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Immunology and Infection

एक उच्च थ्र्रपुट शिगेला-विशिष्ट जीवाणुनाशक परख

doi: 10.3791/59164 Published: February 27, 2019

Summary

यहां हम सीरम में एंटीबॉडी की शिगेलासीडी गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । सीरम बैक्टीरिया और exogenous पूरक के साथ मिलाया जाता है, incubated, और प्रतिक्रिया मिश्रण आगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है. व्यवहार्य जीवाणु, एक स्वचालित कॉलोनी गणनाकार का उपयोग करके कालोनियों को गिना जाता है, और जीवाणुनाशक टीटर को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

Abstract

सीरम जीवाणुनाशक assays (एसएबीए) एंटीबॉडी की कार्यात्मक गतिविधि को मापने और कई दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है । sbas सीधे सीरम में एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन करने के लिए बैक्टीरिया को बांधने और पूरक को सक्रिय करने के द्वारा एंटीबॉडी हत्या गतिविधि को मापने. इस lysis और लक्ष्य बैक्टीरिया की हत्या में सक्रियण परिणाम के पूरक हैं । इन assays मूल्यवान है क्योंकि वे एंटीबॉडी के उत्पादन के पार जाना जैविक कार्य है कि इन एंटीबॉडी है, शोधकर्ताओं की भूमिका है कि एंटीबॉडी संक्रमण को रोकने में खेल सकते है अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है । sbas कई मानव रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन वर्तमान में शिगेला के लिए कोई व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं कार्यप्रणाली है. ऐतिहासिक रूप से, sbas बहुत श्रम-गहन किया गया है, कई समय लेने वाले कदम सही ढंग से जीवित बैक्टीरिया यों तो की आवश्यकता होती है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सरल, मजबूत, और उच्च throughput परख है कि कार्यात्मक शरीर में सीरम में शिगेला के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी उपाय । विधि यहां वर्णित पारंपरिक sbas पर कई लाभ प्रदान करता है, जमे हुए जीवाणु भंडार का उपयोग सहित, ९६ अच्छी तरह से परख प्लेटें, एक माइक्रो संस्कृति प्रणाली, और स्वचालित कॉलोनी गिनती । इन संशोधनों के सभी इस परख कम श्रम-गहन और अधिक उच्च throughput बनाते हैं । इस प्रोटोकॉल सरल और तेजी से पारंपरिक sbas से प्रदर्शन करते हुए अभी भी साधारण प्रौद्योगिकियों और आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग कर रहा है । प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कई स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में लागू किया गया है और परख मजबूत और पुनरुद्देशायोग्य है । परख के लिए पूर्व में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का आकलन नैदानिक अध्ययन के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है । दोनों से पहले और antigen जोखिम के बाद (या तो प्रतिरक्षण या संक्रमण द्वारा) shigellacidal एंटीबॉडी titers quantifying कैसे कार्यात्मक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं उत्पन्न कर रहे हैं और सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा के लिए उनके योगदान के एक व्यापक समझ के लिए अनुमति देता है. इस मानकीकृत के विकास, अच्छी तरह से विशेषता परख बहुत शिगेला वैक्सीन डिजाइन की सुविधा हो सकती है ।

Introduction

शिगेला सेरोटाइप्स, शिगेला फ्लेक्नेरी 2a, एस flexneri 3 ए, और एस. सोनेई, वैश्विक स्तर पर महामारी विज्ञान की प्रसार का प्रदर्शन करते हैं । इन शिगेला प्रजाति के कारण अतिसारीय रोग सैन्य, यात्री1, और विकासशील देशों2में 5 से कम आयु के बच्चों के बीच अतिसारीय मृत्यु का एक प्रमुख कारण है । वर्तमान में कोई लाइसेंस टीके शिगेलाके खिलाफ की रक्षा के लिए कर रहे हैं, हालांकि, वहां विकास के विभिंन चरणों में कई उंमीदवार टीके हैं । इन टीके के कई, और अंय रोगनिरोधी उपाय वर्तमान में विकास में, शिगेला lipopolysaccharide (lps) के खिलाफ उत्पादित एंटीबॉडी पर ध्यान केंद्रित । एलपीएस एक आकर्षक टीका उम्मीदवार है क्योंकि यह एक प्रमुख सतह एंटीजेन और शिगेला के साथ प्राकृतिक संक्रमण एलपीएस-विशिष्ट एंटीबॉडी को प्रेरित करता है जो सेरोटाइप-विशिष्ट तरीके से पुनः संक्रमण के खिलाफ सुरक्षात्मक हो सकता है । इसलिए, एक सफल शिगेला वैक्सीन की संभावना बहु-वैलेंट और लक्ष्य 3-4 शिगेला सेरोटाइप करने के लिए दुनिया भर में परिसंचारी उपभेदों के 70-80% के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रेरित करने की आवश्यकता होगी3,4, 5 , 6. यह आवश्यक है कि assays का मूल्यांकन करने के लिए शिगेला टीका उंमीदवारों कई अलग serotypes के लिए विशिष्ट हो ।

टीका उंमीदवारों एंटीबॉडी titers के स्तर बढ़ाता पर ध्यान केंद्रित के मूल्यांकन के लिए वर्तमान इम्यूलोजिकल assays, लेकिन कुछ अच्छी तरह से विशेषता assays कार्यात्मक एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए कर रहे हैं । एंटीबॉडी कार्यात्मक क्षमता की परीक्षा महत्वपूर्ण है क्योंकि रोगज़नक़ विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी बैक्टीरिया सतह एंटीजन सहित कार्यात्मक तंत्र की एक संख्या के माध्यम से संक्रमण का मुकाबला करने के लिए जिंमेदार हैं, और आसंजन को रोकने और उपकला कोशिकाओं के संक्रमण, बैक्टीरिया की कोशिकाओं को लक्षित करने या opsonization और फैगोसाइटोसिस, और सीधे बाध्यकारी और पूरक झरना की शुरुआत के रोगजनकों की हत्या. एंटीबॉडी द्वारा बैक्टीरिया की सीधी हत्या तब होती है जब एंटीबॉडी लक्ष्य बैक्टीरिया के घटकों की सतह के लिए बाध्य और कई zymogens के सक्रियण के लिए प्रमुख पूरक झरना आरंभ कि अंत में बैक्टीरिया कोशिका में छिद्र गठन में परिणाम है कि lysis और बैक्टीरियल मौत का कारण बनता है । एंटीबॉडी और पूरक घूम द्वारा बैक्टीरिया की यह प्रत्यक्ष हत्या संक्रमण के दौरान रक्षा की एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक लाइन हो सकता है.

