель трассировки с помощью вектора HiRet с конститутивно активных Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) показывает высокоточных деталей органов ячейки, аксоны и дендритных беседки в грудной ПНС и вставочные нейроны в Понтийские ретикулярной формации. HiRet включает в себя хорошо в пути ствола мозга и ПНС, но показывает возраст зависит от интеграции в кортикоспинальных путей нейронов. В целом спинного инъекций с использованием вирусных векторов является подходящим методом для внедрения протеинов интереса в нейроны целевых участков.
Introduction
Вирусных векторов являются важными биологического инструментами, которые можно ввести генетического материала в клетки для того чтобы компенсировать дефектных генов, upregulate существенный рост белки или производство маркер белки, которые подчеркивают структуру и синаптических связей их цели. Эта статья посвящена прямым впрыском высокоэффективных retrogradely переносные лентивирусные вектора в спинной мозг крыс для того чтобы выделить основные моторные пути с флуоресцентные трассировки. Этот метод также является весьма уместным для аксональное регенерации и отрастания исследований ввести протеинов интереса в разнообразных популяций нейронов и был использован для замолчать нейронов для сопоставления функциональных исследований1,2.
Многие анатомические детали позвоночника моторные пути были выяснены путем прямого впрыска исследований с классической Трейсеры как BDA и фтор золото3,4,5,6,7 , 8. Эти Трейсеры считаются золотой стандарт, но может иметь определенные недостатки, такие, как поглощение повреждения аксонов, или аксоны в проход в белого вещества, окружающих инъекции сайта9,10,11 . Это может привести к неправильной интерпретации путь подключения и может быть недостаток в регенерации исследования где поглощение красителя поврежденные или отрезанные аксоны может быть ошибочно принято за регенерирующее волокна во время последующего анализа12.
Лентивирусные векторы популярны в генной терапии исследований, поскольку они обеспечивают стабильные, долгосрочные выражение в нейрональных популяций13,14,,1516,17,18 ,19. Тем не менее, традиционно упакованных лентивирусные векторы могут ограничили Ретроградная транспорта и может вызвать реакцию иммунной системы при использовании в естественных условиях4,,2021. Высоко эффективная Ретроградная транспорта вектор называется HiRet был подготовлен по Kato et al., изменяя вирусный конверт с гликопротеин вирус бешенства для создания гибридных вектор, который улучшает Ретроградная транспорта22,23.
Ретроградная трассировки представляет вектор в синаптических пространство целевого нейрона, позволяя ему быть принятые этой ячейки аксона и перевезены в клетки тела. Успешной перевозки HiRet была продемонстрирована из нейрональных синапсах в мозг мышей и приматов23,24 и мышцы в двигательных нейронов22. Этот протокол демонстрирует инъекции в поясничного отдела спинного мозга, предназначенная специально для синаптических терминалы propriospinal интернейронов и нейронов мозга. ПНС получать соединения от многих различных путей спинного мозга и таким образом могут быть использованы для различных слоев населения нейронов спинного мозга и ствола мозга. Приклеенные этикетку нейронов в этом исследовании представляют цепей, иннервирующих мотонейрона бассейны, связанных с моторной функции задних конечностей. Надежной маркировки рассматривается в спинного мозга и ствола мозга, включая высокой четкости деталей дендритных беседки и аксон терминалов. Мы также использовали этот метод в предыдущих исследованиях в рамках шейного отдела спинного маркировать propriospinal и ствола мозга вставочные пути25.
Этот протокол демонстрирует инъекции вирусный вектор в поясничного отдела спинного мозга крысы. Как видно в кино 1, разрез является мишенью для выявления L1 позвонка, расположенный у последнего ребра. Это используется в качестве хвостовой вехой для 3-4 см разрез, предоставляющий мускулатура через спинной мозг L1-L4. Laminectomies спинной аспектов T11-T13 позвонков, выполняются и скошенные стеклянные игла направлена 0,8 мм сбоку от средней линии и опустил 1,5 мм глубоко в сером веществе придать вирус.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все следующие хирургические и животных ухода процедуры были одобрены Уход за животными и использование комитета университета Темпл.
