Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta Shigellacidal aktivitet av antikroppar i serum. -Serum blandas med bakterier och exogena komplement, inkuberas, och reaktionsblandningen är klädd på agarplattor. Livskraftiga bakterier bildar kolonier som räknas, med hjälp av en automatiserad kolonin uppräknare och används för att bestämma bakteriedödande titern.
Abstract
Serum bakteriedödande analyser (SBAs) mäta den funktionella aktiviteten av antikroppar och har använts i många årtionden. SBAs mäta direkt antikropp dödande aktivitet genom att bedöma möjligheten av antikroppar i serum för att binda till bakterier och aktivera komplement. Denna komplementaktivering resulterar i lys och dödandet av målet bakterier. Dessa analyser är värdefulla eftersom de går utöver kvantifiera antikroppsproduktion för att belysa de biologiska funktioner som dessa antikroppar har, så att forskare att studera den roll som antikroppar kan spela för att förhindra infektion. SBAs har använts för att studera immunsvaret för många mänskliga patogener, men det finns ingen allmänt accepterad metod för Shigella i dagsläget. Historiskt, har SBAs varit mycket arbetsintensiva, som kräver många tidskrävande steg att exakt kvantifiera överlevande bakterier. Det här protokollet beskriver en enkel, robust, och hög genomströmning assay att åtgärder funktionella antikroppar specifika för Shigella i serum in vitro. Den metod som beskrivs här erbjuder många fördelar jämfört med traditionella SBAs, inklusive användning av frysta bakteriell bestånd, 96 assay väl plattor, mikro-kultur system och automatiserade koloni-räkna. Alla dessa ändringar gör denna analys mindre arbetsintensiva och mer hög genomströmning. Detta protokoll är enklare och snabbare att utföra än traditionella SBAs samtidigt som fortfarande använder enkel teknik och lättillgängliga reagenser. Protokollet har tillämpats framgångsrikt i flera oberoende laboratorier och analysen är robust och reproducerbara. Analysen kan användas för att bedöma immunsvar i prekliniska samt kliniska studier. Kvantifiera shigellacidal antikroppsnivåerna var både före och efter antigen exponering (antingen genom immunisering eller infektion) möjliggör en bredare förståelse för hur funktionella antikroppar Svaren genereras och deras bidrag till skyddande immunitet. Utvecklingen av detta standardiserade, välkarakteriserad assay kan kraftigt underlätta Shigella vaccin design.
Introduction
Shigella serotyper, Shigella flexneri 2a, 3a S. flexneri och S. sonnei, visar epidemiologiska prevalensen globalt. Diarrésjukdomar orsakade av dessa Shigella arterna effekter militära, resenärer1, och är en ledande dödsorsak diarré bland barn under 5 i utvecklingsländerna2år. För närvarande finns det inga licensierade vacciner som skyddar mot Shigella, dock finns det flera kandidat vaccin i olika stadier av utvecklingen. Många av dessa vacciner och andra förebyggande åtgärder håller på att utvecklas, fokuserar på antikroppar produceras mot Shigella lipopolysackarid (LPS). LPS är en attraktiv vaccinkandidat eftersom det är en större ytantigen och naturlig smitta med Shigella inducerar LPS-specifika antikroppar som kan vara skyddande mot återinfektion i ett serotypspecifika sätt. En framgångsrik Shigella vaccin behöver därför förmodligen vara multi-valent och mål 3-4 Shigella serotyp för att framkalla immunitet mot 70-80% av globalt cirkulerande stammar3,4, 5 , 6. Detta kräver att analyser att utvärdera Shigella vaccinkandidater är specifik för flera olika serotyper.
Aktuella immunologiska analyser för att utvärdera vaccinkandidater fokusera på kvantifiera nivåer av antikroppsnivåerna var, men det finns några välkarakteriserad analyser att utvärdera funktionella antikroppar. Undersökning av antikroppar funktionell förmåga är viktigt eftersom patogen specifika antikroppar är ansvariga för att bekämpa infektion genom ett antal funktionella mekanismer inklusive bindande bakterier ytantigener och förhindra vidhäftning till och infektion av epitelceller, inriktning bakterieceller eller opsonization och fagocytos och direkt döda patogener genom bindande och initiera komplement kaskad. Direkta dödandet av bakterier genom antikroppar uppstår när antikroppar binder till ytan komponenter av målet bakterier och initiera komplement kaskad leder till aktivering av många zymogens att i slutändan resultatet i pore formation i bakteriella cell som orsakar lys och bakteriell död. Detta direkt dödande av bakterier av cirkulerande antikroppar och komplement kan vara en avgörande tidiga försvarslinje under infektion.
