Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cytometric flowmåling af ROS produktion i makrofager i svar til FcγR tværbinding

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59167
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Summary

Denne undersøgelse viser brugen af flowcytometri at opdage reaktive ilt arter (ROS) produktion som følge af aktivering af FcγR. Denne metode kan bruges til at vurdere ændringer i antimikrobielle og redox signalering funktion af fagocytter reaktion på immunkomplekser, opsonized mikroorganismer eller direkte FcγR cross-linking.

Abstract

Den oxidative eller respiratoriske burst bruges til at beskrive den hurtige forbrug af ilt og generation af reaktive ilt arter (ROS) af fagocytter svar på forskellige immun stimuli. ROS genereret i løbet af immun aktivering udøver potent antimikrobiel aktivitet primært gennem ROS evne til at skade DNA og proteiner, forårsager død af mikroorganismer. At være i stand til at måle ROS produktion reproducerbar og med lethed er nødvendige for at vurdere de forskellige veje og molekyler til denne mekanisme af vært forsvar bidrag. I dette papir, vi demonstrere brugen af fluorescerende sonder og flow flowcytometri ægprodukters ROS produktion. Selv om udbredt, er fluorescerende måling af ROS notorisk problematisk, især med hensyn til måling af ROS induceret af specifikke og ikke mitogenic stimuli. Vi præsenterer en detaljeret metode til at registrere ROS genereret som følge af specifikke FcγR stimulation begynder med makrofag generation, priming, farvning, FcγR cross-linking og slutter med flow cytometric analyse.

Introduction

Reaktive ilt arter (ROS) er reaktiv molekyler eller frie radikaler, der er biprodukter af aerob respiration (gennemgik i 1). Disse omfatter superoxid-anion, peroxid, hydrogenperoxid, hydroxyl radikale og hydroxyl-ioner, blandt andre. Under normale fysiologiske, ROS fremstilles hovedsagelig af mitokondrier og nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADPH) oxidases og er hurtigt detoksi-forskellige enzymer og proteiner såsom superoxiddismutase og glutathion. En overdreven produktion af ROS eller en defekt i evnen til at fjerne ROS kan føre til oxidativ stress, hvorved reaktive ilt arter fremme beskadigelse af proteiner, lipider og DNA fører til cellulært stress eller død og patologiske sygdomstilstande. Men det er i øjeblikket værdsat at ROS kan også fungere som signaling molekyler (redox signalering), og ROS-medieret ændring af forskellige molekyler og pathway mellemprodukter kan påvirke cellulære metabolisme, spredning, overlevelse, inflammatoriske signalering, og aging2. I fagocyterende celler spiller ROS en afgørende rolle i forbindelse med antimikrobiel aktivitet under den såkaldte "respiratoriske burst"1,3,4,5,6. Under fagocytter reaktion på eksterne stimuli translocate komponenter af NADPH oxidase komplekse (p40phox, p47phox, p67phox) fra cytosol til den phagosomal membran, der indeholder gp91phox og p22phox underenheder, og sammen med Rac1/2 handlinger udgør en fuldt funktionel NADPH oxidase enzym kompleks. De forsamlede NADPH oxidase derefter benytter NADPH til at reducere ilt til superoxid inden for den phagosomal vakuole. Superoxid anioner kan direkte skade eller være dismutated i brintoverilte. Både superoxid og brintoverilte kan reagere med andre molekyler til at generere meget reaktive hydroxylradikaler. Skader er medieret af reaktion af disse ROS med jern-svovl klynger på proteiner eller forårsager base oxidation af DNA, i sidste ende fører til begrænset mikrobiel metabolisme eller død af mikrobe5. Betydningen af NADPH oxidase enzym kompleks og ROS produceret under den respiratoriske burst illustreres klinisk hos patienter med kronisk granulomatøs sygdom (CGD)7,8,9, 10. personer med CGD besidder mutationer i gp91phox, hvilket resulterer i en mangel på ROS produktion og modtagelighed for tilbagevendende infektioner med bakterier og svampe, der ikke er normalt en bekymring med immunkompetente enkeltpersoner. Derfor om at studere oxidativ stress, redox signalering eller vært forsvar, at være i stand til at måle er ROS produktion i realtid en nyttig bestræbelse.

Flere assays har været udnyttet til foranstaltning ROS produktion eller resultaterne af oxidativt stress11,12,13. Blandt disse er en af de mest anvendte fluorescerende sonde 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH2-DA)14. Dette molekyle er farveløs og lipofile. Udbredelse af DCFH2-DA over cellemembranen tillader det at blive fulgt op af intracellulære esteraser, som deacetylates det i DCFH2, rendering det celle uigennemtrængelige. Handlinger af flere typer af ROS (brintoverilte, peroxynitrite, hydroxylradikaler, nitrogenoxid og peroxyradikaler) på DCFH2 oxidere det i DCF, der er fluorescerende (rapporteret Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) og kan registreres ved hjælp af en flow Flowcytometret udstyret med en standard filter sat til fluorescein (FL1 kanal). Superoxid reagerer ikke stærkt med DCFH2 men kan reagere med en anden sonde dihydroethidium (DHE) at give fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (samt andre fluorescerende superoxid-uafhængig oxidation produkter)15. De fluorescerende produkter af DHE oxidation kan påvises ved hjælp af en excitation boelgelaengden 518 nm og en emission boelgelaengden 605 nm (FL2 kanal). Selvom relativt enkel at bruge, kræver udnyttelse af disse sonder for opdagelse af ROS viden om deres begrænsninger og passe iblanding farvning procedurer og kontrol i specifikke analysen udføres for at have gyldig eksperimentelle resultater og konklusioner. Følgende protokol viser brugen af et kommercielt tilgængeligt kit beskæftiger disse 2 sonder designet til at måle ROS ved flowcytometri. Vi pletten PRIMES knoglemarv-afledte makrofager med disse sonder og fremkalde ROS produktion gennem FcγR cross-linking. Vi præsentere repræsentative data opnået ved hjælp af denne protokol og understrege passende forholdsregler, der skal gennemføres for vellykkede eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol for dyr håndtering blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af University of Central Florida.

1. generation af knoglemarv afledt makrofager (BMDMs)

