Summary
여기 우리는 혈 청에서 항 체의 Shigellacidal 활동을 측정 하는 프로토콜을 제시. 혈 청은 박테리아와 외 인 보수, 인 큐베이 팅, 혼합 그리고 반응 혼합물은 한 접시에 도금. 실행 가능한 박테리아는 계산, 자동된 식민지 열거자를 사용 하 고 살 균 titer를 결정 하는 데 사용 되는 식민지를 형성 한다.
Abstract
혈 청 살 균 분석 (Sba)는 항 체의 기능 활동을 측정 하 고 많은 수십 년 동안 사용 되었습니다. Sba는 직접 바인딩할 박테리아 및 보완 활성화에 대 한 혈 청 항 체의 능력을 평가 하 여 항 체 살인 활동을 측정 합니다. 이 보완 활성화 결과 세포와 대상 박테리아의 살인. 이 분석 실험은 그들은 생물 학적 기능 있는이 항 체, 항 체는 감염 방지에 재생할 수 있습니다 역할을 연구 하는 연구자 수 있도록 명료 하 항 체 생산을 측정 넘어 가기 때문에 중요 합니다. Sba 많은 인간 병원 체에 대 한 면역 반응을 연구 하는 데 사용 되었습니다 하지만 현재 이질균 에 대 한 아무 널리 허용된 방법론. 역사적으로, Sba 되었습니다 매우 노동 집약적인 살아남은 박테리아를 정확 하 게 계량에 많은 시간이 걸리는 단계 요구. 이 프로토콜 설명 간단 하 고, 강력 하 고 높은 처리량 분석 결과 혈 청 체 외에서 이질균 에 대 한 조치 기능 항 체 관련. 여기 설명 하는 방법을 전통적인 Sba, 냉동된 세균성 주식의 사용을 포함 하 여 많은 이점이, 96 잘 접시, 마이크로-문화 시스템, 그리고 자동화 된 식민지 세 시험. 모든 이러한 수정은 보다 적게 노동 집약 및 더 높은 처리량이 분석이 결과 확인합니다. 이 프로토콜은 간단 하 고 빠르게 여전히 간단한 기술과 쉽게 사용할 수 있는 시 약을 사용 하는 동안 전통적인 Sba 보다 수행 하. 프로토콜 여러 독립적인 실험실에서 성공적으로 적용 되었습니다 이며 분석 결과 강력 하 고 재현할 수 있습니다. 분석 결과 사전 임상으로 임상 연구에서 면역 반응을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. Shigellacidal 항 체 titers (예방 접종 또는 감염 중) 항 원 노출 전후 모두 얼마나 기능 항 체 응답 생성의 광범위 한 이해와 보호 면역에 그들의 공헌에 대 한 수 측정 이 표준의 개발, 잘 특징 분석 결과 Shigella 백신 디자인을 촉진 크게 수 있습니다.
Introduction
S. sonnei , S. flexneri 3a, Shigella flexneri 2a, shigella serotypes 역학 보급 세계적으로 보여줍니다. 설사 질병 이러한 Shigella 종의 영향 군사, 여행자 발생1, 그리고 개발 도상국2에서 5 세 미만 아이 들 설사 죽음의 주요 원인. 그러나 현재 없습니다 허가 백신 Shigella으로부터 보호 하기 위해,, 개발의 여러 단계에서 여러 후보 백신 있습니다. 이 백신 개발에 현재 기타 예방 조치의 많은 Shigella lipopolysaccharide (LPS)에 대 한 생산 하는 항 체에 초점. LPS는 매력적인 백신 후보 주요 표면 항 원 그리고 Shigella 자연 감염 유도 serotype 특정 방식으로 다시 감염에 대하여 보호 될 수 있는 LPS-특정 항 체 때문입니다. 따라서, 성공적인 Shigella 백신 가능성이 있어야 합니다 멀티-발렌타인 및 대상 3-4 Shigella serotypes 세계적으로 순환 긴장3,4, 의 70-80%에 대 한 면역을 유도 하 5 , 6.이 Shigella 백신 후보자를 평가 하는 분석 여러 다른 serotypes에 대 한 특정 해야 합니다.
백신 후보자를 평가 하기 위한 현재 면역학 분석 실험 측정 항 체 titers의 수준에 집중 하지만 몇 가지 특징이 잘 분석 기능 항 체를 평가 하는. 병원 체 특정 항 체는 박테리아 표면 항 원, 바인딩 등을 접착을 방지 하는 기능 메커니즘의 숫자를 통해 감염을 퇴치에 대 한 책임 때문에 항 체 기능적 능력의 시험이 중요 하 고 상피 세포, 세균 세포 또는 opsonization 그리고 식 균 작용, 지정 하 고 직접 바인딩 및 보충 폭포를 시작 하 여 병원 균을 죽이고의 감염. 항 체에 의해 박테리아의 직접적인 살인 항 체 대상 박테리아의 표면 구성 요소를 바인딩할 많은 zymogens는 궁극적으로 박테리아에서 기 공 형성에 결과 셀의 활성화에 지도 보충 폭포를 시작 하는 경우에 발생 세포 및 박테리아 죽음을 발생합니다. 이 직접 죽이 항 체 및 보완을 순환 하 여 박테리아의 감염 방어의 중요 한 초기 라인 있을 수 있습니다.