Individer som är naturligt smittade har antikroppar med shigellacidal aktivitet i deras sera. Dessa Shigella -specifika antikroppar upptäcktes med hjälp av traditionella komplement-medierad dödande analyser 7,8. Detta indikerar att det kan finnas en roll för bakteriedödande antikroppar i skydd mot Shigella. Traditionella bakteriedödande analyserna är enkel i sitt utförande: serum är Värmeinaktiverade (att förstöra endogena komplementaktivitet) och blandas med bakterier av intresse. Exogena komplement läggs till denna blandning på en viss koncentration. Reaktionsblandningen är inkuberas för att möjliggöra bakterie dödande och sedan pläterade bekräfta kolonibildande enheter (CFUs). När CFUs räknas, en 50% döda index (KI) kan beräknas och en SBA titer bestäms. Medan detta förfarande är relativt enkel, dessa analyser kan vara arbetskrävande och tidsödande att utföra och resultatet kan vara mycket varierande. Utöver dessa begränsningar finns för närvarande ingen väl karakteriserade funktionella analyser för Shigella. Därför, vi har framgångsrikt utvecklat och kvalificerade en enkel, högt dataflöde test att mäta Shigella baktericida för tre av de mest kliniskt relevanta stammar9. Det här protokollet beskriver en SBA med ändringar som förbättrar assay effektivitet och reproducerbarhet. Först av dessa ändringar är användningen av frysta bakteriell lagren. Produktionen av engångsbruk lager eliminerar behovet av att kultur färska bakterier för varje analys samtidigt minska assay-till-assay variabilitet. En annan tid och arbete spara fördel av detta protokoll är användningen av ett plattan med 96 brunnar assay format. Detta möjliggör för seriell spädning av prover så att en serie koncentrationer kan testas. Det möjliggör också användning av multikanal för plätering prover på torget petriskålar. När dessa fyrkantiga petriskålar används tillsammans med ett kultur-system som producerar mikro-kolonier, reduceras antalet agarplattor behövs för analysen. Detta, möjliggör i kombination med fritt tillgänglig koloni-inventering programvara, utvecklades ursprungligen för den pneumokocker multiplexade lägre döda assay (MOPA)10, snabb, automatiserad och tillförlitlig kolonin uppräkningen. Alla dessa förbättringar avsevärt minska hands-on assay tid och skapa en hög genomströmning-system som möjliggör flera plattor som ska köras på en gång.
Medan detta protokoll har optimerats för tre av de mest kliniskt relevanta serotyperna av Shigella, SBA beskrivs här kan enkelt appliceras på många andra bakteriella patogener. Förutom detta protokollets potentiella användning med andra bakterier har detta protokoll potential att expandera bortom användande endast serum som utgångsmaterial, vilket kan innefatta analys av antikroppar i andra relevanta provtyper såsom slemhinnor prover, inklusive saliv och fecal prov. Användning av denna analys att undersöka immunologiska svar efter vaccination kan ge bredare inblick i immunsvar som genereras av vaccination leder till rationell design av vacciner, och stöd i förståelsen av hur naturlig immunitet utvecklar.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna för WRAIR mänskliga motivets dataskyddsstyrelsens ordförande. Prover som används i denna studie är humant serumprover samlas in som en del av WRAIR protokollnummer 1328, i överensstämmelse med alla institutionella och federala styr skydd av försökspersoner. Prover var avidentifierade och användningen av dessa anonyma prover klassades som icke-mänskliga föremål forskning av UAB IRB (protokollnummer N150115001).
1. Förbered analysreagenser
- Förbereda 1% Gelatin genom att lägga 1 g gelatin till 100 mL vatten. Autoklav och förvara i rumstemperatur.
- Förbereda 100 mg/mL TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium klorid) stamlösning (1, 000 x) genom att lägga till 5 g TTC 40 mL vatten. När TTC är helt upplöst, justera volymen till 50 mL med vatten och sterila filter använder 0,2 µm filter. Förvara lösningen vid 4 ° C och skyddas från ljus.
Obs: TTC colorizes bakteriekolonier och gör dem mycket lättare att räkna. TTC lösning har en liten gul färg. Om TTC lösning framkallar en röd färg, kasta och förbereda färska. - Förbereda 10% natrium natriumazid (NaN3) stamlösning (100 x) genom att lägga till 5 g NaN3 40 mL vatten. Efter fullständig upplösning, tillsätt vatten till 50 mL. Förvara i rumstemperatur.
Varning: Natriumazid är ett gift och kan vara giftiga vid förtäring eller absorberas genom huden eller ögonen. Den kan reagera med bly och koppar VVS att bilda högexplosiva metallazider. Vid avyttring av reagenser som innehåller natriumazid, spola med stora mängder vatten för att förhindra azider eller Släng i en påse med biohazard. - Förbereda LBA plattan (LB agarplatta) genom att lägga till 35 g av LB agar till 1 L vatten och autoklav. Tillsätt 25 mL till varje kvadrat petriskål (120 x 120 mm2). Inkubera plattorna vid RT för 10-20 min att tillåta agar stelnar. Placera tallrikar tillbaka i plastpåsar och förvara vid 4 ° C i upp till 1 månad.
