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Immunology and Infection

선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59167
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Summary

이 연구는 cytometry 반응성 산소 종 (선생님) 생산은 FcγR의 활성화에서 결과 검색의 사용을 보여줍니다. 항균 및 산화 환 원 신호 면역성이 있는 복합물, opsonized 미생물, 또는 직접 FcγR cross-linking에 식 세포의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

Abstract

산화 또는 호흡기 버스트는 다양 한 면역 자극에 응답 식 세포에 의해 산소의 급속 한 소비와 반응성 산소 종 (ROS)의 발생을 설명 하기 위해 사용 됩니다. 선생님 면역 활성화 중 생성 된 미생물의 죽음을 일으키는 주로 손상 DNA와 단백질, 선생님의 능력을 통해 강력한 항균 활성을 발휘 한다. Reproducibly 고 쉽게 선생님 생산을 측정할 수 있는 다양 한 경로 호스트 방어의이 메커니즘을 분자의 기여를 평가 하기 위해 필요 하다. 이 종이에 우리 형광 프로브의 사용과 cytometry 선생님 생산 검색 합니다. 널리 사용 되지만, 선생님의 형광 측정 특정 하지 mitogenic 자극에 의해 유도 된 선생님의 측정에 관하여 특히 악명 높게 문제 이다. 우리는 대 식 세포 생성, 못쓰게, 얼룩, FcγR 교차 연결, 및 결말 흐름 cytometric 분석 시작 특정 FcγR 자극 결과로 생성 된 선생님을 감지 하는 상세한 방법론 제시.

Introduction

반응성 산소 종 (선생님)는 반응 분자 또는 호 기성 호흡 ( 1에서검토)의 부산물입니다 자유 래 디 칼. Superoxide 음이온, 과산화 수소, 과산화 수소, 수 산 기 과격 한, 그리고 수 산 기 이온, 다른 사람의 사이에서 포함 됩니다. 정상적인 생리 적인 조건 하에서 선생님 미토 콘 드리 아와 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NADPH) oxidases에 의해 주로 생성 하 고 다양 한 효소와 단백질 superoxide dismutase, glutathione 등 여 detoxified 빠르게. 선생님 또는 선생님을 제거 하는 기능에 결함의 과장 된 생산 산화 스트레스, 반응성 산소 종 단백질, 지질, 및 세포 스트레스 또는 죽음 및 병 적인 질병 상태를 선도 하는 DNA의 손상을 촉진 하는 그것에 의하여 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 현재 감사 선생님 수 있습니다. 신호 분자 (산화 환 원 신호), 또한 역할을 하 고 다양 한 분자 및 통로 중간체의 수정 선생님 중재 세포질 물질 대사, 증식, 생존, 선 동적인 영향을 미칠 수 있습니다. 신호, 그리고2노화입니다. Phagocytic 세포에서 선생님 소위 "호흡 파열"1,,34,,56동안 항균 성 활동을 제공 하는 필수적인 역할을 재생 합니다. 식 세포의 외부 자극에 응답, 동안에 NADPH 산화 효소 복잡 한 (p40phox, p47phox, p67phox)의 구성 요소 포함 하는 gp91phox 및 p22phox phagosomal 막에는 cytosol에서 이동 소 단위, 완전 하 게 작동 NADPH 산화 효소 효소 복잡 한 형성 Rac1/2의 작업을 함께. 조립된 NADPH 산화 효소는 다음 NADPH 산소 phagosomal 공포 시간 초과를 줄이기 위해 활용 합니다. Superoxide 음이온 직접 손상 될 수 있습니다 또는 과산화 수소에 dismutated. 초과 과산화 수소는 반응성이 매우 높은 수 산 기 급진 파를 생성 하는 다른 분자와 반응 수 있습니다. 손상 또는 제한 된 미생물 물질 대사 또는 미생물5의 죽음을 선도 하는 궁극적으로 DNA의 기본 산화를 발생 하 여 철-황 단백질에 클러스터와이 선생님의 반응에 의해 중재 됩니다. 복잡 한 NADPH 산화 효소 효소의 중요성 및 호흡기 버스트 동안 생산 하는 선생님은 삽화가 임상 환자 만성 Granulomatous 질병 (CGD)7,,89, 10. CGD와 개인 소유 gp91phox에서 돌연변이 선생님 생산 및 박테리아와 균 류는 보통 immunocompetent 개인 관심사는 재발 감염 민감성의 부족의 결과. 따라서, 공부 하는 산화 스트레스, 산화 환 원 신호, 또는 호스트 방어 되 고 측정할 수 있는지 여부를 실시간으로 선생님 생산 유용한 노력 이다.