  1. Kultur medier forberedelse
    1. Forberede D10F base medier: til Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM), tilføje 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 0,05 mM β-mercaptoethanol.
      Bemærk: Selv om det er bedst at bruge friske D10F media, D10F base medier kan tilberedes op til to uger i forvejen skal bruges til flere forsøg inden for en uge. For en mus er omkring 175 mL af D10F base medier nødvendige (25 mL til at skylle knogler) og 150 mL til at makrofag differentiering medier
    2. Forberede LADMAC vækst medier: til Eagle's Minimum afgørende Medium (Maibritt VITH), tilføje 10% varme inaktiveret FBS og 2 mM L-glutamin. Forberede medier frisk, dag du planlægger at starte din kulturer.
      Bemærk: En liter LADMAC vækst medier vil resultere i ca (19) 50 mL alikvoter af LADMAC-aircondition medier.
    3. Udarbejde komplette DMEM medier: DMEM, tilføje 10% varme inaktiveret FBS og 1 x antibiotikum-antimykotikum. Forberede medier frisk, den dag BMDMs vil blive høstet.
      Bemærk: For en mus, vil omkring 100 mL DMEM komplet medier være påkrævet. Dette omfatter medier anvendt til priming af celler.
  2. Forberedelse af LADMAC aircondition medium
    1. Vokse LADMAC celler til confluency i en 10 cm parabol ved hjælp af 10 mL af LADMAC vækst medier (som defineret i punkt 1.1.2). Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. På confluency, skal du frigør celler ved kraftigt udlevering medier over celler. Passage celler ved tilsætning af 1 mL af fritliggende celler i T-175 målekolber indeholdende 100 mL af LADMAC vækst medier. Inkuber celler indtil fuldstændig sammenflydende ved 37 ° C, 5% CO2 (ca. en uge). På denne måde en 10 cm parabol kan give ti T-175 kolber eller ca 1 L af konditioneret medier.
    3. Når cellerne er klar, indsamle konditioneret medier og centrifugeres ved 350 x g i 5 min at sammenpresse uønskede celler. Filtrere de indsamlede analysere gennem et 0,2 mm filter og gemme 50 mL alikvoter ved-80 ° C. Delprøver af LADMAC-aircondition medier kan opbevares ved-80 ° C i måneder med minimalt tab af aktivitet.
      Bemærk: Hvis store eksperimenter er forventet, forberede store partier af LADMAC-aircondition medier på samme tid at sikre konsistens. Hvis dette ikke er muligt, brug delprøver stammer fra den samme batch eller et parti af LADMAC-aircondition medier for hvert forsøg.
  3. Forberedelse af knoglemarv afledt makrofager
    1. På dagen for eksperimentet, forberede frisk makrofag differentiering medier ved at tilføje 25% af LADMAC aircondition medier i tidligere forberedt D10F medier (1 del LADMAC aircondition medier i 3 dele D10F). Ikke forberede mediet i forvejen! Kun forberede så meget medier, som er nødvendig for BMDM kulturen.
    2. Dag 1: isolere mus knoglemarv celler efter de tidligere beskrevne protokol16 med en ændring til at skylle knoglemarven fra lårben og skinneben med D10F base medie. Bruge 2,5 mL af D10F media til at skylle hver ende af (4) knoglerne. Flush knoglemarv celler direkte ind en pre våde 40 mm celle si placeret på toppen af en 50 mL tube. De resterende medier (~ 5 mL) kan bruges til at skylle ud celle si.
    3. Der centrifugeres indsamlede knoglemarv celler på 350 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler i alt 30 mL af makrofag differentiering medier (pr. mus).
    4. Forberede og etiket (6) petriskåle med sterilt 10 cm. Pladen 5 mL af makrofag differentiering medier i hver i petriskålen. Alikvot 5 mL resuspenderet knoglemarv celler i makrofag differentiering medier i hver petriskål for en samlet maengde paa 10 mL pr parabol. Inkuber i 5 dage ved 37 ° C, 5% CO2.
    5. Dag 5: Aspirér medier fra cellerne. Vask en gang med 1-2 mL PBS og der tilsættes 10 mL af frisklavede makrofag differentiering medier. Der inkuberes i yderligere 3 dage.
    6. Dag 8: Fortsæt til høst BMDMs som beskrevet nedenfor.

2. høst, såning og priming af BMDMs

  1. Efter 7 dage af voksende BMDMs i makrofag differentiering medier, Fjern supernatanten. Vask vedhængende makrofager en gang med 1-2 mL PBS. Opsug PBS.
  2. Der afpipetteres 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA i hver makrofag plade og efterlade dem i 37 ° C inkubator for 5-10 min med hyppige aflytning Adskil celler. Adskille trypsinized makrofager af pipettering op og ned ved hjælp af en P1000 pipette og indsamle makrofager i 50 mL rør indeholdende 10-15 mL af komplet DMEM medier. Vask pladen med yderligere 2 mL komplet DMEM medier til at høste alle resterende makrofager.
    Forsigtig: Lad ikke makrofager i trypsin for mere end 10 min.
  3. Der centrifugeres 50 mL rør på 350 x g i 5 min. Fjern supernatanten. Forsigtigt adskille pellet og resuspend celler i 10 mL af komplet DMEM medier. Grev makrofager ved hjælp af en hemocytometer i nærværelse af en levedygtighed farvestof som trypan blå som følger:
    1. For eksempel, bland 90 µL af Trypan blå med 10 µL af celler for en 1:10 fortynding.
    2. Af denne blanding, indlæse 10 µL i en hemocytometer og tælle det centrale torv (5 x 5 gitter). Den samlede celletal = tæller x 104 x faktor (10) x fortyndingsvolumen (10 mL).
  4. Justere cellesuspension til at være 1 mio/mL i komplet DMEM medier og plade 4 mL af denne cellesuspension til hver 6 cm parabol.
    Bemærk: Et minimum af 3 plader er nødvendig pr. eksperiment. En plade af celler bliver venstre unstimulated, et andet sæt af celler vil blive stimuleret gennem cross-linking af FcγRs, og den tredje plade af celler vil blive brugt til alle de ekstra eksperimenterende og flow cytometric kontrol.
  5. Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2plader.
  6. Den følgende dag, Aspirér supernatanten, vaske cellerne en gang med 1-2 mL PBS. Der tilsættes 4 mL af komplette medier indeholdende 100 ng/mL mus IFN-γ til hver plade. Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2plader.
  7. Hvis det ønskes, tage en alikvot af celler til at vurdere relevante generation af BMDMs ved flowcytometri. Bruger 1 x 106 celler pr. test og forberede polystyren FACs rør på følgende betingelser: isotype kontrol, farves med F4/80 (eller alternativt, farves med CD11b).
  8. Forberede flowcytometri farvning buffer ved at tilføje 0,1% FBS i 1 x PBS. Brug kun dette beløb af FBS for ikke for at ophæve virkningerne af serum-sult i senere trin.
  9. Alikvot 1 x 106 celler pr. tube og centrifugeres ved 750 x g i 5 min.
  10. Vask en gang ved dekantering eller sugning supernatanten og resuspending celler i 2 mL af flow flowcytometri buffer. Der centrifugeres ved 750 x g i 5 min.
  11. Opsug supernatanten og resuspend celler i 100 µL af flowcytometri farvning buffer. Tilføje 1 µL af anti-mus CD16/32 Fc blokerende antistof til hvert rør. Der inkuberes i isbad i 5 min.
  12. Uden vask, tilføje 2 µL af FITC anti-mus F4/80 eller 1 µL af APC anti-mus CD11b antistof til de "farvede" rør og et tilsvarende beløb af det tilsvarende isotype kontrol antistof "isotype" rør. Ruger på is, i mørke, i 30 min.
  13. Vask celler ved tilsætning 2 mL PBS direkte til cellerne. Der centrifugeres ved 750 x g i 5 min.
  14. Opsug supernatanten og resuspend celler i 150 µL af PBS.
  15. Erhverve prøver på en flow Flowcytometret ved hjælp af en stopbetingelse 100 µL eller 10.000 begivenheder på porten af interesse og sikre, at FSC, VSK, FL1 (FITC anti-mus F4/80) eller FL4 (APC anti-mus CD11b) kanaler er valgt for parametrene, der skal analyseres.
  16. Brug flow flowcytometri software, åbne en dot plot for FSC (på x-aksen) vs SSC (på y-aksen) og tegne en gate omkring cellerne i interesse, bortset fra døde celler og små klippestykker (døde celler og snavs er meget mindre begivenheder end den største celle befolkning og vises på lowe r tilbage af plottet).
  17. Gating på cellerne i interesse, åbne et histogram plot med FL1 (FITC anti-mus F4/80) eller FL4 (APC anti-mus CD11b) på x-aksen.
  18. Køre eksemplet "isotype". Generere en markør gate, så at de fleste "isotype" prøve begivenheder er til venstre for indgangen (< 1% positive). Anvend denne skabelon til farvede eksempelfilen.
  19. Køre eksemplet "farvede". Succesrig generation af BMDMs vil resultere i > 95% udtryk af FITC anti-mus F4/80 eller APC anti-mus CD11b (figur 1A), mens forkert kultur betingelser kan resultere i optimal generation af makrofager (figur 1B).
    Bemærk: Hvis genererer BMDMs fra flere genotyper, tage til efterretning af udtryk for disse markører for hvert parti af BMDM genereret i det tilfælde, at dette kan være grund til at udelukke en prøve fra analyse, når ROS generation som reaktion på stimulus er vurderet.