- Förbereda Overlay Agar genom att lägga till 7,5 g agar 1000 mL vatten och autoklav. Inkubera i 56 ° C vattenbad tills den behövs. Precis innan användning, tillsätt 1 mL 100 mg/mL TTC och 10 mL 10% NaN3 och blanda väl.
Obs: Varje LBA platta behöver 25 mL av Overlay Agar. Toppskiktsagar kan förberedas upp till en månad i förväg och smält i en mikrovågsugn eller på en värmeplatta som behövs för analysen. Se till att agar temperatur ~ 55 ° C före ansökan till LBA plattor. - Förbereda analysbuffert genom att tillsätta 5 mL av 10 x Hanks's Balanced Salt lösning (HBSS) med Ca2 +/Mg2 + och 5 mL 1% gelatin i 40 mL vatten. Förvara i rumstemperatur.
2. Förbered komplement och rikta bakterier
-
Förbereda baby kanin komplement (BRC)
Obs: Detaljerade kriterier för komplement hel urval kan hittas här: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf- Få fryst BRC och Tina med rinnande kallt vatten. Fysiskt blanda BRC varje ~ 10-20 min tills helt tinade. Utsätt inte BRC för upprepad frysning tö cykler.
- Medan BRC upptining, etikett 1,5 mL, 5mL eller 15 mL centrifugrör. Plats märkt rören på isen svalna före. Alikvotens korrekt volym BRC nedkylda Centrifugera rören (efter fyllning, omedelbart återvända varje tub till isen). Förvara alikvoter vid ≤-70 ° C i frysen.
Obs: Ca 1 m av komplement behövs för varje test-platta. Alikvoter som komplement är för engångsbruk och ska vara aliquoted i volymer lämpliga till assay layouter. - För att förbereda Värmeinaktiverade BRC, Tina en alikvot av aktiva BRC. Förbereda ett 56 ° C vattenbad. Efter BRC är helt tinade, överföra den till vattenbadet och inkubera i 30 min.
- Efter inkubation, ta bort Värmeinaktiverade BRC från vattenbadet och låt svalna på RT för 10-15 min. blanda kraftigt, och alikvotens ~ 150 µL 1,5 mL mikrocentrifug rör. Lagra alikvoter vid ≤-10 ° C.
-
Förbereda målet bakterier lager
Obs: Proceduren nedan används för att förbereda 48 portioner av målet bakterier materiel. om fler portioner behövs protokollet kan skalas upp.- Ta bort bakterier master lager flaska från frysen och skrapa frysta bakteriell ytan för att ta en liten mängd is från injektionsflaskan på blodagar plåt. Omedelbart återlämna master lager injektionsflaskan till frysen.
- Strimma här små alikvot av bakteriell lager på blodagar tallrik och täck med plattan locket. Inkubera plattan uppochner över natten i 37 °C/5% CO2 inkubator.
- Överföra ~ 10 isolerade smidig kolonier till en 50 mL tub innehållande 30 mL LB buljong. Inkubera under 3-5 timmar vid 37 ° C under varsam skakning tills kultur buljongen har en OD600 av ~0.6-0,7.
- Skörda toppen 12,5 mL av kulturen och överföring till en färsk 50 mL tub. Centrifugera kulturen på 15 000 x g i 2 min med en bordsskiva mikro-centrifug. Avlägsna supernatanten och slamma pelleten i 25 mL 15% steril glycerol-LB.
- Blanda väl och dosera 0,5 mL alikvoter i sterila 1,5 mL micro centrifugrör (~ 48 rör). Lagra alikvoter vid ≤-70 ° C i frys.
- Bekräfta det bakteriella identitet med agglutinationsprovet före användning.
-
Bestämning av optimala utspädningsfaktorn för målet bakterier lager
Obs: Varje sats av målet bakterier lager måste titreras i assay villkor för att bestämma utspädningen som nödvändigt att ge ~ 120 CFU/spot på LB tallrikar.- Få en mikrotiterplattan (utspädning plattan) och tillsätt 135 µL analysbuffert till väl 1A. Tillsätt 120 µL Assay smör till brunnar 1B - 1H.
- Ta bort en flaska med frysta målet bakterier ur frysen och Tina i rumstemperatur. Lägg till 15ul av tinade bakteriell lager till väl 1A för att göra en 10-faldig utspädning av bakteriell beståndet.
- Överföra 30 µL bakteriell lösning från väl 1A till väl 1B att utföra en 5 gånger seriell utspädning. Fortsätt 5 gånger seriespädningar väl 1H för sammanlagt 8 utspädningar (1:10 1:50 1: 250, 1:1 250, 1:6 250, 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
- Få en annan mikrotiterplattan (Assay plattan) och tillsätt 20 µL analysbuffert till alla väl i kolumnerna 1 och 2 i Assay plattan.
- Över 10 µL utspädda bakterier från varje brunn i kolumn 1 i utspädning plattan i motsvarande brunnar i kolumnerna 1 och 2 av Assay plattan. 10 µL av bakterier överförs från väl 1A Skyltens utspädning till väl 1A och 2A i test plattan, etc.
- Fortsätt med analysmetod som beskrivs i Serum bakteriedödande Assay (SBA) nedan för kontroll en och kontroll B, steg 3,6-3.12.
- När plattorna har inkuberats på is, använda en flerkanalspipett med 8 pipettspetsar för att upptäcka 10 µL från brunnarna i kolumn 1 på en LBA-plattan. Också, spot brunnarna från kolumn 2 på LBA plattan.
- Fortsätt med analysen som beskrivs nedan i steg 3.14-4.6.
- Bestämma bakterier utspädning som ger ~ 120 CFU/spot Control b, denna utspädning kommer att användas i analysen.
3. serum bakteriedödande Assay (SBA)
Obs: Proceduren som beskrivs nedan är för en assay platta, men antalet Assay plattor kan ökas.
- Värme-inaktivera testa prover av ruvande prover i 56 ° C vattenbad under 30 minuter.
Obs: Proverna måste vara Värmeinaktiverade före provningen att upphäva alla endogena komplementaktivitet. Detta kan göras före analysen och inaktiverade prover kan åter fryst eller lagras vid 4 ° C tills testas. - Få en Assay plattan och tillsätt 20 µL analysbuffert i kolumnerna 1 till 12 av A rader genom G. Tillsätt 20 µL analysbuffert till kolumnerna 1 och 2 i rad H, se tabell 1.
- Ladda 30 µL av varje prov, i två exemplar till rad H Skyltens Assay. Till exempel Dispensera 30 µL prov 1 i brunnar 3 H och 4 H och fördela 30 µL prov 2 i brunnar 5 H och 6 H, etc.
-
Utför 3-faldig seriespädningar av testprover med hjälp av en flerkanalspipett.
- Ta bort 10 µ av provet från wells 3H - 12H och överföring till motsvarande brunnar i rad G och blanda provet väl genom pipettering upp och ner 8 - 10 gånger.
- Sedan bort 10 µ från wells 3G - 12G och överföring till motsvarande brunnar i raden F och blanda väl.
- Fortsätt dessa seriespädningar igenom rad A. Efter blandning brunnarna i rad A, avlägsna och kassera 10 µl från brunnar 3A-12A så att alla brunnar innehåller 20 µl.
Obs: Eftersom 20 µL serum används i en analysmetod total volym av 80 µL, finns det en 4-faldig ytterligare utspädning i analysen. Denna utspädning skall beaktas vid beräkning av en SBA titer genom utspädning av serumet multipliceras med 4. Exempelvis om en start utspädning 1:2 används, är den faktiska utspädning som testas 1:8.
- Ta bort en injektionsflaska med frysta målet bakterier lager och Tina i rumstemperatur. Späd ut bakterierna i 20 mL analysbuffert enligt förutbestämd optimal utspädningsfaktorn (detta utspädningsfaktorn bestämdes i avsnitt 2.3). Tillsätt 10 µL utspädda bakterier till varje brunn av assay plattan med hjälp av en flerkanalspipett.
- Ta bort en injektionsflaska med frysta BRC och en injektionsflaska med fryst Värmeinaktiverade BRC, Tina i rumstemperatur med rinnande kallt vatten eller placera på rosten av en biologisk säkerhet skåp med blåser luft för att Tina snabbt.
- Bered en 20% lösning av Värmeinaktiverade BRC. Blanda 100 µL Värmeinaktiverade BRC med 400 µL analysbuffert. Tillsätt 50 µL av 20% Värmeinaktiverade BRC lösningen till alla brunnar i kolumn 1 (kontroll en brunnarna).
Obs: Värmeinaktiverade BRC används som en kontroll för att övervaka icke-specifik dödande (NSK) i analysen. - Bered en 20% lösning av infödda BRC. Blanda 1 mL av infödda BRC med 4 mL analysbuffert. Tillsätt 50 µL av denna blandning till alla brunnar i kolumnerna 2 till 12 (test och kontroll B prov brunnarna).
Obs: Den slutliga koncentrationen av BRC i reaktionsblandningen är 12,5%. - Kort blanda Assay plattan genom att skaka försiktigt i 10-15 s på en tallrik shaker eller blanda genom pipettering upp och ner 8 gånger med hjälp av en flerkanalspipett.
- Satte Assay plattan i 37 ° C mikrobiologiska inkubator för 2 h (utan skakningar).
- Torra 2 LBA plattor genom att ta bort locken och placera tallrikar möta i biologiska säkerhetsskåp för 40-60 min.
- När 2 h ruvning är klar, flytta Assay plattan att våt is och inkubera i 10-20 min att stoppa reaktionen.
- Med 12-kanals pipett blanda brunnarna i rad H och spot plattan 10 µL av reaktionsblandningen på botten av en LBA-plattan. Omedelbart luta plattan och låt fläckarna att köra för ~1.5-2 cm. Upprepa proceduren för rad G, F och E, spotting dem ovanför den föregående raden på LBA plattan. Rad E, F, G och H är fläckig på en LBA plattan, och rad A, B, C och D är fläckig på andra LBA plåt på samma sätt, se figur 1.
