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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

fcγr पार जोड़ने के जवाब में मैक्रोफेज में ROS उत्पादन के प्रवाह cytometric माप

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59167
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Summary

इस अध्ययन के प्रवाह cytometry के उपयोग को दर्शाता है प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) fcγr के सक्रियण से उत्पंन उत्पादन का पता लगाने के लिए । यह विधि प्रतिरक्षा परिसरों, opsonized सूक्ष्मजीवों, या प्रत्यक्ष fcγr पार जोड़ने के जवाब में फ़ैगोसाइट के रोगाणुरोधी और रेडॉक्स संकेतन समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

ऑक्सीडेटिव या श्वसन फट को विभिन्न प्रतिरक्षा उत्तेजकों के जवाब में फेगोसाइट्स द्वारा ऑक्सीजन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (ROS) की तेजी से खपत का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रतिरक्षा सक्रियण के दौरान उत्पन्न आरओएस मुख्य रूप से आरओएस की क्षमता को डीएनए और प्रोटीन को नुकसान पहुंचाने, सूक्ष्मजीवों की मौत के कारण प्रबल रोगाणुरोधी गतिविधि डालती है । ROS उत्पादन reproducibly उपाय करने में सक्षम होने के नाते और आसानी से मेजबान रक्षा के इस तंत्र के लिए विभिंन रास्ते और अणुओं के योगदान का आकलन करने के क्रम में आवश्यक है । इस पत्र में, हम फ्लोरोसेंट जांच और प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए ROS उत्पादन का पता लगाने का प्रदर्शन । हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, ros के फ्लोरोसेंट माप बेहद समस्याग्रस्त है, विशेष रूप से विशिष्ट और नहीं mitogenic उत्तेजकों द्वारा प्रेरित ros की माप करने के लिए संबंध है । हम एक विस्तृत पद्धति प्रस्तुत करने के लिए विशिष्ट fcγr उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में उत्पंन ROS का पता लगाने मैक्रोफेज पीढ़ी के साथ शुरू, भड़काना, धुंधला, fcγr पार से जोड़ने, और प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ समाप्त ।

Introduction

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (ROS) प्रतिक्रियाशील अणुओं या मुक्त कण है कि द्वारा कर रहे हैं-एरोबिक श्वसन के उत्पादों ( 1में की समीक्षा की). इनमें सुपरऑक्साइड एनॉयन, पेरोक्साइड, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल और हाइड्रॉक्सिल आयन शामिल हैं । सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत, आरओएस मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रिया और निकोटिनमाइड एडेनिन डिन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट (nadph) आक्साइड द्वारा उत्पादित किया जाता है और तेजी से विभिन्न एंजाइमों और प्रोटीन जैसे सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस और ग्लूटाथिओन के द्वारा detoxified हैं । ros या ros को हटाने की क्षमता में एक दोष के एक अतिरंजित उत्पादन ऑक्सीडेटिव तनाव में परिणाम कर सकते हैं, जिससे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों प्रोटीन, लिपिड की क्षति को बढ़ावा देने, और डीएनए सेलुलर तनाव या मौत और रोगजनक रोग राज्यों के लिए अग्रणी । हालांकि, यह वर्तमान में सराहना की है कि ros भी संकेतन अणुओं के रूप में कार्य कर सकते हैं (redox संकेतन), और विभिन्न अणुओं और मार्ग मध्यवर्ती के ros-मध्यस्थता संशोधन सेलुलर चयापचय को प्रभावित कर सकते हैं, प्रसार, अस्तित्व, भड़काऊ सिग्नलिंग, और एजिंग2. फैगोसाइटिक कोशिकाओं में, ROS तथाकथित "श्वसन फट"1,3,4,5,6के दौरान रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदान करने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । बाहरी उत्तेजनों के लिए फ़ैगोसाइट की प्रतिक्रिया के दौरान, nadph ऑक्सीडेस परिसर (p40 phox, p47phox, p67phox) के घटकों को cytosol से फेगोसोमल झिल्ली को translocate gp91phox और p22phox युक्त उपइकाइयों, और एक साथ Rac1/2 के कार्यों के साथ, एक पूरी तरह कार्यात्मक nadph ऑक्सीडेस एंजाइम परिसर के रूप में । इकट्ठे nadph ऑक्सीडेस तो इस्तेमाल करता है nadph फैगोसोमल vacuole के भीतर सुपरऑक्साइड को ऑक्सीजन को कम करने के लिए । सुपरऑक्साइड anions सीधे नुकसान का कारण या हाइड्रोजन पेरोक्साइड में dismutated जा सकता है । दोनों सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड अंय अणुओं के साथ प्रतिक्रिया के लिए अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सिल कण उत्पंन कर सकते हैं । नुकसान प्रोटीन पर लौह सल्फर समूहों के साथ या डीएनए के आधार ऑक्सीकरण के कारण, अंततः प्रतिबंधित माइक्रोबियल चयापचय या सूक्ष्म जीव5की मौत के लिए अग्रणी के साथ इन ROS की प्रतिक्रिया से मध्यस्थता है । nadph ऑक्सीडेस एंजाइम परिसर और सांस फट के दौरान उत्पादित ROS के महत्व क्रोनिक granulomatous रोग (cgd) के साथ रोगियों में चिकित्सकीय सचित्र है7,8,9, 10. cgd के साथ व्यक्तियों gp91phox में परिवर्तन के पास, ROS उत्पादन और बैक्टीरिया और कवक जो आमतौर पर असुरक्षित व्यक्तियों के साथ एक चिंता नहीं कर रहे है के साथ आवर्तक संक्रमण के लिए संवेदनशीलता की कमी में जिसके परिणामस्वरूप । इसलिए, चाहे अध्ययन ऑक्सीडेटिव तनाव, रेडॉक्स संकेतन, या मेजबान रक्षा, वास्तविक समय में ROS उत्पादन को मापने के लिए सक्षम किया जा रहा एक उपयोगी प्रयास है ।

एकाधिक assays ROS उत्पादन या ऑक्सीडेटिव तनाव11,12,13के परिणाम को मापने के लिए उपयोग किया गया है । इनमें से एक, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट जांच 2 ', 7 ' dichlorodihydrofluorescein डाइएसीटेट (dcfh2-डीए)14है । यह अणु रंगहीन और लिपोफिलिक है । dcfh2के प्रसार-सेल झिल्ली भर में डीए यह इंट्रासेलर esterases द्वारा पर काम किया जा करने के लिए अनुमति देता है, जो यह dcfh 2 में deacetylates, यह सेल impermeable प्रतिपादन । आरओएस के कई प्रकार (हाइड्रोजन पेरोक्साइड, पेराऑक्सीनाइट्राइट, हाइड्रॉक्सिल कण, नाइट्रिक ऑक्साइड, और पेरॉक्सी कण) के कार्य dcfh2 पर यह dcf में oxidize जो फ्लोरोसेंट है (रिपोर्ट पूर्व Em: 485-500 एनएम/515-530 एनएम) और एक प्रवाह का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है cytometer एक मानक फिल्टर fluorescein (FL1 चैनल) के लिए सेट के साथ सुसज्जित । superoxide दृढ़ता से dcfh2 के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है, लेकिन एक और जांच dihydroethidium (DHE) के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए फ्लोरोसेंट उत्पाद 2-हाइड्रोक्सीथिडियम (साथ ही अन्य फ्लोरोसेंट superoxide-स्वतंत्र ऑक्सीकरण उत्पादों)15उपज कर सकते हैं । DHE ऑक्सीकरण के फ्लोरोसेंट उत्पादों ५१८ एनएम की एक उत्तेजना तरंग दैर्घ्य और ६०५ एनएम (FL2 चैनल) के उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । हालांकि अपेक्षाकृत उपयोग करने के लिए सरल, ROS का पता लगाने के लिए इन जांच का उपयोग अपनी सीमाओं के ज्ञान और विशिष्ट परख में धुंधला प्रक्रियाओं और नियंत्रण की सावधानी से निगमन की आवश्यकता है क्रम में किया जा रहा है वैध प्रयोगात्मक परिणाम और निष्कर्ष । निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के उपयोग को प्रदर्शित इन 2 जांच प्रवाह cytometry द्वारा ROS उपाय करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । हम इन जांच और fcγr पार जोड़ने के माध्यम से आरओएस उत्पादन प्रेरित के साथ अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज दाग । हम इस प्रोटोकॉल और तनाव उचित सावधानियों कि सफल प्रयोग के लिए शुरू किया जाना चाहिए का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत करते हैं ।

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Protocol

पशु हैंडलिंग के लिए प्रोटोकॉल इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड फीमेल कमिटी (iacuc) द्वारा यूनिवर्सिटी ऑफ सेंट्रल फ्लोरिडा को मंजूरी दी गई ।

1. अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज की पीढ़ी (bmdms)