3. reagens og materiale forberedelse til ROS måling

  1. Rekonstruere den frysetørrede oxidative stress påvisning reagens i 60 µL af vandfri DMF til at give en 5 mM stamopløsning. Forsigtigt blandes inden brug.
    Bemærk: Der står i manualen ROS-ID kit at holdbarheden af den rekonstituerede reagenser er ca 1 uge ved-20 ° C. Aliquoting reagens umiddelbart efter rekonstituering i små lys-bevis hætteglas minimerer dets oxidation og maksimerer holdbarhed ved-20 ° C.
  2. Rekonstruere den frysetørrede superoxid påvisning reagens i 60 µL af vandfri DMF til at give en 5 mM stamopløsning. Forsigtigt blandes inden brug.
    Forsigtig: som anført i manualen kit behandle begge påvisning reagenser som muligt mutagener, håndterer hver med omhu og bortskaffe korrekt.
  3. Rekonstruere ROS inducer (Pyocyanin) i 20 µL af vandfri DMF til at give en 50 mM stamopløsning.
  4. Rekonstruere ROS Inhibitor (N-acetyl-L-Cystein) i 123 µL med deioniseret vand for at give en 0,5 M stock koncentration.
  5. Label 5 mL runde polystyren rør (flow flowcytometri rør) med den eksperimentelle kontrol og betingelser. (Se 4. Assay betingelser og kontrol)
  6. Forberede lavt serum DMEM (ingen phenol rød) ved at tilføje 0,1% FBS til phenol rød-gratis DMEM.
  7. Alikvot anti-BSA antistof i små prøver (afhængig af brug) og gemme dem på-80 ° C.
  8. Forberede stamopløsning af 100 mg/mL BSA i HBSS (Hanks' afbalanceret saltopløsning) eller PBS. Alikvot i 100 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C.
  9. Forbered en 2 x opløsning af ROS sonder (2 x sonde løsning): for hver 10 mL af lavt serum DMEM, tilføje 4 µL af oxidativt stress påvisning reagens (grøn farve) og 4 µL af superoxid påvisning reagens (orange farvestof).
  10. Forberede 2 x sonde opløsninger indeholdende kun oxidativt stress påvisning reagens (2 x sonde løsning, grøn kun), eller der indeholder kun superoxid påvisning reagens (2 x sonde løsning, orange kun). Forberede mængden reagens behov for eksperimentet og altid forberede 2 x løsning umiddelbart før anvendelsen.
    Bemærk: For at forberede mindre mængder af 2 x afsløring løsning, bruge en mellemliggende 1:10 fortynding af både grønne og Orange påvisning reagenser før endelige fortynding i DMEM. For eksempel for at forberede 1 mL af en 2 x afsløring løsning, fortyndes 1 µL af hver probe til 9 µL af DMEM (1:10 mellemliggende fortynding). Fortynd 4 µL af denne 1:10 mellemliggende fortynding i 1 mL af DMEM.

4. assay betingelser og kontrol

  1. Omfatte følgende eksperimentelle kontrolelementer for cytometric strømningskompensation til hvert eksperiment:
    a) unstained og unstimulated celler.
    b) celler farves kun med oxidativt stress påvisning reagens (grøn reagens) og behandlet med ROS inducer.
    c) celler farves kun med superoxid påvisning reagens (orange reagens) og behandlet med ROS inducer.
  2. For hver mus eller biologiske replikeres, omfatte følgende 6 betingelser:
    a) unstained og unstimulated celler
    b) farvede og unstimulated celler
    c) farvede celler behandles med positive inducer
    d) farvede celler behandles med positive inducer og ROS hæmmer
    e) farvede celler aktiveres gennem FcγR tværbinding
    f) farvede celler aktiveres gennem FcγR cross-linking og behandlet med ROS hæmmer
  3. Beregne mængden af 2 x sonde løsning behov baseret på antallet af mus og betingelser (200 µL af 2 x sonde løsning vil blive brugt for hver betingelse kræver farvning).
    Bemærk: For en analyse ved hjælp af 6 mus, 5 tilstande, der kræver farvning med sonderne vil være behov for per mus. Dette bringer det samlede antal betingelser til 30. Det samlede beløb for 2 x sonde løsning, der er således mindst 6 mL (30 * 200 µL).

5. cellen forberedelse

  1. Efter grunding af makrofager natten, Aspirér supernatanten. Vaske cellerne en gang med PBS.
  2. Serum sulte cellerne ved at erstatte medier med lavt serum DMEM samme rumfang. For hver mus, en plade vil behandles med anti-BSA IgG1 mens serum sulter, mens den anden vil stå ubehandlet. Tilføj kun lavt serum DMEM til ubehandlet plader. Tilføje lavt serum DMEM indeholdende 2,5 µg/mL murine anti-BSA IgG1 behandlede plader.
    Bemærk: En ekstra ubehandlet plade er nødvendig for hvert eksperiment for flow cytometric kompensation kontrol.
  3. Inkuber plader i 4 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
  4. Efter serum sulter, høste cellerne ved blid skrabning eller 0,2 mM EDTA i PBS. Samle dem i mærket 5 mL rund bund rør og centrifugeres dem på 750 x g i 5 min. holde styr på hvilke celler blev behandlet med murine anti-BSA IgG1.
  5. Vask celle pellets engang med 2 mL PBS til at slippe af enhver resterende anti-BSA fra de behandlede celler.
  6. Resuspend celle pellet i 600 µL af lavt serum DMEM.
  7. Fra 600 µL cellesuspension, alikvot 200 µL til den forud mærket 5 mL rund bund rør som følger:
    1. Fra de ubehandlede celler, tage 200 µL af mærket "unstimulated", 200 µL til rør mærket "positive inducer" og 200 µL af mærket "positive inducer + hæmmer"-rør-rør
    2. Fra anti-BSA IgG1 behandlede celler, tage 200 µL til rør mærket "FcγR crosslinking/FcγR XL" og 200 µL til rør mærket "FcγR XL + hæmmer"
    3. Fra de ubehandlede celler skal bruges til erstatning kontrolelementer, tage 200 µL til røret mærket "unstained unstimulated", 200 µL til "grøn + inducer" kontrol og 200 µL "orange + inducer" styre.
      Bemærk: Hvis celler fra 5.7.1 og 5.7.3 er afledt af den samme mus, de samme "unstained unstimulated" celler kan bruges til kontrolelementet eksperimentelle og kompensation. Hvis ikke en yderligere 200 µL af celler vil være behov for en "unstained unstimulated" eksperimentelle kontrol for en).
  8. Holde rør på is indtil farvning og stimulation. Under serum forberede sult og bindende IgG1, sonder, bestemte stimuli og induktorer som beskrevet nedenfor.
    Bemærk: Hvis udfører assay for første gang, hvis ingen skabelon er tilgængelig, eller ingen efter-the-fact erstatning findes på flow Flowcytometret og tilsvarende software, stimulere og plette kompensation kontrol og køre disse på flow-Flowcytometret til at udføre manuel udligning forud for tilsætning af stimuli til eksperimentelle prøver.