- Inkubera plattorna LBA vid rumstemperatur tills lösningen är adsorberat plattorna LBA (10-15 min). Sätt locken på LBA plattorna och placera LBA plattorna i mikrobiologiska inkubatorn uppochnervänt Inkubera över natten (~ 16-18 h). Inkubera S. flexneri 2a och 3a på 29 ° C och inkubera S. sonnei är på 26 ° C.
Obs: Dessa temperaturer ger mindre ”mikro-kolonier” med storlekar passar korrekt räknar med en koloni counter9. - Efter natten inkubation, tillsätt 25 mL Overlay Agar (vid ~ 55 ° C) innehållande 100 µg/mL TTC och 0,1% NaN3 till varje LBA-platta.
- Inkubera LBA plattorna vid 37 ° C i 2 h att tillåta de överlevande bakterierna utveckla röd färg, se figur 1 nedan.
- Fotografera plattor med en digitalkamera och överföra bilder till en dator där NIST: s integrerade kolonin numreringen programvara (NICE) har installerats, se figur 2.
Obs: TREVLIG koloni-räknar mjukvaran är tillgänglig utan kostnad. Se Lista över material för detaljer och instruktioner för installation.
4. räkna bakterie kolonier
- Öppen trevlig mjukvaran och ingående Operatörens namn, Experiment information och någon assay anteckningar i fälten tomma. Klicka på knappen klar när denna data anges.
- Importera fotograferade plattor genom att klicka på knappen Öppna och välja rätt filer från datorn.
- Justera parametrarna test genom att ange antalet rader 4 och antalet kolumner till 12. Justera inställningen bakgrunden till-3 sigma och Resolution till låg. Se figur 2.
- Flytta områden av intresse (ROIs) genom att klicka och dra så att varje ROI är direkt över ett prov plats. Se till att alla bakteriekolonier inuti ROI med ingen överlappning mellan prover. När en platta är klar, dubbelklicka på nästa plattan i listan lagrade bilder och justera ROIs. Se figur 2.
- När alla plattor har justerats, klicka på knappen grön greve , se figur 2 och figur 3. När räknar är klar klicka på Exportera för att exportera data i.xls/.xlsx format. Namnge och spara filen.xls/.xlsx för dataanalys.
- Ordna exporterade data in i ett tabellformat så att räkningarna är organiserade i en tabell som representerar 96 brunnar assay plattan, se tabell 2.
5. beräkna SBA Titer (KI) och icke-specifik dödande (NSK)
Obs: SBA titer eller dödande index (KI) definieras som det reciproka värdet av den serumspädningen som dödar 50% av bakterierna som mål.
- Beräkna 50% döda (KI) cutoff indexvärdet med genomsnitt av CFU av aktiva komplement kontrollbrunnar (kontroll B) och dividera med 2. Beräkna den genomsnittliga CFU för varje utspädning av varje prov som kördes i två exemplar, se tabell 3.
- Eftersom en spädning av serumet ger sällan exakt 50% KI värdet, det kan interpoleras från två sekventiella serumspädningar, en som dödar mindre än 50% och en som dödar mer än 50%, se figur 4. Formeln för att beräkna den interpolerade SBA KI visas nedan:
Obs: Den baktericida titer, eller KI, kan också beräknas automatiskt med hjälp av Opsotiter-programvara som utvecklats av UAB. Att begära Opsotiter, kontakta Dr Moon Nahm eller Mr. Rob Burton. Se https://www.vaccine.uab.edu för kontaktinformation. - Beräkna värdet NSK genom att ta 1 minus genomsnittet av kontroll B dividerat med medelvärdet av kontroll A.