  1. संस्कृति मीडिया की तैयारी
    1. D10F बेस मीडिया तैयार करें: dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (dmem) के लिए, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs), 1 मिमी सोडियम pyruvate, 10 मिमी 4 जोड़ें-(2-hydroxyethyl) -1-पिपराज़ीनीएथेन्स्लफोनिक एसिड (hepes), और ०.०५ मिमी β-mercaptoethanol ।
      नोट: यद्यपि यह ताज़ा D10F मीडिया का उपयोग करने के लिए श्रेष्ठ है, D10F आधार मीडिया दो सप्ताह के लिए एक सप्ताह के भीतर एकाधिक प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा करने के लिए पहले से तैयार किया जा सकता है । एक माउस के लिए, चारों ओर १७५ मिलीलीटर D10F बेस मीडिया की जरूरत है (25 मिलीलीटर हड्डियों को फ्लश करने के लिए और १५० एमएल मैक्रोफेज भेदभाव मीडिया बनाने के लिए)
    2. ladmac विकास मीडिया तैयार: ईगल ंयूनतम आवश्यक माध्यम (emem) के लिए, 10% गर्मी निष्क्रिय fbs और 2 मिमी एल glutamine जोड़ें । मीडिया को नए सिरे से तैयार करें, जिस दिन आप अपनी संस्कृतियों को शुरू करने की योजना बनाते हैं ।
      नोट: ladmac विकास मीडिया के एक लीटर लगभग में परिणाम होगा (19) ५० एमएल ladmac के aliquots-वातानुकूलित मीडिया ।
    3. पूरा dmem मीडिया तैयार करें: dmem के लिए, 10% गर्मी निष्क्रिय fbs और 1x एंटीबायोटिक-antimycotic जोड़ें । मीडिया को नए सिरे से तैयार करो, दिन bmdms पर काटा जाएगा ।
      नोट: एक माउस के लिए, dmem पूरा मीडिया के चारों ओर १०० मिलीलीटर की आवश्यकता होगी । यह कोशिकाओं को भड़काना के लिए इस्तेमाल किया मीडिया भी शामिल है ।
  2. ladmac वातानुकूलित माध्यम की तैयारी
    1. ladmac वृद्धि मीडिया के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर एक 10 सेमी डिश में कन्फ्लुएंसी करने के लिए लामैक कोशिकाओं को विकसित (1.1.2 में परिभाषित). ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह 2 पर कोशिकाओं को सेतेहैं ।
    2. कन्फ्लुएंसी में, कोशिकाओं पर बलपूर्वक मीडिया को वितरित करके कोशिकाओं को अलग कर देते हैं । 1 मिलीलीटर से अलग कोशिकाओं टी-१७५ बोतल में जोड़कर बीतने कोशिकाओं ladmac विकास मीडिया के १०० एमएल युक्त । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 (लगभग एक सप्ताह) में पूरी तरह से संगामी तक कोशिकाओं को सेते हैं । इस तरह, १ १० सेमी डिश दस टी-१७५ बोतल या वातानुकूलित मीडिया के लगभग 1 एल उपज कर सकते हैं ।
    3. एक बार कोशिकाओं को तैयार कर रहे हैं, के लिए वातानुकूलित मीडिया और सेंपेरेज ३५० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए गोली अवांछित कोशिकाओं को इकट्ठा । एक ०.२ मिमी फिल्टर के माध्यम से एकत्र supernatants फ़िल्टर और दुकान ५० एमएल aliquots पर-८० डिग्री सेल्सियस. ladmac के aliquots-वातानुकूलित मीडिया में रखा जा सकता है-८० डिग्री सेल्सियस गतिविधि की ंयूनतम हानि के साथ महीनों के लिए ।
      नोट: बड़े प्रयोगों पूर्वानुमानित हैं, तो संगतता सुनिश्चित करने के लिए एक ही समय में ladmac-वातानुकूलित मीडिया के बड़े बैचेस तैयार करें । यह संभव नहीं है, तो प्रत्येक प्रयोग के लिए एक ही बैच या ladmac के बहुत-वातानुकूलित मीडिया से व्युत्पंन aliquots का उपयोग करें ।
  3. अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज की तैयारी
    1. प्रयोग के दिन पर, पहले से तैयार D10F मीडिया में (1 भाग ladmac वातानुकूलित मीडिया में 3 भागों D10F) ladmac वातानुकूलित मीडिया के 25% जोड़कर ताजा मैक्रोफेज भेदभाव मीडिया तैयार करते हैं । इस मीडिया को पहले से तैयार न करें! केवल bmdm संस्कृति के लिए जरूरत के रूप में ज्यादा मीडिया के रूप में तैयार करते हैं ।
    2. दिन 1: अलग माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अनुसार पहले से वर्णित प्रोटोकॉल16 के लिए एक संशोधन के साथ femurs और tibias से अस्थि मज्जा फ्लश D10F base मीडिया का उपयोग कर । (4) हड्डियों के प्रत्येक छोर को फ्लश करने के लिए D10F मीडिया के २.५ mL का उपयोग करें । सीधे एक पूर्व गीला ४० मिमी सेल छलनी में अस्थि मज्जा कोशिकाओं फ्लश एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर रखा । शेष मीडिया (~ 5 मिलीलीटर) बाहर सेल छलनी कुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. अपकेंद्रिका एकत्र अस्थि मज्जा कोशिकाओं पर ३५० एक्स जी के लिए 5 मिनट. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मैक्रोफेज भेदभाव मीडिया के 30 मिलीलीटर की कुल में कोशिकाओं resuspend (प्रति माउस) ।
    4. तैयार और लेबल (6) बाँझ १० सेमी पेट्री डिश. प्रत्येक पेट्री डिश में मैक्रोफेज भेदभाव मीडिया की थाली 5 मिलीलीटर । प्रति डिश 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक पेट्री डिश में मैक्रोफेज अंतर मीडिया में सस्पेंड अस्थि मज्जा कोशिकाओं की aliquot 5 मिलीलीटर । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह 2 पर 5 दिनों के लिए सेते।
    5. 5 दिवस: कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया । पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर के साथ एक बार धोएं और 10 मिलीलीटर नए सिरे से तैयार मैक्रोफेज भेदभाव मीडिया जोड़ें । एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए सेते ।
    6. दिन 8: नीचे वर्णित bmdms संचयन के लिए आगे बढ़ें ।

2. कटाई, बोने और bmdms के भड़काना

  1. मैक्रोफेज भेदभाव मीडिया में bmdms बढ़ के 7 दिनों के बाद, supernatant हटा दें । पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर के साथ एक बार धोकर पंसारी मैक्रोफेज धो लें । पीबीएस महाप्राण ।
  2. प्रत्येक मैक्रोफेज प्लेट में ०.२५% ट्रिप्सिन-edta की 1 मिलीलीटर का वितरण और कोशिकाओं को अलग करने के लिए लगातार दोहन के साथ 5-10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस इनकोबेटर में उन्हें छोड़ दें । एक P1000 पिपेट का उपयोग करके ऊपर और नीचे pipetting द्वारा trypsinized मैक्रोफेज अलग करना और पूर्ण dmem मीडिया के 10-15 मिलीलीटर युक्त ५० मिलीलीटर ट्यूबों में मैक्रोफेज इकट्ठा । अतिरिक्त 2 मिलीलीटर पूरा dmem मीडिया के साथ थाली धोने के लिए किसी भी शेष मैक्रोफेज फसल ।
    चेतावनी: अधिक से अधिक 10 मिनट के लिए ट्रिप्सिन में मैक्रोफेज मत छोड़ो ।
  3. ५० मिलीलीटर ट्यूबों को ३५० एक्स जी के लिए 5 मिनट के लिए अपकेंद्रिप । सुपरनाटंट छोड़ें । धीरे गोली अलग करना और पूरा dmem मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । इस प्रकार के रूप में trypan नीला के रूप में एक व्यवहार्यता डाई की उपस्थिति में एक hemocytometer का उपयोग कर मैक्रोफेज गिनती:
    1. उदाहरण के लिए, एक 1:10 कमजोर पड़ने के लिए कोशिकाओं के 10 μl के साथ trypan नीला के ९० μl मिक्स ।
    2. इस मिश्रण में, 10 μl को हीमोसिटोमीटर में लोड करें और सेंट्रल स्क्वायर (5 x 5 ग्रिड) की गणना करें । कुल सेल गणना = गणना x 104 एक्स तनुकरण फैक्टर (10) एक्स वॉल्यूम (10 मिलीलीटर) ।
  4. प्रत्येक 6 सेमी डिश में इस सेल सस्पेंशन के पूर्ण dmem मीडिया और प्लेट 4 एमएल में 1 मिलियन/एमएल होने के लिए सेल सस्पेंशन को समायोजित करें ।
    नोट: प्रयोग के अनुसार न्यूनतम 3 प्लेट्स की आवश्यकता होती है. कोशिकाओं की एक थाली अप्रेरित छोड़ दिया जाएगा, कोशिकाओं का एक दूसरा सेट fcγrs के पार से जोड़ने के माध्यम से प्रेरित किया जाएगा, और कोशिकाओं की तीसरी थाली अतिरिक्त प्रयोगात्मक और प्रवाह cytometric नियंत्रण के सभी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  5. ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2पर रात भर प्लेटों सेते हैं ।
  6. अगले दिन, supernatant महाप्राण, pbs के 1-2 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने । प्रत्येक थाली को १०० एनजी/एमएल माउस ifn-γ युक्त पूरा मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2पर रात भर प्लेटों सेते हैं ।
  7. यदि वांछित, प्रवाह cytometry द्वारा bmdms के उचित उत्पादन का आकलन करने के लिए कोशिकाओं का एक aliquot ले लो । परीक्षण के अनुसार 1x106 कोशिकाओं का उपयोग करें और निम्न स्थितियों के लिए पॉलीस्टाइरीन फैक्स ट्यूब तैयार: आइसोटाइप नियंत्रण, F4/80 के साथ दाग (या वैकल्पिक रूप से, CD11b के साथ दाग) ।
  8. 1x pbs में ०.१% fbs जोड़कर प्रवाह cytometry धुंधला करने वाला बफर तैयार करें । fbs के केवल इस राशि का उपयोग करें ताकि बाद के चरणों में सीरम भुखमरी के प्रभाव को नकारना नहीं है ।
  9. aliquot 1 x 106 कोशिकाओं ट्यूब और अपकेंद्रिका प्रति ७५० एक्स जी 5 मिनट के लिए ।
  10. प्रवाह cytometry बफर के 2 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspending कोशिकाओं को decanting या aspirating द्वारा एक बार धोने । 5 मिनट के लिए ७५० एक्स जी पर अपकेंद्रिका ।
  11. महाप्राण और resuspend कोशिकाओं में १०० μl प्रवाह cytometry धुंधला करने के लिए बफर । विरोधी माउस के 1 μl जोड़ें CD16/एफसी प्रत्येक ट्यूब को एंटीबॉडी अवरुद्ध । 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते ।
  12. धोने के बिना, के 2 μl जोड़ें fitc विरोधी माउस F4/80 या 1 μl के apc विरोधी माउस CD11b एंटीबॉडी के लिए "सना हुआ" ट्यूबों और इसी समप्ररूप नियंत्रण एंटीबॉडी की एक समान राशि को "समप्ररूप" ट्यूबों. बर्फ पर सेते, अंधेरे में, के लिए 30 मिनट.
  13. कोशिकाओं को सीधे पीबीएस की 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं । 5 मिनट के लिए ७५० एक्स जी पर अपकेंद्रिका ।
  14. पीबीएस के १५० μl में महाप्राण और resuspend कोशिकाओं ।
  15. एक प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने प्राप्त ब्याज के गेट पर १०० μl या १०,००० घटनाओं की एक बंद हालत का उपयोग कर और यह सुनिश्चित करें कि fsc, SSC, FL1 (fitc विरोधी माउस F4/80) या FL4 (apc विरोधी माउस CD11b) चैनलों का विश्लेषण किया जा करने के लिए मापदंडों के लिए चयनित कर रहे हैं.
  16. प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, fsc के लिए एक डॉट प्लॉट (एक्स-अक्ष पर) बनाम एसएससी (y-अक्ष पर) और ब्याज की कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट ड्रा, मृत कोशिकाओं और मलबे को छोड़कर (मृत कोशिकाओं और मलबे बहुत छोटी घटनाओं मुख्य कोशिका आबादी से और लोव पर दिखाई देते हैं प्लॉट के आर लेफ्ट).
  17. ब्याज की कोशिकाओं पर Gating, एक्स-अक्ष पर FL1 (fitc विरोधी माउस F4/80) या FL4 (apc विरोधी माउस CD11b) के साथ एक हिस्टोग्राम प्लॉट खोलें ।
  18. "isotype" नमूना चलाएँ । "isotype" नमूना घटनाओं के बहुमत के गेट के बाईं ओर कर रहे हैं ताकि एक मार्कर गेट उत्पन्न (< 1% सकारात्मक). इस टेंपलेट को सना हुआ नमूना फ़ाइल पर लागू करें ।
  19. "सना हुआ" नमूना चलाएँ । bmdms के सफल सृजन में परिणाम होगा > 95% fitc विरोधी के अभिव्यक्ति-माउस F4/80 या apc विरोधी माउस CD11b (चित्रा 1a), जबकि गलत संस्कृति की स्थिति सब मैक्रोफेज की इष्टतम पीढ़ी (चित्र 1b) में परिणाम हो सकता है ।
    नोट: एक से अधिक genotypes bmdms जनरेट कर रहा है, तो उत्पन्न bmdm के प्रत्येक बैच के लिए इन मार्करों की अभिव्यक्ति का ध्यान दें, इस मामले में कि यह विश्लेषण से एक नमूना को छोड़कर के लिए आधार हो सकता है जब उत्तेजना के जवाब में ROS पीढ़ी का आकलन किया है.