जो व्यक्ति स्वाभाविक रूप से संक्रमित होते हैं, उनके सीरा में शिगेलासीडी गतिविधि के साथ एंटीबॉडी होती है । ये शिगेला-विशिष्ट एंटीबॉडी पारंपरिक पूरक मध्यस्थता हत्या assays 7,8का उपयोग कर पाया गया । यह दर्शाता है कि शिगेलाके खिलाफ संरक्षण में जीवाणुनाशक एंटीबॉडी के लिए एक भूमिका हो सकती है । पारंपरिक जीवाणुनाशक assays उनके निष्पादन में सरल कर रहे हैं: सीरम गर्मी निष्क्रिय है (अंतर्जात पूरक गतिविधि को नष्ट करने के लिए) और ब्याज के बैक्टीरिया के साथ मिलाया. exogenous पूरक एक विशिष्ट एकाग्रता में इस मिश्रण करने के लिए जोड़ा जाता है. प्रतिक्रिया मिश्रण बैक्टीरिया की हत्या के लिए अनुमति देने के लिए और फिर कॉलोनी बनाने इकाइयों (cfus) की पुष्टि करने के लिए चढ़ाया incubated है । एक बार cfus गिना जाता है, एक ५०% की हत्या सूचकांक (KI) की गणना की जा सकती है और एक sba टिटर निर्धारित किया है । हालांकि यह प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल है, इन assays श्रम गहन और समय लेने के लिए प्रदर्शन कर सकते है और परिणाम अत्यधिक चर जा सकता है । इन सीमाओं के अलावा, कोई अच्छी तरह कार्यात्मक assays विशेषता वर्तमान में शिगेला के लिए मौजूद हैं । इसलिए, हम सफलतापूर्वक विकसित किया है और एक सरल, उच्च throughput परख के लिए सबसे अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक उपभेदों9के तीन के लिए शिगेला जीवाणुनाशक गतिविधि को मापने के योग्य है । इस प्रोटोकॉल संशोधनों के साथ एक sba का वर्णन है कि परख दक्षता और reproducibility में सुधार होगा । इन संशोधनों में से सबसे पहले फ्रोजन बैक्टीरियल स्टॉक्स का इस्तेमाल होता है । एकल उपयोग के शेयरों के उत्पादन के लिए प्रत्येक परख के लिए ताजा बैक्टीरिया संस्कृति की जरूरत समाप्त करते हुए भी परख को कम करने के लिए परख परिवर्तनशीलता । इस प्रोटोकॉल का एक और समय और श्रम बचत लाभ एक ९६-अच्छी थाली परख प्रारूप का उपयोग है । यह नमूनों की धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए अनुमति देता है ताकि सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण किया जा सकता है ।  यह भी स्क्वायर पेट्री व्यंजन पर नमूने चढ़ाना के लिए मल्टीचैनल पिसेटों के उपयोग के लिए अनुमति देता है । जब इन वर्ग पेट्री व्यंजन एक संस्कृति प्रणाली है कि माइक्रो कालोनियों का उत्पादन के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है, आगार की संख्या की परख के लिए आवश्यक प्लेटें कम है । यह, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कॉलोनी-गिनती सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में, मूल रूप से न्यूमोकोकल बहुसंकेतित ऑप्सोनोफेगोसाइटिक हत्या परख (mopa)10के लिए विकसित, तेजी से, स्वचालित, और विश्वसनीय कॉलोनी गणन के लिए अनुमति देता है । इन सुधारों के सभी काफी हाथों को कम परख समय पर और एक उच्च throughput एकाधिक प्लेटों के लिए अनुमति प्रणाली बनाने के लिए एक बार में चला रहे हैं ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल शिगेला के सबसे नैदानिक प्रासंगिक सीरोटाइप के तीन के लिए अनुकूलित किया गया है, यहां वर्णित sba आसानी से कई अंय जीवाणु रोगजनकों के लिए लागू किया जा सकता है । अन्य बैक्टीरिया के साथ इस प्रोटोकॉल के संभावित उपयोग के अलावा, इस प्रोटोकॉल में एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में केवल सीरम का उपयोग कर से परे विस्तार करने की क्षमता है, जो इस तरह श्लेष्मल नमूनों के रूप में अन्य प्रासंगिक नमूना प्रकार में एंटीबॉडी का विश्लेषण शामिल हो सकता है, जिसमें लार और मल के नमूने शामिल हैं । टीकाकरण के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस परख के उपयोग के टीके के तर्कसंगत डिजाइन करने के लिए अग्रणी टीकाकरण द्वारा उत्पंन प्रतिरक्षित प्रतिक्रियाओं में व्यापक अंतर्दृष्टि दे सकते हैं, और कैसे प्राकृतिक प्रतिरक्षा विकसित की समझ में सहायता ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल wrair मानव विषय के संरक्षण बोर्ड के दिशा निर्देशों का अनुसरण करता है । इस अध्ययन में प्रयुक्त नमूनों मानव सीरम के सभी संस्थागत और संघीय नियमों के अनुपालन में wrair प्रोटोकॉल संख्या १३२८ के भाग के रूप में एकत्र किए गए नमूने मानव विषयों की सुरक्षा के संचालन कर रहे हैं । नमूने de-पहचाना गया, और इन अनाम नमूनों का उपयोग uab irb (प्रोटोकॉल संख्या N150115001) द्वारा गैर-मानवीय विषय अनुसंधान के रूप में वर्गीकृत किया गया था ।

