Summary

Cytometric måling av ROS produksjon i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

Published: March 07, 2019
doi:

Summary

Denne studien demonstrerer bruken av flowcytometri å oppdage reaktive oksygen arter (ROS) produksjon skyldes aktivering av FcγR. Denne metoden kan brukes til å vurdere endringer i antimikrobielle og redoks signalnettverk funksjon av phagocytes immun komplekser, opsonized mikroorganismer eller direkte FcγR cross-linking.

Abstract

Oksidativt eller respirasjonssykdommer utbrudd brukes til å beskrive raske forbruket av oksygen og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS) av phagocytes svar på ulike immun stimuli. ROS genereres under immun aktivisering utøver potente antimikrobielle aktivitet primært gjennom evne til ROS å skade DNA og proteiner, forårsaker død av mikroorganismer. Å kunne måle ROS produksjon reproduserbar og Peterkirken er nødvendig for å vurdere bidrag av ulike veier og molekyler til denne mekanismen av vert forsvar. I dette papiret, vi demonstrerer bruken av fluorescerende sonder og flow cytometri for å oppdage ROS produksjon. Selv om mye brukt, er fluorescerende måling av ROS svært problematisk, særlig med hensyn til måling av ROS av bestemt og ikke mitogenic stimuli. Vi presenterer en detaljert metodikk for å oppdage ROS generert spesiell FcγR stimulering med macrophage generasjon grunning, flekker, FcγR cross-linking og slutter med flyt cytometric analyse.

Introduction

Reaktive oksygen arter (ROS) er reaktive molekyler eller frie radikaler som er biprodukter i aerobic åndedrett (omtalt i 1). Disse inkluderer den superoxide anion peroxide, hydrogen peroxide, hydroksyl radikale og hydroksyl ioner, blant andre. Under normale fysiologiske, ROS produseres hovedsakelig av mitokondrier og nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADPH) oxidases og er raskt detoxified av ulike enzymer og proteiner som superoxide dismutase og glutation. En overdreven produksjon av ROS eller feil kan fjerne ROS kan føre oksidativt stress, der frie radikaler fremme skade av proteiner og lipider DNA som fører til mobilnettet stress eller død og patologisk sykdomstilstander. Men er det for tiden verdsatt at ROS kan også fungere som signalnettverk molekyler (redoks signalisering), og ROS-mediert endring av ulike molekyler og veien mellomprodukter kan påvirke cellenes stoffskifte, spredning, overlevelse, inflammatorisk signalisering og aldring2. Phagocytic cellene: ROS spiller en viktig rolle i å gi antimikrobielle aktivitet under såkalte “åndedretts brast”1,3,4,5,6. Under responsen av phagocytes på eksterne stimuli translocate komponenter i den NADPH oksidase komplekse (p40phox, p47phox, p67phox) fra stoffer til phagosomal membranen som inneholder gp91phox og p22phox tenkes, og sammen med handlinger Rac1/2, en fullt funksjonell NADPH oksidase enzym komplekse. Den sammensatte NADPH oksidase benytter deretter NADPH for å redusere oksygen til superoxide innen den phagosomal vacuole. Superoxide anioner kan direkte forårsake skade eller bli dismutated i hydrogenperoksid. Både superoxide og hydrogen peroxide kan reagere med andre molekyler å generere svært reaktive hydroksylradikaler. Skade er formidlet av reaksjonen av disse ROS med jern-svovel klynger på proteiner eller forårsaker base oksidasjon av DNA, slutt fører til begrenset mikrobiell metabolisme eller død av mikrobe5. Betydningen av NADPH oksidase enzym komplekse og ROS produsert under respiratory utbrudd illustreres klinisk hos pasienter med kronisk granulomatøs sykdom (CGD)7,8,9, 10. personer med CGD har mutasjoner i gp91phox, noe som resulterer i mangel på ROS produksjon og mottakelighet for tilbakevendende infeksjoner med bakterier og sopp som ikke vanligvis er et problem med immunkompetente personer. Derfor om studere oksidativt stress, redox signalering eller vert forsvar, å kunne måle er ROS produksjon i sanntid en nyttig oppgave.