Representative Results
En plattan med 96 brunnar layoutalternativet för en typisk analys visas i tabell 1. Denna layout har aktiva komplement kontrollbrunnarna (kontroll B), Värmeinaktiverade komplement kontrollbrunnarna (kontroll en) och fem prover i två exemplar. Prover seriellt spädas ut 3 gånger upp plattan från rad H ro en möjliggör 8 utspädningar av varje prov som testas på en gång. Figur 1 visar två LBA plattor efter natten inkubation och overlay tillsats. Färgutveckling har ägt rum och alla överlevande kolonier är synliga i rött. Bakterie dödande syns tydligt för alla prov i de första tre utspädningarna (rader F-H) och som prover späds ytterligare upp plattan, en minskning av bakterie dödande ses där serum är mindre koncentrerad. NICE programvarugränssnitt kan ses i figur 2. Micro-kolonin räknas från den trevlig mjukvaran kan ses i figur 3, och dessa räknas har varit organiserat i tabell 2. Antalet genomsnittliga CFU för varje utspädning av varje prov beräknas och en 50% KI värde beräknas i tabell 3. Detta 50% KI värde kan tillämpas på de genomsnittliga CFUs för varje spädning av serumet att fastställa de värden som behövs för att beräkna SBA KI enligt formeln beskrivs i figur 4. Det slutliga resultatet av analysen visas i tabell 4.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 | Utspädning 8 |
| B | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 | Utspädning 7 |
| C | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 | Utspädning 6 |
| D | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 | Utspädning 5 |
| E | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 | Utspädning 4 |
| F | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 | Utspädning 3 |
| G | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 | Utspädning 2 |
| H | Kontroll en | Kontroll B | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 | Utspädning 1 |
| Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | Prov 4 | Prov 5 | ||||||||
Tabell 1: Assay plattan layout. Kolumnerna 1 och 2 innehåller komplement kontrollbrunnarna. Kontroll en ligger i kolumn 1 och är den Värmeinaktiverade komplettera kontrollen, som innehåller SBA buffert, bakterier och Värmeinaktiverade komplement. Kontroll B ligger i kolumn 2 och är aktivt komplettera kontrollen, som innehåller SBA buffert, bakterier och komplement. Kolumnerna 3-12 innehåller serumprov. Varje prov körs dubbla och seriellt utspädda 3gånger från rad H enligt rad A
Figur 1: LBA plattor efter färgutveckling. Representativa S. flexneri 3a mikro-bakteriekolonier vuxit över natten till lämplig storlek. Toppskiktsagar har lagts och kolonier har utvecklat en röd färg genom reduktion av TTC föreningen i toppskiktsagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: NIST: s integrerade kolonin uppräknaren (NICE) programvarugränssnitt. Grafisk representation av fin programvarugränssnitt. Regioner av intresse (ROIs) är centrerad över kolonier för varje plats innan du räknar. Data kan exporteras direkt från fönstret NICE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: LBA plattor räknade i trevlig mjukvaran. Färg fotografi bilder läses in i trevlig mjukvaran och kolonin bildar enheter (CFUs) räknas automatiskt. Denna bild visar två representativa LBA plattor med sin koloni count information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 185 | 167 | 145 | 151 | 122 | 134 | 119 | 142 | 124 | 115 | 113 | 123 | 1:17496 | Utspädning 8 |
| 186 | 152 | 145 | 138 | 132 | 135 | 108 | 116 | 100 | 119 | 105 | 109 | 1:5832 | Utspädning 7 |
| 179 | 160 | 145 | 135 | 109 | 120 | 54 | 55 | 71 | 75 | 79 | 89 | 1:1944 | Utspädning 6 |
| 193 | 153 | 146 | 138 | 87 | 105 | 5 | 6 | 6 | 9 | 19 | 30 | 1:648 | Utspädning 5 |
| 184 | 129 | 121 | 143 | 6 | 7 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | Utspädning 4 |
| 180 | 145 | 22 | 24 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1: 72 | Utspädning 3 |
| 207 | 129 | 1 | 0 | 2 | 2 | 1 | 0 | 4 | 1 | 0 | 1 | 1:24 | Utspädning 2 |
| 201 | 140 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 4 | 4 | 1:8 | Utspädning 1 |
| Kontroll en | Kontroll B | Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | Prov 4 | Prov 5 | |||||||
Tabell 2: antal bakteriekolonier. CFU räknas exporteras från trevlig mjukvaran till excel-format. Dessa räknas kan ordnas till en tabell som visar bakteriella räknas för alla dubbla prover och kontrollbrunnarna.
| Kontroll en | Kontroll B | 148 | 128 | 131 | 120 | 118 | 1:17496 | Utspädning 8 |
| 189 | 147 | 142 | 134 | 112 | 110 | 107 | 1:5832 | Utspädning 7 |
| NSK (1-CtrB/CtrA): 22% | 140 | 115 | 55 | 73 | 84 | 1:1944 | Utspädning 6 | |
| 50% KI (CtrB/2): 73 | 142 | 96 | 6 | 8 | 25 | 1:648 | Utspädning 5 | |
| 132 | 7 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | Utspädning 4 | ||
| 23 | 3 | 2 | 1 | 0 | 1: 72 | Utspädning 3 | ||
| 1 | 2 | 1 | 3 | 1 | 1:24 | Utspädning 2 | ||
| 0 | 0 | 1 | 1 | 4 | 1:8 | Utspädning 1 | ||
| Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | Prov 4 | Prov 5 | ||||
Tabell 3: beräkning av 50% KI cutoff-värdet och dubbla prov medelvärden. 50% KI cutoff värdet beräknades genom att ta medelvärdet av alla kontroll B brunnar och dividera med 2. Medelvärden av dubbletter beräknades för varje utspädning av varje prov som kördes i två exemplar. NSK värdet beräknas också.
Figur 4: Schematisk av linjär interpolation. Antalet överlevande bakterier (y-axeln) på varje utspädning av serumet testade (x-axeln) är ritade (svarta diamanter) och enskilda punkter förbinds av den tunna, streckad svart linjen. De fasta och streckade horisontella linjerna visar 0% och 50% döda, respektive. Serumspädningarna ovan (utspädning 5) nedan (utspädning 4) 50% döda linje är anslutna med en röd linje och bakteriedödande titer (KI) är indicerat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| SBA KI | |
| Prov 1 | 72 |
| Prov 2 | 216 |
| Prov 3 | 1994 |
| Prov 4 | 1994 |
| Prov 5 | 648 |
Tabell 4: SBA resultat visar bakteriedödande titer (KI). SBA KI slutvärdena har fastställts för varje prov och visas. Dessa värden beräknas enligt de genomsnittliga CFUs, värdet 50% KI cutoff och linjär interpolation formeln.
Discussion
Protokollet beskrivs här visar en funktionell immun analys för att bedöma shigellacidal aktiviteten av antikroppar i serum. I analysen visat för detta protokoll monoklonala antikroppar specifika för S. flexneri 3a var användas9 tillsammans med mänskliga kontrollsera från ett tidigare Shigella vaccin studie11. Källan till serum testas i denna analys kan varierar kraftigt från prekliniska djur prover till mänskliga kliniska prover, och aktiviteten shigellacidal i serumprovet påverkas av vaccinationer och exponeringar som individen har upplevt. Viss korsreaktivitet kan förväntas mellan närbesläktade serotyper, särskilt S. flexneri 2a och S. flexneri 3a men lite korsreaktivitet har setts i dessa stammar i jämförelse med S. sonnei9. Grunden för SBA fokuserar på aktivering av komplement kaskad av antikropp-antigen bindande. Därför är hanteringen av BRC reagens en av de många kritiska steg som är involverade i genomförandet av detta protokoll. BRC valdes för användning i denna analys på grund av dess konsekvent prestanda och låga nivåer av NSK i andra bakteriedödande analyser12,13,14. Aktiviteten hos BRC är temperaturkänsliga och lämpliga åtgärder måste vidtas för att säkerställa att frysa tö cykler minimeras, att BRC är aliquoted till engångsbruk volymer, och att de BRC alikvoter är tinade snabbt, omedelbart före användning i analysen. Konsekvens av komplementaktivitet påverkar reproducerbarheten för denna analys. En annan avgörande steg som påverkar analysreproducerbarhet är produktion och utspädning av bakteriell bestånd. Det är viktigt att innan du börjar analysen den tillämpliga utspädningen av bakteriell bestånd bestäms, som assay framgång är beroende på konsekvent produktion av kontroller A och B ha CFU räknas i genomsnitt ~ 120 CFU per plats. För att få ställen som är räknebara av programvara, är det också viktigt att den teknik som används för platta bakterier utförs framgångsrikt. Nedfall av bakteriell lösning och vippning av plattan så att ställen kör ~ 2-3 cm är kritisk för att producera kolonier av rätt storlek och rätt distribution för noggrann inventering av NICE programvara. Behärska alla dessa steg kommer att säkerställa att korrekta, konsekventa resultat produceras av detta protokoll
Även när alla kritiska steg utförs finnas väl fortfarande instanser där det är nödvändigt att ändra eller felsöka detta protokoll. Ändringar i detta protokoll att utvärdera andra bakterier kan kräva optimering av övernattning LBA plattan inkubation temperaturen, att säkerställa bildandet av mikro-kolonier. Andra stammar av bakterier eller antikropp källor, utom serum, kan kräva optimering av komplement koncentration. NSK värden och KIs av kontrollserumen bör också övervakas för att säkerställa att analysen fungerar korrekt. NSK bör inte stiger över 70%. KI kontroll sera inte får variera mer än menar ± 2SD. Uppnå lyckad och konsekvent resultat när du använder det här protokollet, kommer det vara nödvändigt att utföra alla steg som beskrivs här med särskild uppmärksamhet på de kritiska steg som beskrivs ovan.
Medan detta protokoll fyller ett viktigt behov i Shigella forskarsamhället, är det inte utan sina begränsningar. Detta protokoll är beroende av biologiskt material och därför kommer alltid att finnas vissa variationer som är svår att kontrollera. Variationer i komplementaktivitet från olika partier och källor kan bidra till variationer i analyser. För att minska detta, är det viktigt att hantera komplement på rätt sätt och testa nya massor av komplement för aktivitet innan köp. Det kan också vara bra att skapa pooler av komplement massor med känd aktivitet har en homogen leverans. Detta protokoll är enkel design och kräver inte någon specialiserad utrustning och automatiserade kolonin enumerating programvara är fritt tillgänglig. Medan denna enkelhet är en fördel, kräver så att detta protokoll att användas i praktiskt taget alla laboratorium, det fortfarande en övernattning inkubation. Senaste analyser har beskrivits som har mycket kortare inkubation kravet, men kräver specialiserade, förberedande reagenser15. En annan begränsning av denna analys är att den i sin nuvarande form endast är kapabel att utreda en enda bakterieart på en gång. I fältet Shigella finns det en önskan att skapa ett multivalenta vaccin, och med immunologiska analyser som kan bedöma patogener i en multiplex sätt är av stort värde. Denna analys skulle kunna ändras i framtiden för att möta detta behov, men i dess nuvarande form, det är en singel-plex assay.
Medan denna analys har vissa begränsningar, har det fortfarande många fördelar jämfört med befintliga eller alternativa metoder. Dessa fördelar omfattar många förbättringar som samverkar till att göra genomförandet av denna metod mycket mindre arbetsintensiva och mer högt dataflöde än traditionella SBAs. Användningen av frysta bakteriell lagren, ett plattan med 96 brunnar assay format, plätering på större fyrkantig petriskålar, färgning av kolonierna som möjliggör fotografering och automatisk koloni-räkna, bidra alla till att minska det material och den tid som behövs för att slutföra detta assay. Denna analys har också fördelar över andra metoder för hög genomströmning eftersom det inte kräver någon specialiserad reagenser eller utrustning. Protokollet beskrivs kan utföras med grundläggande reagenser och fritt tillgänglig programvara, vilket möjliggör dess tillämpning i en laboratoriemiljö.
Alla de fördelar som detta protokoll ger stöder dess användning i många framtida utredningar. Analysen är idealiskt för undersökning av immunsvar efter vaccination eller naturlig infektion. Denna applikation tillåter SBA vara ett värdefullt verktyg i Shigella vaccinforskning och har redan använts för att utvärdera vaccin immunogenicitet hos Shigella bio-conjugate vacciner där det har visat förmåga av dessa vacciner till inducera produktion av funktionella antikroppar16. Detta protokoll har testats av flera laboratorier och har visat att producera tillförlitliga och reproducerbara resultat9. Detta protokoll ger också jämförbara resultat när de samma proverna testas via andra bakteriedödande analyser17. Samstämmigheten i data som genereras av denna analys, och dess förenlighet med andra äldre metoder gör det ett robust verktyg för att exakt bedöma baktericida i serumprov. Analysen kan också enkelt anpassas till utvärdera ytterligare provtyper. Serumet är lätt tillgängliga i vuxen kliniska prövningar, kan det vara svårt att få tillräcklig serum i studier med fokus på spädbarn och små barn. en av eventuella målgrupperna för Shigella vacciner. I dessa prövningar är helblod rutinmässigt insamlade på filterpapper och torkas. Det har varit några preliminära framgångar med denna typ av samplingsformat använda SBA. Utöver helblod är slemhinnor prover (t.ex. saliv, fekal extrakt och urin) också ett mål som är relevanta i Shigella vaccinforskning. För närvarande detta protokoll har utvärderats för tre av de mest kliniskt relevanta serotyperna av Shigella men det kan också anpassas för ytterligare Shigella spp. samt andra bakteriella patogener. Framtida arbete kommer att fokusera på produktionen av en multiplex assay med många av samma egenskaper som den analysmetod som beskrivs i detta protokoll. En multiplex assay möjliggör utvärdering av flera Shigella serotyperna samtidigt ytterligare bevara provvolymer och händer på assay tid. Det finns också arbete pågår för att överföra denna analys laboratorier över hela världen. Dessa globala utvärderingar kommer att generera mer data mot kvalificera analysen på större forskning skala, samtidigt som den ökar antalet mikrobiologi och immunologi laboratorier som har tillgång till denna SBA att utvärdera bakterier och serum prover samlat från olika endemiska platser. Den analysmetod som beskrivs här är enkel och hög genomströmning och har förmågan att förbättra immunologisk bedömning i den Shigella fältet samt bredare program för bedömning av andra bakteriella patogener.
Disclosures
R.W.K är anställd av den amerikanska regeringen och som sådan de åsikter som framförs i denna publikation är författarens och återspeglar inte nödvändigtvis de officiella politik eller ståndpunkt av Institutionen för armén, försvarsdepartementet, eller den amerikanska regeringen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades genom ett bidrag från sökväg till M.H.N. Denna studie genomfördes som en kooperativ forsknings- och utvecklingsavtalet mellan Walter Reed Army Institutet för forskning och University of Alabama i Birmingham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) | Sigma | T8877 | ≥98.0% (HPLC) |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S2002 | ≥99.5% |
| Baby Rabbit Complement | PelFreez | 31061-3 | 3-4 week old |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14065-56 | Without Phenol Red |
| LB Agar (Lennox) | Sigma | L2897 | Powder microbial growth medium |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Powdered, (C12H18O9)n |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For molecular biology, ≥99% |
| LB Broth (Lennox) | Sigma | L3022 | Powder microbial growth medium |
| Square Petri Dish | Sigma | Z617679-240EA | 120 mm x 120 mm |
| Assay Plate | Costar | 3799 | 96 well u-bottom plate with lid |
| NICE Software | University of Alabama at Birmingham | ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/ |
References
- Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).
- Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).
- Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).
- Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).
- Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).
- Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).
- Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).
- Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).
- Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3 (3), (2018).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).
- Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).
- Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).
- Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).
- Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
- Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12 (2), e0172163 (2017).
- Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).
- Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).