1. परख अभिकर्मकों तैयार

  1. 1 ग्राम जिलेटिन को १०० मिलीलीटर पानी में जोड़कर १% जिलेटिन तैयार करें । ऑटोक्लेव और कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  2. तैयार १०० मिलीग्राम/एमएल टीटीसी (2, 3, 5-triphenyltetrazolium क्लोराइड) स्टॉक समाधान (1, 000x) टीटीसी के 5 जी को जोड़कर ४० मिलीलीटर पानी । जब ttc पूरी तरह भंग हो जाता है, तो वॉल्यूम को ०.२ μm फ़िल्टर का उपयोग करके पानी और बाँझ फ़िल्टर के साथ ५० मिलीलीटर में समायोजित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान और प्रकाश से रक्षा करना ।
    नोट: ttc बैक्टीरियल कालोनियों colorizes और उन्हें गिनती करने के लिए बहुत आसान बनाता है । टीटीसी समाधान थोड़ा पीला रंग है । यदि टीटीसी समाधान लाल रंग विकसित करता है, तो छोड़ें और ताजा तैयार करें ।
  3. 10% सोडियम एज़ाइड (नेन3) स्टॉक समाधान (100x) को जोड़कर 5 ग्राम NaN3 से ४० मिलीलीटर पानी तैयार करें । पूर्ण विघटन के बाद, ५० मिलीलीटर में पानी डालें । कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    सावधानी: सोडियम ऐज़ाइड एक जहर है और विषाक्त अगर घूस या त्वचा या आंखों के माध्यम से अवशोषित हो सकता है । यह सीसा और तांबे नलसाजी के साथ प्रतिक्रिया के लिए अत्यधिक विस्फोटक धातु azides फार्म हो सकता है । सोडियम ऐज़ाइड युक्त अभिकर्मकों के निपटान पर, ऐज़ाइड बिल्ड-अप को रोकने या एक biohazard बैग में त्यागने के लिए पानी की एक बड़ी मात्रा के साथ फ्लश ।
  4. lba प्लेट (lb आगर प्लेट) को ३५ ग्राम के पौंड आगार से जोड़कर 1 L पानी और आटोक्लेव तैयार कर लें । प्रत्येक वर्ग पेट्री डिश (१२० x १२० mm2) के लिए 25 मिलीलीटर जोड़ें । 10-20 मिनट के लिए आरटी पर सेते प्लेटें आगर जमना करने की अनुमति देने के लिए । प्लेट्स को प्लास्टिक बैग में वापस रखें और 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  5. अधिव्यापन आगर को १,००० मिलीलीटर पानी और आटोक्लेव के ७.५ ग्राम जोड़कर तैयार करें । ५६ ° c पानी स्नान में सेते जब तक की जरूरत है । सही उपयोग करने से पहले, जोड़ें 1 मिलीलीटर की १०० मिलीग्राम/एमएल टीटीसी और 10 मिलीलीटर 10% नेन3 और अच्छी तरह से मिलाएं ।
    नोट: प्रत्येक lba प्लेट अधिव्यापन आगर के 25 मिलीलीटर की जरूरत है । अधिव्यापन आगर एक महीने के लिए अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और एक माइक्रोवेव में या एक गर्म प्लेट पर परख के लिए जरूरत के रूप में पिघला । सुनिश्चित करें कि आगर तापमान lba प्लेटों के लिए आवेदन से पहले ~ ५५ डिग्री सेल्सियस है ।
  6. 5 मिलीलीटर 10x हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (hbss) के साथ Ca2 +/मिलीग्राम2 + और 5 मिलीलीटर 1% जिलेटिन की ४० मिलीलीटर पानी जोड़कर परख बफर तैयार करें । कमरे के तापमान पर स्टोर ।

2. पूरक और लक्ष्य बैक्टीरिया तैयार

  1. बेबी खरगोश पूरक (brc) तैयार
    नोट: पूरक बहुत चयन के लिए विस्तृत मापदंड यहां पाया जा सकता है: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
    1. ठंडा पानी चलाने के साथ जमे हुए brc और गल प्राप्त करें । शारीरिक रूप से मिश्रण brc हर ~ 10-20 मिनट तक पूरी तरह से गल । दोहराया फ्रीज गल चक्र के लिए brc विषय नहीं है ।
    2. जबकि brc गल रहा है, लेबल १.५ मिलीलीटर, 5ml, या 15 मिलीलीटर अपकेंद्री ट्यूबों । प्लेस पूर्व ठंडा करने के लिए बर्फ पर ट्यूबों लेबल । aliquot उचित मात्रा brc पूर्व ठंडा अपकेंद्री ट्यूबों के लिए (भरने के बाद, तुरंत बर्फ के लिए प्रत्येक ट्यूब वापसी) । संग्रह में ≤-७० ° c फ्रीजर में aliquots ।
      नोट: पूरक के लगभग 1 मीटर प्रत्येक परख थाली के लिए आवश्यक है । पूरक aliquots एकल उपयोग के लिए कर रहे है और उचित संस्करणों में aliउद्धृत करने के लिए लेआउट परख चाहिए ।
    3. हीट-एक्टिवेट brc, गल एक सक्रिय brc के aliquot तैयार करने के लिए । एक ५६ ° c पानी स्नान तैयार करें । के बाद brc पूरी तरह से गल गया है, यह पानी स्नान करने के लिए स्थानांतरण और 30 मिनट के लिए सेते ।
    4. ऊष्मायन के बाद, गर्मी-निष्क्रिय brc पानी स्नान से निकालें और 10-15 मिनट के लिए आरटी पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । जोरदार मिश्रण, और aliquot ~ १५० μl १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए । ≤-10 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots ।
  2. लक्ष्य बैक्टीरिया शेयर तैयार करें
    नोट: नीचे दी गई प्रक्रिया लक्ष्य बैक्टीरिया स्टॉक के ४८ aliquots तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है; यदि अधिक aliquots की जरूरत है प्रोटोकॉल बढ़ाया जा सकता है ।
    1. बैक्टीरिया मास्टर स्टॉक शीशी फ्रीजर से निकालें और जमे हुए जीवाणु सतह परिमार्जन एक रक्त आगर थाली पर शीशी से बर्फ की एक छोटी राशि को दूर करने के लिए. तुरंत मास्टर स्टॉक शीशी को फ्रीजर में लौटा दें ।
    2. रक्त आगार की थाली पर जीवाणु स्टॉक के इस छोटे aliquot लकीर और प्लेट ढक्कन के साथ कवर । ३७ डिग्री सेल्सियस/5% सह 2 इनकोबेटर में रातोंरात प्लेट को उल्टा करदो
    3. स्थानांतरण ~ 10 पृथक चिकनी कालोनियों एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए £ शोरबा के 30 मिलीलीटर युक्त । 3-5 एच के लिए सेते ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए जब तक संस्कृति शोरबा एक ओडी६०० के ~ 0.6-0.7 है ।
    4. संस्कृति के शीर्ष १२.५ मिलीलीटर फसल और एक ताजा ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण । 2 मिनट के लिए १५,००० एक्स जी में एक तालिका शीर्ष माइक्रो अपकेंद्रिका का उपयोग कर संस्कृति को अपकेंद्रिप । सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 15% बाँझ ग्लिसरोल-पौंड की 25 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित ।
    5. अच्छी तरह मिलाएं और ०.५ मिलीलीटर एलिकोट्स को १.५ एमएल माइक्रो सेंट्रोज ट्यूब (~ ४८ ट्यूब) में वितरित करें । ≤-७० डिग्री सेल्सियस में फ्रीजर में स्टोर aliquots ।
    6. उपयोग करने से पहले बैक्टीरिया की पहचान का उपयोग कर समूहन परीक्षण की पुष्टि करें ।
  3. लक्ष्य बैक्टीरिया शेयर के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने कारक का निर्धारण
    नोट: लक्ष्य जीवाणु शेयर के प्रत्येक बैच परख की स्थिति में titrated होना चाहिए करने के लिए उपज के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने का निर्धारण ~ १२०/
    1. एक microtiter थाली (कमजोर पड़ने प्लेट) जाओ और अच्छी तरह से 1a के लिए परख बफर के १३५ μl जोड़ें । कुओं 1b-1h के लिए परख मक्खन के १२० μl जोड़ें ।
    2. फ्रीजर से जमे हुए लक्ष्य बैक्टीरिया की एक शीशी निकालें और कमरे के तापमान पर गल । बैक्टीरियल स्टॉक के 10 गुना कमजोर पड़ने को बनाने के लिए अच्छी तरह से 1a के लिए 15ul को गल बैक्टीरियल स्टॉक में जोड़ें ।
    3. अच्छी तरह से 1a से अच्छी तरह से 1b के लिए एक 5 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए बैक्टीरियल समाधान के 30 μl स्थानांतरण । जारी 5-गुना सीरियल dilutions के लिए अच्छी तरह से 1h की कुल के लिए 8 dilutions (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
    4. एक और microtiter थाली (परख प्लेट) जाओ और परख प्लेट में कॉलम 1 और 2 में सभी अच्छी तरह से परख बफर के 20 μl जोड़ें ।
    5. कॉलम 1 और 2 परख थाली के में इसी कुएं में कमजोर पड़ने प्लेट के कॉलम 1 में एक अच्छी तरह से पतला बैक्टीरिया के 10 μl स्थानांतरण । बैक्टीरिया की 10 μl अच्छी तरह से 1a और परख थाली, आदि में 2a में कमजोर पड़ने प्लेट की अच्छी तरह से 1a से स्थानांतरित कर दिया है
    6. परख के साथ जारी रखें के रूप में सीरम जीवाणुनाशक परख में वर्णित (sba) नियंत्रण के लिए एक और नियंत्रण बी, कदम 3.6-3.12 ।
    7. के बाद प्लेटों बर्फ पर incubated किया गया है, 8 पिपेट सुझावों के साथ एक मल्टीचैनल पिपेट एक lba प्लेट पर कॉलम 1 में कुओं से 10 μl हाजिर करने के लिए उपयोग करें । इसके अलावा, कॉलम 2 से lba प्लेट पर कुओं हाजिर ।
    8. के रूप में नीचे दिए गए कदम 3.14-4.6 में वर्णित परख के साथ जारी रखें ।
    9. बैक्टीरिया कमजोर पड़ने कि पैदावार ~ १२० cfu/नियंत्रण बी में स्पॉट का निर्धारण, इस कमजोर पड़ने परख में इस्तेमाल किया जाएगा ।