6. udføre analysen

  1. Forberede 2 x positive inducer løsning ved at fortynde Pyocyanin 1: 100 i 2 x sonde løsning (udarbejdet i trin 3.9) for at opnå en 2 x koncentration af 500 µM af pyocyanin (endelig koncentration vil være 250 µM). Også, Fortynd pyocyanin 1: 100 i hver af de "2 x sonde løsning, grøn kun" og "2 x sonde løsning, orange kun" rør forberedt i 3.10.
    Bemærk: Begge betingelser, der er mærket med "positive inducer" og "positive inducer + hæmmer" vil blive behandlet med den positive inducer. Planen i overensstemmelse hermed ved beregning af mængden af 2 x positive inducer løsning til at forberede. For eksempel: Hvis udfører assay med 3 mus, 6 betingelser (3 * 2) vil blive behandlet med positive inducer, så Forbered 6 * 200 µL = 1,2 mL 2 x positive inducer løsning.
  2. Forbered en 2 x BSA løsning ved fortynding af stamopløsningen BSA i 2 x sonde løsning til at opnå en koncentration af 2 µg/mL (endelig koncentration vil være 1 µg/mL).
    Bemærk: Begge betingelser, der er mærket med "FcγR XL" og "FcγR XL + hæmmer" vil blive behandlet med 2 x BSA løsning. Planen i overensstemmelse hermed ved beregningen af løsning til at forberede. For eksempel: Hvis udfører analysen ved hjælp af 3 mus, 6 (3 * 2) betingelser vil blive behandlet med BSA løsning og så 6 * 200 µL eller 1,2 mL 2 x BSA løsning vil være nødvendig.
  3. Før du starter den specifik stimulation (FcγR crosslinking), Sørg for at alle reagenser og celler er klar. Sted rør på is i den rækkefølge, de bliver stimuleret.
  4. Flow cytometers med en autosampler, Vær opmærksom på den tid, forskellige tager til at analysere en prøve og gå videre til næste, herunder enhver blanding og sonde vaske trin (for eksempel 3,5 min).
    Bemærk: Timing er meget kritisk til dette assay. I rækkefølge for hver betingelse skal kontrolleres godt, skal stimulering foretages for den nøjagtige tid (30 min) for hver betingelse. Stimulere cellerne i orden og indarbejde tidsforsinkelsen mellem prøven erhvervelse af flow Flowcytometret. For eksempel, hvis den nødvendige tid til forskellige til at analysere en prøve og gå videre til næste er 3,5 min, stimulere cellerne i den rækkefølge, de vil blive analyseret hver 3,5 min.
  5. Hvis udføre manuel kompensation på dette tidspunkt, stimulere kontrol rør skal bruges til erstatning (trin 5.7.3). Tilføje 200 µL "2 x sonde løsning, grøn kun" indeholdende inducer (fra 6.1) ind i rørene markeret "grøn + inducer" (trin 5.7.3). Tilføje 200 µL "2 x sonde løsning, orange kun" indeholdende inducer (trin 6.1) ind i rørene markeret "orange + inducer" (trin 5.7.3).
  6. Inkuber celler for 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 i mørke.
  7. Ved hjælp af flow flowcytometri software, generere og etiket 3 eksempelfiler til den kontrol "unstained, ubehandlet", "grøn + inducer" og "orange + inducer" prøver, og sørg for at angive kanaler/parametrene skal analyseres (FSC, VSK, FL1, FL2) og ønskede stop betingelser (100 µL, 3 min, osv.). Generere og mærke et lignende sæt af filer til eksperimentelle prøver.
  8. Køre eksemplet "unstained, ubehandlet". Åbne en dot plot for FSC (på x-aksen) vs SSC (på y-aksen) og trække en gate omkring cellerne i interesse, bortset fra døde celler og små klippestykker (døde celler og snavs er meget mindre begivenheder end den største celle befolkning og vises på den nederste venstre hjørne af plottet).
  9. Ved hjælp af denne "celler" gate, åbne en anden dot plot af FL1 (x-aksen) vs FL2 (y-aksen). Tegne en indledende kvadrant gate. Justere kvadrant gates, så begivenhederne vises på den nederste venstre kvadrant af FL1 vs FL2 plot.
  10. Køre eksemplet "grøn + inducer". Justere spændingen, så begivenhederne vises på de nederste venstre og højre kvadranter af FL1 vs FL2 plot. Anvende denne kompensationsmatrix til alle 3 eksempelfiler.
  11. Køre eksemplet "orange + inducer". Justere spændingen, så begivenhederne vises på den øverste og nederste venstre kvadranter af FL1 vs FL2 plot. Anvende denne kompensationsmatrix til alle 3 eksempelfiler.
  12. Kontroller hver kompensation fil og sikre at "unstained, ubehandlet" begivenheder vises på den nederste venstre kvadrant, "grøn + inducer" begivenheder vises på de lavere venstre og højre kvadranter, og "orange + inducer" begivenheder vises på den øverste og nederste venstre kvadranter af FL1 vs FL2 plot. Anvende matrixen erstatning til alle de eksperimentelle eksempelfiler.
    1. Sikre at passende kompensation der anvendes for alle kontrol-eksempelfiler før du anvender matrixen erstatning til alle de eksperimentelle eksempelfiler. Henvises til figur 2 for repræsentative data viser ukompenserede og korrekt kompenseret prøver.
      Bemærk: Mange cytometers betegne FL1 som standard FITC/NGL kanal (ophidset af blå 488 nm laser, og opdages med en 530/30 filtersæt) og FL2 som standard PE kanal (ophidset af blå 488 nm laser, og opdages med en 585/40 filtersæt). Vi bruger denne samme konvention men forsigtighed nye flow flowcytometri brugere at rådføre sig med deres flow flowcytometri core manager til at sikre, at deres Flowcytometret er ligeledes konfigureret og at de relevante kanaler anvendes til at opdage disse sonder. Afhængigt af model af flow forskellige og ledsagende software, kan det være muligt at udføre kompensation, før eller efter prøver er blevet opkøbt. Hvis efter-the-fact kompensation er muligt, kan kompensation trin udføres efter alle eksperimentelle prøver er blevet opkøbt af forskellige. For cytometers med et dynamisk område, hvor ydelse spænding justeringer ikke er nødvendige, en kompensation eksperiment kan også udføres på en separat dag og den eksperimentelle skabelon (herunder erstatning matrix) kan gemmes for at reducere den tid, der kræves for at udføre manuel udligning.
  13. Når manuel kompensation er blevet udført, og en eksperimentel skabelon er opnået begynde behandling af eksperimentelle prøver. Før behandling med positive Induceren eller FcγR celle stimulation, markere hvilke rør få ROS inhibitor. Behandle disse celler med ROS hæmmer mindst 30 min. før positive Induceren eller FcγR stimulation.
  14. For at tilføje ROS-hæmmer, forberede en endelig koncentration på 5 mM ved at tilføje 1 µL af inhibitoren til 200 µL af resuspenderede celler (uden anti-BSA IgG1).
  15. Behandling af celler med stimulus (eller positive inducer) og indlæse cellerne med ROS sonder som følger:
    1. Til unstimulated celler: tilføje 200 µL af 2 x sonde løsning uden nogen tilskyndelse til de 200 µL af cellesuspension mærket "farvede, unstimulated".
    2. Positiv kontrol: tilføje 200 µL af 2 x positive inducer løsning (udarbejdet i trin 6.1) til 200 µL af cellesuspension mærket "positive inducer" eller "positive inducer + hæmmer".
    3. For celler stimuleret af FcγR tværbindingsmidler (bestemt stimulus): tilføje 200 µL af 2 x BSA løsning (udarbejdet i 6.2) til 200 µL af cellesuspension mærket "Fcγr XL" eller "FcγR XL + hæmmer".
      Bemærk: Husk at indarbejde tidsforsinkelsen mellem analysen ved at tilføje stimulus hver x min hvor x er tidsforsinkelsen mellem erhvervelse af en stikprøve og næste.
  16. Inkuber celler for 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 i mørke. Analysere prøverne i den rækkefølge, de blev stimuleret ved hjælp af en flow Flowcytometret udstyret med en autosampler. Bruge Analyselinjeskabeloner i genereres under de indledende kompensation trin. Ikke vaske cellerne inden analyse.