자연적으로 감염 된 개인은 그들의 세라에 shigellacidal 활동 항 체를 있다. 이러한 Shigella-특정 항 체는 7,8분석 실험 전통적인 보완-중재 살인을 사용 하 여 발견 했다. 이질균에 대 한 보호의 살 균 항 체에 대 한 역할 있을 수 있음을 나타냅니다. 전통적인 bactericidal 분석 실험은 그들의 실행에서 간단: 혈 청은 열 (내 생 보완 활동 파괴)을 비활성화 하 고 관심의 박테리아와 혼합. 외 인 보수는 특정 농도에이 혼합물에 추가 됩니다. 반응 혼합물 세균성 살해 수 있도록 인 큐베이 팅 하 고 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 확인 후 도금. CFUs 계산 됩니다, 일단 50% 살인 지 (반) 산출 될 수 있다 고 SBA titer 결정. 이 절차는 비교적 간단 하 고, 하는 동안 이러한 분석 노동 집약 하 고 수 수 하 고 결과 매우 다양 수 있습니다. 이러한 제한 뿐만 아니라 현재 아무 특징이 잘 기능 분석에 대 한 존재 이질균. 따라서, 우리 성공적으로 개발 하 고 가장 임상 관련 종자9의 3 Shigella 살 균 활동을 측정 하는 간단 하 고, 높은 처리량 분석 결과 자격. 이 프로토콜 분석 결과 효율성과 재현성을 향상 시키는 수정 SBA를 설명 합니다. 이러한 개조의 첫 냉동된 세균성 주식의 사용 이다. 단일 사용 주식의 생산 또한 분석 결과를 분석 결과 가변성을 감소 시키고 있는 동안 각 분석 결과 대 한 문화 신선한 박테리아를 필요가 없습니다. 또 다른 시간과 노동 96 잘 접시 분석 결과 포맷의 사용은 저장 하는이 프로토콜을 이용. 이 샘플의 직렬 희석 농도의 범위를 테스트할 수 있도록 수 있습니다. 그것은 또한 도금 사각 접시에 샘플에 대 한 멀티 채널 펫의 사용에 대 한 수 있습니다. 이러한 사각형 접시 문화 시스템을 생산 하는 마이크로-식민지와 함께에서 사용 되는 경우 한 천 배지는 분석 결과 대 한 요구의 수는 감소 됩니다. 함께 자유롭게 사용할 수 있는 식민지 계산 소프트웨어, 원래 폐 렴 다중화 opsonophagocytic 분석 결과 (MOPA)10, 살인에 대 한 개발 가능, 자동화, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 식민지 열거 합니다. 이러한 개선의 모든 줄일 실습 시험 시간 및 높은 처리량 시스템 여러 접시 한 번에 실행 될 수 있도록.
이 프로토콜은 3 이질균, SBA는 여기에 설명 된의 가장 임상 관련 serotypes에 대 한 최적화 되었습니다 동안 다른 많은 세균성 병원 균에 쉽게 적용할 수 있습니다. 다른 박테리아와이 프로토콜의 사용 가능성, 뿐만 아니라이 프로토콜 점 막 샘플 같은 다른 관련 샘플 형식에서 항 체의 분석을 포함 될 수 있습니다, 시작 물자로만 혈 청을 사용 하 여 확장 가능성이 있다 타 액과 배설물 샘플을 포함합니다. 예방 접종 후 면역 응답을 조사 하는이 분석 결과 사용 하 여 백신의 합리적인 디자인을 선도 하는 예방 접종에 의해 생성 된 면역 반응에 대 한 광범위 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 그리고 어떻게 자연 면역의 이해에 원조 개발.
Protocol
이 프로토콜 WRAIR 인간 주체의 보호 위원회의 지침을 따릅니다. 이 연구에 사용 된 샘플 WRAIR 프로토콜 번호 1328, 인간을 대상의 보호 통치 모든 기관 및 연방 규정을 준수의 일환으로 수집 하는 인간의 혈 청 샘플 있습니다. 샘플 드 식별, 그리고 이러한 익명 샘플 사용 UAB IRB (프로토콜 번호 N150115001)에 의해 비 인간 대상 연구로 분류 되었다.
1. 분석 결과 시 약 준비
- 1% 준비 물 100 mL에 젤라틴의 1 g을 추가 하 여 젤라틴. 오토 클레이 브 그리고 실내 온도에 상점입니다.
- 준비 100 mg/mL TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium 염화) 재고 솔루션 (1, 000 x) 40 mL 물에 TTC의 5 g을 추가 하 여. TTC 완전히 해산 때 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 살 균 필터와 물 50 mL를 볼륨을 조정 합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
참고: TTC는 세균성 식민지 색을 지정 하 고 그들을 훨씬 쉽게 계산 하. TTC 솔루션은 약간의 노란색. TTC 솔루션 개발은 붉은 색, 삭제 하 고 신선한 준비. - 물 40 mL에 5 g 앤3 을 추가 하 여 10% 나트륨 아 지 드 (NaN3) 재고 솔루션 (100 x)를 준비 합니다. 완전 한 해체 후 물 50 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 상점.
주의: 나트륨 아 지 드 독 이며, 섭취 또는 피부 또는 눈을 통해 흡수 하는 경우 독성이 있을 수 있습니다. 그것은 리드와 높은 폭발성 금속 azides를 구리 배관 반응 수 있습니다. 나트륨 아 지 드를 포함 하는 시 약의 처분, 아 지 드 형성을 방지 하거나 생물 가방에 무시 하는 물의 큰 볼륨 플러시. - 물과 압력솥의 1 l 파운드 agar의 35 g를 추가 하 여 LBA 플레이트 (파운드 천 배지)를 준비 합니다. 각 광장 페 트리 접시 (120 x 120 m m2) 25 mL를 추가 합니다. 접시를 공고히 한 천 수 있도록 10-20 분에 대 한 RT에서 품 어. 최대 1 개월에 대 한 비닐 봉지와 4 ° C에 저장소에 다시 접시를 놓습니다.