3. अभिकर्मक और आरओएस मापन के लिए सामग्री की तैयारी

  1. एक 5 मिमी शेयर समाधान उपज के लिए जलीय dmf के ६० μl में lyophilized ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने अभिकर्मक पुनर्गठन । उपयोग करने से पहले धीरे मिलाएं ।
    नोट: यह ROS-आईडी किट मैनुअल में कहा गया है कि पुनर्गठन अभिकर्मक के शेल्फ जीवन के बारे में है 1 सप्ताह में-20 ° c. अभिकर्मक का तुरंत पुनर्गठन के बाद छोटे प्रकाश-प्रूफ सील्स में इसके ऑक्सीकरण को कम करता है और शेल्फ लाइफ को अधिकतम-20 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाता है ।
  2. एक 5 मिमी शेयर समाधान उपज के लिए जलीय dmf के ६० μl में lyophilized सुपरऑक्साइड का पता लगाने अभिकर्मक को फिर से संगठित करना । उपयोग करने से पहले धीरे मिलाएं ।
    चेतावनी: के रूप में किट मैनुअल में कहा गया है, संभव mutagens के रूप में दोनों का पता लगाने अभिकर्मकों का इलाज, देखभाल के साथ प्रत्येक संभाल, और ठीक से निपटाने ।
  3. एक ५० मिमी स्टॉक समाधान उपज के लिए, जलीय dmf के 20 μl में ROS inducer (pyocyanin) का पुनर्गठन ।
  4. एक ०.५ मीटर स्टॉक एकाग्रता उपज के लिए विआयनीकृत पानी की १२३ μl में ROS अवरोधक (एन-acetyl-एल-cysteine) का पुनर्गठन ।
  5. लेबल 5 मिलीलीटर दौर polystyrene ट्यूबों (प्रवाह cytometry ट्यूबों) प्रयोगात्मक नियंत्रण और शर्तों के साथ । (देखें 4. परख शर्तों और नियंत्रण)
  6. कम सीरम dmem तैयार (कोई phenol लाल) phenol लाल मुक्त dmem के लिए ०.१% fbs जोड़कर ।
  7. (उपयोग पर निर्भर करता है) छोटे aliquot में विरोधी bsa एंटीबॉडी aliquot और उन्हें-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  8. hbss में १०० मिलीग्राम/एमएल bsa के स्टॉक समाधान (हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान) या पीबीएस तैयार करें । १०० μl aliquot में aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  9. ROS जांच (2x जांच समाधान) के एक 2x समाधान तैयार: कम सीरम dmem के प्रत्येक 10 मिलीलीटर के लिए, ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने अभिकर्मक के 4 μl जोड़ें (हरा डाई) और सुपरऑक्साइड का पता लगाने के 4 μl अभिकर्मक (ऑरेंज डाई) ।
  10. केवल ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने अभिकर्मक (2x जांच समाधान, हरी केवल) युक्त 2x जांच समाधान तैयार है, या केवल सुपरऑक्साइड का पता लगाने अभिकर्मक युक्त (2x जांच समाधान, ऑरेंज केवल) । प्रयोग के लिए आवश्यक अभिकर्मक की केवल मात्रा तैयार करें और हमेशा उपयोग करने से पहले 2x समाधान तुरंत तैयार कर लें ।
    नोट: 2x जांच समाधान के छोटे खंड तैयार करने के लिए, dmem में अंतिम कमजोर पड़ने से पहले दोनों हरे और नारंगी का पता लगाने अभिकर्मकों के एक मध्यवर्ती 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, एक 2x जांच समाधान के 1 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, dmem के 9 μl में प्रत्येक जांच के 1 μl पतला (1:10 मध्यवर्ती कमजोर पड़ने) । dmem के 1 मिलीलीटर में इस 1:10 मध्यवर्ती कमजोर पड़ने के 4 μl पतला ।

4. परख शर्तों और नियंत्रण

  1. प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक क्षतिपूर्ति के लिए निम्नलिखित प्रायोगिक नियंत्रण शामिल करें:
    a) रहित और अप्रेरित कोशिकाएं ।
    ख) केवल ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने अभिकर्मक के साथ दाग कोशिकाओं (हरी अभिकर्मक) और ROS inducer के साथ इलाज किया ।
    ग) केवल सुपरऑक्साइड का पता लगाने अभिकर्मक (नारंगी अभिकर्मक) के साथ दाग कोशिकाओं और ROS inducer के साथ इलाज किया ।
  2. प्रत्येक माउस या जैविक प्रतिकृति के लिए, निंनलिखित 6 शर्तें शामिल हैं:
    क) अनसना और अप्रेरित कोशिकाएं
    ख) दाग और अप्रेरित कोशिकाओं
    ग) दाग कोशिकाओं सकारात्मक inducer के साथ इलाज
    घ) दाग कोशिकाओं सकारात्मक inducer और ROS अवरोध करनेवाला के साथ इलाज
    ई) fcγr पार जोड़ने के माध्यम से सक्रिय दाग कोशिकाओं
    च) दाग कोशिकाओं fcγr पार जोड़ने के माध्यम से सक्रिय और ROS अवरोधक के साथ इलाज
  3. चूहों और शर्तों की संख्या के आधार पर जरूरत 2x जांच समाधान की राशि की गणना (2x जांच समाधान के २०० μl हर हालत धुंधला की आवश्यकता के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) ।
    नोट: एक 6 चूहों का उपयोग कर परख के लिए, 5 जांच के साथ धुंधला की आवश्यकता शर्तों माउस प्रति की जरूरत होगी । यह शर्तों की कुल संख्या को 30 से लाता है । इस प्रकार, 2x जांच समाधान की कुल राशि की जरूरत है कम 6 मिलीलीटर (30 * 200 μl) ।

5. सेल की तैयारी

  1. रात भर मैक्रोफेज भड़काना के बाद, महाप्राण । pbs के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
  2. सीरम कम सीरम dmem की एक ही मात्रा के साथ मीडिया की जगह से कोशिकाओं भूखे । प्रत्येक माउस के लिए, एक थाली विरोधी bsa igg1 के साथ इलाज किया जाएगा, जबकि सीरम भूखे, जबकि अंय untreated छोड़ दिया जाएगा । बिना इलाज वाली प्लेटों में केवल कम सीरम dmem जोड़ें । कम सीरम dmem युक्त मुरीन विरोधी bsa igg1 का इलाज प्लेटों के २.५ μg/
    नोट: एक अतिरिक्त अस्वास्थ्यकर प्लेट प्रवाह cytometric मुआवजा नियंत्रण के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक है ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2पर 4 एच के लिए प्लेटें सेते हैं ।
  4. सीरम भूखे रहने के बाद, कोमल scraping द्वारा कोशिकाओं फसल या pbs में ०.२ मिमी edta का उपयोग करके । उन्हें लेबल 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों में ले लीजिए और उन्हें ७५० एक्स जी के लिए 5 मिनट पर अपकेंद्रिप करें । ट्रैक रखें जो कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया था murine विरोधी-bsa igg1.
  5. उपचार कोशिकाओं से किसी भी अवशिष्ट विरोधी bsa से छुटकारा पाने के लिए पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार सेल छर्रों को धोएं ।
  6. कम सीरम dmem के ६०० μl में resuspend सेल गोली ।
  7. ६०० μl सेल निलंबन से, aliquot २०० μl से पूर्व-लेबल 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों निम्नानुसार:
    1. अस्वास्थ्यकर कोशिकाओं से, लेबल ट्यूबों के लिए २०० μl ले "अप्रेरित", २०० μl ट्यूबों के लिए लेबल "सकारात्मक inducer" और २०० ट्यूबों के लिए μl लेबल "सकारात्मक inducer + अवरोधक"
    2. विरोधी bsa igg1 उपचार कोशिकाओं से, लेबल ट्यूबों के लिए २०० μl ले "fcγr crosslinking/fcγr xl" और २०० μl ट्यूबों के लिए लेबल "fcγr XL + अवरोधक"
    3. अस्वास्थ्यकर कोशिकाओं से मुआवजा नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए, लेबल ट्यूब के लिए २०० μl ले "अनुपचारित अप्रेरित", २०० μl "ग्रीन + inducer" नियंत्रण के लिए और २०० μl "नारंगी + inducer" नियंत्रण के लिए.
      नोट: यदि 5.7.1 और 5.7.3 से कोशिकाओं को एक ही माउस से व्युत्पंन कर रहे हैं, एक ही "unstained unstimulated" कोशिकाओं प्रयोगात्मक और क्षतिपूर्ति नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि नहीं, तो एक अतिरिक्त २०० μl कोशिकाओं की जरूरत होगी एक के लिए एक "unstained unstimulated" प्रयोगात्मक नियंत्रण) ।
  8. धुंधला और उत्तेजना जब तक बर्फ पर ट्यूबों रखें । सीरम भुखमरी और igg 1 के बंधन के दौरान, जांच तैयार, विशिष्ट उत्तेजकों, और inducers के रूप में नीचे उल्लिखित ।
    नोट: अगर पहली बार के लिए परख प्रदर्शन, यदि कोई टेंपलेट उपलब्ध है, या नहीं के बाद-तथ्य मुआवजा प्रवाह cytometer और इसी सॉफ्टवेयर पर उपलब्ध है, उत्तेजित और मुआवजा नियंत्रण दाग और प्रवाह cytometer पर इन चलाने के लिए प्रदर्शन प्रायोगिक नमूनों को उद्दीपी के अतिरिक्त पहले मैनुअल क्षतिपूर्ति.