3. सीरम जीवाणुनाशक परख (एसबीए)

नोट: नीचे वर्णित प्रक्रिया एक परख थाली के लिए है, लेकिन परख प्लेटों की संख्या में वृद्धि की जा सकती है ।

  1. हीट-30 मिनट के लिए एक ५६ ° c पानी स्नान में नमूने incubating द्वारा परीक्षण के नमूने inactivate ।
    नोट: परीक्षण नमूनों गर्मी-निष्क्रिय करने के लिए परीक्षण करने से पहले किसी भी अंतर्जात पूरक गतिविधि निराकृत होना चाहिए. यह परख और निष्क्रिय नमूनों के आगे किया जा सकता है फिर से जमे हुए या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब तक परीक्षण किया जा सकता है ।
  2. एक परख प्लेट जाओ और कॉलम 1 के माध्यम से पंक्तियों के 12 के माध्यम से एक जी के माध्यम से 20 μl जोड़ें कॉलम 1 और पंक्ति एच के 2 के लिए परख बफर के 20 μl जोड़ें, तालिका 1देखें ।
  3. प्रत्येक परीक्षण नमूना के 30 μl लोड, डुप्लिकेट में, परख प्लेट की पंक्ति एच के लिए । उदाहरण के लिए, 30 μl का नमूना 1 कुओं 3h और 4h में वितरण, और 30 μl के नमूने 2 कुओं में 5h और 6h, आदि वितरण
  4. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर परीक्षण नमूनों की 3 गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन.
    1. कुओं 3h-12h से नमूने के 10 μ निकालें और पंक्ति जी में इसी कुएं में स्थानांतरण और नमूना अच्छी तरह से ऊपर और नीचे 8-10 बार pipetting द्वारा मिश्रण ।
    2. फिर वेल्स 3g-12g से 10 μ निकालें और पंक्ति एफ में इसी कुएं में स्थानांतरण और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    3. पंक्ति A के माध्यम से ये सीरियल dilutions जारी रखें । एक पंक्ति में कुओं को मिलाने के बाद, निकालें और कुओं से 10 μl त्यागें 3a-12 ए इतना है कि सभी कुओं में शामिल 20 μl.
      नोट: क्योंकि सीरम के 20 μl ८० μl की कुल परख मात्रा में प्रयोग किया जाता है, परख में एक 4 गुना अतिरिक्त कमजोर पड़ने है । इस कमजोर पड़ने के लिए 4 द्वारा सीरम के कमजोर पड़ने से गुणा एक sba टिटर की गणना के दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, 1:2 का एक प्रारंभिक कमजोर पड़ने का उपयोग किया जाता है, तो वास्तविक कमजोर पड़ने का परीक्षण किया जा रहा है 1:8 है ।
  5. कमरे के तापमान पर जमे हुए लक्ष्य बैक्टीरिया स्टॉक और गल की एक शीशी निकालें । पूर्व निर्धारित इष्टतम कमजोर पड़ने कारक (इस कमजोर पड़ने कारक खंड २.३में निर्धारित किया गया था) के अनुसार परख बफर के 20 मिलीलीटर में बैक्टीरिया को पतला । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला बैक्टीरिया के 10 μl जोड़ें ।
  6. जमे हुए brc की एक शीशी और जमे हुए गर्मी की एक शीशी निकालें-निष्क्रिय brc, ठंडे पानी या जल्दी से गल के लिए हवा उड़ाने के साथ एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के कद्दूकस पर जगह चलने के साथ कमरे के तापमान पर गल ।
  7. हीट-एक्टिवेट brc का 20% समाधान तैयार करें । मिक्स १०० μl गर्मी की परख बफर के ४०० μl के साथ brc निष्क्रिय । कॉलम 1 में सभी कुओं को इस 20% गर्मी-निष्क्रिय brc समाधान के ५० μl जोड़ें (एक कुओं को नियंत्रित) ।
    नोट: हीट-निष्क्रिय brc परख में गैर विशिष्ट हत्या (nsk) पर नजर रखने के लिए एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
  8. देशी brc के एक 20% समाधान तैयार करें । 4 मिलीलीटर परख बफर के साथ देशी brc के 1 मिलीलीटर मिलाएं । कॉलम 2 के माध्यम से 12 (नियंत्रण बी और परीक्षण नमूना कुओं) में सभी कुओं को इस मिश्रण के ५० μl जोड़ें ।
    नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण में brc की अंतिम एकाग्रता १२.५% है ।
  9. संक्षेप में एक थाली शेखर या एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर 8 बार नीचे pipetting द्वारा मिश्रण पर 10-15 एस के लिए धीरे मिलाते द्वारा परख थाली मिक्स ।
  10. 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस माइक्रोबायोलॉजिकल इनकोबेटर में परख थाली रखो (मिलाते हुए बिना) ।
  11. सूखी 2 lba प्लेटें हटाने के lids और रखने प्लेटें जैविक सुरक्षा कैबिनेट में 40-60 मिनट के लिए चेहरा ।
  12. जब 2 एच ऊष्मायन पूरा हो गया है, गीला बर्फ के लिए परख थाली चाल और 10-20 मिनट के लिए सेते प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ।
  13. एक 12-चैनल पिपेट का उपयोग कर, पंक्ति एच में कुओं का मिश्रण है, और एक lba प्लेट के तल पर प्रतिक्रिया मिश्रण के स्पॉट प्लेट 10 μl. तुरंत थाली झुकाव और स्पॉट ~ 1.5-2 सेमी के लिए चलाने के लिए अनुमति देते हैं । पंक्ति G, F, और E के लिए इस कार्यविधि को दोहराएं, उंहें lba प्लेट पर पिछली पंक्ति के ऊपर खोलना । पंक्ति ई, एफ, जी, और एच एक lba प्लेट पर देखा जाता है, और पंक्ति ए, बी, सी, और डी एक ही तरीके से एक दूसरे lba थाली पर देखा जाता है, चित्रा 1देखें ।
  14. जब तक समाधान lba प्लेट्स (10-15 मिनट) में adsorbed है lba प्लेटों को कमरे के तापमान पर सेते हैं । lba प्लेटों पर ढक्कन रखो और सूक्ष्मजीवविज्ञानी इनकोटर उल्टा में lba प्लेटों जगह-रात भर सेते नीचे (~ 16-18 एच) । 29 डिग्री सेल्सियस पर सेते एस flexneri 2a और 3a और सेते एस sonnei 26 डिग्री सेल्सियस पर है ।
    नोट: इन तापमान एक कॉलोनी काउंटर9द्वारा सटीक गिनती के लिए उपयुक्त आकार के साथ छोटे "माइक्रो कालोनियों" उपज ।
  15. रात भर ऊष्मायन के बाद, जोड़ने आगार के 25 मिलीलीटर (पर ~ ५५ ° c) १०० μg/एमएल ttc और ०.१% नेन3 प्रत्येक lba थाली से युक्त ।
  16. 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर lba प्लेटों सेते जीवित बैक्टीरिया लाल रंग विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए, नीचे चित्रा 1 देखें ।
  17. फोटोग्राफ एक डिजिटल कैमरा का उपयोग कर प्लेटें और एक कंप्यूटर के लिए छवियों को स्थानांतरित जहां NIST एकीकृत कॉलोनी सॉफ्टवेयर गणना (अच्छा) स्थापित किया गया है, चित्रा 2देखें.
    नोट: अच्छी कॉलोनी-गिनती सॉफ्टवेयर कोई शुल्क नहीं है पर उपलब्ध है । विवरण और स्थापना के निर्देश के लिए सामग्री की सूची देखें ।