7. flow flowcytometri dataanalyse og forventede resultater

  1. Inden for flow flowcytometri software, åbne tidligere genererede analyse filer for de eksperimentelle prøver (skabeloner blev genereret i trin 6.7-6.12 og prøver blev kørt i trin 6.16). Sikre at kompensationsmatrix fra at udføre manuel kompensation blev korrekt anvendt til de eksperimentelle prøver.
    Bemærk: For flow cytometers og flow flowcytometri software i stand til at efter-the-fact kompensation, hvis kompensationsmatrix ikke var tidligere anvendt til de eksperimentelle eksempelfiler, anvendes det på dette tidspunkt.
  2. Lig kontrol korrekte manuel kompensation, sikre, at kontrollen inden for de eksperimentelle prøver opfører sig som forventet.
    1. Sikre, at de "unstained, ubehandlede" begivenheder vises på den nederste venstre kvadrant af FL1 vs FL2 plot, at hændelserne "positive inducer" Vis øget fluorescens øverst til venstre, øverste højre, og lavere rigtige kvadranter af FL1 vs FL2 plot, og at" positive inducer + ROS hæmmer"begivenheder viser en reduktion i fluorescens i øverste venstre hjørne, øverste højre, og lavere rigtige kvadranter af FL1 vs FL2 plot i forhold til fluorescens observeret med"positive inducer"prøve.
    2. Hvis kontrollen inden for de eksperimentelle prøver ikke viser nogen øget fluorescens, kontrollere, at alle assay trin blev udført, kontrollere passende generation og priming af knoglemarv-afledte makrofager (2,7-2.19), og gentage eksperimentet. Hvis kontrollen inden for de eksperimentelle prøver viser de forventede tendenser, gå videre til at analysere eksperimentelle prøver stimuleret gennem FcγR (figur 3A).
  3. Kontroller, at FcγR-specifikke stimulus fungerer korrekt. Kør følgende prøver fra en C57BL/6J WT mus: "unstained unstimulated", "farves, unstimulated", "farves, stimuleret gennem FcγR", og "farves, stimuleret gennem FcγR + ROS hæmmer". Disse svarer til prøver, 4.2a, 4.2b, 4.2e og 4.2f i afsnit 4, henholdsvis.
    1. Sikre, at "unstained, unstimulated" begivenhederne vil vises på den nederste venstre kvadrant af FL1 vs FL2 plot, at "farves, unstimulated" arrangementer også vises på den nederste venstre kvadrant af FL1 vs FL2 plot, at "farves, stimuleret gennem FcγR" begivenheder Vis øget fluorescens øverst til venstre, øverste højre, og lavere rigtige kvadranter af FL1 vs FL2 plot, og at "farves, stimuleret gennem FcγR + ROS hæmmer" begivenheder vil vise faldt fluorescens i øverste venstre hjørne, øverste højre og nederste højre kvadranter af FL1 vs FL2 plot i forhold til eksemplet "farves, stimuleret gennem FcγR" (figur 3A).
    2. Hvis disse forventninger ikke er opfyldt, for eksempel, "farves, stimuleret gennem FcγR" prøven viser minimal eller ingen øget fluorescens i forhold til eksemplet "farvede, unstimulated", eller "farves, unstimulated" stikprøven allerede viser markant forhøjede niveauer af fluorescens i forhold til "unstained, unstimulated" prøven, kontrollere, at alle assay trin blev udført korrekt, kontrollere passende generation, klargøring og håndtering af BMDMs (2,7-2.19), og gentage eksperimentet. Hvis disse forventninger opfyldes, gå videre til analyse af resten af de eksperimentelle prøver.
      Bemærk: Celler producerer ROS, som reagerer med grønne sonden (brintoverilte, peroxynitrite, hydroxylradikaler, nitrogenoxid, peroxyradikaler, etc.) vil vises i øverste højre og lavere rigtige kvadranter af en log FL1 (x-aksen) versus en log FL2 (y-aksen) dot plot. Celler producerer ROS, som reagerer med orange sonden (hovedsageligt men ikke udelukkende superoxid) vises i de to øverste kvadranter af en log FL1 (x-aksen) versus en log FL2 (y-aksen) dot plot.
  4. Generere enkelte histogrammer, låge på cellerne i interesse, for analyse af FL1 og FL2 fluorescens. Ved hjælp af "unstained, unstimulated" prøver, generere et histogram markør sådan, at alle "unstained, unstimulated" begivenheder vises til venstre for denne markør. Gælde dette plot med markør for resten af de eksperimentelle prøver (figur 3B).
  5. Præsentere resultaterne af forsøget som procentdel af de positive celler for hver af ROS sonderne eller ved at vise den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af stimuleret prøverne versus kontrol (figur 3 c).

8. cellens overflade farvning i kombination med flow cytometric analyse af ROS produktion (valgfrit)

Bemærk: Dette trin giver en protokol for farvning makrofager med en celle-overflade markør inden stimulation af måling af FcγR og ROS. Dette kan være nyttigt i vurderingen af ROS produktion i blandet cellepopulationer. Det er vigtigt at vælge et antistof til makrofag overflade markør konjugeret med et passende fluor, som ikke griber ind i fluorescens fra de oxidative stress eller superoxid påvisning reagenser. I denne protokol bruges et antistof til musen F4/80 konjugeret med Alexa fluor 647.