- 물과 압력솥의 1000 mL를 agar의 7.5 g을 추가 하 여 중첩 Agar를 준비 합니다. 56 ° C 물 목욕까지 필요에서 품 어. 바로 사용 하기 전에, 100 mg/mL TTC와 10 mL의 1 mL을 추가 10% 할머니3 와 섞어 잘.
참고: 각 LBA 판 오버레이 Agar의 25 mL이 필요합니다. 오버레이 한 천 1 개월 사전에 준비 하 고 분석 결과 대 한 필요에 따라 전자 레인지 나 핫 플레이트에 녹아 수 있습니다. 천이 온도 LBA 판 응용 프로그램 전에 ~ 55 ° C 인지 확인 합니다. - 물 40 mL에 5 mL의 10 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 캘리포니아2 +/Mg2 + 와 1% 젤라틴의 5 mL을 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 실내 온도에 상점.
2. 준비 보완 및 박테리아를 대상
-
준비 아기 토끼 보완 (BRC)
참고: 기준 보완 많은 선택을 찾을 수 있습니다 여기에 대 한 자세한: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf- BRC 냉동된을 녹여 냉 수를 실행 합니다. 물리적으로 혼합 된 BRC 마다 10 ~ 20 분 완전히 해 동 때까지. BRC 반복된 동결 해 동 주기를 적용 하지 마십시오.
- BRC 녹고 동안 1.5 mL 이나 5 mL, 15 mL 원심 분리기 튜브 라벨. 장소 표시를 미리 냉각 얼음에 튜브. 사전 냉각된 원심 분리기 튜브에 aliquot 적절 한 볼륨 BRC (작성 후 즉시 반환 각 튜브는 얼음에). Aliquots ≤-70 ° C에서 냉동 실에 저장 합니다.
참고: 보완의 약 1 m 각 분석 결과 접시 필요 합니다. 보완 aliquots 싱글 이며 aliquoted 레이아웃 분석 결과에 적합 한 볼륨에 있어야 합니다. - 열 비활성화 BRC를 준비 하려면 활성 BRC의 한 약 수 동. 56 ° C 물 목욕을 준비 합니다. BRC 완전히 해 동 후 물 목욕을 전송 하 고 30 분 동안 품 어.
- 부 화, 후 물 목욕에서 열 비활성화 BRC 제거 하 고 10-15 분 믹스에 대 한 적극적으로, RT에 시원한 수 그리고 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 aliquot ~ 150 µ L. 저장 ≤에 aliquots-10 ° c.
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준비 대상 박테리아 주식
참고: 다음 절차의 대상 박테리아; 48 aliquots를 준비 하는 더 많은 aliquots가 필요한 경우 프로토콜 확장할 수 있습니다.- 마스터는 냉장고에서 유리병 주식과 혈액 한 천 배지 위에 유리병에서 얼음의 작은 금액을 제거 하는 냉동된 세균성 표면 긁어 박테리아를 제거 합니다. 즉시 냉동 실에 마스터 재고 유리병을 반환 합니다.
- 혈액 한 천 배지와 접시 뚜껑 덮개에 세균 재고의이 작은 약 수 행진 품 어 접시 거꾸로 하룻밤 37 °C/5% CO2 배양 기에서.
- ~ 10 격리 된 부드러운 식민지 파운드 국물의 30 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 전송. 문화 국물 ~0.6 0.7의600 세 때까지 부드럽게 흔들어 37 ° C에서 3-5 h에 대 한 품 어.
- 최고 12.5 mL 문화와 신선한 50 mL 튜브에 수확. 문화는 탁상용 마이크로 원심 분리기를 사용 하 여 2 분 동안 15000 x g 에서 원심 상쾌한 삭제 하 고 다시 15% 살 균 글리세롤-파운드 25 mL에 펠 릿을 일시 중단.
- 잘 혼합 하 고 0.5 mL aliquots 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 (~ 48 튜브)로 분배. Aliquots ≤-70 ° C에서 냉동 실에 저장 합니다.
- 사용 하기 전에 교착 테스트를 사용 하 여 세균성 id를 확인 합니다.
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대상 박테리아 주식에 대 한 최적의 희석 비율의 결정
참고: 각 일괄 처리 대상 박테리아의 희석 ~ 120 CFU/파운드 플레이트에 자리를 양보 하는 데 필요한 결정 하기 위해 시험 조건에서 적정 해야 합니다.- 결정 플레이트 (희석 플레이트) 고 1A를 잘 분석 결과 버퍼의 135 µ L을 추가. 분석 결과 버터 120 µ L를 웰 스 1B-1 시간 추가.
- 냉장고에서 냉동된 대상 박테리아의 유리병을 제거 하 고 실 온에서 해 동. 1A 세균 주식의 10 희석 수 있도록 잘 해 동 세균성 주식 15ul을 추가 합니다.
- 5 직렬 희석을 수행 하기 위해 잘 1b 잘 1A에서 30 µ L 세균성 솔루션의 전송. 8 희석 (1시 10분, 1시 50분, 1: 250, 250 1:1; 250 1:6; 250 1: 31; 250 1: 156, 1:781 250)의 총에 대 한 1 시간을 잘 5 직렬 희석을 계속 합니다.
- 다른 결정 플레이트 (분석 결과 플레이트) 하 고 열 1과 2는 시험 접시에 모두 잘 분석 결과 버퍼의 20 µ L를 추가.
- 1과 2는 시험 접시의 열에 해당 우물에 각 잘 희석 플레이트의 열 1에서에서에서 희석된 박테리아의 10 µ L를 전송. 박테리아의 10 µ L 잘 1A와 2A 분석 결과 접시, 등으로 희석 판의 잘 1A에서 전송 됩니다.
- 분석 결과 A 컨트롤과 컨트롤 B 단계 3.6-3.12에 혈 청 살 균 분석 결과 (SBA) 아래 설명 된 대로 계속 합니다.
- 판 얼음에 인 큐베이 팅 되었습니다, 후 LBA 플레이트에 열 1에 있는 우물에서 10 µ L 자리 8 피 펫 팁 멀티 채널 피 펫을 사용 합니다. 또한, LBA 플레이트에 열 2에서에서 우물 자리.
- 3.14-4.6 단계에서 아래와 같이 분석 결과 함께 계속.
- 결정 제어 b에서 ~ 120 CFU/자리 생성 박테리아 희석,이 희석 분석 결과에 사용 됩니다.
3. 혈 청 살 균 시험 (SBA)
참고: 아래 설명 된 절차 한 분석 결과 접시, 하지만 분석 결과 접시의 수를 늘릴 수 있습니다.
- 30 분 동안 56 ° C 물 욕조에 잠복기 샘플에는 샘플을 테스트 열 비활성화.
참고: 테스트 샘플은 어떤 생 보완 활동 폐지를 테스트 하기 전에 열 비활성화 되어야 합니다. 이 분석 결과 앞서 행 해질 수 있다 고 사 샘플을 다시 동결 또는 테스트 때까지 4 ° C에서 저장 수 있습니다. - 분석 결과 플레이트 및 추가 분석 결과 버퍼의 20 µ L 열 1 행의 A G. 추가 20 µ L 통해 분석 결과 버퍼의 열 1과 2 행 H의 12, 표 1을 참조 하십시오.
- 중복 행 H 분석 결과 접시의 각 테스트 샘플의 30 µ L을 로드 합니다. 예를 들어 3 H, 4 H, 웰 스에 샘플 1의 30 µ L를 분배 하 고 웰 스 H 5와 6 H 등으로 30 µ L 샘플 2의 분배.
-
멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 테스트 샘플의 3 연속 희석을 수행 합니다.
- 행 G 10 우물 3-12 시에서에서 샘플의 μ와 해당 웰 스 전송 제거 하 고 잘 아래로 pipetting으로 샘플을 혼합 8-10 시간.
- 다음 행 F 10 우물 3 G-12 G에서에서 μ와 해당 우물에 제거 하 고 잘 혼합.
- 계속 행 A. 통해 직렬이 희석 혼합 후 행 A 우물, 제거 하 고 모든 웰 스 포함 20 µ l 우물 3A-12A에서 10 µ l를 삭제 합니다.
참고: 혈 청의 20 µ L 80 µ L의 분석 결과 전체 볼륨에서 사용 되, 분석 결과에 4-fold 추가 희석이입니다. 이 희석 혈 청 희석 4를 곱하여 SBA titer의 계산 하는 동안 계정에 촬영 해야 합니다. 예를 들어 1: 2의 시작 희석을 사용 하는 경우 테스트 중인 실제 희석 1:8입니다.
- 냉동된 대상 박테리아 재고와 실 온에서 해 동 한 유리병을 제거 합니다. (이 희석 요인은 섹션 2.3결정 했다) 미리 정해진된 최적의 희석 요인에 따라 분석 결과 버퍼의 20 mL에 박테리아를 희석. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 희석된 박테리아의 10 µ L를 추가 합니다.
- 또는 제거 냉동된 BRC의 한 유리병과의 한 유리병 열 비활성화 BRC, 냉 수를 실행을 실 온에서 해 동 냉동 해 동 신속 하 게 공기를 불어 캐비닛 생물 안전의 창 살에 장소.
- 열 비활성화 BRC의 20% 솔루션을 준비 합니다. 믹스 100 µ L 열 비활성화 BRC의 분석 결과 버퍼의 400 µ L와. 열 1 (제어 A 우물)에 있는 모든 우물에이 20% 열 비활성화 BRC 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
참고: 열 비활성화 BRC 분석 결과에서 일반적인 살인 (NSK)를 모니터링 하는 제어로 사용 됩니다. - 네이티브 BRC의 20% 솔루션을 준비 합니다. 분석 결과 버퍼의 4 mL와 함께 네이티브 BRC의 1 mL를 혼합. 열 2 12 (제어 B와 테스트 샘플 우물)-모든 우물에이 혼합물의 50 µ L를 추가 합니다.
참고: 반응 혼합물에서 BRC의 최종 농도 12.5%입니다. - 짧게 분석 결과 플레이트 판 통에 10-15 s 부드럽게 흔들어 혼합 또는 8 배 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 혼합.
- (흔들어) 없이 분석 결과 플레이트 37 ° C 2 h에 대 한 미생물 배양 기에 넣어.
- 건조 2 LBA 판 뚜껑을 제거 하 고 접시를 배치 하 여 생물 안전 캐비닛 40-60 분에 직면 하 고.
- 2 h 부 화 완료 되 면 얼음을 젖은 반응을 중지를 10-20 분 동안 품 어을 분석 결과 접시를 이동 합니다.
- 12 채널 피 펫을 사용 하 여 행 H, 및 LBA 판의 하단에 반응 혼합물의 자리 접시 10 µ L에서 웰 스 믹스. 즉시 접시를 기울기 고 ~1.5-2 cm. 행 G, F, E, LBA 접시에 이전 행 위에 그들을 야생에 대 한이 절차를 반복에 대 한 실행을 관광 명소. 행 E, F, G 및 H LBA 플레이트, 및 행 A, B, C 및 D는 같은 방식으로 두 번째 LBA 접시에 발견 한 발견은 그림 1을 참조 하십시오.
- 솔루션은 LBA 접시 (10-15 분)으로 흡착 될 때까지 실 온에서 LBA 접시를 품 어. LBA 접시에 뚜껑을 넣고 밤새 품 어를 거꾸로 미생물 인큐베이터에서 LBA 판 배치 (16 ~ 18 h). S. flexneri 2a, 3a 29 ° C에서 품 어와 품 어 S. sonnei 는 26 ° c.에
참고: 이 온도 더 작은 "마이크로-식민지" 식민지 카운터9에의해 정확한 계산을 위해 적당 한 크기와 항복. - 하룻밤 부 화 후 25 mL 오버레이 Agar의 (~ 55 ° C)에서 포함 하는 100 µ g/mL TTC와 0.1% 할머니3 각 LBA 접시에 추가 합니다.
- LBA 판 붉은 색 개발 아래 그림 1 을 참조 하십시오 살아남은 박테리아 수 있도록 2 h 37 ° C에서 품 어.
- 사진 디지털 카메라를 사용 하 여 접시와 NIST의 통합된 식민지 열거 소프트웨어 (니스)가 설치 된 컴퓨터에 이미지를 전송 그림 2를 참조 하십시오.
참고: 멋진 식민지-세 소프트웨어 비용 없이 이용하실 수 있습니다. 세부 사항 및 설치 지침에 대 한 자료 목록 참조.
4. 수 세균성 식민지
- 오픈 좋은 소프트웨어 및 입력된 연산자 이름, 실험 정보 및 모든 빈 필드에 메모 를 시험. 이 데이터 입력 되 면 완료 단추를 클릭 합니다.
- 열기 단추를 클릭 하 고 컴퓨터에서 올바른 파일을 선택 하 여 촬영된 번호판을 가져옵니다.
- 12의 열 수와 4 행 의 수를 설정 하 여 분석 결과 매개 변수를 조정 합니다. -3 시그마 배경 설정과 낮은 해상도 조정 합니다. 그림 2를 참조 하십시오.
- 클릭 하 여 각 ROI는 직접 한 샘플 자리를 관심사 (ROIs)의 영역을 이동 합니다. 모든 세균성 식민지 샘플 사이 아무 중복 투자 수익 내는 확인 하십시오. 한 접시 완료 되 면 저장 데이터 이미지 목록에서 다음 접시를 두 번 클릭 하 고는 ROIs를 조정 합니다. 그림 2를 참조 하십시오.
- 모든 접시 조정 되었습니다, 녹색 수 버튼을 클릭, 그림 2 및 그림 3참조. 완료 되 면 세.xls/.xlsx 형식에서 데이터를 내보내려면 내보내기 버튼을 클릭 합니다. 이름 하 고 데이터 분석에 대 한.xls/.xlsx 파일을 저장 합니다.
- 조사 분석 결과 96 잘 접시를 나타내는 테이블에 구성 됩니다 있도록 테이블 형식으로 데이터를 내보낸, 참조 표 2.
5. SBA Titer (기) 및 비 특정 살인 (NSK) 계산
참고: SBA titer, 또는 살인 인덱스 (반) 대상 박테리아의 50%를 죽이 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.
- 활성 보완 제어 우물 (제어 B)의 CFU를 평균 하 고 2로 분할 하 여 인덱스 (기) 컷오프 값을 죽이고 50%를 계산 합니다. 각 희석 중복에서 실행 하는 각 샘플에 대 한 평균 CFU 계산 표 3을 참조 하십시오.
- 혈 청 희석 거의 정확 하 게이 50% 기 값을 얻을 것입니다, 때문에 그것은 두 개의 순차적 혈 청 희석, 살인 보다는 더 적은 50%와 50% 이상 죽이에서 보간 수 있습니다 그림 4를 참조 하십시오. 보간된 SBA 기 계산을 위한 공식은 아래와 같습니다.
참고: 살 균 titer, 또는 기, 또한 UAB에서 개발한 Opsotiter 소프트웨어를 사용 하 여 자동으로 계산할 수 있습니다. 요청 Opsotiter 박사 문 남 또는 씨 롭 버튼 문의. 연락처 정보에 대 한 https://www.vaccine.uab.edu를 참조 하십시오. - 제어 B 컨트롤 a.의 평균으로 나눈 값의 평균을 뺀 1을 복용 하 여 NSK 값 계산
Representative Results
전형적인 분석 결과에 사용 되는 96 잘 접시 레이아웃에 표시 됩니다 표 1. 이 레이아웃에는 중복에서 활성 보완 제어 웰 스 (제어 B), 열 비활성화 보완 제어 웰 스 (제어 A), 및 5 개의 샘플. 샘플은 3-fold 희석 순차적으로 한 번에 테스트할 각 샘플의 8 희석에 대 한 수 있도록 행 하 행에서에서 접시를. 그림 1 야간 보육 및 오버레이 추가 후 2 개의 LBA 격판덮개를 보여준다. 색상 개발 자리를 차지 하 고 모든 살아남은 식민지 빨간색으로 표시 됩니다. 세균 죽이 처음 세 희석 (행 F-H)에서 테스트 하는 모든 샘플에 대 한 명확 하 게 볼 샘플 희석 접시를 더, 세균성 살해 감소 혈 청은 덜 집중 볼 수 있다. 좋은 소프트웨어 인터페이스는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 좋은 소프트웨어에서 마이크로-식민지 수는 그림 3에서 볼 수 있습니다 그리고 이러한 수 표 2에 조직 되었습니다. 각 샘플의 각 희석에 대 한 평균 CFU 수가 계산 되 고 50% 기 값은 표 3에 계산. 이 50% 기 값은 그림 4에서 설명 하는 수식에 따라 SBA 기 계산 하는 데 필요한 값을 결정 하는 각 혈 청 희석에 대 한 평균된 CFUs에 적용할 수 있습니다. 분석 결과의 최종 결과 표 4에 표시 됩니다.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 컨트롤 A | 제어 B | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 | 8 희석 |
| B | 컨트롤 A | 제어 B | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 |
| C | 컨트롤 A | 제어 B | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 |
| D | 컨트롤 A | 제어 B | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 |
| E | 컨트롤 A | 제어 B | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 |
| F | 컨트롤 A | 제어 B | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 |
| G | 컨트롤 A | 제어 B | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 |
| H | 컨트롤 A | 제어 B | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 |
| 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | ||||||||
표 1: 분석 결과 플레이트 레이아웃. 열 1 및 2 포함 보완 제어 우물. 컨트롤 A 열 1에에서 위치 하 고 있으며 열 비활성화 제어, SBA 버퍼, 박테리아, 그리고 열 비활성화 보완 보완. 제어 B 열 2에에서 위치 하 고 있으며 활성 제어, SBA 버퍼, 박테리아, 그리고 보완 보완. 열 3-12 혈 청 샘플을 포함합니다. 각 샘플 중복 하 고 순차적으로 희석 3-fold에서 실행 행 H 행 A
그림 1: 컬러 개발 후 LBA 판. 대표 S. flexneri 3a 세균성 마이크로-식민지 하룻밤 적절 한 크기로 성장 했다. 오버레이 agar를 추가 하 고 식민지 오버레이 agar에 TTC 화합물의 감소에 의해 붉은 색을 개발 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: NIST의 통합 식민지 열거자 (니스) 소프트웨어 인터페이스. 좋은 소프트웨어 인터페이스의 그래픽 표현입니다. 관심 (ROIs) 영역 계산 하기 전에 각 명소에 대 한 식민지 중심은. 좋은 창에서 직접 데이터를 내보낼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: LBA 판 계산된에서 좋은 소프트웨어. 컬러 사진 이미지 좋은 소프트웨어에 로드 하 고 콜로 니 형성 단위 (CFUs)는 자동으로 계산 됩니다. 이 이미지는 두 대표 LBA 접시와 그들의 서식 지 수 정보를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 185 | 167 | 145 | 151 | 122 | 134 | 119 | 142 | 124 | 115 | 113 | 123 | 1:17496 | 8 희석 |
| 186 | 152 | 145 | 138 | 132 | 135 | 108 | 116 | 100 | 119 | 105 | 109 | 1:5832 | 희석 7 |
| 179 | 160 | 145 | 135 | 109 | 120 | 54 | 55 | 71 | 75 | 79 | 89 | 1:1944 | 희석 6 |
| 193 | 153 | 146 | 138 | 87 | 105 | 5 | 6 | 6 | 9 | 19 | 30 | 1:648 | 희석 5 |
| 184 | 129 | 121 | 143 | 6 | 7 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | 희석 4 |
| 180 | 145 | 22 | 24 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1: 72 | 희석 3 |
| 207 | 129 | 1 | 0 | 2 | 2 | 1 | 0 | 4 | 1 | 0 | 1 | 1:24 | 희석 2 |
| 201 | 140 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 4 | 4 | 1:8 | 희석 1 |
| 컨트롤 A | 제어 B | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | |||||||
표 2: 세균성 식민지의 수. CFU 카운트 형식 excel 멋진 소프트웨어에서 내보내집니다. 이 수는 박테리아 모든 중복 샘플 및 제어 웰 스에 대 한 건의 보여주는 테이블에 이용하실 수 있습니다.
| 컨트롤 A | 제어 B | 148 | 128 | 131 | 120 | 118 | 1:17496 | 8 희석 |
| 189 | 147 | 142 | 134 | 112 | 110 | 107 | 1:5832 | 희석 7 |
| NSK (1-CtrB/CtrA): 22% | 140 | 115 | 55 | 73 | 84 | 1:1944 | 희석 6 | |
| 50% 기 (CtrB/2): 73 | 142 | 96 | 6 | 8 | 25 | 1:648 | 희석 5 | |
| 132 | 7 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | 희석 4 | ||
| 23 | 3 | 2 | 1 | 0 | 1: 72 | 희석 3 | ||
| 1 | 2 | 1 | 3 | 1 | 1:24 | 희석 2 | ||
| 0 | 0 | 1 | 1 | 4 | 1:8 | 희석 1 | ||
| 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | ||||
표 3: 50% 기 컷오프 값의 중복 샘플 평균 계산. 50% 기 컷오프 값은 모든 제어 B 우물의 평균을 복용 하 고 2로 분할 하 여 계산 됩니다. 중복의 평균 각 희석 중복에서 실행 하는 각 샘플에 대 한 계산 했다. NSK 값도 계산 됩니다.
그림 4: 선형 보간의 도식. 테스트 (x 축)은 혈 청의 각 희석에 살아남은 박테리아 (y 축)의 수 (블랙 다이아몬드), 플롯 하 고 개별 포인트 얇은, 파선 검은 선으로 연결 된다. 견고 하 고 파선 가로선 0%와 50%를 죽이, 각각 나타냅니다. (희석 5) 위에 혈 청 희석 (희석 4) 아래 라인을 죽이고 50% 빨간 선으로 연결 되어 있고 살 균 titer (기)가 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| SBA 기 | |
| 샘플 1 | 72 |
| 샘플 2 | 216 |
| 샘플 3 | 1994 |
| 샘플 4 | 1994 |
| 샘플 5 | 648 |
표 4: SBA 결과 보여주는 bactericidal titer (기). 최종 SBA 기 값 각 샘플에 대 한 결정 되 고 표시 됩니다. 이 값은 평균 CFUs, 50% 기 컷오프 값 그리고 선형 보간 수식을 사용 하 여 계산 됩니다.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜에서는 혈 청 항 체의 shigellacidal 활동을 평가 하기 위해 기능 면역 분석 결과 보여 줍니다. 분석 결과 이전 Shigella 백신에서 제어 인간의 세라 함께 사용된9 했다 S. flexneri 3a에 대 한 특정이 프로토콜 단일 클론 항 체에 대 한 설명에서 연구11. 혈 청이 분석이 결과에서 테스트의 소스 다를 수 있습니다 널리 전 임상 동물 샘플에서 인간의 임상 샘플, 그리고 혈 청 샘플의 shigellacidal 활동 예방접종 및 노출 개인 경험에 의해 영향을 받을 것 이다. 어떤 분은 밀접 하 게 관련된 serotypes, 특히 S. flexneri 2a와 S. flexneri 3a 사이 예상 있을 수 있습니다 하지만 작은 분 S. sonnei9에 비해 이러한 긴장에서 볼 수 있다. SBA의 항 체-항 원 바인딩에 의해 보충 폭포의 활성화에 초점을 맞추고. 따라서, BRC 시 약의 취급이이 프로토콜의 실행에 관련 된 많은 중요 한 단계 중 하나입니다. BRC는 그것의 일관 된 성능과 다른 살 균 분석12,,1314NSK의 낮은 수준 때문에이 시험에 사용 하기 위해 선정 됐다. BRC의 활동 온도 민감한 이며 적절 한 조치를 동결 해 동 사이클 최소화는 BRC 싱글 볼륨으로 aliquoted 그리고 분석 결과에 사용 직전 BRC aliquots는 신속 하 게, 해 동을 보장 하기 위해 이동 해야 합니다. 보수 활동의 일관성이 분석이 결과의 재현성에 영향을 줄 것 이다. 분석 결과 재현성에 영향을 주는 다른 중요 한 단계는 생산 및 세균성 주식 희석입니다. 그 분석 결과 시작 하기 전에 적절 한 세균성 주식 희석 결정 됩니다, 분석 결과 성공으로 일관 된 생산의 컨트롤 A와 B에 따라 CFU 카운트 평균 자리 당 ~ 120 CFU 중요 하다. 소프트웨어에 의해 수 있는 관광 명소를 위해서, 그것도 필수적 플레이트 박테리아를 사용 하는 기술을 성공적으로 실행 됩니다. 증 착 세균성 솔루션 및 명소 실행 ~ 2-3 접시의 기울이기의 cm은 좋은 소프트웨어에 의해 정확한 계산에 대 한 바로 크기와 올바른 배포의 식민지를 생산을 위한 중요 한. 정확 하 고 일관 된 결과이 프로토콜에 의해 생산 됩니다 보장 모든이 단계를 습득
모든 중요 한 단계는 실행 하는 경우에 잘 있을 수 있습니다 여전히 수정 하거나이 프로토콜 문제를 해결 하는 데 필요한 경우. 다른 박테리아를 평가 하기 위해이 프로토콜의 수정 하룻밤 LBA 판 부 화 온도, 마이크로-식민지의 형성을 보장 하기 위해 최적화를 해야 합니다. 다른 변종 박테리아 또는 항 체의 혈 청, 다른 소스 보완 농도의 최적화를 요구할 수 있습니다. NSK 값과 제어 세라의 KIs 또한 분석 결과 적절 하 게 작동 하는지 확인을 모니터링 해야 합니다. NSK 하지 이상 70% 상승 한다. 세라 다 안 해야 하는 컨트롤의 기 이상 ± 2SD를 의미 한다. 성공적이 고 일관 된 결과 얻기 위해이 프로토콜을 사용 하는 경우는 위에서 설명 하는 중요 한 단계에 특별 한 주의 함께 여기에 설명 된 대로 모든 단계를 수행 하는 데 필요한 것입니다.
이 프로토콜은 Shigella 연구 커뮤니티에 중요 한 필요를 채우고, 하는 동안 그것은 그것의 제한 없이입니다. 이 프로토콜 생물 학적 자료에 의존 하며, 따라서 항상 제어 하기 어려운 몇 가지 변화를 있을 것입니다. 다른 많은 소스에서 보완 활동 변화 분석 실험에 있는 가변성에 기여할 수 있습니다. 이 줄이기 위해 보수를 적절 하 게 처리 하 여 구입 하기 전에 활동에 대 한 보수의 새로운 많은 테스트 중요 하다. 그것은 또한 균질 공급을 알려진 활동 보수 많이의 풀을 만들 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 디자인에 의해 간단 하 고 어떤 특수 장비가 필요 하지 않습니다 이며 소프트웨어를 열거 하는 자동화 된 식민지 자유롭게 사용할 수 있습니다. 이 단순 이점이 동안, 거의 모든 실험실에서 사용 될이 프로토콜을 허용 여전히 필요지 않습니다 하룻밤 부 화. 최근 분석 실험 훨씬 짧은 보육 요구 하지만 전문, 예비 시 약15필요가 설명 했습니다. 이 분석 결과의 또 다른 한계는 그것의 현재 모양에서 그것은 한 번에 하나의 세균성 종 조사입니다. Shigella 필드에서 multivalent 백신을 만들려는 욕망은 하 고 다중 방식으로 병원 체를 평가할 수 있는 면역학 분석 실험 데 큰 가치 이다. 이 분석 결과,이 필요를 충족을 나중에 수정할 수 있지만 현재의 형태로, 그것은 단일-플렉스 분석 결과.
이 분석 결과 몇 가지 제한, 그것은 여전히 기존 또는 다른 방법에 비해 많은 이점이 있다. 이러한 장점은 훨씬 노동 집약 및 전통적인 Sba 보다 더 높은 처리량이 메서드의 실행을 결합 하는 많은 개선을 포함 합니다. 모든 재료와 이것을 완료 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 도움이 냉동된 세균성 주식의 사용, 96 잘 접시 분석 결과 형식, 큰 사각 접시에 도금, 사진 촬영 및 자동 식민지 세, 식민지의 채색 분석 결과입니다. 이 분석 결과 또한 어떤 특수 시 약 또는 장비 필요로 하지 않기 때문에 다른 높은 처리량 방법에 비해 이점이 있다. 기본적인 시 약 및 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 모든 실험실 설정에서 응용 프로그램에 대 한 수 있도록 설명 하는 프로토콜을 수행할 수 있습니다.
모든이 프로토콜을 제공 하는 장점 많은 미래의 수사에 그것의 사용을 지원 합니다. 분석 결과 적으로 예방 접종 이나 자연 감염 후 면역 반응의 검사에 적합 합니다. 이 응용 프로그램 SBA Shigella 백신 연구에 귀중 한 도구에 대 한 허용 하 고 이미 그것에이 백신의 능력을 보여주었다 Shigella 바이오-공액 백신에서 백신 immunogenicity를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 16기능 항 체 생산을 유도. 이 프로토콜은 광범위 하 게 여러 실험실에 의해 테스트 되었습니다 하 고 안정적이 고 재현 가능한 결과9를 생산 하기 위해 표시 되었습니다. 동일한 샘플17다른 살 균 분석 실험 사용 하 여 테스트 하는 경우이 프로토콜 또한 유사한 결과 생성 합니다. 이 분석 결과 의해 생성 된 데이터에 일관성 그리고 다른 더 오래 된 방법의 호환성 정확 하 게 혈 청 샘플에서 살 균 활동을 평가 하기 위한 강력한 도구. 분석 결과 또한 쉽게 추가 샘플 형식 평가를 적용할 수 있습니다. 혈 청은 성인 임상 시험에서 쉽게 사용할 수, 재판 유아 및 소아;에 초점에 충분 한 혈 청을 얻을 하기가 어려울 수 있습니다. Shigella 백신에 대 한 최종 대상 인구 중 하나입니다. 이러한 시련에 전체 혈액은 정기적으로 필터 종이에 수집 하 고 건조. 이 유형의 SBA를 사용 하 여 샘플 형식으로 몇 가지 예비 성공이 되었습니다. 전체 혈액 이외에 (타 액, 배설물 추출 물, 소변 등) 점 막 샘플 Shigella 백신 연구에 관련 된 타겟 있습니다. 현재,이 프로토콜 3 Shigella 의 가장 임상 관련 serotypes에 대 한 평가 하지만 그것은 또한 추가 Shigella 종 뿐만 아니라 다른 세균성 병원 체에 대 한 적용할 수 있습니다. 미래의 일은이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과와 동일한 특성의 많은 것과 다중 분석 결과의 생산에 집중할 것 이다. 다중화 된 분석 결과 허용할 것 이다 여러 Shigella serotypes의 평가 대 한 동시에, 추가 시험 시간에 손과 샘플 볼륨을 보존. 또한 진행 전세계 실험실에이 분석 결과 전송 하는 일이 있다. 이러한 글로벌 평가 큰 규모로 연구, 미생물학 및 면역학 실험실 박테리아 및 혈 청이이 SBA에 액세스할 수 증가 동시에 분석 결과 자격으로 더 많은 데이터를 생성 합니다 샘플 다른 발병 위치에서 수집. 여기서 설명 하는 분석 결과 간단 하 고 높은 처리량 고 Shigella 필드, 뿐만 아니라 다른 세균성 병원 체의 평가에 광범위 한 응용 프로그램에서 면역학 평가 개선 하는 기능이 있다.
Disclosures
R.W.K 미국 정부의 직원 이며, 같은이 책에서 표현 들 저자와 반드시 공식적인 정책 또는 육군, 국방부, 미국 정부의 부의 입장을 반영 하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 M.H.N. 경로에서 교부 금에 의해 투자 되었다 이 연구는 협동 연구와 월터 리드 육군 연구소 그리고 버밍엄에서 알라바 마의 대학 사이 개발 계약으로 실시 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) | Sigma | T8877 | ≥98.0% (HPLC) |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S2002 | ≥99.5% |
| Baby Rabbit Complement | PelFreez | 31061-3 | 3-4 week old |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14065-56 | Without Phenol Red |
| LB Agar (Lennox) | Sigma | L2897 | Powder microbial growth medium |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Powdered, (C12H18O9)n |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For molecular biology, ≥99% |
| LB Broth (Lennox) | Sigma | L3022 | Powder microbial growth medium |
| Square Petri Dish | Sigma | Z617679-240EA | 120 mm x 120 mm |
| Assay Plate | Costar | 3799 | 96 well u-bottom plate with lid |
| NICE Software | University of Alabama at Birmingham | ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/ |
References
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