6. परख प्रदर्शन

  1. 2x जांच समाधान (चरण ३.९ में तैयार) में pyocyanin 1:100 पतला द्वारा 2x सकारात्मक inducer समाधान तैयार pyocyanin के ५०० μm की एक 2x एकाग्रता प्राप्त करने के लिए (अंतिम एकाग्रता २५० μm होगा) । इसके अलावा, प्रत्येक "2x जांच समाधान, ग्रीन केवल" और "2x जांच समाधान, ऑरेंज केवल" ट्यूबों में ३.१० में तैयार की एक में पतला pyocyanin 1:100 ।
    नोट: "सकारात्मक inducer" और "सकारात्मक inducer + अवरोधक" के साथ लेबल दोनों शर्तों सकारात्मक inducer के साथ इलाज किया जाएगा. योजना तदनुसार जब 2x सकारात्मक inducer समाधान की राशि की गणना तैयार करने के लिए । उदाहरण के लिए: यदि 3 चूहों के साथ परख प्रदर्शन, 6 शर्तों (3 * 2) सकारात्मक inducer के साथ इलाज किया जाएगा, तो तैयार 6 * 200 μl = 2x सकारात्मक inducer समाधान के १.२ मिलीलीटर ।
  2. 2 μg/ml (अंतिम एकाग्रता 1 μg/एमएल) की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 2x जांच समाधान में bsa स्टॉक समाधान को पतला करके एक 2x bsa समाधान तैयार करें ।
    नोट: "fcγr xl" और "fcγr xl + अवरोध करनेवाला" के साथ लेबल दोनों शर्तों 2x bsa समाधान के साथ इलाज किया जाएगा । योजना तैयार करने के लिए समाधान की राशि की गणना करते समय तदनुसार । उदाहरण के लिए: यदि 3 चूहों का उपयोग कर परख प्रदर्शन, 6 (3 * 2) शर्तों bsa समाधान के साथ इलाज किया जाएगा और इसलिए 6 * 200 μl या 2x bsa समाधान के १.२ मिलीलीटर की जरूरत होगी ।
  3. विशिष्ट उत्तेजना (fcγr crosslinking) शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मकों और कोशिकाओं को तैयार कर रहे हैं । क्रम में वे उत्तेजित हो जाएगा बर्फ पर ट्यूबों प्लेस ।
  4. एक ऑटोनमूना के साथ प्रवाह cytometers के लिए, साइटोमीटर एक नमूना विश्लेषण और अगले करने के लिए आगे बढ़ने के लिए ले जाता है कि समय का ध्यान रखना, किसी भी मिश्रण और जांच धोने कदम सहित (उदाहरण के लिए ३.५ मिनट).
    नोट: समय इस परख के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। हर हालत के लिए आदेश में अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा करने के लिए, उत्तेजना हर हालत के लिए सही समय (30 मिनट) के लिए बाहर किया जाना चाहिए । क्रम में कोशिकाओं को उत्तेजित और प्रवाह साइटोमीटर द्वारा नमूना अधिग्रहण के बीच अंतराल समय शामिल. उदाहरण के लिए, यदि साइटोमीटर के लिए आवश्यक समय एक नमूना का विश्लेषण करने के लिए और अगले करने के लिए आगे बढ़ना है ३.५ मिनट, क्रम में वे हर ३.५ मिनट का विश्लेषण किया जाएगा में कोशिकाओं को उत्तेजित.
  5. इस बिंदु पर मैन्युअल मुआवजा प्रदर्शन कर रहे हैं, तो क्षतिपूर्ति के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए नियंत्रण ट्यूबों को उत्तेजित (step 5.7.3). जोड़ें २०० μl के "2x जांच समाधान, हरी केवल" inducer युक्त (से ६.१) के रूप में चिह्नित ट्यूबों में "ग्रीन + inducer" (चरण 5.7.3). जोड़ें २०० μl के "2x जांच समाधान, ऑरेंज केवल" inducer युक्त (चरण ६.१) ट्यूबों में चिह्नित "नारंगी + inducer" (चरण 5.7.3).
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते, अंधेरे में 5% सह2 ।
  7. प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग, उत्पन्न और नियंत्रण के लिए 3 नमूना फ़ाइलें लेबल "unstained, unstained", "ग्रीन + inducer", और "नारंगी + inducer" नमूने, चैनल का संकेत करने के लिए सुनिश्चित कर रहा है/पैरामीटर विश्लेषण किया जा करने के लिए (fsc, SSC, FL1, FL2) और वांछित बंद शर्तें (१०० μl, 3 मिनट, आदि) । जनरेट करें और प्रायोगिक नमूनों के लिए फ़ाइलों का एक समान सेट लेबल ।
  8. "unstained, unstained" नमूना चलाएँ । fsc (x-अक्ष) बनाम एसएससी (y-अक्ष पर) के लिए एक डॉट प्लॉट खोलें और ब्याज की कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट ड्रा करें, मृत कोशिकाओं और मलबे को छोड़कर (मृत कोशिकाएं और मलबे मुख्य कोशिका आबादी की तुलना में बहुत छोटी घटनाएं हैं और प्लॉट के निचले बाएँ पर दिखाई देते हैं) ।
  9. इस "सेल" गेट का उपयोग करके, FL1 (x-अक्ष) बनाम FL2 (y-अक्ष) का एक और डॉट प्लॉट खोलें । एक प्रारंभिक क्वाड्रेंट गेट ड्रा । इस तरह के FL1 बनाम FL2 प्लॉट के निचले बाएँ वृत्त का चक्र पर दिखाई देते हैं ताकि वृत्त का द्वार को समायोजित करें ।
  10. "हरी + inducer" नमूना चलाएँ । वोल्टेज को समायोजित करें ताकि घटनाओं FL1 बनाम FL2 प्लॉट के निचले बाएँ और दाएँ quadrants पर दिखाई देते हैं । सभी 3 नमूना फ़ाइलों के लिए यह क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स लागू करें ।
  11. "नारंगी + inducer" नमूना चलाएँ । वोल्टेज समायोजित करें ताकि घटनाओं पर दिखाई देते हैं ऊपरी और निचले बाएँ quadrants FL1 बनाम FL2 प्लॉट. सभी 3 नमूना फ़ाइलों के लिए यह क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स लागू करें ।
  12. प्रत्येक मुआवजा फ़ाइल की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि "unstained, unstained" घटनाओं निचले बाएँ वृत्त का चक्र पर दिखाई देते हैं, "हरी + inducer" घटनाओं निचले बाएँ और दाएँ quadrants पर दिखाई देते हैं, और "ऑरेंज + inducer" घटनाओं FL1 बनाम ऊपरी और निचले बाएँ quadrants पर दिखाई देते हैं FL2 प्लॉट. सभी प्रयोगात्मक नमूना फ़ाइलों के लिए मुआवजा मैट्रिक्स लागू करें ।
    1. सुनिश्चित करें कि सभी प्रायोगिक नमूना फ़ाइलों के लिए क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स लागू करने से पहले सभी नियंत्रण नमूना फ़ाइलों के लिए उपयुक्त क्षतिपूर्ति लागू किया जाता है । रिप्रेजेंटेटिव डेटा के लिए आंकड़ा 2 का संदर्भ लें, जिसमें अनुत्कारित और सही ढंग से क्षतिपूर्ति नमूने हों ।
      नोट: कई cytometers मानक fitc/gfp चैनल के रूप में FL1 नामित (नीले ४८८ एनएम लेजर से उत्साहित है, और एक 530/30 फिल्टर सेट के साथ पता चला) और मानक पीई चैनल के रूप में FL2 (नीले ४८८ एनएम लेजर से उत्साहित है, और एक 585/40 फ़िल्टर सेट के साथ पता चला) । हम यह एक ही संमेलन लेकिन सावधानी नए प्रवाह cytometry उपयोगकर्ताओं को उनके प्रवाह cytometry कोर प्रबंधक के साथ परामर्श करने के लिए सुनिश्चित करें कि उनके cytometry इसी तरह विन्यस्त है और उपयुक्त चैनल इन जांच का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है के लिए उपयोग करते हैं । प्रवाह साइटोमीटर और साथ सॉफ्टवेयर के मॉडल पर निर्भर करता है, यह मुआवजा पहले या बाद में नमूनों का अधिग्रहण किया गया है करने के लिए संभव हो सकता है. यदि के बाद वास्तव में मुआवजा संभव है, मुआवजा कदम सभी प्रायोगिक नमूनों cytometer द्वारा अधिग्रहीत किया गया है के बाद किया जा सकता है । एक गतिशील रेंज है, जहां PMT वोल्टेज समायोजन की जरूरत नहीं है के साथ cytometers के लिए, एक मुआवजा प्रयोग भी एक अलग दिन और प्रयोगात्मक टेम्पलेट पर प्रदर्शन किया जा सकता है (मुआवजा मैट्रिक्स सहित) प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए बचाया जा सकता है मैनुअल मुआवजा ।
  13. एक बार मैनुअल मुआवजा प्रदर्शन किया गया है और एक प्रयोगात्मक टेम्पलेट प्राप्त की है, प्रायोगिक नमूनों का उपचार शुरू. सकारात्मक inducer या fcγr सेल उत्तेजना के साथ इलाज करने से पहले, मार्क जो ट्यूबों ROS अवरोध करनेवाला मिलता है । इस ROS अवरोधक के साथ इन कोशिकाओं का इलाज कम से 30 मिनट से पहले सकारात्मक inducer या fcγr उत्तेजना ।
  14. ROS अवरोधक जोड़ने के लिए, 5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता तैयार करने के लिए अवरोधक के 1 μl जोड़कर सस्पेंड कोशिकाओं के २०० μl (विरोधी bsa igg1के बिना) ।
  15. उत्तेजना (या सकारात्मक inducer) के साथ कोशिकाओं का इलाज और इस प्रकार के रूप में ROS जांच के साथ कोशिकाओं लोड:
    1. अप्रेरित कोशिकाओं के लिए: "दाग, अप्रेरित" लेबल सेल निलंबन के २०० μl के लिए किसी भी उत्तेजना के बिना 2x जांच समाधान के २०० μl जोड़ें ।
    2. सकारात्मक नियंत्रण के लिए: 2x सकारात्मक inducer समाधान के २०० μl जोड़ें (चरण ६.१ में तैयार) सेल निलंबन के २०० μl के लिए लेबल "सकारात्मक inducer" या "सकारात्मक inducer + अवरोधक".
    3. fcγr द्वारा प्रेरित कोशिकाओं के लिए क्रॉस-लिंकिंग (विशिष्ट उत्तेजना): 2x bsa समाधान के २०० μl जोड़ें (६.२ में तैयार) सेल निलंबन के २०० μl के लिए "fcγr xl" या "fcγr एक्स्ट्रा लार्ज + अवरोधक" लेबल ।
      नोट: एक नमूना और अगले के अधिग्रहण के बीच अंतराल समय है, जहां हर एक्स मिनट उत्तेजना जोड़कर नमूना विश्लेषण के बीच अंतराल समय को शामिल करने के लिए याद रखें.
  16. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते, अंधेरे में 5% सह2 । वे एक ऑटोसैंपलर के साथ सुसज्जित एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर प्रेरित किया गया क्रम में नमूनों का विश्लेषण. प्रारंभिक क्षतिपूर्ति चरणों के दौरान जनरेट किए गए विश्लेषण टेम्पलेट्स का उपयोग करें. विश्लेषण से पहले कोशिकाओं को न धोएं ।