4. गिनती बैक्टीरियल कालोनियों

  1. खुला अच्छा सॉफ्टवेयर और इनपुट ऑपरेटर नाम, प्रयोग जानकारी, और खाली क्षेत्रों में किसी भी परख नोटों । एक बार जब यह डेटा दर्ज किया जाता है तो Done बटन क्लिक करें ।
  2. ओपन बटन पर क्लिक करके और कंप्यूटर से सही फ़ाइलों का चयन करके फोटो प्लेट आयात करें ।
  3. 4 करने के लिए पंक्तियों की संख्या और 12 के लिए स्तंभों की संख्या सेट करके परख मापदंडों को समायोजित करें । -3 सिग्मा और कम करने के लिए संकल्प करने के लिए पृष्ठभूमि सेटिंग समायोजित करें । चित्रा 2देखें ।
  4. ब्याज के क्षेत्रों (rois) पर क्लिक करके और खींच ताकि प्रत्येक रॉय सीधे एक नमूना स्थान पर है ले जाएं । सुनिश्चित करें कि सभी बैक्टीरिया कालोनियों के नमूने के बीच कोई ओवरलैप के साथ रॉय के अंदर हैं । एक बार एक थाली पूरा हो गया है, संग्रहीत डेटा छवियों की सूची में अगले थाली डबल क्लिक करें और rois समायोजित । चित्रा 2देखें ।
  5. सभी प्लेटें समायोजित किया गया है, जब हरे रंग की गणना बटन क्लिक करें, चित्रा 2 और चित्रा 3देखें । जब गिनती समाप्त हो गया है निर्यात करें बटन. xls/. xlsx स्वरूप में डेटा निर्यात करने के लिए । डेटा विश्लेषण के लिए. xls/. xlsx फ़ाइल का नाम और सहेजें ।
  6. निर्यात किए गए डेटा को तालिका स्वरूप में व्यवस्थित करें ताकि गणना ९६-well परख प्लेट का प्रतिनिधित्व करने वाली तालिका में व्यवस्थित हो, तालिका 2 देखें ।

5. गणना sba टिटर (KI) और गैर विशिष्ट हत्या (nsk)

नोट: एसबीए टिटर, या हत्या सूचकांक (KI) सीरम कमजोर पड़ने के व्युत्क्रम के रूप में परिभाषित किया गया है कि लक्ष्य बैक्टीरिया का ५०% मारता है ।

  1. सक्रिय पूरक नियंत्रण कुओं (नियंत्रण बी) के cfu औसत से ५०% की हत्या सूचकांक (KI) कटऑफ मूल्य की गणना और 2 से विभाजित । प्रत्येक नमूना जो डुप्लिकेट में चलाया गया था के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए औसत cfu परिकलित करें, तालिका 3देखें ।
  2. क्योंकि एक सीरम कमजोर पड़ने शायद ही कभी वास्तव में इस ५०% KI मूल्य उपज जाएगा, यह दो अनुक्रमिक सीरम dilutions, एक है कि ५०% से कम मारता है और एक है कि अधिक से अधिक ५०% मारता से दुओं किया जा सकता है, चित्रा 4देखें । दुओं sba KI की गणना करने के लिए सूत्र नीचे दिखाया गया है:
    Equation
    नोट: जीवाणुनाशक टिटर, या KI, uab द्वारा विकसित ऑप्स्टिट्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित रूप से परिकलित किया जा सकता है । ऑप्स्टिट्यूटका अनुरोध करने के लिए, डॉ चंद्रमा nahm या श्री रोब बर्टन से संपर्क करें । संपर्क जानकारी के लिए https://www.vaccine.uab.edu देखें ।
  3. नियंत्रण A के औसत से विभाजित नियंत्रण B का औसत 1 ऋण लेने के द्वारा nsk मान की गणना करें ।