  1. Generere BMDMs, høst og prime dem som beskrevet tidligere (afsnit 1 og 2).
    Bemærk: Et minimum af tre 6 cm plader er nødvendige for at udføre alle de eksperimentelle kontroller og vilkår som beskrevet nedenfor. Én plade vil behandles med anti-BSA IgG1 , mens serum sultende mens de andre to plader vil stå ubehandlet.
    1. Omfatte 4 eksperimentelle kontrolelementer, som vil blive brugt til cytometric strømningskompensation (pr. eksperiment):
      a) unstained og unstimulated celler.
      b) celler behandles med oxidativt stress påvisning reagens (grøn reagens) og ROS inducer.
      c) celler behandles med superoxid påvisning reagens (orange reagens) og ROS inducer.
      d) celler farves kun med anti-mus F4/80 konjugeret med Alexa 647.
    2. For hver mus eller biologiske replikeres, omfatte følgende 3 betingelser:
      a) farves med F4/80 og venstre unstimulated
      b) farves med F4/80 og aktiveret gennem FcγR
      c) farves med F4/80 og aktiveret via FcγR og behandles med ROS hæmmer
  2. Efter grunding af makrofager natten, Aspirér supernatanten. Vaske cellerne en gang med 1-2 mL PBS. Serum sulte cellerne ved at erstatte medierne med den samme mængde af lavt serum DMEM. For hver mus, en plade vil behandles med anti-BSA IgG1 mens serum sulter, mens de to andre plader vil være venstre ubehandlet. Inkuber plader i 4 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
  3. Efter serum sulter, høste cellerne ved blid skrabning eller 0,2 mM EDTA i PBS. Indsamle hver plade i mærket 5 mL rund bund rør og centrifugeres dem på 750 x g i 5 min. holde styr på hvilke celler blev behandlet med murine anti-BSA IgG1.
  4. Vask celle pellets én gang med 1-2 mL PBS til at slippe af enhver resterende anti-BSA fra de behandlede celler.
  5. Resuspend en af celle pellets fra den plade som ikke fik anti-BSA IgG1 i 600 µL af lavt serum DMEM. Disse celler vil ikke blive udsat for celle overflade farvning. Bruge disse til kompensation kontrol. Alikvot 200 µL af denne cellesuspension ind (3) 5 mL runde nederste rør mærket a) unstained, unstimulated b) grønne oxidativ stress reagens + ROS inducer, c) orange superoxid påvisning reagens + ROS inducer.
  6. Resuspend en af cellen træpiller fra den plade som ikke fik anti-BSA IgG1, i 300 µL af flowcytometri farvning buffer (PBS + 0,1% FBS). Alikvot 100 µL af denne cellesuspension til (2) 5 mL rund bund rør til farvning med Alexa 647 anti-mus F4/80.
  7. Resuspend celle pellets fra den plade som modtaget anti-BSA IgG1 i 300 µL af flow flowcytometri farvning buffer. Alikvot 100 µL af denne cellesuspension til (2) 5 mL rund bund rør til farvning med Alexa 647 anti-mus F4/80.
  8. Pletten celler, som blev aliquoted i 8.6 og 8.7, med 5 µL af Alexa 647 anti-mus F4/80 i 30 min på is, i mørke.
  9. Efter farvning, vask celler ved tilsætning 2 mL PBS og centrifugeres ved 750 x g, Aspirér supernatanten og resuspend hver tube i 200 µL af lavt serum DMEM uden phenol rød. Der er afsat en ubehandlet rør til at tjene som enkeltvis farves FL4 kontrol. Forbered sonder, inducer, FcγR stimulus og ROS hæmmere som angivet i punkt 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 og 6.14.
    1. For celler, der ikke modtager anti-BSA IgG1, mærke rør med følgende: en) ingen stimulus eller b) ROS inducer.
    2. For celler, der har modtaget anti-BSA IgG1, etiket med følgende: en) Fc XL eller b) Fc XL + -hæmmer.
  10. Stimulere prøver skal bruges til erstatning efter deres respektive behandlinger, som angivet i 6,5-6.6, i den rækkefølge, de bliver læst på flow forskellige, indarbejde tidsforsinkelsen mellem erhvervelse af en prøve, som næste.
  11. Inkuber celler for 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 i mørke. Analysere prøverne i den rækkefølge, de blev stimuleret ved hjælp af en flow Flowcytometret udstyret med en autosampler.
  12. Udføre manuel kompensation som beskrevet i 6.7-6.12 og data analyse som beskrevet i afsnit 7.
  13. Ved hjælp af flow flowcytometri software, generere og mærke 4 eksempelfiler til kontrol, "unstained, ubehandlet", "grøn + inducer", "orange + inducer" og "F4/80 stained" prøver, og sørg for at angive kanaler/parametre skal analyseres (FSC, VSK, FL1, FL2, FL4) og ønskede stop betingelser (100 µL, 3 min, osv.).
  14. Køre prøverne og generere dot parceller til at udføre manuel kompensation.
    1. For celle overflade farvning, generere to yderligere grunde: FL1 (x-aksen) vs FL4 (y-aksen) og FL2 (x-aksen) vs FL4 (y-aksen). Justere spændinger for at sikre, at passende kompensation anvendes som vist i figur 7A. Når alle kompensation er udført korrekt, gælde matrixen kompensation for alle de eksperimentelle eksempelfiler.
  15. Når manuel kompensation er blevet udført, og en eksperimentel skabelon er opnået, starte behandling af eksperimentelle prøver som angivet i 6.13-6.15.3 og erhverve prøver på en flow Flowcytometret som beskrevet i 6.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen, der er skitseret i, præsenterer vi repræsentative data viser flow cytometric påvisning af ROS produktion som følge af stimulation af WT C57BL/6J BMDMs gennem FcγR. Som forventet, vi observerer minimale ændringer i FL1 eller FL2 fluorescens ovenfor baggrundsniveauer i unstimulated celler (figur 3A, sammenligne "farvede, unstimulated" vs "unstained, unstimulated" dot grunde). Vi observerer en markant stigning i FL1 og FL2 fluorescens, når cellerne er stimuleret med FcγR danne tvaerbindinger agent (figur 3A, Sammenlign "farves og stimuleret via Fc cross-linking" prøver vs "farvede, unstimulated" dot grunde). Endelig, når cellerne blev behandlet med ROS hæmmer før FcγR danne tvaerbindinger, denne øgede Fluorescens er bragt tilbage til basal niveauer (figur 3A, Sammenlign "farvet og behandlet med ROS inhibitor og stimuleret via Fc cross-linking" vs "farves og stimuleret via Fc cross-linking"dot grunde). Det fremgår også tydeligt, når data er præsenteret som et histogram for hver kanal (figur 3B), eller når data er præsenteret som en procentdel af celler positive for enten de grøn eller orange ROS sonder (figur 3 c). En lignende tendens er også tydeligt, når data er præsenteret som MFI, selvom reduktionen af orange fluorescens med forbehandling med ROS hæmmer ikke opfanges samt når præsenteret som MFI versus som en procentdel (figur 3 c). Vi også fremlægge resultaterne af 3 uafhængige forsøg udført på forskellige dage (figur 3, eksperiment 1, 2 og 3). Den gennemsnitlige værdier og tilsvarende standard fejl af middelværdien er angivet i grafer (figur 3 c).

Vi præsenterer også mislykkede forsøg, hvor sub-optimale ROS produktion som følge af FcγR stimulation blev observeret (figur 4). En minimal stigning i FL1 og FL2 fluorescens blev opdaget når man sammenligner "farves og stimuleret via Fc cross-linking" prøver vs "farvede, unstimulated" prøver (figur 4A, B, C). Dette præsenteres sammen med en vellykket eksperiment at fremhæve de store forskelle mellem de forventede procenter eller MFI stigninger og de observerede værdier i den mislykkede eksperiment.

Den nuværende protokol udnytter en 24 h priming trin. Når man sammenligner en 24 h versus en 48 h opstartstiden, observeret vi ingen markant forskel i andelen af celler positive for de grønne, oxidativ stress reagens (figur 5A, top histogrammer og figur 5B grønne sonde, % positive). Dog øge øger opstartstiden til 48 h gjorde procentdelen af celler positive for den orange fluorescens (figur 5A, lavere histogrammer og figur 5B orange sonde, % positive). Dette blev ligeledes afspejlet når data blev præsenteret som MFI. Dette tyder på, at en 48 h opstartstiden for optimal detektion af alle arter, ROS, kan være mere ideelt.