Flere analyser har vært benyttet til mål ROS produksjon eller resultatet av oksidativt stress11,12,13. Blant disse er en av de mest brukte lysstoffrør sonde 2, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Dette molekylet er fargeløs og lipofile. Spredningen av DCFH2-DA over cellemembranen kan det følges av intracellulær esterases, som deacetylates det i DCFH2, gjengi det celle ugjennomtrengelig. Handlingene til flere typer ROS (hydrogenperoksid, peroxynitrite, hydroksylradikaler, nitrogenoksid og peroxy radikaler) på DCFH2 oksidere det i DCF som er fluorescerende (rapporterte Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) og kan oppdages ved hjelp av en flyt cytometer utstyrt med en standard filtersettet for fluorescein (FL1-kanal). Superoxide reagerer ikke sterkt med DCFH2 , men kan reagere med en annen sonde dihydroethidium (DHE) å gi fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (samt andre fluorescerende superoxide uavhengig oksidasjonsprodukter)15. Fluorescerende produkter av DHE oksidasjon kan oppdages ved hjelp av en eksitasjon bølgelengden til 518 nm og et utslipp bølgelengden til 605 nm (FL2 kanal). Selv om det er relativt enkel å bruke, krever utnyttelse av disse sonder deteksjon av ROS kunnskap om sine begrensninger og forsiktig innlemmelse av flekker prosedyrer og kontroller i bestemte analysen utføres for å ha gyldig eksperimentell resultater og konklusjoner. Følgende protokollen demonstrerer bruken av en kommersielt tilgjengelig kit ansette disse 2 sonder laget for å måle ROS av flowcytometri. Vi flekken primet Ben margtransplantasjon-avledet makrofager med disse sonder og indusere ROS produksjon gjennom FcγR cross-linking. Vi presenterer representant data innhentet bruker denne protokollen og stress forsiktighetsregler som må foretas for vellykket eksperimentering.

Protocol

Protokollen for dyr håndtering ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk committee (IACUC) av University of Central Florida. 1. generasjon av benmarg avledet makrofager (BMDMs) Kultur medier forberedelse Forberede D10F base media: Å Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM), legge til 10% varme inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 1 mM natrium pyruvate, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 0.05 mM β-mercaptoethanol…

Representative Results

Bruker protokollen skissert innen, presentere vi representant data viser flyt cytometric påvisning av ROS produksjon skyldes stimulering av WT C57BL/6J BMDMs gjennom FcγR. Som forventet, vi observerer minimale endringer i FL1 eller FL2 fluorescens over bakgrunnen nivå i unstimulated celler (figur 3A, sammenligne “farget, unstimulated” vs “unstained kvinne, unstimulated” dot tomter). Vi observerer en markant økning i FL1 og FL2 fluorescens når celler blir stimulert med FcγR cross-linkin…

Discussion

DCFH2-DA og DHE-basert oppdagelsen av ROS er en brukte teknikken14,15. Brukervennlighet og tilpasningsevne disse ROS sonder for kinetisk microplate formater, fluorescens mikroskopi eller flow cytometric analyse har bidratt til deres popularitet. Men i våre studier av FcγR-mediert macrophage funksjoner synes det ikke å være en standardprotokoll for å utføre denne analysen for flyt cytometric analyse av FcγR krysskoblet celler. Gitt den reaktive n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne takke andre medlemmer av det Tigno-Aranjuez inkludert Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy og Roopin Singh for deres hjelp i laboratoriet vedlikehold og mus kolonien vedlikehold. Støtte for denne forskningen ble levert av grant R00 HL122365 og oppstart midler til J.T.T-A.

Materials

Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Play Video

Cite This Article
Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

View Video