7. प्रवाह cytometry डेटा विश्लेषण और प्रत्याशित परिणाम

  1. प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर के भीतर, प्रयोगात्मक नमूनों के लिए पहले से उत्पन्न विश्लेषण फ़ाइलें खोलें (टेम्पलेट्स चरण में जनरेट किया गया 6.7-6.12 और नमूने में चलाए गए थे कदम ६.१६). सुनिश्चित करें कि मैनुअल मुआवजे के प्रदर्शन से मुआवजा मैट्रिक्स सही ढंग से प्रयोगात्मक नमूनों के लिए लागू किया गया था ।
    नोट: के लिए फ्लो cytometers और प्रवाह cytometers सॉफ्टवेयर के बाद-तथ्य मुआवजे में सक्षम, मुआवजा मैट्रिक्स पहले प्रयोगात्मक नमूना फ़ाइलों के लिए लागू नहीं किया गया था, यह इस बिंदु पर लागू होते हैं.
  2. सही मैन्युअल क्षतिपूर्ति की पुष्टि करने के लिए इसी तरह, सुनिश्चित करें कि प्रायोगिक नमूनों के भीतर नियंत्रण अपेक्षा के अनुरूप व्यवहार करते हैं.
    1. सुनिश्चित करें कि "unstained, unstained" घटनाओं FL1 बनाम FL2 प्लॉट के निचले बाएँ वृत्त का चक्र पर दिखाई देगा, कि "सकारात्मक inducer" घटनाओं ऊपरी बाएँ में प्रतिदीप्ति में वृद्धि दिखा, ऊपरी दाएँ, और FL1 बनाम FL2 प्लॉट के निचले सही quadrants, और कि " सकारात्मक inducer + ROS अवरोधक "घटनाओं ऊपरी बाएँ में प्रतिदीप्ति में कमी दिखाने के लिए, ऊपरी दाएँ, और FL1 बनाम FL2 प्लॉट की कम सही quadrants" सकारात्मक inducer "नमूना के साथ मनाया प्रतिदीप्ति की तुलना में.
    2. यदि प्रयोगात्मक नमूनों के भीतर नियंत्रण किसी भी वृद्धि की प्रतिदीप्ति नहीं दिखा, जांच करें कि सभी परख कदम प्रदर्शन किया गया था, उचित पीढ़ी और अस्थि मज्जा के भड़काना की पुष्टि-मैक्रोफेज व्युत्पंन (2.7-2.19), और प्रयोग दोहराएं । यदि प्रायोगिक नमूनों के भीतर नियंत्रण अपेक्षित रुझान दिखाने के लिए, प्रयोगात्मक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ना fcγr के माध्यम से प्रेरित (चित्रा 3a).
  3. सत्यापित करें कि fcγr-विशिष्ट उत्तेजना उचित रूप से कार्य कर रहा है । एक C57BL/6j wt माउस से निंनलिखित नमूने भागो: "unstained, अप्रेरित", "दाग, अप्रेरित", "दाग, fcγr के माध्यम से उत्तेजित", और "दाग, fcγr के माध्यम से उत्तेजित + ROS अवरोधक" । ये क्रमशः धारा 4 में 4.2 a, 4.2 b, 4.2 e और 4.2 f के नमूनों के अनुरूप हैं ।
    1. सुनिश्चित करें कि "unstained, अप्रेरित" घटनाओं FL1 बनाम FL2 प्लॉट के निचले बाएं वृत्त का चक्र पर दिखाई देगा, कि "दाग, अप्रेरित" घटनाओं भी FL1 बनाम FL2 प्लॉट के निचले बाएं वृत्त का चक्र पर दिखाई देगा, कि "सना हुआ, fcγr घटनाओं के माध्यम से उत्तेजित" ऊपरी बाएँ में बढ़ी हुई प्रतिदीप्ति दिखाएँ, ऊपरी दाएँ, और FL1 बनाम FL2 प्लॉट के निचले दाएँ quadrants, और कि "दाग, fcγr + ROS अवरोधक के माध्यम से उत्तेजित" घटनाओं ऊपरी बाएँ में घटी हुई प्रतिदीप्ति दिखाएगा, ऊपरी दाएँ, और निचले दाएँ FL1 बनाम FL2 साजिश के quadrants "दाग, fcγr के माध्यम से प्रेरित" नमूना (चित्रा 3a) की तुलना में ।
    2. इन अपेक्षाओं को पूरा नहीं कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, "दाग, fcγr के माध्यम से प्रेरित" नमूना "सना हुआ, अप्रेरित" नमूना, या "दाग, अउत्तेजित" नमूना पहले से ही स्पष्ट रूप से पता चलता है की तुलना में कम या कोई वृद्धि प्रतिदीप्ति दिखाता है प्रतिदीप्ति के स्तर में वृद्धि की तुलना में "unstained, अप्रेरित" नमूना, जांच करें कि सभी परख कदम ठीक से प्रदर्शन किया गया, उचित पीढ़ी, भड़काना, और bmdms (2.7-2.19) के हैंडलिंग, और प्रयोग को दोहराने की पुष्टि । यदि इन अपेक्षाओं को पूरा कर रहे हैं, प्रयोगात्मक नमूनों के बाकी के विश्लेषण के लिए आगे बढ़ना.
      नोट: एक लॉग FL2 (Y-अक्ष) बनाम एक लॉग FL1 (एक्स-अक्ष) के ऊपरी दाएँ और निचले सही quadrants में दिखाई देगा जो हरे रंग की जांच (हाइड्रोजन पेरोक्साइड, peroxynitrite, हाइड्रोक्सिल कण, नाइट्रिक ऑक्साइड, परॉक्सि कण, आदि) के साथ प्रतिक्रिया कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले सेल डॉट प्लॉट । ROS जो ऑरेंज प्रोब (मोटे तौर पर नहीं बल्कि विशेष रूप से superoxide) के साथ प्रतिक्रिया का उत्पादन कोशिकाओं को एक लॉग FL1 (एक्स-अक्ष) बनाम एक लॉग FL2 (Y-अक्ष) डॉट प्लॉट के दो ऊपरी quadrants में दिखाई देगा ।
  4. व्यक्तिगत हिस्टोग्राम उत्पन्न, ब्याज की कोशिकाओं पर gated, FL1 और FL2 प्रतिदीप्ति के विश्लेषण के लिए. "unstained, अप्रेरित" नमूने का उपयोग कर, एक हिस्टोग्राम मार्कर इस तरह है कि सभी "unstained, अप्रेरित" घटनाओं इस मार्कर के बाईं ओर प्रकट उत्पन्न करते हैं । प्रायोगिक नमूनों (चित्रा 3b) के बाकी के लिए मार्कर के साथ इस भूखंड लागू करें ।
  5. प्रत्येक ROS जांच के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्रयोग के परिणाम प्रस्तुत करने या उत्तेजित नमूनों की माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (mfi) दिखा कर नियंत्रण बनाम (चित्रा 3c) ।

8. सेल सतह ROS उत्पादन के प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ संयोजन में धुंधला (वैकल्पिक)

नोट: यह चरण fcγr और ROS मापन की उत्तेजना से पहले एक सेल-सतह मार्कर के साथ मैक्रोफेज धुंधला करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है । यह मिश्रित कोशिका आबादी में ROS उत्पादन का आकलन करने में उपयोगी हो सकता है । यह एक उचित फ्लुओर कि ऑक्सीडेटिव तनाव या सुपरऑक्साइड का पता लगाने अभिकर्मकों से प्रतिदीप्ति के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है के लिए संयुग्मित मैक्रोफेज सतह मार्कर के लिए एक एंटीबॉडी का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल में, एक एंटीबॉडी के लिए माउस F4/80 संयुग्मित करने के लिए Alexa फ्लुओर ६४७ किया जाता है ।