1. предварительно хирургические препараты
- Подготовьте вытащил стекла иглы для вирусных инъекций за несколько дней до операции, используя 3,5 nanoliter стекла капиллярные пипетки предназначены для nanoliter форсунок. Тяните каждый дозатор иглы съемник двухэтапный согласно инструкциям производителя для создания двух шаблонов иглы.
- Уточните кончик иглы шаблонов, отрезав примерно 1-2 мм излишки стекла с microscissors. Мера приблизительное диафрагмы под микроскопом с калибровки микроскопа изолировать иглы с отверстиями 30-40 мкм.
- С иглой, дислоцированные в 30° используйте микропипеткой beveller для создания подсказка с 30-40 мкм диафрагмы и скошенный угол 45°. Проверка ширины диафрагмы с нониуса масштаба на слайде калибровки. Пройти через стеклянный иглу с помощью шприца с насадкой гибкой иглой смыть мусора и Марк иглы на регулярной основе с черным маркером воды и этанола.
- Иглы в крытой Петри, ранее очищен с 70% этанола и стерилизовать 30 мин в капюшоне биобезопасности под УФ светом.
- Подготовка HiRet человека, удалив соразмерную громкость из холодильника непосредственно перед процедурой.
Примечание: Соразмерную громкость включает суммы, необходимой для инъекций (1 мкл на инъекцию x количество инъекций) плюс небольшое количество дополнительного объема для учета закупорить и погрузка потерь. Перевозить и хранить вирус на льду когда не в пользе. - Подготовьте инжектор, подключить его в микронасосом и поместив его в микроманипулятор с нониуса масштаба.
- Подготовить стеклянных иглу, тщательно загрузить цветной краситель например Красного масла с помощью шприца оснащен гибкой иглой. Убедитесь, что нет пузырьков остаются в иглу. Используйте асептические технику при обращении с иглой и воздерживаться от прикосновения кончика.
- Вставить иглу стекла в инжектор, обеспечивающ что игла установлена правильно в шайбы, форсунки колпачок ввинчивается на жесткой, и стали инжектор иглу распространяется приблизительно на ¾ длины иглы стекла. Вирус может быть загружена в иглу на более позднем этапе.
2. анестезии и хирургических сайт подготовка
- Вес животного на цифровой шкале. Запись предоперационное вес для определения объема необходимых анестетика и для контроля веса после хирургии. Самок Sprague-Dawley приблизительно 200 – 250 g использовались в настоящем Протоколе.
- Анестезировать крыс с помощью изофлюрановая ингаляции или вводят раствора кетамина/Ксилазина (k / x). Здесь кетамин внутрибрюшинно вводили в 67 мг/кг и ксилазина в дозировке 6,7 мг/кг.
- Подтвердите соответствующие анестетиков плоскости, щипать ноги твердо. Если рефлексивного выхода происходит, подождите несколько дополнительных минут, прежде чем продолжить.
Примечание: Также наблюдать за усы, глаза и частота дыхания для признаков сознания. Если подергивания усы, глаз мигает, когда коснулся нежно, или дыхание быстрое и неглубокие, подождите, пока плоскости обезболивающий глубже приступить к протоколу. Также контролировать эти знаки на протяжении Ламинэктомия и инъекции хирургии. Если животное показывает мелкой обезболивающий плоскости, администрировать руля выстрел кетамин только равный ½ оригинальный k / x дозировки. - Бритье крыса вдоль спинной midline от бедра до нижнего угла лопатки. Потяните кожу животного тугой легче и более точного бритья.
- Применить глазная мазь для обоих глаз.
- Применяются антисептические бритая район для стерилизации на сайте. Для первого скраб Замочите марлевый стерильный раствор 5% йода и стереть прочь все волосы и мусор. Следить за этим с однонаправленной пальцем с стерильной марлей, пропитанной 70% этиловом спирте, таким образом, чтобы ни один район направляется дважды. Используйте эту же технику с чередующимися йода и этанола, пропитанной марлевые вдвое больше.
3. хирургического поля и инструмент подготовки
- Подготовьте набор газобетона хирургических инструментов, которые включают скальпель, rongeurs, Крысиный зуб щипцы, Весна ножницы, hemostats, средней точки Изогнутый пинцет и ретракторы или взвешенных крюки развертки стерильных обертывание для создания поля, стерильный.
- Откройте пакет стерильные хирургические перчатки и поместите обернуть стерильных перчаток на столе. Используйте это в качестве дополнительного стерильные поля для используемых инструментов для предотвращения загрязнения запасов стерильных wrap.
- Перетащите поле стерильным лезвием скальпеля #10. Закрепите лезвие на ручку с hemostats. Позиция стерильного физиологического раствора, 4.0 Хромовой Кетгуд шов и материалы для контроля кровотечения, таких как cauterizer, стерильную марлю, стерильным ватным наконечником аппликаторы (для мышц кровоточит), или gelfoam или bonewax (для костей кровоточит) в доступном месте.
- Получить животных и установите его на стерильной тканью. Поместите марлю под мочевого пузыря для сбора мочи. Подпирать целевой области с проката полотенце под живот. Если возможно, место хирургические грелку под стерильной тканью, особенно для больше процедур.
Примечание: Бесплодие имеет важное значение во время хирургии выживания. Держите бутылку спрей под рукой, чтобы поддерживать стерильность перчатках, и использование бисера стерилизатор если стерильность инструмента компрометации, или между отдельными операций на 70% спирте.
4. выявление позвоночника и выявления Ламинэктомия сайт
- Определите области, где разрез кожи будут приниматься путем нажатия пальцами нежно последнего ребра найти L1 позвонка. Используя это в качестве ориентира, делают разрез кожи 3-4 см с #10 хирургическим скальпелем заканчивается просто уступает L1 подвергать мышцы. Придерживайте кожу подтянутой распространяя нежный и зафиксируйте с лезвием скальпеля для обеспечения чистого разреза.
- Вырезать и распространение поверхностный жир с щипцы и ножницы, в случае необходимости. (В зависимости от целевой позвонка, там может быть или не быть большой жировой ткани, поверхностные мышцы).
- Почувствовать остистого отростка с плоским лезвием скальпеля или палец. Часто будет озвучена срединная область «V» белый фасции с обеих сторон. Сделайте небольшой надрез ростральной разрешить обслуживание надежно ухватиться верхней процесс пинцетом крысиный зуб, а затем сделать 2 длинные, глубокие порезы как можно ближе к процессы как можно скорее. В глубокой точке разреза спинной поверхности позвонков может ощущаться с лезвием скальпеля.
- Держите боковые мышцы сторону с ретракторы или взвешенных крючки для улучшения видимости. Четкие мышцы вокруг процессов с скальпель, Весна ножницы или rongeurs чтобы определить форму головы.
Примечание: Помните, что спинного мозга не распространяется полная длина позвоночника, как спинного тканей останавливается растет ранее в развитии чем кости. Это означает, что целевой уровень спинного мозга могут быть под по-разному именем позвонка. - Найдите T11 и смежные процессы T12 и T13.
Примечание: Помощь в ориентации правильные позвоночного уровня можно найти в Атлас спинного мозга крыс и предыдущих исследований, описанием достопримечательностей в мышь, которая имеет очень похожи позвоночных структура6,33. Оставьте ростральной остистого отростка, например T9 спокойно дать ориентир срединной линии.
5. выполнение Ламинэктомия
- После того, как был правильно определен целевой области, выполняют laminectomies спинной аспектов T11-T13. Аккуратно распространение позвонков раскрыть межпозвонковых связок, которые являются хорошие сайты для вставки rongeurs для первоначального укус кости. Держите rongeurs в положении, полузакрытыми, увеличить штраф контроль.
- Удаление остистого отростка и спинной позвонок, принимая небольшие закуски с rongeurs. Будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг или нарушить Дура. Слегка приподнимите пинцетом зуб крысы, чтобы помочь вытащить спинного мозга от позвонков и уменьшить тенденцию к хит спинного тканей.
- Убрать кости от средней линии так, что может наблюдаться срединной кровеносного сосуда. Оставьте окно, которое ясно показывает ткани спинного мозга и мусора.