Givet, at på grund af omkostningerne eller den nødvendige tid til eksperimenter, kan anvendelse af et kit til at udføre denne analyse ikke være en mulighed. Af denne grund, vi også prøvet lignende komponenter til dem, der findes i kit og købt disse fra standard kreditorer (Thermofisher, EMD Millipore, Cayman). Vi finder at ved hjælp af individuelt indkøbte komponenter og den samme forsøgsplan for celle lastning og FcγR stimulation, kan vi sammenfatte mange af de samme resultater vi observerede ved hjælp af kit (fig. 6A, B). Men selv om stigninger i fluorescens var tilsyneladende med stimulation, et højere niveau af ROS produktion blev observeret ved hjælp af kit. Dette kan indikere, at brugen af individuelt fremskaffede komponenter kan være muligt men skulle blive yderligere optimeret for denne specifikke analyse.

Endelig, vi vise, at det også er muligt at kombinere celle-overflade farvning med disse ROS sonder. Vi bruger en kendt makrofag markør, F4/80, konjugeret med Alexa 647 og udføre celleoverfladen farvning inden behandling med ROS inhibitor, ROS Induceren eller bestemte stimuli til at fremkalde ROS produktion. Vi demonstrere i figur 7B , makrofager reagerer som forventet, når behandlet med FcγR crosslinking agent og FcγR crosslinking agent + ROS inhibitoren (figur 7B, orange vs Grøn prik grunde). Desuden, vi kan observere øget orange eller grønne fluorescens specifikt genereret af F4/80 mærket celler ved behandling med FcγR crosslinking agent og reduceret med forbehandling med ROS inhibitor (fig. 7B, F4/80 vs grøn og F4/80 vs orange dot grunde).

Figure 1
Figur 1: Flow cytometric vurdering af passende generation af BMDMs. Vildtype BMDMs blev genereret og blev efterladt enten unstained eller bejdset med FITC anti-mus F4/80 eller Alexa 647 anti-mus CD11b. FSC (x-aksen) vs SSC (y-aksen) parceller blev genereret og makrofager (BMDMs) blev lukket for at udelukke døde celler og små klippestykker. Ved hjælp af et plot af FSC-H(x-axis) vs FSC-A (y-akse), blev en singlet gate genereret. Gating på housecoats, histogrammer blev genereret for at vise celler farves med enten FITC F4/80 eller APC CD11b i forhold til isotypen farves kontrol. A) korrekte BMDM differentiering med mere end 95% af celler farvning positiv for CD11b eller F4/80. B) ukorrekt BMDM differentiering hvor mindre end 95% af celler farvning positive for F4/80 og 2 toppe er til stede for CD11b. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Udfører kompensation, når ved hjælp af grønne og orange ROS sonder. Kompensation vil kræve unstained ubehandlede celler, celler farves med grønne ROS sonde og behandlet med ROS inducer, og celler farves med orange ROS sonde og behandlet med ROS inducer. Dot grunde til unstained ubehandlede celler bruges til at bestemme kvadrant gates. Tallene for celler enkeltvis farves med enten grøn ROS sonde eller orange ROS sonde og behandlet med ROS inducer vises før og efter, kompensation var anvendt. Matrixen kompensation anvendes derefter på alle efterfølgende eksperimentelle prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Måling af ROS i svar på specifikke FcγR stimulation ved hjælp af grønne og orange ROS sonder og vurdering af assay reproducerbarhed. Wild-type knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) blev genereret, primet, og blev efterladt enten unstained eller bejdset med en cocktail af grøn og orange ROS sonder. Farves BMDMs blev enten venstre ubehandlet, stimuleret gennem deres FcγRs ved hjælp af murine anti-BSA IgG1 + BSA i 30 min, eller behandlet med ROS hæmmer før stimulation via FcγR cross-linking. A) Dot parceller, viser en stigning i procentdelen af celler i øverste venstre hjørne, øverste højre og nederste højre kvadranter på specifikke FcγR stimulation, som er reduceret i overværelse af ROS inhibitor. B) histogrammer for hver kanal, fluorescens, viser markør gate at bestemme celler positive for hver sonde. C) præsentation af data som en procentdel af celler positive for hver enkelt sonde eller en stigning i MFI. Tre uafhængige, repræsentative forsøg er præsenteret. Middelværdi for 3 forsøg og standard fejl af middelværdien er vist som linjer i graferne. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-Cystein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Eksempler på vellykkede og suboptimal FcγR stimulation. Wild-type knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) blev genereret, primet, og blev efterladt enten unstained eller bejdset med en cocktail af grøn og orange ROS sonder. Farves BMDMs blev enten venstre ubehandlet, stimuleret gennem deres FcγRs ved hjælp af murine anti-BSA IgG1 + BSA i 30 min, eller behandlet med ROS hæmmer før stimulation via FcγR cross-linking. Repræsentative resultater for vellykket og suboptimal stimulation er vist som A) dot parceller, B) histogrammer, eller C) procentdelen af celler positivt for hver enkelt sonde eller en stigning i MFI. Vellykket stimulation viser øget fluorescens øverst til venstre, øverste højre og sænke rigtige kvadranter af FL1 vs FL2 plot og øget MFI og procentdelen af positive celler farves med hver probe til FcγR stimulation. Suboptimal stimulation viser minimal stigning i MFI eller procentdelen af positive celler. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-Cystein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Effekten af opstartstiden på ROS generation efter FcγR stimulation. BMDMs blev genereret, primet for enten 24 eller 48 h, og blev efterladt enten unstained eller bejdset med en cocktail af grøn og orange ROS sonder. Farves BMDMs blev enten venstre ubehandlet, stimuleret gennem deres FcγRs ved hjælp af murine anti-BSA IgG1 + BSA i 30 min, eller behandlet med ROS hæmmer før stimulation via FcγR cross-linking. A) histogrammer for fluorescens induceret af hver probe efter stimulation af makrofager primet for enten 24 eller 48 h. B) procentdel af celler positive for hver sonden ved stimulation af makrofager primet for enten 24 eller 48 h. Priming makrofager for 48 h resulterede i en stigning i procent af celler positive for orange fluorescens (eller en stigning i MFI for FL2 kanalen) i forhold til priming makrofager i 24 timer. Middelværdi for 3 forsøg og standard fejl af middelværdien er vist som linjer i graferne. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-Cystein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Flow cytometric ROS måling på FcγR cross-linking ved hjælp af reagenser fra forskellige kreditorer. BMDMs blev genereret, primet for 24 h, og blev efterladt enten unstained eller bejdset med en cocktail af oxidativt stress og superoxid påvisning sonder. Farves BMDMs blev enten venstre ubehandlet, stimuleret med ROS inducer, stimuleret gennem deres FcγRs ved hjælp af murine anti-BSA IgG1 + BSA i 30 min, eller behandlet med ROS hæmmer før stimulation via FcγR cross-linking. Sonder, ROS inducer og ROS hæmmer var anvendes enten fra kit eller blev købt separat fra forskellige leverandører og anvendes på en lignende koncentration. A) Dot observationsområder viser en side-by-side sammenligning af resultater, der opnås ved hjælp af kit og ikke-kit komponenter. B) histogrammer viser en side-by-side sammenligning af resultater, der opnås ved hjælp af kit og ikke-kit komponenter. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-Cystein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Kombinerer celle-overflade farvning med cytometric flowmåling af ROS produktion ved FcγR cross-linking. A) Dot grunde til de forskellige fluorescerende kanaler ved hjælp af unstained eller enkeltvis farves kompensation kontrol. Wild-type BMDMs blev genereret, primet for 24 h, og blev forladt unstained, bejdset med Alexa 647 anti-mus F4/80 kun, farves med grønne ROS sonde kun og behandlet med ROS Induceren eller bejdset med orange ROS sonde kun og behandlet med ROS inducer. Dot grunde til unstained ubehandlede celler bruges til at bestemme kvadrant gates. Parceller viser forventede resultater hvis kanaler opvejes korrekt. Matrixen kompensation blev derefter anvendes på alle efterfølgende eksperimentelle prøver. B) vildtype BMDMs blev genereret, primet for 24 h og farves med Alexa 647 anti-mus F4/80. Bagefter, blev BMDMs enten venstre unstimulated, stimuleres via deres FcγRs ved hjælp af murine anti-BSA IgG1 + BSA i 30 min, eller behandlet med ROS hæmmer før stimulation via FcγR cross-linking. Dot parceller påvise, at grøn eller orange fluorescens specielt produceret af F4/80 celler kan påvises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DCFH2-DA og DHE-baseret detektion af ROS er en meget udbredt teknik14,15. Brugervenlighed og tilpasningsevne af disse ROS sonder til kinetic mikrotiterplade formater, Fluorescens mikroskopi eller flow cytometric analyse har bidraget til deres popularitet. Men i vores studier af FcγR-medieret makrofag funktioner, der ikke syntes at være en standardprotokol til at udføre denne analyse for flow cytometric analyse af FcγR krydsbundet celler. Givet den reaktive karakter af analysander bliver vurderet, har vi fundet, at timingen er af afgørende betydning for at sikre, at reproducerbarhed er opnået. Selv om vi har også udført kinetic mikrotiterplade assays, der kan være en bred variation i intensitet af fluorescens fra forsøg til eksperiment, hvilket gør det vanskeligt at samlede biologiske replikerer til statistiske analyser. Flow cytometric brug af disse sonder giver mulighed for kvantificering af "ROS positive" celler, som løser nogle af disse spørgsmål, men ikke uden komplikationer. Dette gælder især, når du bruger en flow Flowcytometret udstyret med en autosampler. I dette tilfælde vil analyse af et stort antal prøver påvirke mængden tid cellerne er udsat for forskellige stimuli. For at afbøde dette, har vi indarbejdet tidsforsinkelsen mellem analysen i protokollen til at sikre, at analysen udføres på celler stimuleret i et lignende tidsrum.