  1. bmdms उत्पंन, फसल और उंहें प्रधानमंत्री के रूप में पहले वर्णित (1 अनुभाग और 2) ।
    नोट: नीचे वर्णित सभी प्रयोगात्मक नियंत्रणों और शर्तों को पूरा करने के लिए न्यूनतम तीन 6 सेमी प्लेट्स की आवश्यकता होती है । एक थाली विरोधी bsa igg1 के साथ इलाज किया जाएगा, जबकि सीरम भूखे जबकि अंय दो प्लेटें untreated छोड़ दिया जाएगा ।
    1. 4 प्रयोगात्मक नियंत्रण जो प्रवाह cytometric क्षतिपूर्ति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा शामिल करें (प्रति प्रयोग):
      a) रहित और अप्रेरित कोशिकाएं ।
      ख) ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने अभिकर्मक (हरी अभिकर्मक) और ROS inducer के साथ इलाज किया कोशिकाओं ।
      ग) सुपरऑक्साइड का पता लगाने अभिकर्मक (ऑरेंज अभिकर्मक) और ROS inducer के साथ इलाज किया कोशिकाओं ।
      घ) केवल विरोधी माउस F4 के साथ दाग कोशिकाओं ६४७ Alexa को संयुग्मित 80 ।
    2. प्रत्येक माउस या जैविक प्रतिकृति के लिए, निंन 3 शर्तें शामिल हैं:
      a) F4/80 के साथ दाग और अप्रेरित वाम
      ख) F4/80 के साथ दाग और fcγr के माध्यम से सक्रिय
      c) F4/80 के साथ दाग और fcγr के माध्यम से सक्रिय और ROS अवरोधक के साथ इलाज
  2. रात भर मैक्रोफेज भड़काना के बाद, महाप्राण । कोशिकाओं को एक बार पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर के साथ धोएं । सीरम ने मीडिया को कम सीरम डम्म की ही मात्रा के साथ बदलकर कोशिकाओं को भूखा कर दिया. प्रत्येक माउस के लिए, एक थाली विरोधी bsa igg1 के साथ इलाज किया जाएगा, जबकि सीरम भूख से मर, जबकि अंय दो प्लेटें untreated छोड़ दिया जाएगा । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2पर 4 एच के लिए प्लेटें सेते हैं ।
  3. सीरम भूखे रहने के बाद, कोमल scraping द्वारा कोशिकाओं फसल या pbs में ०.२ मिमी edta का उपयोग करके । लेबल 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों में प्रत्येक थाली ले लीजिए और उन्हें ७५० एक्स जी के लिए 5 मिनट के लिए अपकेंद्रितएक पर नज़र रखने के लिए जो कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया था मूरीन विरोधी bsa igg1.
  4. धोने सेल छर्रों एक बार pbs के 1-2 मिलीलीटर के साथ इलाज किया कोशिकाओं से किसी भी अवशिष्ट विरोधी bsa से छुटकारा पाने के लिए.
  5. थाली से सेल छर्रों में से एक resuspend जो विरोधी नहीं मिला-bsa कम सीरम dmem के ६०० μl में1 igg । इन कोशिकाओं को सेल सतह दाग के अधीन नहीं किया जाएगा । मुआवजा नियंत्रण के लिए इन का उपयोग करें । aliquot इस सेल निलंबन के २०० μl में (3) 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों लेबल एक) unstained, अप्रेरित बी) ग्रीन ऑक्सीडेटिव तनाव अभिकर्मक + ros inducer, सी) ऑरेंज सुपरऑक्साइड पता लगाने अभिकर्मक + ros inducer ।
  6. प्लेट जो विरोधी bsa igg1, प्रवाह cytometry धुंधला (pbs + ०.१% fbs) के ३०० μl में नहीं मिला से सेल छर्रों में से एक resuspend । aliquot १०० μl में इस सेल निलंबन (2) 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के साथ धुंधला के लिए Alexa ६४७ विरोधी माउस F4/
  7. प्लेट जो विरोधी bsa igg1 प्रवाह cytometry धुंधला बफर के ३०० μl में प्राप्त से सेल छर्रों resuspend । aliquot १०० μl में इस सेल निलंबन (2) 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के साथ धुंधला के लिए Alexa ६४७ विरोधी माउस F4/
  8. दाग कोशिकाओं, जो ८.६ और ८.७ में एलिकोटेड थे, Alexa ६४७ विरोधी के 5 μl के साथ, बर्फ पर 30 मिनट के लिए, अंधेरे में F4/
  9. धुंधला करने के बाद, ७५० एक्स जीमें 2 मिलीलीटर पीबीएस और सेंटिफ़ेज जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, महाप्राण को ले लें, और फेनॉल रेड के बिना कम सीरम dmem के २०० μl में प्रत्येक ट्यूब resuspend । अकेले दाग FL4 नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए एक अस्वास्थ्यकर ट्यूब अलग सेट करें । अनुभाग ३.९, ३.१०, ६.१, ६.२ और ६.१४ में दर्शाए अनुसार प्रोब्स, प्रेरक, fcγr उत्तेजना और ROS inhibitors तैयार करें ।
    1. कोशिकाओं के लिए नहीं प्राप्त विरोधी bsa igg1, लेबल ट्यूबों निंनलिखित के साथ: a) कोई उत्तेजना या ख) ROS inducer ।
    2. कोशिकाओं के लिए जो विरोधी bsa igg1, निंनलिखित के साथ लेबल प्राप्त: एक) एफसी एक्स्ट्रा लार्ज या बी) एफसी एक्स्ट्रा लार्ज + अवरोधक ।
  10. नमूनों को प्रोत्साहित करने के लिए उनके संबंधित उपचार के अनुसार मुआवजे के लिए इस्तेमाल किया जा के रूप में 6.5-6.6 में संकेत दिया, क्रम में है कि वे प्रवाह cytometer पर पढ़ा जाएगा, एक नमूना और अगले के अधिग्रहण के बीच में अंतराल समय शामिल ।
  11. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते, अंधेरे में 5% सह2 । वे एक ऑटोसैंपलर के साथ सुसज्जित एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर प्रेरित किया गया क्रम में नमूनों का विश्लेषण.
  12. धारा 7 में वर्णित के रूप में 6.7-6.12 और डेटा विश्लेषण में वर्णित के रूप में मैन्युअल क्षतिपूर्ति निष्पादित करें ।
  13. प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग, उत्पन्न और लेबल नियंत्रण के लिए 4 नमूना फ़ाइलें "unstained, unstained", "ग्रीन + inducer", "नारंगी + inducer" और "F4/80 दाग" नमूने, का संकेत करने के लिए सुनिश्चित कर रहा है चैनलों/मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए (fsc, SSC, FL1, FL2, FL4) और वांछित बंद शर्तों (१०० μl, 3 मिनट, आदि) ।
  14. नमूने चलाएं और मैंयुअल क्षतिपूर्ति करने के लिए डॉट प्लॉट जनरेट करें ।
    1. सेल सतह धुंधला करने के लिए, दो अतिरिक्त भूखंडों उत्पन्न: FL1 (एक्स-अक्ष) बनाम FL4 (y-अक्ष) और FL2 (एक्स-अक्ष) बनाम FL4 (y-अक्ष). यह सुनिश्चित करने के लिए voltages को समायोजित करें कि चित्र 7aमें दर्शाए अनुसार उचित क्षतिपूर्ति लागू की जाए. एक बार सभी मुआवजा ठीक से किया गया है, प्रयोगात्मक नमूना फ़ाइलों के सभी के लिए मुआवजा मैट्रिक्स लागू.
  15. एक बार जब मैनुअल क्षतिपूर्ति किया गया है और एक प्रयोगात्मक टेम्पलेट प्राप्त की है, के रूप में दिखाया प्रयोगात्मक नमूनों का इलाज शुरू में 6.13-6.15.3 और ६.१६ में वर्णित के रूप में एक प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने प्राप्त.

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Representative Results

भीतर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम fcγr के माध्यम से wt C57BL/6j bmdms की उत्तेजना से उत्पन्न आरओएस उत्पादन के प्रवाह cytometric पता लगाने के प्रतिनिधि डेटा पेश करते हैं । उम्मीद के रूप में, हम अप्रेरित कोशिकाओं में पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर FL1 या FL2 प्रतिदीप्ति में न्यूनतम परिवर्तन का निरीक्षण (चित्रा 3a, तुलना "दाग, अप्रेरित" बनाम "unदाग, अप्रेरित" डॉट भूखंडों). हम FL1 और FL2 प्रतिदीप्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि का निरीक्षण जब कोशिकाओं fcγr पार जोड़ने के एजेंट के साथ प्रेरित कर रहे हैं (चित्रा 3a, तुलना "दाग और एफसी पार से जोड़ने के लिए प्रेरित" नमूने बनाम "दाग, अप्रेरित" डॉट भूखंडों). अंत में, जब कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया ROS अवरोधक से पहले fcγr पार जोड़ने के लिए, इस वृद्धि की प्रतिदीप्ति बेसल स्तर पर वापस लाया जाता है (चित्रा 3a, तुलना "दाग और ROS अवरोधक के साथ इलाज और एफसी पार से प्रेरित-जोड़ने" बनाम "दाग और एफसी पार से जोड़ने "डॉट भूखंडों) के माध्यम से प्रेरित । यह भी स्पष्ट है जब डेटा प्रत्येक चैनल के लिए एक हिस्टोग्राम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (चित्रा 3b) या जब डेटा या तो हरे या नारंगी ROS जांच के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (चित्रा 3b). एक समान प्रवृत्ति भी स्पष्ट है जब डेटा mfi के रूप में प्रस्तुत किया है, हालांकि आरओएस अवरोधक के साथ पूर्व उपचार के साथ ऑरेंज प्रतिदीप्ति में कमी के रूप में अच्छी तरह से जब mfi के रूप में एक प्रतिशत (चित्रा 3c) के रूप में प्रस्तुत कब्जा नहीं किया है । हम विभिन्न दिनों में किए गए 3 स्वतंत्र प्रयोगों के परिणाम भी प्रस्तुत करते हैं (चित्र 3, प्रयोग 1, 2 और 3). माध्य का औसत मान और समांतर मानक त्रुटि रेखांकन (चित्र 3c) में दर्शाई गई है ।

हम भी असफल प्रयोग मौजूद है, जहां उप इष्टतम fcγr उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में ROS उत्पादन मनाया गया (चित्रा 4) । FL1 और FL2 प्रतिदीप्ति में एक न्यूनतम वृद्धि का पता लगाया गया था जब तुलना "दाग और एफसी क्रॉस-लिंकिंग के माध्यम से प्रेरित" नमूने बनाम "दाग, अप्रेरित" नमूने (चित्रा 4a, बी, सी). यह अपेक्षित प्रतिशत या mfi बढ़ाता है और असफल प्रयोग में स्वीकार्य मान के बीच बड़े अंतर को हाइलाइट करने के लिए एक सफल प्रयोग के साथ प्रस्तुत किया है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक 24 ज भड़काना कदम का इस्तेमाल करता है । जब एक ४८ एच के समय भड़काना बनाम 24 एच की तुलना, हम हरे, ऑक्सीडेटिव तनाव अभिकर्मक के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत में कोई उल्लेखनीय अंतर मनाया (चित्रा 5a, शीर्ष हिस्टोग्राम और चित्रा 5a ग्रीन जांच,% सकारात्मक) । हालांकि, ४८ ज करने के लिए भड़काना समय बढ़ाने ऑरेंज प्रतिदीप्ति के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि (चित्रा 5a, कम हिस्टोग्राम और चित्रा 5a ऑरेंज जांच,% सकारात्मक) । यह उसी तरह परिलक्षित हुआ जब डेटा mfi के रूप में प्रस्तुत किया गया था । यह पता चलता है कि सभी ROS प्रजातियों के इष्टतम पता लगाने के लिए, एक ४८ एच भड़काना समय अधिक आदर्श हो सकता है ।

यह देखते हुए कि, लागत या प्रयोग के लिए समय की जरूरत के कारण, एक किट के उपयोग के लिए इस परख प्रदर्शन एक विकल्प नहीं हो सकता है । इस कारण से, हम भी किट में उपलब्ध कराए गए उन लोगों के लिए इसी तरह के घटकों का परीक्षण किया और मानक विक्रेताओं से इन खरीदा (थर्मफिशर, emd millipore, केमैन). हम पाते है कि व्यक्तिगत रूप से प्राप्त घटकों और सेल लदान और fcγr उत्तेजना के लिए एक ही प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम एक ही निष्कर्ष हम किट (चित्रा 6a, बी) का उपयोग कर मनाया के कई दोहराऊंगा कर सकते हैं । हालांकि, हालांकि प्रतिदीप्ति में वृद्धि उत्तेजना के साथ स्पष्ट थे, ROS उत्पादन के एक उच्च स्तर किट का उपयोग कर मनाया गया । इसका संकेत हो सकता है कि व्यक्तिगत रूप से प्राप्त घटकों का उपयोग संभव हो सकता है लेकिन आगे इस विशिष्ट परख के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी ।

अंत में, हम दर्शाते है कि यह भी इन ROS जांच के साथ सेल सतह धुंधला गठबंधन करने के लिए संभव है । हम एक ज्ञात मैक्रोफेज मार्कर, F4/80 का उपयोग, Alexa ६४७ करने के लिए संयुग्मित और ros अवरोधक, ros inducer, या ros उत्पादन प्रेरित करने के लिए विशिष्ट उत्तेजकों के साथ इलाज करने से पहले सेल सतह धुंधला प्रदर्शन करते हैं । हम आंकड़ा 7b में प्रदर्शित करता है कि मैक्रोफेज जब fcγr crosslinking एजेंट और fcγr crosslinking एजेंट + ROS अवरोधक (चित्रा 7b, ऑरेंज बनाम ग्रीन डॉट भूखंडों) के साथ इलाज की उम्मीद के रूप में प्रतिक्रिया. इसके अलावा, हम वृद्धि हुई नारंगी या हरे रंग की प्रतिदीप्ति विशेष रूप से F4/80 fcγr crosslinking एजेंट के साथ उपचार पर लेबल कोशिकाओं द्वारा उत्पंन निरीक्षण कर सकते है और पूर्व के साथ कम ROS अवरोधक के साथ उपचार (चित्रा 7बी, F4/ F4/80 बनाम ऑरेंज डॉट भूखंडों) ।

Figure 1
चित्र 1: प्रवाह bmdms के उपयुक्त उत्पादन के cytometric मूल्यांकन । जंगली प्रकार bmdms उत्पंन किया गया था और या तो unstained छोड़ दिया या fitc विरोधी के साथ दाग माउस F4/80 या Alexa ६४७ विरोधी माउस CD11b. fsc (एक्स-अक्ष) बनाम एसएससी (y-अक्ष) भूखंडों उत्पन्न किया गया और मैक्रोफेज (bmdms) मृत कोशिकाओं और मलबे को बाहर करने के लिए gated थे. fsc-H (x-अक्ष) बनाम fsc-a (y-अक्ष) के प्लॉट का उपयोग करके, एक सिंगलेट गेट जनरेट किया गया । सिंगलेट्स पर Gating, हिस्टोग्राम आइसोटाइप दाग नियंत्रण की तुलना में या तो fitc F4/80 या apc CD11b के साथ दाग कोशिकाओं को दिखाने के लिए उत्पन्न किया गया था । एक) CD11b या F4/80 के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं के अधिक से अधिक ९५% के साथ भेदभाव सही bmdm । ख) गलत bmdm भेदभाव जहां कोशिकाओं की तुलना में कम ९५% F4/80 और 2 चोटियों के लिए सकारात्मक धुंधला कर रहे है CD11b के लिए मौजूद हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2. हरी और नारंगी ROS जांच का उपयोग करते समय क्षतिपूर्ति प्रदर्शन । मुआवजा unstained इलाज कोशिकाओं की आवश्यकता होगी, हरे रंग की ros जांच के साथ दाग कोशिकाओं और ros inducer के साथ इलाज किया, और ऑरेंज ros जांच के साथ दाग कोशिकाओं और ros inducer के साथ इलाज किया । बिना दाग वाले कोशिकाओं के लिए डॉट भूखंडों का उपयोग क्वाड्रेंट गेट्स को निर्धारित करने के लिए किया जाता है । कोशिकाओं के लिए डेटा अकेले या तो ग्रीन ros जांच या ऑरेंज ros जांच के साथ दाग और ros inducer के साथ इलाज से पहले दिखाए जाते हैं, और बाद, मुआवजा लागू किया गया था । मुआवजा मैट्रिक्स तो सभी बाद प्रयोगात्मक नमूनों के लिए लागू किया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3. विशिष्ट fcγr उत्तेजना का उपयोग कर हरे और नारंगी ros जांच और परख reproducibility के आकलन के जवाब में ROS की माप । जंगली प्रकार की अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (bmdms) उत्पन्न, primed थे, और या तो unstained या हरे और नारंगी ROS जांच के एक कॉकटेल के साथ दाग छोड़ दिया गया । दाग bmdms या तो इलाज छोड़ दिया गया था, उनके fcγrs के माध्यम से प्रेरित मुरीने विरोधी bsa igg1 + bsa 30 मिनट के लिए, या ROS अवरोध करनेवाला के साथ इलाज के लिए fcγr पार से जोड़ने के माध्यम से उत्तेजना से पहले । एक) डॉट भूखंडों, ऊपरी बाएँ में कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि दिखा रहा है, ऊपरी दाएँ, और कम सही quadrants पर विशिष्ट fcγr उत्तेजना, जो ROS अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में कम है. ख) प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के हिस्टोग्राम, प्रत्येक जांच के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए मार्कर गेट दिखा रहा है । ग) प्रत्येक जांच के लिए या mfi में वृद्धि के रूप में सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में डेटा की प्रस्तुति । तीन स्वतंत्र, प्रतिनिधि प्रयोग प्रस्तुत कर रहे हैं । मतलब के 3 प्रयोगों और मानक त्रुटियों के लिए मतलब रेखांकन के भीतर लाइनों के रूप में दिखाया जाता है । fc XL, fc क्रॉस-लिंकिंग; एनएसी, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4. सफल और सबऑप्टिमल fcγr उत्तेजना के उदाहरण । जंगली प्रकार की अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (bmdms) उत्पन्न, primed थे, और या तो unstained या हरे और नारंगी ROS जांच के एक कॉकटेल के साथ दाग छोड़ दिया गया । दाग bmdms या तो इलाज छोड़ दिया गया था, उनके fcγrs के माध्यम से प्रेरित मुरीने विरोधी bsa igg1 + bsa 30 मिनट के लिए, या ROS अवरोध करनेवाला के साथ इलाज के लिए fcγr पार से जोड़ने के माध्यम से उत्तेजना से पहले । सफल और सबऑप्टिमल उत्तेजना के लिए प्रतिनिधि परिणाम एक) डॉट भूखंडों के रूप में दिखाए जाते हैं, ख) हिस्टोग्राम, या सी) प्रत्येक जांच के लिए या mfi में वृद्धि के रूप में सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत । सफल उत्तेजना ऊपरी बाएँ में प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, ऊपरी दाएँ और निचले दाएँ FL1 बनाम FL2 प्लॉट और बढ़ी हुई mfi और सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के quadrants fcγr उत्तेजना पर प्रत्येक जांच के साथ दाग से पता चलता है. suboptimal उत्तेजना mfi में ंयूनतम वृद्धि या सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत से पता चलता है । fc XL, fc क्रॉस-लिंकिंग; एनएसी, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. fcγr उत्तेजना पर ROS पीढ़ी पर भड़काना समय का प्रभाव । bmdms जनरेट किया गया, या तो 24 या ४८ एच के लिए primed, और या तो unstained या हरी और नारंगी ROS जांच के एक कॉकटेल के साथ दाग छोड़ दिया गया । दाग bmdms या तो इलाज छोड़ दिया गया था, उनके fcγrs के माध्यम से प्रेरित मुरीने विरोधी bsa igg1 + bsa 30 मिनट के लिए, या ROS अवरोध करनेवाला के साथ इलाज के लिए fcγr पार से जोड़ने के माध्यम से उत्तेजना से पहले । A) एकजांच द्वारा प्रेरित प्रतिदीप्ति के लिए हिस्टोग्राम मैक्रोफेज की उत्तेजना पर या तो 24 या ४८ एच. बी) के लिए primed कोशिकाओं के प्रतिशत की उत्तेजना पर प्रत्येक जांच के लिए सकारात्मक मैक्रोफेज के लिए primed या तो 24 या ४८ एच. भड़काना मैक्रोफेज के लिए ४८ h ऑरेंज प्रतिदीप्ति के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि हुई (या FL2 चैनल के लिए mfi में वृद्धि) 24 एच के लिए मैक्रोफेज भड़काना की तुलना में । मतलब के 3 प्रयोगों और मानक त्रुटियों के लिए मतलब रेखांकन के भीतर लाइनों के रूप में दिखाया जाता है । fc XL, fc क्रॉस-लिंकिंग; एनएसी, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. fcγr क्रॉस- अलग विक्रेताओं से अभिकर्मकों का उपयोग कर जोड़ने पर cytometric ROS मापन प्रवाह । bmdms जनरेट किया गया, 24 एच के लिए primed, और या तो unstained या ऑक्सीडेटिव तनाव और सुपरऑक्साइड जांच जांच की एक कॉकटेल के साथ दाग छोड़ दिया गया । दाग bmdms या तो इलाज छोड़ दिया गया था, ros inducer के साथ उत्तेजित, उनके fcγrs के माध्यम से प्रेरित मुरीन विरोधी-bsa igg1 + bsa 30 मिनट के लिए, या ROS अवरोधक के साथ इलाज के लिए fcγr के माध्यम से उत्तेजना से पहले पार जोड़ने । जांच, ros inducer और ros अवरोध करनेवाला किट से या तो इस्तेमाल किया गया था या अलग से विभिंन विक्रेताओं से खरीदे थे और एक समान एकाग्रता में इस्तेमाल किया । क) डॉट भूखंडों किट और गैर किट घटकों का उपयोग कर प्राप्त परिणामों की एक साथ-साथ तुलना दिखा । ख) किट और गैर किट घटकों का उपयोग कर प्राप्त परिणामों की एक पक्ष द्वारा साइड तुलना दिखा हिस्टोग्राम. fc XL, fc क्रॉस-लिंकिंग; एनएसी, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. fcγr पार से जोड़ने पर ROS उत्पादन के प्रवाह cytometric माप के साथ सेल सतह दाग का मेल । क) विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनल unstained या अकेले दाग मुआवजा नियंत्रण का उपयोग कर के लिए डॉट भूखंडों । जंगली प्रकार bmdms उत्पन्न, 24 एच के लिए primed थे, और या तो unstained छोड़ दिया गया, Alexa के साथ दाग ६४७ विरोधी माउस F4/केवल, हरे रंग की आरओएस जांच के साथ दाग केवल और ros inducer के साथ इलाज किया, या केवल ऑरेंज ros जांच के साथ दाग और ros inducer के साथ इलाज । बिना दाग वाले कोशिकाओं के लिए डॉट भूखंडों का उपयोग क्वाड्रेंट गेट्स को निर्धारित करने के लिए किया जाता है । यदि चैनल्स सही रूप से क्षतिपूर्ति हैं, तो प्लॉट अपेक्षित परिणाम प्रदर्शित करता है । इसके बाद सभी प्रायोगिक नमूनों पर क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स लागू किया गया । ख) जंगली प्रकार bmdms उत्पंन, 24 एच के लिए primed और Alexa ६४७ विरोधी के साथ दाग-माउस F4/ इसके बाद, bmdms या तो अप्रेरित छोड़ दिया गया था, उनके fcγrs के माध्यम से प्रेरित मुरीन विरोधी bsa igg1 + bsa 30 मिनट के लिए, या ROS अवरोध करनेवाला के साथ इलाज के लिए fcγr पार से जोड़ने के माध्यम से उत्तेजना से पहले । डॉट भूखंडों का प्रदर्शन है कि विशेष रूप से F4/80 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित हरे या नारंगी प्रतिदीप्ति का पता लगाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

dcfh2-डीए और DHE-ROS का पता लगाने आधारित एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक है14,15। उपयोग की आसानी और गतिज माइक्रोप्लेट स्वरूपों के लिए इन ROS जांच के अनुकूलनशीलता, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometric विश्लेषण उनकी लोकप्रियता में योगदान दिया है । हालांकि, fcγr के हमारे अध्ययन में-mediated मैक्रोफेज कार्यों, वहां fcγr पार से जुड़े कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए इस परख प्रदर्शन के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रतीत नहीं हुआ । विश्लेषण की प्रतिक्रियाशील प्रकृति को देखते हुए मूल्यांकन किया जा रहा है, हमने पाया है कि समय पर यह सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण महत्व का है कि पुनरुद्दयता प्राप्त की है । यद्यपि हमने काइनेटिक माइक्रोप्लेट assays का प्रदर्शन किया है, फिर भी प्रयोग से प्रतिदीप्ति की तीव्रता में व्यापक परिवर्तनशीलता हो सकती है, जिससे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए जैविक प्रतिकृति बनाना कठिन हो सकता है । इन जांच के प्रवाह cytometric उपयोग "ROS सकारात्मक" कोशिकाओं जो इन मुद्दों में से कुछ का निराकरण करता है लेकिन जटिलताओं के बिना नहीं है के परिमाणन के लिए अनुमति देता है । यह विशेष रूप से सच है जब एक प्रवाह cytometer एक ऑटोनमूना के साथ सुसज्जित का उपयोग कर । इस मामले में, नमूनों की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण कोशिकाओं को विभिन्न उत्तेजको के संपर्क में हैं समय की मात्रा को प्रभावित करेगा. इसे कम करने के लिए, हमने प्रोटोकॉल में नमूना विश्लेषण के बीच अंतराल समय को शामिल किया है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि विश्लेषण कोशिकाओं पर समय की एक समान राशि के लिए प्रेरित किया जाता है ।

प्रवाह cytometric ROS विश्लेषण में एक और महत्वपूर्ण कारक उचित नियंत्रण का समावेश है । यह अतिरंजित नहीं किया जा सकता है कि हर प्रयोग में (कम) सभी प्रयोगात्मक और मुआवजा नियंत्रण हम इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध होना चाहिए । ये प्रत्येक प्रयोग की वैधता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में नमूनों को बाहर ंयायतापूर्वक अगर जरूरत सक्षम हो । इस के कुछ उदाहरणों में शामिल है यदि मैक्रोफेज अंतर नहीं था/परिपक्व उचित रूप से और बहुत कम ROS उत्पादन भी inducer उपचार के साथ प्रदर्शन किया । एक और मामला मैक्रोफेज के अनुचित सक्रियण भी fcγr पार से जोड़ने से पहले हो सकता है, एक उच्च बेसल ROS संकेत में जिसके परिणामस्वरूप । फ्लोरोसेंट संकेतों के गायब दिखा विशिष्ट fcγr पार जोड़ने के साथ संयोजन के रूप में ROS inhibitors का उपयोग एक और महत्वपूर्ण नियंत्रण हम अक्सर अंय समान assays प्रदर्शन के अध्ययन में कमी पाया है । इस अध्ययन में प्रयुक्त ROS अवरोधक, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन, एक सार्वभौमिक ROS अवरोधक के रूप में माना जाता है । हालांकि, अगर एक विशिष्ट एंजाइमों द्वारा उत्पादित ros में रुचि है, अंय विशिष्ट ros inhibitors के रूप में अच्छी तरह से परख में शामिल किया जा सकता है । कुछ उदाहरणों में मेफानामिक एसिड (साइक्लोऑक्सीजेनेस-निर्भर ros अवरोधक), एपॉसिनिन (nadph oxidase-निर्भर ros अवरोधक), या एलोप्यूरिनॉल (एक xanthine oxidase-निर्भर ros अवरोधक) शामिल हैं ।

यह इसके अलावा क्या वास्तव में इस readout में मापा जा रहा है समझने के लिए महत्वपूर्ण है । जैसा कि पहले उल्लेख किया, dcfh2-डीए कई ros प्रजातियों के उपाय, और इसलिए, हरी जांच से उत्पंन प्रतिदीप्ति एक और14से एक ROS प्रजातियों भेदभाव नहीं किया जा सकता है । इसी तरह, नारंगी जांच (संभावना DHE), हालांकि अक्सर विशेष रूप से सुपरऑक्साइड के रूप में उद्धृत, दोनों सुपरऑक्साइड-विशिष्ट और सुपरऑक्साइड-स्वतंत्र ऑक्सीकरण उत्पादों, जो एचपीएलसी जैसे अतिरिक्त तकनीकों के उपयोग के बिना प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता का उत्पादन कर सकते हैं 15. हालांकि, श्वसन फट के दौरान "कुल ros" या "प्रेरित ros" को मापने के प्रयोजनों के लिए, उचित नियंत्रण के साथ इन जांच का उपयोग स्वीकार्य हो सकता है । कई नए फ्लोरोसेंट आधारित ROS सेंसर उभरा है या11,13विकसित किया जा रहा है । कुछ, इस तरह के रूप में redox-संवेदी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, उनके प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण के कारण ROS उत्पादन की एक गतिशील माप का लाभ है । हालांकि, इन कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता होगी, जो हमेशा संभव नहीं हो सकता है या वांछित । कई मामलों में, फ्लोरोसेंट जांच आधारित ROS पता लगाना अभी भी एक वैध और उपयोगी उपकरण है, जब तक प्रयोग मानकीकृत है, अच्छी तरह से नियंत्रित है, और इस तरह के प्रयोगों से प्राप्त निष्कर्ष अतिरंजित नहीं कर रहे हैं ।

इस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ros किट का उपयोग करने के लिए लाभ यह है कि सभी आवश्यक अभिकर्मकों सहित ros inducers, scavengers, और titrated जांच शामिल है और "तैयार करने के लिए उपयोग" । यदि प्रयोग की अवधि के लिए संक्षिप्त होना प्रत्याशित है (एक सप्ताह के भीतर पूरा), इस किट के प्रवाह cytometry के प्रदर्शन के लिए एक अधिक लागत प्रभावी तरीका प्रदान कर सकते है-के लिए खरीदने या प्रत्येक विशिष्ट घटक व्यक्तिगत अनुकूलन की आवश्यकता के बिना आधारित ROS पता लगाने । हम इसके अलावा एक विशिष्ट एगोनिस्ट (fcγr उत्तेजना) के साथ इस किट का उपयोग कर प्रदर्शन और प्रयोगों भर में पुनरुत्पादन का प्रदर्शन; हम ROS पीढ़ी पर भड़काना समय के प्रभाव का आकलन; हम विभिन्न कंपनियों से समान जांच, अवरोही, और inducers का उपयोग कर की तुलना; हम असफल प्रयोग के उदाहरण प्रदान करते हैं; और अंत में, हम इन ROS जांच के उपयोग के साथ सेल सतह धुंधला गठबंधन । यह संभवतः एक मिश्रित जनसंख्या के भीतर विभिंन प्रकार के सेल से ROS के एक साथ पता लगाने के लिए अनुमति होगी, कम नमूना और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है । उदाहरण के लिए, यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल-व्युत्पन्न ROS के बीच फर्क, मुख्य सेल fcγr ligation का जवाब देने में सक्षम प्रकार. कई प्रयोगों के लिए जो बीच में लंबे समय तक हस्तक्षेप के साथ प्रदर्शन किया जाना है, एक किट का उपयोग आदर्श के रूप में नहीं हो सकता है. जांच के कई aliquots प्रदान नहीं कर रहे है और एक बार पुनर्गठन, निर्माता केवल अनुशंसा करता है कि अभिकर्मकों एक सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया जा (के रूप में ROS जांच उच्च प्रतिक्रियाशील हैं) । यदि यह प्रत्याशित है कि इस अवधि के प्रयोग के साथ असंगत है, हम अनुशंसा करते है कि व्यक्तिगत अभिकर्मकों के बजाय एक किट अलग से खरीदा है और प्रयोग के दिन के दौरान ही पुनर्गठन । जैसा कि हम यहां प्रदर्शित, व्यक्तिगत रूप से खरीदी घटकों के अतिरिक्त अनुकूलन इसके अलावा परख से पहले की जरूरत हो सकती है । कुल मिलाकर, हमें उंमीद है कि इस काम के लिए reproducibly उपाय आरओएस पीढ़ी प्रवाह cytometry का उपयोग शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी संसाधन प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को प्रयोगशाला रखरखाव और माउस कॉलोनी अनुरक्षण में उनकी मदद के लिए madelyn एच मिलर, उमर carडोना, andjie जीयूडी, और roopin सिंह सहित टिग्नो-आर्जुएज़ लैब के अंय सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस शोध के लिए सहायता अनुदान R00 HL122365 और स्टार्ट-अप फंडों द्वारा जे. टी. टी-ए को प्रदान की गई.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४५ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) प्रवाह cytometry एफसी गामा रिसेप्टर (fcγr) एफसी रिसेप्टर्स मैक्रोफेज श्वसन फट
fcγr पार जोड़ने के जवाब में मैक्रोफेज में ROS उत्पादन के प्रवाह cytometric माप
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Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

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