- Нежно коснуться спинного мозга с щипцами. Некоторые животные могут рефлекторно прыгать, даже если их обезболивающий самолет глубоко. Нанести несколько капель онемение агента как лидокаин непосредственно на спинной мозг для предотвращения прыжки во время процедуры инъекции.
- Закрепите животного в спинномозговой держатель крепления стабилизирующим щипцы для остистого отростка ростральной и каудально к окну Ламинэктомия. Поднимите брюшке животного с помощью держателя позвоночника инвертировать эффект дыхательных движений. Это увеличит иглы стабильности и обеспечения соответствующей глубины инъекций.
6. Загрузка вируса и позиционирование инжектор
- Загрузить вирус в инжектор, закупорить приблизительно 5 мкл на кусок парафина и позиционирования иглы, таким образом, чтобы кончик внутри падение.
- Используйте микронасосом снять до 4 мкл вируса со скоростью 20 – 100 nL/сек.
- Установите контроллер инъекционные и выпустить небольшое количество вируса от иглы, чтобы убедиться, что кончик иглы не блокируется. Стереть избыток вируса Лаборатория салфеткой.
Примечание: Гамильтон шприц с иглой стальной может использоваться как альтернатива вытащил стеклянной пипетки. - Поместите микроманипулятор так, что видна нониуса масштаба и положение иглы в средней линии спинного мозга.
Примечание: Midline иногда может быть расположен на большой кровеносный сосуд на передней поверхности спинного мозга. Однако это может варьироваться в отдельных крыс, и ориентации срединной линии должны быть подтверждены по сравнению с нетронутыми остистого отростка. - Прямые иглы боково на 0,8 мм, используя нониуса масштаба на микроманипулятор.
- Опустите иглу в спинном до тех пор, пока это отступов, но не прокола, дура. Используя быстрый вращательные движения, прокол дура с иглой, до тех пор, пока она упала на глубину 1,5 мм.
7. инъекции вируса в спинного мозга
- Когда игла находится в месте, программа инжектор впрыснуть в размере 400 нл/мин подтвердить что вирус вступает спинного мозга, наблюдая прогресс краситель фронта. Там должно быть без очевидных утечки или выпячивание тканей спинного мозга. Если наблюдается утечки, это иногда может быть уменьшена путем уменьшения скорости впрыска до 200 nL/мин.
- По окончании инъекции позволяют иглы на отдых в спинном мозге для 2-5 мин (в зависимости от объёма инъекции) для облегчения распространения вируса.
- Медленно снять иглу и перейти на следующий сайт инъекции. Inject 1 мкл вируса в каждой из 6 сайтов равномерно около 1 мм друг от друга по длине L1-L4 позвоночника ткани. Той же иглой может использоваться для каждой инъекции, пока он продолжает функционировать должным образом.
8. Закрытие и послеоперационный уход за ранами
- Удалите животное из держателя позвоночника и вывезти ретракторы или крючки, используемые для распространения боковые мышцы. Убедитесь, что раны ясно все мусора перед закрытием.
- Шов мышц с помощью 4.0 Хромовой Кетгуд швов. Вырежьте шовные потоков вблизи узел для уменьшения вероятности раздражения внутренних кожи.
- Сшивание кожи закрыты с использованием 9-мм раны клипы. Чтобы разрешить для оптимального лечения, линия до края кожи до сшивания.
- Поместите животное на воде конвекции потепление площадку и монитор до бодрствующем.
- Придать 5 – 10 мл стерильного физиологического раствора подкожно для пополнения жидкости и антибиотик например Цефазолин для предотвращения инфекции. Когда животное амбулаторно, поместите его обратно в свои дома клетке и обеспечить первоначальный анальгетиков. Контролировать крыс для любого знака боли и страданий и лечить согласно вашей IACUC утверждения процедуры для облегчения боли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное инъекций и транспорта вирусный вектор должно привести к трансдукции надежные населения односторонних нейронов спинного мозга и в некоторых ядрах ствола головного мозга. Рисунок 1 демонстрирует, стереотипные маркировки нейронов и аксоны в грудного отдела спинного и Понтийские ретикулярной формации ствола мозга на четыре недели после инъекции. Значительные экспрессия гена GFP рассматривается в нейроны в сером веществе грудного отдела спинного мозга на стороне ипсилатеральные для впрыска (рис. 1A, в штучной упаковке район). Также несколько нейронов наблюдаются на контралатеральную сторону, особенно вблизи средней линии. В белого вещества экспрессия гена GFP наблюдается в аксоны ипсилатеральные шнура (рис. 1A, стрелы и наконечники стрел), особенно в районах, типичная для propriospinal аксоны (стрелок). Рисунок 1A' показывает увеличение области в штучной упаковке в A, демонстрирует типичное выражение в нейрональных клеток органов и дендритов. Экспрессия гена GFP в нейронов может также наблюдаться в ядрах ствола головного мозга как Понтийские ретикулярной формации (рис. 1B, увеличение области упакованный в Рисунок 1B').
Рисунок 1: трансдукции нейронов спинного мозга и ствола головного мозга. (A) GFP выражение в нейроны (в штучной упаковке район), аксоны нейронов (стрелок) propriospinal и аксоны других участков (стрелки) грудного отдела спинного мозга. (A') Увеличение экспрессии нейронов в штучной упаковке области а. (B) Понтийские ретикулярной формации в мозга выразив GFP-меченых нейронов и дендритов. (B) Увеличение области в штучной упаковке в B. Масштаб бары: (A) = 500 мкм; (B) = 1 мм; (A'), (B) = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: Ориентация инъекции в поясничного отдела спинного мозга крысы. Это видео резюме основы ориентации и инъекции вирусный вектор в спинной мозг крыс. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генетические манипуляции нейронов в головном и спинном служил для выделения чувств, мотор и вегетативная пути через флуоресцентные трассировки и исследовать потенциал отрастания нейрональных участки после травмы27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. прямого впрыска retrogradely переносные вирусный вектор в спинной мозг могут ориентироваться нейрональных популяций через их синаптических связей, что делает этот метод отличным выбором для сопоставления путей в центральной нервной системе. HiRet вектор специально показывает селективного поглощения в нейрональных синапса22,24,25и предыдущий трассировки с аналогичным структурированные векторов показал не распространение в раненых аксоны или несвязанные ячейки 34 , 35, которая согласуется с результатами, показывая HiRet построить22,23,25. Таким образом прямой впрыск HiRet как Ретроградная tracer является идеальным методом для изучения interneuronal цепей, которые проходят пластичности после травмы.
Есть два важных концепций, участвующих в успешных инъекции вирусный вектор в спинной мозг. Первым является создание правильную цель с стеклянной иглой, а второй является обеспечение адекватного потока вируса от иглы в ткани. Как этот протокол включает Ретроградная трассировки, ориентация правильную область требует глубокого понимания синаптических связей нейрональных населения интерес. Propriospinal и вставочные нейроны, соединения поясничного отдела спинного ориентированы здесь. Эти нейроны разбросаны по всему ствола мозга и шейного и грудного отдела спинного сегменты, с большинством ПНС, локализованные для пластинки V-VII в серое вещество. Для обеспечения трансдукции достаточное количество нейронов, шесть вирусный инъекции производятся над площадью, охватывающих четыре сегментов спинного мозга. L1-L4 сегменты выбираются из-за присутствия центрального генераторы и их известных связей в других областях спинного. Как только правильный сегмент спинного мозга и пластинки, как известно, физическое местоположение этих целей через анатомические ориентиры имеет решающее значение. Атласы, показывая детали анатомические структуры и позвоночной форма может быть полезно для подтверждения таргетинга достопримечательности8,36. Следует отметить, что большинство этого протокола остается то же ли сделаны одной инъекции или шесть; Разница заключается только в число сегментов спинного мозга, через ламинэктомии и тот факт, что вам нужно будет перезагрузить стекла игла с дополнительной вирус если инъекционных более чем 4 мкл. Протокол также может быть легко адаптирована для мыши. Из-за меньшего размера объем вируса, вводят в шнур должна быть скорректирована в сторону понижения и измерения, необходимые для хит правильный позвоночника пластинки скорректированы. Несколько видео аналогичных операций на мыши ранее были опубликованы37,38.