En anden vigtig faktor i analysen af handelsstrømmen cytometric ROS er medtagelsen af passende kontrol. Det kan ikke overvurderes, at alle eksperimenter skal have (mindst) alle de eksperimentelle og kompensation styrer vi liste i denne protokol. Det er vigtigt at sikre gyldigheden af hvert eksperiment så godt, at kunne med rette udelukke prøver hvis nødvendigt. Nogle eksempler på dette omfatter hvis makrofager ikke skelne/modne passende og udstillet meget lavere ROS produktion selv med inducer behandling. Et andet tilfælde kunne være upassende aktiveringen af makrofager selv før FcγR danne tvaerbindinger, hvilket resulterer i en høj basal ROS signal. Brug af ROS hæmmere sammen med specifikke FcγR tværbindingsmidler viser forsvinden af fluorescerende signaler er en anden vigtig kontrol vi har ofte fundet mangler i andre undersøgelser, der udfører lignende assays. ROS inhibitor anvendes i denne undersøgelse, N-acetyl-L-Cystein, betragtes som en universel ROS hæmmer. Hvis man er interesseret i ROS produceret af specifikke enzymer, kan andre specifikke ROS hæmmere medtages i assayet. Nogle eksempler er mefanamic syre (cyclooxygenase-afhængige ROS inhibitor), apocynin (NADPH oxidase-afhængige ROS hæmmer) eller allopurinol (en xanthin oxidase-afhængige ROS hæmmer).

Det er desuden afgørende at forstå, hvad faktisk bliver målt i denne udlæsning. Som tidligere nævnt, DCFH2-DA måler flere ROS arter, og så, fluorescens som følge af grønne sonden kan ikke bruges til at skelne en ROS art fra en anden14. Ligeledes, den orange sonde (sandsynligvis DHE), selv om ofte nævnt som superoxid specifikke, kan producere både superoxid-specifikke og superoxid-uafhængig oxidation produkter, som ikke kan adskilles uden brug af ekstra teknikker såsom HPLC 15. dog til formål at måle "samlede ROS" eller "induceret ROS" under den respiratoriske burst, brug af disse sonder sammen med de passende kontrol, kan være acceptabelt. Mange nye fluorescerende baseret ROS sensorer er opstået eller er ved at blive udviklet11,13. Nogle, som redox-følsomme fluorescerende proteiner, har fordel af en dynamisk måling af ROS produktion på grund af deres reversible oxidation. Disse kræver dog genmanipulation af celler, som ikke altid er muligt eller ønskede. I mange tilfælde, fluorescerende sonde-baserede ROS opdagelse er stadig en gyldig og nyttig værktøj, så længe eksperimentet er standardiseret, velkontrollerede, og konklusionerne stammer fra sådanne eksperimenter overvurderes ikke.

Fordele ved at bruge denne kommercielt tilgængelige ROS kit er, at alle nødvendige reagenser herunder ROS induktorer, skyllevæsker og titreret sonder inkluderet "klar til brug". Hvis perioden af eksperimenter er forventes for at være kortfattet (afsluttet inden for en uge), kan dette kit give en mere omkostningseffektiv metode til at udføre flow flowcytometri-baserede ROS opdagelse uden at skulle købe eller optimere hver enkelt komponent individuelt. Vi desuden vise ved hjælp af dette kit med en specifik agonist (FcγR stimulation) og påvise reproducerbarhed på tværs af eksperimenter; vi vurdere virkningerne af priming gange på ROS generation; vi sammenligner med lignende sonder, hæmmere og induktorer fra forskellige virksomheder; Vi giver eksempler på mislykkede forsøg. og endelig, vi kombinerer celle-overflade farvning med brugen af disse ROS sonder. Dette ville potentielt giver mulighed for samtidige påvisning af ROS fra forskellige celletyper i en blandet population, der kræver mindre prøven og reagenser. F.eks kan dette være særligt nyttigt, når skelne mellem makrofag og neutrofile-afledte ROS, de vigtigste celletyper i stand til at reagere på FcγR ligatur. For flere forsøg, som skal udføres med lange mellemliggende perioder i mellem, brug af et kit muligvis ikke så ideel. Flere delprøver af sonderne leveres ikke og når rekonstitueret, producenten kun anbefaler, at reagenserne anvendes inden for en uge (som ROS sonder er meget reaktive). Hvis det forventes, at denne periode er uforenelig med eksperimenter, anbefales det, at enkelte reagenser snarere end et kit købes separat og rekonstitueres kun i løbet af dagen af eksperimenter. Som vi viser her, kan yderligere optimering af de individuelt indkøbte komponenter desuden være behov forud for analysen. Samlet set håber vi, at dette arbejde giver en nyttig ressource for forskere bruger flowcytometri reproducerbar måle ROS generation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke andre medlemmer af Tigno-Aranjuez Lab herunder Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy og Roopin Singh for deres hjælp i laboratoriet vedligeholdelse og mus koloni vedligeholdelse. Support af denne forskning blev leveret af grant R00 HL122365 og Start-up midler til J.T.T-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Tags

Immunologi og infektion sag 145 reaktive ilt arter (ROS) flow flowcytometri Fc gamma receptor (FcγR) Fc receptorer makrofager respiratoriske burst
Cytometric flowmåling af ROS produktion i makrofager i svar til FcγR tværbinding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J.… More

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter