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Immunology and Infection

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

doi: 10.3791/59164 Published: February 27, 2019

Summary

여기 우리는 혈 청에서 항 체의 Shigellacidal 활동을 측정 하는 프로토콜을 제시. 혈 청은 박테리아와 외 인 보수, 인 큐베이 팅, 혼합 그리고 반응 혼합물은 한 접시에 도금. 실행 가능한 박테리아는 계산, 자동된 식민지 열거자를 사용 하 고 살 균 titer를 결정 하는 데 사용 되는 식민지를 형성 한다.

Abstract

혈 청 살 균 분석 (Sba)는 항 체의 기능 활동을 측정 하 고 많은 수십 년 동안 사용 되었습니다. Sba는 직접 바인딩할 박테리아 및 보완 활성화에 대 한 혈 청 항 체의 능력을 평가 하 여 항 체 살인 활동을 측정 합니다. 이 보완 활성화 결과 세포와 대상 박테리아의 살인. 이 분석 실험은 그들은 생물 학적 기능 있는이 항 체, 항 체는 감염 방지에 재생할 수 있습니다 역할을 연구 하는 연구자 수 있도록 명료 하 항 체 생산을 측정 넘어 가기 때문에 중요 합니다. Sba 많은 인간 병원 체에 대 한 면역 반응을 연구 하는 데 사용 되었습니다 하지만 현재 이질균 에 대 한 아무 널리 허용된 방법론. 역사적으로, Sba 되었습니다 매우 노동 집약적인 살아남은 박테리아를 정확 하 게 계량에 많은 시간이 걸리는 단계 요구. 이 프로토콜 설명 간단 하 고, 강력 하 고 높은 처리량 분석 결과 혈 청 체 외에서 이질균 에 대 한 조치 기능 항 체 관련. 여기 설명 하는 방법을 전통적인 Sba, 냉동된 세균성 주식의 사용을 포함 하 여 많은 이점이, 96 잘 접시, 마이크로-문화 시스템, 그리고 자동화 된 식민지 세 시험. 모든 이러한 수정은 보다 적게 노동 집약 및 더 높은 처리량이 분석이 결과 확인합니다. 이 프로토콜은 간단 하 고 빠르게 여전히 간단한 기술과 쉽게 사용할 수 있는 시 약을 사용 하는 동안 전통적인 Sba 보다 수행 하. 프로토콜 여러 독립적인 실험실에서 성공적으로 적용 되었습니다 이며 분석 결과 강력 하 고 재현할 수 있습니다. 분석 결과 사전 임상으로 임상 연구에서 면역 반응을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. Shigellacidal 항 체 titers (예방 접종 또는 감염 중) 항 원 노출 전후 모두 얼마나 기능 항 체 응답 생성의 광범위 한 이해와 보호 면역에 그들의 공헌에 대 한 수 측정 이 표준의 개발, 잘 특징 분석 결과 Shigella 백신 디자인을 촉진 크게 수 있습니다.

Introduction

S. sonnei , S. flexneri 3a, Shigella flexneri 2a, shigella serotypes 역학 보급 세계적으로 보여줍니다. 설사 질병 이러한 Shigella 종의 영향 군사, 여행자 발생1, 그리고 개발 도상국2에서 5 세 미만 아이 들 설사 죽음의 주요 원인. 그러나 현재 없습니다 허가 백신 Shigella으로부터 보호 하기 위해,, 개발의 여러 단계에서 여러 후보 백신 있습니다. 이 백신 개발에 현재 기타 예방 조치의 많은 Shigella lipopolysaccharide (LPS)에 대 한 생산 하는 항 체에 초점. LPS는 매력적인 백신 후보 주요 표면 항 원 그리고 Shigella 자연 감염 유도 serotype 특정 방식으로 다시 감염에 대하여 보호 될 수 있는 LPS-특정 항 체 때문입니다. 따라서, 성공적인 Shigella 백신 가능성이 있어야 합니다 멀티-발렌타인 및 대상 3-4 Shigella serotypes 세계적으로 순환 긴장3,4, 의 70-80%에 대 한 면역을 유도 하 5 , 6.이 Shigella 백신 후보자를 평가 하는 분석 여러 다른 serotypes에 대 한 특정 해야 합니다.

백신 후보자를 평가 하기 위한 현재 면역학 분석 실험 측정 항 체 titers의 수준에 집중 하지만 몇 가지 특징이 잘 분석 기능 항 체를 평가 하는. 병원 체 특정 항 체는 박테리아 표면 항 원, 바인딩 등을 접착을 방지 하는 기능 메커니즘의 숫자를 통해 감염을 퇴치에 대 한 책임 때문에 항 체 기능적 능력의 시험이 중요 하 고 상피 세포, 세균 세포 또는 opsonization 그리고 식 균 작용, 지정 하 고 직접 바인딩 및 보충 폭포를 시작 하 여 병원 균을 죽이고의 감염. 항 체에 의해 박테리아의 직접적인 살인 항 체 대상 박테리아의 표면 구성 요소를 바인딩할 많은 zymogens는 궁극적으로 박테리아에서 기 공 형성에 결과 셀의 활성화에 지도 보충 폭포를 시작 하는 경우에 발생 세포 및 박테리아 죽음을 발생합니다. 이 직접 죽이 항 체 및 보완을 순환 하 여 박테리아의 감염 방어의 중요 한 초기 라인 있을 수 있습니다.

자연적으로 감염 된 개인은 그들의 세라에 shigellacidal 활동 항 체를 있다. 이러한 Shigella-특정 항 체는 7,8분석 실험 전통적인 보완-중재 살인을 사용 하 여 발견 했다. 이질균에 대 한 보호의 살 균 항 체에 대 한 역할 있을 수 있음을 나타냅니다. 전통적인 bactericidal 분석 실험은 그들의 실행에서 간단: 혈 청은 열 (내 생 보완 활동 파괴)을 비활성화 하 고 관심의 박테리아와 혼합. 외 인 보수는 특정 농도에이 혼합물에 추가 됩니다. 반응 혼합물 세균성 살해 수 있도록 인 큐베이 팅 하 고 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 확인 후 도금. CFUs 계산 됩니다, 일단 50% 살인 지 (반) 산출 될 수 있다 고 SBA titer 결정. 이 절차는 비교적 간단 하 고, 하는 동안 이러한 분석 노동 집약 하 고 수 수 하 고 결과 매우 다양 수 있습니다. 이러한 제한 뿐만 아니라 현재 아무 특징이 잘 기능 분석에 대 한 존재 이질균. 따라서, 우리 성공적으로 개발 하 고 가장 임상 관련 종자9의 3 Shigella 살 균 활동을 측정 하는 간단 하 고, 높은 처리량 분석 결과 자격. 이 프로토콜 분석 결과 효율성과 재현성을 향상 시키는 수정 SBA를 설명 합니다. 이러한 개조의 첫 냉동된 세균성 주식의 사용 이다. 단일 사용 주식의 생산 또한 분석 결과를 분석 결과 가변성을 감소 시키고 있는 동안 각 분석 결과 대 한 문화 신선한 박테리아를 필요가 없습니다. 또 다른 시간과 노동 96 잘 접시 분석 결과 포맷의 사용은 저장 하는이 프로토콜을 이용. 이 샘플의 직렬 희석 농도의 범위를 테스트할 수 있도록 수 있습니다.  그것은 또한 도금 사각 접시에 샘플에 대 한 멀티 채널 펫의 사용에 대 한 수 있습니다. 이러한 사각형 접시 문화 시스템을 생산 하는 마이크로-식민지와 함께에서 사용 되는 경우 한 천 배지는 분석 결과 대 한 요구의 수는 감소 됩니다. 함께 자유롭게 사용할 수 있는 식민지 계산 소프트웨어, 원래 폐 렴 다중화 opsonophagocytic 분석 결과 (MOPA)10, 살인에 대 한 개발 가능, 자동화, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 식민지 열거 합니다. 이러한 개선의 모든 줄일 실습 시험 시간 및 높은 처리량 시스템 여러 접시 한 번에 실행 될 수 있도록.

이 프로토콜은 3 이질균, SBA는 여기에 설명 된의 가장 임상 관련 serotypes에 대 한 최적화 되었습니다 동안 다른 많은 세균성 병원 균에 쉽게 적용할 수 있습니다. 다른 박테리아와이 프로토콜의 사용 가능성, 뿐만 아니라이 프로토콜 점 막 샘플 같은 다른 관련 샘플 형식에서 항 체의 분석을 포함 될 수 있습니다, 시작 물자로만 혈 청을 사용 하 여 확장 가능성이 있다 타 액과 배설물 샘플을 포함합니다. 예방 접종 후 면역 응답을 조사 하는이 분석 결과 사용 하 여 백신의 합리적인 디자인을 선도 하는 예방 접종에 의해 생성 된 면역 반응에 대 한 광범위 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 그리고 어떻게 자연 면역의 이해에 원조 개발.

Protocol

이 프로토콜 WRAIR 인간 주체의 보호 위원회의 지침을 따릅니다. 이 연구에 사용 된 샘플 WRAIR 프로토콜 번호 1328, 인간을 대상의 보호 통치 모든 기관 및 연방 규정을 준수의 일환으로 수집 하는 인간의 혈 청 샘플 있습니다. 샘플 드 식별, 그리고 이러한 익명 샘플 사용 UAB IRB (프로토콜 번호 N150115001)에 의해 비 인간 대상 연구로 분류 되었다.

1. 분석 결과 시 약 준비

  1. 1% 준비 물 100 mL에 젤라틴의 1 g을 추가 하 여 젤라틴. 오토 클레이 브 그리고 실내 온도에 상점입니다.
  2. 준비 100 mg/mL TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium 염화) 재고 솔루션 (1, 000 x) 40 mL 물에 TTC의 5 g을 추가 하 여. TTC 완전히 해산 때 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 살 균 필터와 물 50 mL를 볼륨을 조정 합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
    참고: TTC는 세균성 식민지 색을 지정 하 고 그들을 훨씬 쉽게 계산 하. TTC 솔루션은 약간의 노란색. TTC 솔루션 개발은 붉은 색, 삭제 하 고 신선한 준비.
  3. 물 40 mL에 5 g 앤3 을 추가 하 여 10% 나트륨 아 지 드 (NaN3) 재고 솔루션 (100 x)를 준비 합니다. 완전 한 해체 후 물 50 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 상점.
    주의: 나트륨 아 지 드 독 이며, 섭취 또는 피부 또는 눈을 통해 흡수 하는 경우 독성이 있을 수 있습니다. 그것은 리드와 높은 폭발성 금속 azides를 구리 배관 반응 수 있습니다. 나트륨 아 지 드를 포함 하는 시 약의 처분, 아 지 드 형성을 방지 하거나 생물 가방에 무시 하는 물의 큰 볼륨 플러시.
  4. 물과 압력솥의 1 l 파운드 agar의 35 g를 추가 하 여 LBA 플레이트 (파운드 천 배지)를 준비 합니다. 각 광장 페 트리 접시 (120 x 120 m m2) 25 mL를 추가 합니다. 접시를 공고히 한 천 수 있도록 10-20 분에 대 한 RT에서 품 어. 최대 1 개월에 대 한 비닐 봉지와 4 ° C에 저장소에 다시 접시를 놓습니다.
  5. 물과 압력솥의 1000 mL를 agar의 7.5 g을 추가 하 여 중첩 Agar를 준비 합니다. 56 ° C 물 목욕까지 필요에서 품 어. 바로 사용 하기 전에, 100 mg/mL TTC와 10 mL의 1 mL을 추가 10% 할머니3 와 섞어 잘.
    참고: 각 LBA 판 오버레이 Agar의 25 mL이 필요합니다. 오버레이 한 천 1 개월 사전에 준비 하 고 분석 결과 대 한 필요에 따라 전자 레인지 나 핫 플레이트에 녹아 수 있습니다. 천이 온도 LBA 판 응용 프로그램 전에 ~ 55 ° C 인지 확인 합니다.
  6. 물 40 mL에 5 mL의 10 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 캘리포니아2 +/Mg2 + 와 1% 젤라틴의 5 mL을 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 실내 온도에 상점.