Следующим фактором является должного распространения в ткань. Тщательная подготовка иглы необходимо убедиться, что отверстие достаточно для вирусного подвеска течь наружу и что мусора не блокирует кончик, и визуализация потока от иглы в спинной мозг через передний цветной краситель полезно подтвердить, что приостановление проникает ткани. После приостановки был распространен в ткани, поддержание иглы в спинной 2-5 минут обеспечит должного распространения.
Успешный трансдукции целевой группы населения также может зависеть от встроенных свойств вводится как эффективность титр, серотип и инфекции вируса. Мы находим геномной копирования титр по крайней мере 1010 GC/мл для HiRet человека хорошо работать для экспериментов в естественных условиях. Более высокие титры или инъекции томов может показать высокий индекс маркировки, но необходимо принять, поскольку вирус может диффузных из данной области или в контралатеральной спинной. Следует также учитывать тип вектора для маркировки клетки интерес, на основе их тропизм. Некоторые вирусные серотипов может иметь лучше инфекции и трансдукция ставки в различных популяций нейронов39. Знаны, что традиционные лентивирусные векторы заразить широкий спектр типов клеток вследствие VSV-G конверт белков, однако изменения в этот вектор может влиять на его тропизм40. HiRet конструкция изменяет конверт, pseudotyping с синтеза гликопротеина (FuG-B) вируса бешенства, который позволяет для высокоэффективных Ретроградная транспорта22,23 и является эффективным в преобразователя propriospinal и вставочные участки, с нейронов цифры сопоставимы с тракта трассировки через методы, такие как fluorogold и microruby4,41 (для деталей строительства HiRet вектор см Хирано и др.) 22. Однако, он сделал не ярлык достаточно взрослый кортикоспинальных путей в этих экспериментах, хотя это ярлык КНТ новорожденных с высокой эффективностью в других исследований1. Это возможно, рецепторы, необходимые для поглощения HiRet на целевых синапсов, например NCAM или p75НТР, являются только слабо выражена на взрослых КНТ нейронов42,43, хотя это все еще изучается. В любом случае это свидетельствует о важности определения, подходит ли вектора используется для целевых ячеек. В этом эксперименте обрабатывались и исследован после четырех недель, чтобы обеспечить обильные время для усиления и транспорта из поясничного шнур по всех областях мозга головного и спинного тканей. HiRet транспортируется через быстро Ретроградная аксональное транспорта, и таким образом более короткий экспериментальный период может быть уместным, если расстояние меньше, такие как если область инъекции в шейного отдела спинного.
Прямой впрыск хирургии является полезным инструментом для внедрения технологии вирусный вектор в спинной мозг. Использование HiRet для генетические эксперименты это выгодно, как он разрешает стабильной, длинный прочного трансген выражение и является токсичным для нейронов. В этом эксперименте не GFP маркировки был замечен в нейроны, которые не делают прямой синаптических связей в области инъекции. Это было верно в предыдущих исследованиях в животных с травмы грудной ушиба25. Кроме того HiRet-GFP смог ярлык мотонейронов спинного мозга или спинной корень нейроны ганглия, когда вводят в временно demyelinated седалищного нерва (неопубликованные наблюдения). Вместе эти данные позволяют предположить, что HiRet не легко войти через аксоны и эффективно передает нейронов, поглощение вектора на синапсы, обеспечивая более подробной и высококачественной карта нейрональных связей целевого населения. Это преимущество над другими retrogradely переносные вирусных векторов, таких как Ретроградная аденоассоциированный вирус (rAAV ретро), который как известно, быть приняты аксоны в пассаж44 и делает HiRet особенно полезным в исследованиях, картирование регенерирующее и Повторное подключение цепи в спинной мозг потерпевшего. Преимущества HiRet может также предусматривать конкретные ориентации нейрональных популяций для глушителей или абляции исследования25,44,45,,4647.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет гранта от Национальный институт неврологических нарушений и инсульта R01 R01NS103481 и Больница Шрайнерс для педиатрических исследований предоставляет ГХК 84051 и SHC 86000 и Министерство обороны (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