Representative Results

एक ९६-अच्छी तरह से थाली लेआउट एक ठेठ परख में प्रयुक्त तालिका 1 में दिखाया गया है । इस लेआउट सक्रिय पूरक नियंत्रण कुओं (नियंत्रण बी), गर्मी निष्क्रिय पूरक नियंत्रण कुओं (नियंत्रण एक), और डुप्लिकेट में पांच नमूने है. नमूने एक बार में परीक्षण किया जा करने के लिए प्रत्येक नमूने के 8 dilutions के लिए अनुमति पंक्ति के लिए पंक्ति एच से थाली को गुना 3 पतला प्रश्नपत्र हैं. चित्रा 1 रातोंरात ऊष्मायन और ओवरले इसके अलावा के बाद दो lba प्लेटों से पता चलता है । रंग विकास की जगह ले लिया है और सभी जीवित कालोनियों लाल रंग में दिखाई दे रहे हैं । बैक्टीरियल हत्या स्पष्ट रूप से पहले तीन dilutions में परीक्षण सभी नमूनों के लिए देखा जाता है (पंक्तियों एफ एच) और नमूने के रूप में थाली को आगे पतला कर रहे हैं, बैक्टीरियल हत्या में कमी देखा जाता है, जहां सीरम कम केंद्रित है. अच्छा सॉफ्टवेयर इंटरफेस चित्रा 2में देखा जा सकता है । सूक्ष्म कॉलोनी अच्छा सॉफ्टवेयर से गिना जाता है चित्रा 3में देखा जा सकता है, और इन गिनती 2 तालिकामें आयोजित किया गया है । प्रत्येक नमूने के प्रत्येक तनुकरण के लिए औसत cfu गणना परिकलित की जाती है और तालिका 3में ५०% KI मान की गणना की जाती है । यह ५०% KI मूल्य प्रत्येक सीरम कमजोर पड़ने के लिए औसत cfus के लिए लागू किया जा सकता है कि चित्रा 4में वर्णित सूत्र के अनुसार sba KI की गणना करने के लिए आवश्यक मूल्यों का निर्धारण करने के लिए । परख के अंतिम परिणाम तालिका 4में दिखाया गया है ।

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
नियंत्रण एक नियंत्रण B कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8 कमजोर पड़ने 8
बी नियंत्रण एक नियंत्रण B कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7 कमजोर पड़ने 7
सी नियंत्रण एक नियंत्रण B कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6 कमजोर पड़ने 6
डी नियंत्रण एक नियंत्रण B कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5 कमजोर पड़ने 5
नियंत्रण एक नियंत्रण B तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4 तनुता 4
एफ नियंत्रण एक नियंत्रण B कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3 कमजोर पड़ने 3
जी नियंत्रण एक नियंत्रण B कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2 कमजोर पड़ने 2
एच नियंत्रण एक नियंत्रण B कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1 कमजोर पड़ने 1
नमुना १ नमूना 2 नमुना ३ नमुना ४ नमुना ५

तालिका 1: परख प्लेट लेआउट। स्तंभ 1 और 2 में पूरक नियंत्रण कुओं होते हैं । नियंत्रण A स्तंभ 1 में स्थित है और ऊष्मा-निष्क्रिय पूरक नियंत्रण है, जिसमें sba बफ़र, बैक्टीरिया, और ऊष्मा-निष्क्रिय पूरक हैं । नियंत्रण B स्तंभ 2 में स्थित है और सक्रिय पूरक नियंत्रण है, जिसमें sba बफ़र, बैक्टीरिया, और पूरक है । स्तंभ 3-12 सीरम नमूने होते हैं । प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट और प्रश्नपत्र पतला 3-पंक्ति H से पंक्ति A से फ़ोल्ड में चलाया जाता है

Figure 1
चित्रा 1: रंग विकास के बाद lba प्लेटें । प्रतिनिधि एस flexneri 3a बैक्टीरियल माइक्रो कालोनियों उचित आकार के लिए रातोंरात हो गए हैं । अधिव्यापन आगर जोड़ा गया है और कालोनियों अधिव्यापन आगर में ttc यौगिक की कमी से एक लाल रंग विकसित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: NIST एकीकृत कॉलोनी गणनाकार (अच्छा) सॉफ्टवेयर इंटरफेस । अच्छा सॉफ्टवेयर इंटरफेस के ग्राफिकल प्रतिनिधित्व । ब्याज के क्षेत्र (rois) गिनती से पहले प्रत्येक स्थान के लिए कालोनियों पर केंद्रित कर रहे हैं । डेटा अच्छी खिड़की से सीधे निर्यात किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: lba अच्छा सॉफ्टवेयर में गिना प्लेटें । रंग फोटोग्राफ छवियों अच्छा सॉफ्टवेयर में लोड कर रहे हैं और कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीयूएस) स्वचालित रूप से गिना जाता है. इस छवि को अपनी कॉलोनी गिनती जानकारी के साथ दो प्रतिनिधि lba प्लेटें दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

१८५ १६७ १४५ १५१ १२२ १३४ ११९ १४२ १२४ ११५ ११३ १२३ 1:17496 कमजोर पड़ने 8
१८६ १५२ १४५ १३८ १३२ १३५ १०८ ११६ १०० ११९ १०५ १०९ 1:5832 कमजोर पड़ने 7
१७९ १६० १४५ १३५ १०९ १२० ५४ ५५ ७१ ७५ ७९ ८९ 1:1944 कमजोर पड़ने 6
१९३ १५३ १४६ १३८ ८७ १०५ 5 6 6 9 19 30 1:648 कमजोर पड़ने 5
१८४ १२९ १२१ १४३ 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 तनुता 4
१८० १४५ 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1:72 कमजोर पड़ने 3
२०७ १२९ 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 1:24 कमजोर पड़ने 2
२०१ १४० 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 कमजोर पड़ने 1
नियंत्रण एक नियंत्रण B नमुना १ नमूना 2 नमुना ३ नमुना ४ नमुना ५

तालिका 2: बैक्टीरियल कालोनियों की गिनती । cfu गिनती अच्छा सॉफ्टवेयर से एक्सेल प्रारूप करने के लिए निर्यात कर रहे हैं । ये गिनती एक तालिका में सभी डुप्लिकेट नमूनों के लिए बैक्टीरिया गिना जाता है दिखाने के लिए और कुओं को नियंत्रित करने के लिए व्यवस्था की जा सकती है ।

नियंत्रण एक नियंत्रण B १४८ १२८ १३१ १२० ११८ 1:17496 कमजोर पड़ने 8
१८९ १४७ १४२ १३४ ११२ ११० १०७ 1:5832 कमजोर पड़ने 7
nsk (1-ctrb/ctra): 22% १४० ११५ ५५ ७३ ८४ 1:1944 कमजोर पड़ने 6
५०% KI (ctrb/2): ७३ १४२ ९६ 6 8 25 1:648 कमजोर पड़ने 5
१३२ 7 1 1 1 1:216 तनुता 4
23 3 2 1 0 1:72 कमजोर पड़ने 3
1 2 1 3 1 1:24 कमजोर पड़ने 2
0 0 1 1 4 1:8 कमजोर पड़ने 1
नमुना १ नमूना 2 नमुना ३ नमुना ४ नमुना ५

तालिका 3:५०% KI cutoff मान और डुप्लिकेट नमूना औसत की गणना । ५०% KI cutoff मूल्य सभी नियंत्रण बी कुओं का औसत लेने और 2 से विभाजित करके गणना की गई थी. डुप्लिकेट का औसत प्रत्येक नमूने के प्रत्येक तनुकरण के लिए परिकलित किए गए थे जो डुप्लीकेट में चलाया गया था । nsk मान की गणना भी की जाती है.

Figure 4
चित्र 4: रेखीय अंतर्वेशन का योजनाबद्ध । सीरम परीक्षण (एक्स-अक्ष) के प्रत्येक कमजोर पड़ने पर जीवित बैक्टीरिया (y-अक्ष) की संख्या प्लॉट किया जाता है (काले हीरे), और व्यक्तिगत अंक पतली, धराशायी काली रेखा से जुड़े होते हैं । ठोस और डैश्ड क्षैतिज रेखाएँ क्रमशः 0% और ५०% हत्या दर्शाती हैं । सीरम dilutions ऊपर (कमजोर पड़ने 5) और नीचे (कमजोर पड़ने 4) ५०% हत्या लाइन एक लाल रेखा से जुड़े हुए हैं, और जीवाणुनाशक अनुमापांक (KI) संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

SBA KI
नमुना १ ७२
नमूना 2 २१६
नमुना ३ १९९४
नमुना ४ १९९४
नमुना ५ ६४८

तालिका 4: sba परिणाम दिखा जीवाणुनाशक टिटर (KI) । अंतिम sba KI मान प्रत्येक नमूने के लिए निर्धारित किया गया है और दिखाए जाते हैं । ये मान औसत सीयूएस, ५०% KI cutoff मान, और रैखिक अंतर्वेशन सूत्र का उपयोग करके परिकलित किए जाते हैं.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा परख को दर्शाता है सीरम में एंटीबॉडी की shigellacidal गतिविधि का आकलन । परख में इस प्रोटोकॉल मोनोक्लोनल S के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए प्रदर्शन किया flexneri 3 एक पिछले शिगेला टीका अध्ययन से नियंत्रण मानव सीरा के साथ9 का इस्तेमाल कर रहे थे11। इस परख में परीक्षण सीरम के स्रोत मानव नैदानिक नमूनों के लिए पूर्व नैदानिक पशु नमूनों से व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं, और सीरम नमूने की shigellacidal गतिविधि टीकाकरण और जोखिम है कि व्यक्ति का अनुभव किया है द्वारा प्रभावित हो जाएगा. कुछ परस्पर-प्रतिक्रिया निकटता से संबंधित serotypes के बीच की उम्मीद की जा सकती है, विशेष रूप से एस flexneri 2a और एस flexneri 3a लेकिन लिटिल क्रॉस-जेट की तुलना में इन उपभेदों में देखा गया है एस sonnei9. sba के आधार एंटीबॉडी-antigen बाइंडिंग से पूरक कैस्केड के सक्रियण पर केंद्रित है । इसलिए, brc अभिकर्मक की हैंडलिंग इस प्रोटोकॉल के निष्पादन में शामिल कई महत्वपूर्ण चरणों में से एक है । brc क्योंकि इसके लगातार प्रदर्शन और nsk के निंन स्तर के अंय जीवाणुनाशक assays12,13,14में इस परख में उपयोग के लिए चुना गया था ।  brc की गतिविधि तापमान संवेदनशील है और उचित उपाय है कि फ्रीज गल चक्र कम कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए, कि brc एकल उपयोग की मात्रा में aliquoted है, और कि brc aliquots जल्दी गल कर रहे हैं, तुरंत पहले परख में उपयोग करने के लिए. पूरक गतिविधि की निरंतरता इस परख के reproducibility प्रभाव होगा । एक और महत्वपूर्ण कदम है कि प्रभाव परख reproducibility उत्पादन और बैक्टीरियल स्टॉक के कमजोर पड़ने है । यह महत्वपूर्ण है कि पहले परख बैक्टीरिया का भंडार के उचित कमजोर पड़ने की शुरुआत निर्धारित की है, के रूप में परख सफलता नियंत्रण ए और बी के अनुरूप उत्पादन के आधार पर है सीएफयू गिनती औसत है ~ १२० प्रति स्पॉट cfu । ऐसे स्पॉट प्राप्त करने के लिए जो सॉफ्टवेयर द्वारा गणनीय हैं, यह भी जरूरी है कि प्लेट बैक्टीरिया को इस्तेमाल करने वाली तकनीक को सफलतापूर्वक क्रियान्वित किया जाए । जीवाणु समाधान और थाली के झुकाव का जमाव ताकि स्पॉट रन ~ 2-3 सेमी सही आकार और अच्छा सॉफ्टवेयर द्वारा सटीक गिनती के लिए सही वितरण की कालोनियों के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है । इन सभी चरणों के माहिर यह सुनिश्चित करेंगे कि सटीक, सुसंगत परिणाम इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित कर रहे हैं

यहां तक कि जब सभी महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से क्रियान्वित कर रहे हैं वहाँ अभी भी जहां यह संशोधित करने या इस प्रोटोकॉल का निवारण करने के लिए आवश्यक है उदाहरण हो सकता है. अन्य जीवाणुओं का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल के संशोधनों के लिए रात भर lba प्लेट ऊष्मायन तापमान के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, माइक्रो कालोनियों के गठन को सुनिश्चित करने के लिए. बैक्टीरिया या एंटीबॉडी स्रोतों के अन्य उपभेदों, सीरम के अलावा, एकाग्रता के पूरक की आवश्यकता हो सकती है. nsk मूल्यों और नियंत्रण सीरा की KIs भी सुनिश्चित करने के लिए कि परख उचित काम कर रहा है पर नजर रखी जानी चाहिए । nsk ७०% से अधिक वृद्धि नहीं करनी चाहिए । नियंत्रण सीरा की KI मतलब ± 2sd से अधिक भिन्न नहीं होना चाहिए । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय सफल और सुसंगत परिणाम प्राप्त करने के लिए, ऊपर उल्लिखित महत्वपूर्ण चरणों पर विशेष ध्यान देने के साथ सभी चरणों को पूरा करना आवश्यक होगा ।