2. 준비 보완 및 박테리아를 대상

  1. 준비 아기 토끼 보완 (BRC)
    참고: 기준 보완 많은 선택을 찾을 수 있습니다 여기에 대 한 자세한: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
    1. BRC 냉동된을 녹여 냉 수를 실행 합니다. 물리적으로 혼합 된 BRC 마다 10 ~ 20 분 완전히 해 동 때까지. BRC 반복된 동결 해 동 주기를 적용 하지 마십시오.
    2. BRC 녹고 동안 1.5 mL 이나 5 mL, 15 mL 원심 분리기 튜브 라벨. 장소 표시를 미리 냉각 얼음에 튜브. 사전 냉각된 원심 분리기 튜브에 aliquot 적절 한 볼륨 BRC (작성 후 즉시 반환 각 튜브는 얼음에). Aliquots ≤-70 ° C에서 냉동 실에 저장 합니다.
      참고: 보완의 약 1 m 각 분석 결과 접시 필요 합니다. 보완 aliquots 싱글 이며 aliquoted 레이아웃 분석 결과에 적합 한 볼륨에 있어야 합니다.
    3. 열 비활성화 BRC를 준비 하려면 활성 BRC의 한 약 수 동. 56 ° C 물 목욕을 준비 합니다. BRC 완전히 해 동 후 물 목욕을 전송 하 고 30 분 동안 품 어.
    4. 부 화, 후 물 목욕에서 열 비활성화 BRC 제거 하 고 10-15 분 믹스에 대 한 적극적으로, RT에 시원한 수 그리고 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 aliquot ~ 150 µ L. 저장 ≤에 aliquots-10 ° c.
  2. 준비 대상 박테리아 주식
    참고: 다음 절차의 대상 박테리아; 48 aliquots를 준비 하는 더 많은 aliquots가 필요한 경우 프로토콜 확장할 수 있습니다.
    1. 마스터는 냉장고에서 유리병 주식과 혈액 한 천 배지 위에 유리병에서 얼음의 작은 금액을 제거 하는 냉동된 세균성 표면 긁어 박테리아를 제거 합니다. 즉시 냉동 실에 마스터 재고 유리병을 반환 합니다.
    2. 혈액 한 천 배지와 접시 뚜껑 덮개에 세균 재고의이 작은 약 수 행진 품 어 접시 거꾸로 하룻밤 37 °C/5% CO2 배양 기에서.
    3. ~ 10 격리 된 부드러운 식민지 파운드 국물의 30 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 전송. 문화 국물 ~0.6 0.7의600 세 때까지 부드럽게 흔들어 37 ° C에서 3-5 h에 대 한 품 어.
    4. 최고 12.5 mL 문화와 신선한 50 mL 튜브에 수확. 문화는 탁상용 마이크로 원심 분리기를 사용 하 여 2 분 동안 15000 x g 에서 원심 상쾌한 삭제 하 고 다시 15% 살 균 글리세롤-파운드 25 mL에 펠 릿을 일시 중단.
    5. 잘 혼합 하 고 0.5 mL aliquots 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 (~ 48 튜브)로 분배. Aliquots ≤-70 ° C에서 냉동 실에 저장 합니다.
    6. 사용 하기 전에 교착 테스트를 사용 하 여 세균성 id를 확인 합니다.
  3. 대상 박테리아 주식에 대 한 최적의 희석 비율의 결정
    참고: 각 일괄 처리 대상 박테리아의 희석 ~ 120 CFU/파운드 플레이트에 자리를 양보 하는 데 필요한 결정 하기 위해 시험 조건에서 적정 해야 합니다.
    1. 결정 플레이트 (희석 플레이트) 고 1A를 잘 분석 결과 버퍼의 135 µ L을 추가. 분석 결과 버터 120 µ L를 웰 스 1B-1 시간 추가.
    2. 냉장고에서 냉동된 대상 박테리아의 유리병을 제거 하 고 실 온에서 해 동. 1A 세균 주식의 10 희석 수 있도록 잘 해 동 세균성 주식 15ul을 추가 합니다.
    3. 5 직렬 희석을 수행 하기 위해 잘 1b 잘 1A에서 30 µ L 세균성 솔루션의 전송. 8 희석 (1시 10분, 1시 50분, 1: 250, 250 1:1; 250 1:6; 250 1: 31; 250 1: 156, 1:781 250)의 총에 대 한 1 시간을 잘 5 직렬 희석을 계속 합니다.
    4. 다른 결정 플레이트 (분석 결과 플레이트) 하 고 열 1과 2는 시험 접시에 모두 잘 분석 결과 버퍼의 20 µ L를 추가.
    5. 1과 2는 시험 접시의 열에 해당 우물에 각 잘 희석 플레이트의 열 1에서에서에서 희석된 박테리아의 10 µ L를 전송. 박테리아의 10 µ L 잘 1A와 2A 분석 결과 접시, 등으로 희석 판의 잘 1A에서 전송 됩니다.
    6. 분석 결과 A 컨트롤과 컨트롤 B 단계 3.6-3.12에 혈 청 살 균 분석 결과 (SBA) 아래 설명 된 대로 계속 합니다.
    7. 판 얼음에 인 큐베이 팅 되었습니다, 후 LBA 플레이트에 열 1에 있는 우물에서 10 µ L 자리 8 피 펫 팁 멀티 채널 피 펫을 사용 합니다. 또한, LBA 플레이트에 열 2에서에서 우물 자리.
    8. 3.14-4.6 단계에서 아래와 같이 분석 결과 함께 계속.
    9. 결정 제어 b에서 ~ 120 CFU/자리 생성 박테리아 희석,이 희석 분석 결과에 사용 됩니다.

3. 혈 청 살 균 시험 (SBA)

참고: 아래 설명 된 절차 한 분석 결과 접시, 하지만 분석 결과 접시의 수를 늘릴 수 있습니다.

  1. 30 분 동안 56 ° C 물 욕조에 잠복기 샘플에는 샘플을 테스트 열 비활성화.
    참고: 테스트 샘플은 어떤 생 보완 활동 폐지를 테스트 하기 전에 열 비활성화 되어야 합니다. 이 분석 결과 앞서 행 해질 수 있다 고 사 샘플을 다시 동결 또는 테스트 때까지 4 ° C에서 저장 수 있습니다.
  2. 분석 결과 플레이트 및 추가 분석 결과 버퍼의 20 µ L 열 1 행의 A G. 추가 20 µ L 통해 분석 결과 버퍼의 열 1과 2 행 H의 12, 표 1을 참조 하십시오.
  3. 중복 행 H 분석 결과 접시의 각 테스트 샘플의 30 µ L을 로드 합니다. 예를 들어 3 H, 4 H, 웰 스에 샘플 1의 30 µ L를 분배 하 고 웰 스 H 5와 6 H 등으로 30 µ L 샘플 2의 분배.
  4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 테스트 샘플의 3 연속 희석을 수행 합니다.
    1. 행 G 10 우물 3-12 시에서에서 샘플의 μ와 해당 웰 스 전송 제거 하 고 잘 아래로 pipetting으로 샘플을 혼합 8-10 시간.
    2. 다음 행 F 10 우물 3 G-12 G에서에서 μ와 해당 우물에 제거 하 고 잘 혼합.
    3. 계속 행 A. 통해 직렬이 희석 혼합 후 행 A 우물, 제거 하 고 모든 웰 스 포함 20 µ l 우물 3A-12A에서 10 µ l를 삭제 합니다.
      참고: 혈 청의 20 µ L 80 µ L의 분석 결과 전체 볼륨에서 사용 되, 분석 결과에 4-fold 추가 희석이입니다. 이 희석 혈 청 희석 4를 곱하여 SBA titer의 계산 하는 동안 계정에 촬영 해야 합니다. 예를 들어 1: 2의 시작 희석을 사용 하는 경우 테스트 중인 실제 희석 1:8입니다.
  5. 냉동된 대상 박테리아 재고와 실 온에서 해 동 한 유리병을 제거 합니다. (이 희석 요인은 섹션 2.3결정 했다) 미리 정해진된 최적의 희석 요인에 따라 분석 결과 버퍼의 20 mL에 박테리아를 희석. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 희석된 박테리아의 10 µ L를 추가 합니다.
  6. 또는 제거 냉동된 BRC의 한 유리병과의 한 유리병 열 비활성화 BRC, 냉 수를 실행을 실 온에서 해 동 냉동 해 동 신속 하 게 공기를 불어 캐비닛 생물 안전의 창 살에 장소.
  7. 열 비활성화 BRC의 20% 솔루션을 준비 합니다. 믹스 100 µ L 열 비활성화 BRC의 분석 결과 버퍼의 400 µ L와. 열 1 (제어 A 우물)에 있는 모든 우물에이 20% 열 비활성화 BRC 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
    참고: 열 비활성화 BRC 분석 결과에서 일반적인 살인 (NSK)를 모니터링 하는 제어로 사용 됩니다.
  8. 네이티브 BRC의 20% 솔루션을 준비 합니다. 분석 결과 버퍼의 4 mL와 함께 네이티브 BRC의 1 mL를 혼합. 열 2 12 (제어 B와 테스트 샘플 우물)-모든 우물에이 혼합물의 50 µ L를 추가 합니다.
    참고: 반응 혼합물에서 BRC의 최종 농도 12.5%입니다.
  9. 짧게 분석 결과 플레이트 판 통에 10-15 s 부드럽게 흔들어 혼합 또는 8 배 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 혼합.
  10. (흔들어) 없이 분석 결과 플레이트 37 ° C 2 h에 대 한 미생물 배양 기에 넣어.
  11. 건조 2 LBA 판 뚜껑을 제거 하 고 접시를 배치 하 여 생물 안전 캐비닛 40-60 분에 직면 하 고.
  12. 2 h 부 화 완료 되 면 얼음을 젖은 반응을 중지를 10-20 분 동안 품 어을 분석 결과 접시를 이동 합니다.
  13. 12 채널 피 펫을 사용 하 여 행 H, 및 LBA 판의 하단에 반응 혼합물의 자리 접시 10 µ L에서 웰 스 믹스. 즉시 접시를 기울기 고 ~1.5-2 cm. 행 G, F, E, LBA 접시에 이전 행 위에 그들을 야생에 대 한이 절차를 반복에 대 한 실행을 관광 명소. 행 E, F, G 및 H LBA 플레이트, 및 행 A, B, C 및 D는 같은 방식으로 두 번째 LBA 접시에 발견 한 발견은 그림 1을 참조 하십시오.
  14. 솔루션은 LBA 접시 (10-15 분)으로 흡착 될 때까지 실 온에서 LBA 접시를 품 어. LBA 접시에 뚜껑을 넣고 밤새 품 어를 거꾸로 미생물 인큐베이터에서 LBA 판 배치 (16 ~ 18 h). S. flexneri 2a, 3a 29 ° C에서 품 어와 품 어 S. sonnei 는 26 ° c.에
    참고: 이 온도 더 작은 "마이크로-식민지" 식민지 카운터9에의해 정확한 계산을 위해 적당 한 크기와 항복.
  15. 하룻밤 부 화 후 25 mL 오버레이 Agar의 (~ 55 ° C)에서 포함 하는 100 µ g/mL TTC와 0.1% 할머니3 각 LBA 접시에 추가 합니다.
  16. LBA 판 붉은 색 개발 아래 그림 1 을 참조 하십시오 살아남은 박테리아 수 있도록 2 h 37 ° C에서 품 어.
  17. 사진 디지털 카메라를 사용 하 여 접시와 NIST의 통합된 식민지 열거 소프트웨어 (니스)가 설치 된 컴퓨터에 이미지를 전송 그림 2를 참조 하십시오.
    참고: 멋진 식민지-세 소프트웨어 비용 없이 이용하실 수 있습니다. 세부 사항 및 설치 지침에 대 한 자료 목록 참조.

4. 수 세균성 식민지

  1. 오픈 좋은 소프트웨어 및 입력된 연산자 이름, 실험 정보 및 모든 빈 필드에 메모 를 시험. 이 데이터 입력 되 면 완료 단추를 클릭 합니다.
  2. 열기 단추를 클릭 하 고 컴퓨터에서 올바른 파일을 선택 하 여 촬영된 번호판을 가져옵니다.
  3. 12의 수와 4 의 수를 설정 하 여 분석 결과 매개 변수를 조정 합니다. -3 시그마 배경 설정과 낮은 해상도 조정 합니다. 그림 2를 참조 하십시오.
  4. 클릭 하 여 각 ROI는 직접 한 샘플 자리를 관심사 (ROIs)의 영역을 이동 합니다. 모든 세균성 식민지 샘플 사이 아무 중복 투자 수익 내는 확인 하십시오. 한 접시 완료 되 면 저장 데이터 이미지 목록에서 다음 접시를 두 번 클릭 하 고는 ROIs를 조정 합니다. 그림 2를 참조 하십시오.
  5. 모든 접시 조정 되었습니다, 녹색 버튼을 클릭, 그림 2 및 그림 3참조. 완료 되 면 세.xls/.xlsx 형식에서 데이터를 내보내려면 내보내기 버튼을 클릭 합니다. 이름 하 고 데이터 분석에 대 한.xls/.xlsx 파일을 저장 합니다.
  6. 조사 분석 결과 96 잘 접시를 나타내는 테이블에 구성 됩니다 있도록 테이블 형식으로 데이터를 내보낸, 참조 표 2.

5. SBA Titer (기) 및 비 특정 살인 (NSK) 계산

참고: SBA titer, 또는 살인 인덱스 (반) 대상 박테리아의 50%를 죽이 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.

  1. 활성 보완 제어 우물 (제어 B)의 CFU를 평균 하 고 2로 분할 하 여 인덱스 (기) 컷오프 값을 죽이고 50%를 계산 합니다. 각 희석 중복에서 실행 하는 각 샘플에 대 한 평균 CFU 계산 표 3을 참조 하십시오.
  2. 혈 청 희석 거의 정확 하 게이 50% 기 값을 얻을 것입니다, 때문에 그것은 두 개의 순차적 혈 청 희석, 살인 보다는 더 적은 50%와 50% 이상 죽이에서 보간 수 있습니다 그림 4를 참조 하십시오. 보간된 SBA 기 계산을 위한 공식은 아래와 같습니다.
    Equation
    참고: 살 균 titer, 또는 기, 또한 UAB에서 개발한 Opsotiter 소프트웨어를 사용 하 여 자동으로 계산할 수 있습니다. 요청 Opsotiter 박사 문 남 또는 씨 롭 버튼 문의. 연락처 정보에 대 한 https://www.vaccine.uab.edu를 참조 하십시오.
  3. 제어 B 컨트롤 a.의 평균으로 나눈 값의 평균을 뺀 1을 복용 하 여 NSK 값 계산

Representative Results

전형적인 분석 결과에 사용 되는 96 잘 접시 레이아웃에 표시 됩니다 표 1. 이 레이아웃에는 중복에서 활성 보완 제어 웰 스 (제어 B), 열 비활성화 보완 제어 웰 스 (제어 A), 및 5 개의 샘플. 샘플은 3-fold 희석 순차적으로 한 번에 테스트할 각 샘플의 8 희석에 대 한 수 있도록 행 하 행에서에서 접시를. 그림 1 야간 보육 및 오버레이 추가 후 2 개의 LBA 격판덮개를 보여준다. 색상 개발 자리를 차지 하 고 모든 살아남은 식민지 빨간색으로 표시 됩니다. 세균 죽이 처음 세 희석 (행 F-H)에서 테스트 하는 모든 샘플에 대 한 명확 하 게 볼 샘플 희석 접시를 더, 세균성 살해 감소 혈 청은 덜 집중 볼 수 있다. 좋은 소프트웨어 인터페이스는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 좋은 소프트웨어에서 마이크로-식민지 수는 그림 3에서 볼 수 있습니다 그리고 이러한 수 표 2에 조직 되었습니다. 각 샘플의 각 희석에 대 한 평균 CFU 수가 계산 되 고 50% 기 값은 표 3에 계산. 이 50% 기 값은 그림 4에서 설명 하는 수식에 따라 SBA 기 계산 하는 데 필요한 값을 결정 하는 각 혈 청 희석에 대 한 평균된 CFUs에 적용할 수 있습니다. 분석 결과의 최종 결과 표 4에 표시 됩니다.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 컨트롤 A 제어 B 8 희석 8 희석 8 희석 8 희석 8 희석 8 희석 8 희석 8 희석 8 희석 8 희석
B 컨트롤 A 제어 B 희석 7 희석 7 희석 7 희석 7 희석 7 희석 7 희석 7 희석 7 희석 7 희석 7
C 컨트롤 A 제어 B 희석 6 희석 6 희석 6 희석 6 희석 6 희석 6 희석 6 희석 6 희석 6 희석 6
D 컨트롤 A 제어 B 희석 5 희석 5 희석 5 희석 5 희석 5 희석 5 희석 5 희석 5 희석 5 희석 5
E 컨트롤 A 제어 B 희석 4 희석 4 희석 4 희석 4 희석 4 희석 4 희석 4 희석 4 희석 4 희석 4
F 컨트롤 A 제어 B 희석 3 희석 3 희석 3 희석 3 희석 3 희석 3 희석 3 희석 3 희석 3 희석 3
G 컨트롤 A 제어 B 희석 2 희석 2 희석 2 희석 2 희석 2 희석 2 희석 2 희석 2 희석 2 희석 2
H 컨트롤 A 제어 B 희석 1 희석 1 희석 1 희석 1 희석 1 희석 1 희석 1 희석 1 희석 1 희석 1
샘플 1 샘플 2 샘플 3 샘플 4 샘플 5

표 1: 분석 결과 플레이트 레이아웃. 열 1 및 2 포함 보완 제어 우물. 컨트롤 A 열 1에에서 위치 하 고 있으며 열 비활성화 제어, SBA 버퍼, 박테리아, 그리고 열 비활성화 보완 보완. 제어 B 열 2에에서 위치 하 고 있으며 활성 제어, SBA 버퍼, 박테리아, 그리고 보완 보완. 열 3-12 혈 청 샘플을 포함합니다. 각 샘플 중복 하 고 순차적으로 희석 3-fold에서 실행 행 H 행 A

Figure 1
그림 1: 컬러 개발 후 LBA 판. 대표 S. flexneri 3a 세균성 마이크로-식민지 하룻밤 적절 한 크기로 성장 했다. 오버레이 agar를 추가 하 고 식민지 오버레이 agar에 TTC 화합물의 감소에 의해 붉은 색을 개발 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: NIST의 통합 식민지 열거자 (니스) 소프트웨어 인터페이스. 좋은 소프트웨어 인터페이스의 그래픽 표현입니다. 관심 (ROIs) 영역 계산 하기 전에 각 명소에 대 한 식민지 중심은. 좋은 창에서 직접 데이터를 내보낼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: LBA 판 계산된에서 좋은 소프트웨어. 컬러 사진 이미지 좋은 소프트웨어에 로드 하 고 콜로 니 형성 단위 (CFUs)는 자동으로 계산 됩니다. 이 이미지는 두 대표 LBA 접시와 그들의 서식 지 수 정보를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 8 희석
186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 희석 7
179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 희석 6
193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 희석 5
184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 희석 4
180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1: 72 희석 3
207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 1:24 희석 2
201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 희석 1
컨트롤 A 제어 B 샘플 1 샘플 2 샘플 3 샘플 4 샘플 5

표 2: 세균성 식민지의 수. CFU 카운트 형식 excel 멋진 소프트웨어에서 내보내집니다. 이 수는 박테리아 모든 중복 샘플 및 제어 웰 스에 대 한 건의 보여주는 테이블에 이용하실 수 있습니다.

컨트롤 A 제어 B 148 128 131 120 118 1:17496 8 희석
189 147 142 134 112 110 107 1:5832 희석 7
NSK (1-CtrB/CtrA): 22% 140 115 55 73 84 1:1944 희석 6
50% 기 (CtrB/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 희석 5
132 7 1 1 1 1:216 희석 4
23 3 2 1 0 1: 72 희석 3
1 2 1 3 1 1:24 희석 2
0 0 1 1 4 1:8 희석 1
샘플 1 샘플 2 샘플 3 샘플 4 샘플 5

표 3: 50% 기 컷오프 값의 중복 샘플 평균 계산. 50% 기 컷오프 값은 모든 제어 B 우물의 평균을 복용 하 고 2로 분할 하 여 계산 됩니다. 중복의 평균 각 희석 중복에서 실행 하는 각 샘플에 대 한 계산 했다. NSK 값도 계산 됩니다.

Figure 4
그림 4: 선형 보간의 도식. 테스트 (x 축)은 혈 청의 각 희석에 살아남은 박테리아 (y 축)의 수 (블랙 다이아몬드), 플롯 하 고 개별 포인트 얇은, 파선 검은 선으로 연결 된다. 견고 하 고 파선 가로선 0%와 50%를 죽이, 각각 나타냅니다. (희석 5) 위에 혈 청 희석 (희석 4) 아래 라인을 죽이고 50% 빨간 선으로 연결 되어 있고 살 균 titer (기)가 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

SBA 기
샘플 1 72
샘플 2 216
샘플 3 1994
샘플 4 1994
샘플 5 648

표 4: SBA 결과 보여주는 bactericidal titer (기). 최종 SBA 기 값 각 샘플에 대 한 결정 되 고 표시 됩니다. 이 값은 평균 CFUs, 50% 기 컷오프 값 그리고 선형 보간 수식을 사용 하 여 계산 됩니다.

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜에서는 혈 청 항 체의 shigellacidal 활동을 평가 하기 위해 기능 면역 분석 결과 보여 줍니다. 분석 결과 이전 Shigella 백신에서 제어 인간의 세라 함께 사용된9 했다 S. flexneri 3a에 대 한 특정이 프로토콜 단일 클론 항 체에 대 한 설명에서 연구11. 혈 청이 분석이 결과에서 테스트의 소스 다를 수 있습니다 널리 전 임상 동물 샘플에서 인간의 임상 샘플, 그리고 혈 청 샘플의 shigellacidal 활동 예방접종 및 노출 개인 경험에 의해 영향을 받을 것 이다. 어떤 분은 밀접 하 게 관련된 serotypes, 특히 S. flexneri 2a와 S. flexneri 3a 사이 예상 있을 수 있습니다 하지만 작은 분 S. sonnei9에 비해 이러한 긴장에서 볼 수 있다. SBA의 항 체-항 원 바인딩에 의해 보충 폭포의 활성화에 초점을 맞추고. 따라서, BRC 시 약의 취급이이 프로토콜의 실행에 관련 된 많은 중요 한 단계 중 하나입니다. BRC는 그것의 일관 된 성능과 다른 살 균 분석12,,1314NSK의 낮은 수준 때문에이 시험에 사용 하기 위해 선정 됐다.  BRC의 활동 온도 민감한 이며 적절 한 조치를 동결 해 동 사이클 최소화는 BRC 싱글 볼륨으로 aliquoted 그리고 분석 결과에 사용 직전 BRC aliquots는 신속 하 게, 해 동을 보장 하기 위해 이동 해야 합니다. 보수 활동의 일관성이 분석이 결과의 재현성에 영향을 줄 것 이다. 분석 결과 재현성에 영향을 주는 다른 중요 한 단계는 생산 및 세균성 주식 희석입니다. 그 분석 결과 시작 하기 전에 적절 한 세균성 주식 희석 결정 됩니다, 분석 결과 성공으로 일관 된 생산의 컨트롤 A와 B에 따라 CFU 카운트 평균 자리 당 ~ 120 CFU 중요 하다. 소프트웨어에 의해 수 있는 관광 명소를 위해서, 그것도 필수적 플레이트 박테리아를 사용 하는 기술을 성공적으로 실행 됩니다. 증 착 세균성 솔루션 및 명소 실행 ~ 2-3 접시의 기울이기의 cm은 좋은 소프트웨어에 의해 정확한 계산에 대 한 바로 크기와 올바른 배포의 식민지를 생산을 위한 중요 한. 정확 하 고 일관 된 결과이 프로토콜에 의해 생산 됩니다 보장 모든이 단계를 습득

모든 중요 한 단계는 실행 하는 경우에 잘 있을 수 있습니다 여전히 수정 하거나이 프로토콜 문제를 해결 하는 데 필요한 경우. 다른 박테리아를 평가 하기 위해이 프로토콜의 수정 하룻밤 LBA 판 부 화 온도, 마이크로-식민지의 형성을 보장 하기 위해 최적화를 해야 합니다. 다른 변종 박테리아 또는 항 체의 혈 청, 다른 소스 보완 농도의 최적화를 요구할 수 있습니다. NSK 값과 제어 세라의 KIs 또한 분석 결과 적절 하 게 작동 하는지 확인을 모니터링 해야 합니다. NSK 하지 이상 70% 상승 한다. 세라 다 안 해야 하는 컨트롤의 기 이상 ± 2SD를 의미 한다. 성공적이 고 일관 된 결과 얻기 위해이 프로토콜을 사용 하는 경우는 위에서 설명 하는 중요 한 단계에 특별 한 주의 함께 여기에 설명 된 대로 모든 단계를 수행 하는 데 필요한 것입니다.

이 프로토콜은 Shigella 연구 커뮤니티에 중요 한 필요를 채우고, 하는 동안 그것은 그것의 제한 없이입니다. 이 프로토콜 생물 학적 자료에 의존 하며, 따라서 항상 제어 하기 어려운 몇 가지 변화를 있을 것입니다. 다른 많은 소스에서 보완 활동 변화 분석 실험에 있는 가변성에 기여할 수 있습니다. 이 줄이기 위해 보수를 적절 하 게 처리 하 여 구입 하기 전에 활동에 대 한 보수의 새로운 많은 테스트 중요 하다. 그것은 또한 균질 공급을 알려진 활동 보수 많이의 풀을 만들 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 디자인에 의해 간단 하 고 어떤 특수 장비가 필요 하지 않습니다 이며 소프트웨어를 열거 하는 자동화 된 식민지 자유롭게 사용할 수 있습니다. 이 단순 이점이 동안, 거의 모든 실험실에서 사용 될이 프로토콜을 허용 여전히 필요지 않습니다 하룻밤 부 화. 최근 분석 실험 훨씬 짧은 보육 요구 하지만 전문, 예비 시 약15필요가 설명 했습니다. 이 분석 결과의 또 다른 한계는 그것의 현재 모양에서 그것은 한 번에 하나의 세균성 종 조사입니다. Shigella 필드에서 multivalent 백신을 만들려는 욕망은 하 고 다중 방식으로 병원 체를 평가할 수 있는 면역학 분석 실험 데 큰 가치 이다. 이 분석 결과,이 필요를 충족을 나중에 수정할 수 있지만 현재의 형태로, 그것은 단일-플렉스 분석 결과.

이 분석 결과 몇 가지 제한, 그것은 여전히 기존 또는 다른 방법에 비해 많은 이점이 있다. 이러한 장점은 훨씬 노동 집약 및 전통적인 Sba 보다 더 높은 처리량이 메서드의 실행을 결합 하는 많은 개선을 포함 합니다. 모든 재료와 이것을 완료 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 도움이 냉동된 세균성 주식의 사용, 96 잘 접시 분석 결과 형식, 큰 사각 접시에 도금, 사진 촬영 및 자동 식민지 세, 식민지의 채색 분석 결과입니다. 이 분석 결과 또한 어떤 특수 시 약 또는 장비 필요로 하지 않기 때문에 다른 높은 처리량 방법에 비해 이점이 있다. 기본적인 시 약 및 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 모든 실험실 설정에서 응용 프로그램에 대 한 수 있도록 설명 하는 프로토콜을 수행할 수 있습니다.

모든이 프로토콜을 제공 하는 장점 많은 미래의 수사에 그것의 사용을 지원 합니다. 분석 결과 적으로 예방 접종 이나 자연 감염 후 면역 반응의 검사에 적합 합니다. 이 응용 프로그램 SBA Shigella 백신 연구에 귀중 한 도구에 대 한 허용 하 고 이미 그것에이 백신의 능력을 보여주었다 Shigella 바이오-공액 백신에서 백신 immunogenicity를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 16기능 항 체 생산을 유도. 이 프로토콜은 광범위 하 게 여러 실험실에 의해 테스트 되었습니다 하 고 안정적이 고 재현 가능한 결과9를 생산 하기 위해 표시 되었습니다. 동일한 샘플17다른 살 균 분석 실험 사용 하 여 테스트 하는 경우이 프로토콜 또한 유사한 결과 생성 합니다. 이 분석 결과 의해 생성 된 데이터에 일관성 그리고 다른 더 오래 된 방법의 호환성 정확 하 게 혈 청 샘플에서 살 균 활동을 평가 하기 위한 강력한 도구. 분석 결과 또한 쉽게 추가 샘플 형식 평가를 적용할 수 있습니다. 혈 청은 성인 임상 시험에서 쉽게 사용할 수, 재판 유아 및 소아;에 초점에 충분 한 혈 청을 얻을 하기가 어려울 수 있습니다. Shigella 백신에 대 한 최종 대상 인구 중 하나입니다. 이러한 시련에 전체 혈액은 정기적으로 필터 종이에 수집 하 고 건조. 이 유형의 SBA를 사용 하 여 샘플 형식으로 몇 가지 예비 성공이 되었습니다. 전체 혈액 이외에 (타 액, 배설물 추출 물, 소변 등) 점 막 샘플 Shigella 백신 연구에 관련 된 타겟 있습니다. 현재,이 프로토콜 3 Shigella 의 가장 임상 관련 serotypes에 대 한 평가 하지만 그것은 또한 추가 Shigella 종 뿐만 아니라 다른 세균성 병원 체에 대 한 적용할 수 있습니다. 미래의 일은이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과와 동일한 특성의 많은 것과 다중 분석 결과의 생산에 집중할 것 이다. 다중화 된 분석 결과 허용할 것 이다 여러 Shigella serotypes의 평가 대 한 동시에, 추가 시험 시간에 손과 샘플 볼륨을 보존. 또한 진행 전세계 실험실에이 분석 결과 전송 하는 일이 있다. 이러한 글로벌 평가 큰 규모로 연구, 미생물학 및 면역학 실험실 박테리아 및 혈 청이이 SBA에 액세스할 수 증가 동시에 분석 결과 자격으로 더 많은 데이터를 생성 합니다 샘플 다른 발병 위치에서 수집. 여기서 설명 하는 분석 결과 간단 하 고 높은 처리량 고 Shigella 필드, 뿐만 아니라 다른 세균성 병원 체의 평가에 광범위 한 응용 프로그램에서 면역학 평가 개선 하는 기능이 있다.

Disclosures

R.W.K 미국 정부의 직원 이며, 같은이 책에서 표현 들 저자와 반드시 공식적인 정책 또는 육군, 국방부, 미국 정부의 부의 입장을 반영 하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 M.H.N. 경로에서 교부 금에 의해 투자 되었다 이 연구는 협동 연구와 월터 리드 육군 연구소 그리고 버밍엄에서 알라바 마의 대학 사이 개발 계약으로 실시 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/

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References

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높은 처리량 <em>Shigella</em>-특정 살 균 시험
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Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).More

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).

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