हालांकि यह प्रोटोकॉल शिगेला अनुसंधान समुदाय में एक महत्वपूर्ण आवश्यकता भरता है, यह इसकी सीमाओं के बिना नहीं है । इस प्रोटोकॉल जैविक सामग्री पर निर्भर करता है और, इसलिए, हमेशा कुछ परिवर्तनशीलता कि नियंत्रण के लिए मुश्किल है हो जाएगा । विभिन्न लॉट और स्रोतों से पूरक गतिविधि में भिन्नता assays में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं. इस को कम करने के लिए, यह उचित पूरक संभाल और खरीद से पहले गतिविधि के लिए पूरक के नए बहुत परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह भी एक सजातीय आपूर्ति करने के लिए जाना जाता गतिविधि के साथ पूरक बहुत के पूल बनाने के लिए उपयोगी हो सकता है. इस प्रोटोकॉल डिजाइन द्वारा सरल है और किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है और स्वचालित कॉलोनी गणना सॉफ्टवेयर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है । हालांकि इस सादगी एक लाभ है, इस प्रोटोकॉल वस्तुतः किसी भी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है, यह अभी भी एक रात ऊष्मायन की आवश्यकता है । हाल के assays वर्णित किया गया है कि बहुत कम ऊष्मायन आवश्यकता है, लेकिन विशेष, तैयारी अभिकर्मकों15की आवश्यकता है । इस परख की एक और सीमा यह है कि अपने वर्तमान रूप में यह केवल एक ही बार में एक जीवाणु प्रजातियों की जांच करने में सक्षम है । शिगेला क्षेत्र में एक बहुमान वैक्सीन बनाने की इच्छा होती है, और इम्यूनोलॉजिकल assays होते हैं जो एक मल्टीप्लेक्स तरीके से रोगजनकों का आकलन कर सकते हैं महान मूल्य का है । यह परख भविष्य में इस जरूरत को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, लेकिन अपने वर्तमान रूप में, यह एक एकल-plex परख है ।

जबकि इस परख कुछ सीमाएं हैं, यह अभी भी मौजूदा या वैकल्पिक तरीकों पर कई फायदे हैं । इन लाभों में कई सुधार शामिल हैं जो इस विधि के निष्पादन को बहुत कम श्रम-प्रधान और पारंपरिक sbas की तुलना में अधिक उच्च थ्रूपुट बनाने के लिए संयोजित करते हैं । जमे हुए बैक्टीरियल स्टॉक का उपयोग, एक ९६-अच्छी तरह से थाली परख प्रारूप, बड़ा वर्ग पेट्री व्यंजन पर चढ़ाना, कालोनियों कि छायाचित्रण और स्वत: कॉलोनी के लिए अनुमति देता है की रंगाई-गिनती, सभी सामग्री और समय को कम करने के लिए इस पूरा करने के लिए आवश्यक मदद परख. इस परख भी अंय उच्च throughput तरीकों पर लाभ है क्योंकि यह किसी विशेष अभिकर्मकों या उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । वर्णित प्रोटोकॉल बुनियादी अभिकर्मकों और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है, किसी भी प्रयोगशाला की स्थापना में अपने आवेदन के लिए अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल प्रदान करता है लाभ के सभी कई भविष्य की जांच में इसके उपयोग का समर्थन करता है । परख आदर्श टीकाकरण या प्राकृतिक संक्रमण के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की परीक्षा के लिए अनुकूल है । यह आवेदन sba के लिए शिगेला वैक्सीन अनुसंधान में एक मूल्यवान उपकरण होने की अनुमति देता है और पहले से ही शिगेला जैव में वैक्सीन immunogenicity का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है संयुग्मी टीके जहां यह इन टीके की क्षमता का प्रदर्शन किया है कार्यात्मक एंटीबॉडी16के उत्पादन को प्रेरित । इस प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर कई प्रयोगशालाओं द्वारा परीक्षण किया गया है और विश्वसनीय, पुनरुद्निर्माण परिणाम9का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है. इस प्रोटोकॉल भी तुलनीय परिणाम जब एक ही नमूने अंय जीवाणुनाशक assays17का उपयोग कर परीक्षण कर रहे है पैदा करता है । इस परख द्वारा उत्पंन डेटा में निरंतरता, और अंय पुराने तरीकों के साथ अपनी संगतता यह सही सीरम नमूनों में जीवाणुनाशक गतिविधि का आकलन करने के लिए एक मजबूत उपकरण बनाता है । परख भी आसानी से अतिरिक्त नमूना प्रकार के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । जबकि सीरम वयस्क नैदानिक परीक्षणों में आसानी से उपलब्ध है, यह शिशुओं और छोटे बच्चों पर ध्यान केंद्रित परीक्षणों में पर्याप्त सीरम प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है; शिगेला टीके के लिए अंतिम लक्ष्य आबादी में से एक । इन परीक्षणों में, पूरे रक्त को नियमित रूप से फिल्टर पेपर पर एकत्र किया जाता है और सूख जाता है । वहां नमूना प्रारूप के इस प्रकार के साथ कुछ प्रारंभिक सफलता sba का उपयोग किया गया है । पूरे रक्त के अलावा, श्लेष्मल नमूने (जैसे लार, मल अर्क, और मूत्र) भी एक लक्ष्य है जो शिगेला वैक्सीन अनुसंधान में प्रासंगिक है । वर्तमान में, इस प्रोटोकॉल को शिगेला के सबसे नैदानिक रूप से प्रासंगिक सेरोटाइनों में से तीन के लिए मूल्यांकन किया गया है, लेकिन यह अतिरिक्त शिगेला एसपीपी के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है । साथ ही साथ अन्य बैक्टीरियल रोगजनकों । भविष्य के काम इस प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित परख के रूप में एक ही विशेषताओं के कई के साथ एक मल्टीप्लेक्स परख के उत्पादन पर ध्यान दिया जाएगा । एक बहुसंकेतित परख एक साथ कई शिगेला सीरोटाइप के मूल्यांकन के लिए अनुमति देगा, आगे नमूना मात्रा और परख समय पर हाथ संरक्षण । दुनिया भर में प्रयोगशालाओं को इस परख हस्तांतरण करने के लिए भी काम चल रहा है । इन वैश्विक मूल्यांकन एक बड़ा अनुसंधान पैमाने पर परख योग्यता की दिशा में अधिक डेटा उत्पंन करेगा, जबकि एक ही समय में माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी प्रयोगशालाओं कि इस sba के लिए उपयोग किया है की संख्या में वृद्धि बैक्टीरिया और सीरम नमूने का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न स्थानिकमारी वाले स्थानों से एकत्र । परख यहां वर्णित सरल और उच्च throughput है और के लिए शिगेला क्षेत्र में प्रतिरक्षा मूल्यांकन में सुधार करने की क्षमता है, साथ ही साथ अंय जीवाणु रोगजनकों के मूल्यांकन के लिए व्यापक अनुप्रयोगों ।

Disclosures

आर. K अमेरिकी सरकार का एक कर्मचारी है और इस तरह इस प्रकाशन में व्यक्त विचार लेखकों के हैं और जरूरी नहीं कि सरकारी नीति या सेना, रक्षा विभाग, और न ही अमेरिकी सरकार के विभाग के पद प्रतिबिंबित करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम के लिए पथ से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था m.h.n. यह अध्ययन वाल्टर रीड आर्मी इंस्टीट्यूट ऑफ रिसर्च और बर्मिंघम विश्वविद्यालय अलबामा के बीच एक सहकारी अनुसंधान और विकास समझौते के रूप में आयोजित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/

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References

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एक उच्च थ्र्रपुट <em>शिगेला</em>-विशिष्ट जीवाणुनाशक परख
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Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).More

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).

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