여러 분석 실험 측정 선생님 생산 또는 산화 스트레스11,,1213의 결과 이용 되어 있다. 이러한 가운데, 중 가장 널리 사용 되는 형광 프로브 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-다)14. 이 분자는 무색이 고 질 성. DCFH2-다 세포 막에 걸쳐 확산이 있습니다 세포내 esterases에 의해 위에 행동 될 DCFH2, 스며들 지 않는 셀 렌더링으로 deacetylates는. 선생님 (과산화 수소, peroxynitrite, 수 산 기 유리 기, 산화 질소 및 peroxy 급진 파) DCFH2 에 여러 종류의 작업은 형광 DCF로 산화 (전 보고 / Em: 485-500 nm/515-530 nm)는 흐름을 사용 하 여 감지할 수 있습니다 cytometer fluorescein (FL1 채널)에 대 한 설정 하는 표준 필터 장착. Superoxide는 DCFH2 와 강하게 반응 하지 않습니다 하지만 다른 프로브 dihydroethidium (DHE) 형광 제품 2-hydroxyethidium (뿐만 아니라 다른 형광 superoxide 독립적인 산화 제품)15를 반응 수 있습니다. DHE 산화의 형광 제품 518의 여기 파장을 사용 하 여 검출 될 수 있다 및 605의 방출 파장 nm (FL2 채널). 하지만 비교적 사용이 간단, 선생님의 검출에 대 한 이러한 프로브 활용 그들의 한계의 지식 및 얼룩이 지기의 절차 및 컨트롤에 유효한 있기 위하여 수행 되 고 특정 분석 결과 실험 주의 설립 필요 합니다. 결과 및 결론입니다. 다음 프로토콜 채용이 2 프로브 cytometry 여 선생님을 측정 하도록 설계 되어 상용 키트의 사용을 보여줍니다. 우리는 이러한 프로브 끝났다 골 수 유래 세포를 얼룩이 고 FcγR cross-linking 통해 선생님 생산 유도. 우리는이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 대표적인 데이터 제시 하 고 성공적인 실험을 위해 착수 해야 하는 적절 한 예방 조치를 강조.

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Protocol

처리 하는 동물에 대 한 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 센트럴 플로리다 대학의에 의해 승인 되었다.

1. 골 수의 생성 유래 세포 (BMDMs)

  1. 문화 미디어 준비
    1. D10F 기본 미디어 준비:에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 추가 10% 열 소 태아 혈 청 (FBS), 1 m m 나트륨 pyruvate, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 산과 0.05 m m β-mercaptoethanol 비활성화.
      참고: 신선한 D10F 미디어를 사용 하는, D10F 기본 미디어 수 준비까지 2 주를 사전에 주 내 여러 실험에 사용할. 1 마우스에 대 한 D10F 기본 미디어의 약 175 mL 이며 필요한 (뼈를 25 mL) 대 식 세포 감 별 법 미디어 있도록 150 mL
    2. LADMAC 성장 미디어 준비:에 글의 최소 필수 매체 (EMEM), 추가 10% 열 비활성화 FBS 및 2 m L-글루타민. 당신의 문화를 시작 하려는 날에 미디어 신선한을 준비 합니다.
      참고: LADMAC 성장 매체의 1 개 리터 약 (19) 50 mL aliquots LADMAC 조절 미디어의 발생 합니다.
    3. 완전 한 DMEM 미디어 준비: DMEM, 추가 10% 열 비활성화 FBS 및 1 x 항생제-Antimycotic. 미디어 신선한 준비, 하루에 BMDMs 수확 될 것입니다.
      참고: 하나의 마우스 DMEM 완전 한 미디어의 약 100 mL 하셔야 합니다. 못쓰게 셀에 사용 되는 미디어 포함 됩니다.
  2. LADMAC 조건된 매체의 준비
    1. LADMAC 셀 confluency LADMAC 성장 매체 (1.1.2에 정의 된)의 10 mL를 사용 하 여 10 cm 접시에 성장. 37 ° C, 5%에서 세포를 품 어 공동2.
    2. Confluency에 강제로 셀을 통해 미디어를 분배 하 여 세포를 분리 합니다. 통로 T-175 플라스 크 100ml LADMAC 성장 매체를 포함 하로 분리 된 세포의 1 mL을 추가 하 여 셀. 셀 때까지 완전히 confluent 37 ° C, 5% CO2 (약 1 주일)에서 품 어. 이 이렇게 한 10 cm 접시 10 T-175 플라스 크 또는 약 1 L 바른된 미디어의 얻을 수 있습니다.
    3. 일단 셀 준비가, 바른된 미디어와 원치 않는 세포 pellet을 5 분 동안 350 x g 에서 원심 분리기를 수집 합니다. 수집된 supernatants 0.2 m m 필터를 통해 필터링 하 고 저장-80 ° c.에 50 mL aliquots LADMAC 조절 미디어의 aliquots 개월 활동의 최소한의 손실-80 ° C에 보관 수 있습니다.
      참고: 큰 실험 예상 되는 경우 일관성을 보장 하기 위해 동시에 LADMAC 조절 미디어의 큰 배치를 준비 합니다. 만약 이것이 가능 하지, 동일한 일괄 처리 또는 각 실험에 대 한 LADMAC 조절 미디어의 많은에서 파생 하는 aliquots를 사용 합니다.
  3. 골 수의 준비 파생 된 대 식 세포
    1. 실험 당일 이전 준비 D10F 미디어 (D10F 3 파트로 1 파트 LADMAC 조절 미디어)로 조절 하는 LADMAC 미디어의 25%를 추가 하 여 신선한 대 식 세포 감 별 법 미디어를 준비 합니다. 이 미디어를 사전에 준비 하지 않는다! 만 BMDM 문화에 대 한 필요에 따라 많은 미디어를 준비 합니다.
    2. 주 1: 수정 화관과 tibias D10F 기본 미디어를 사용 하 여 골 수를 앞에서 설명한 프로토콜16 에 따라 마우스 골 수 세포를 분리. D10F 미디어의 2.5 mL를 사용 하 여 (4) 뼈의 양끝을 플러시. 50 mL 튜브 위에 미리 젖은 40 mm 셀 스 트레이너에 직접 골 수 세포를 플러시. 나머지 미디어 (~ 5 mL) 셀 여과기 밖으로 린스를 사용할 수 있습니다.
    3. 원심 350 x g 5 분 삭제에서 수집 된 골 수 세포는 상쾌한 고 대 식 세포 감 별 법 미디어 (마우스) 당 30 mL의 총에서 셀 resuspend.
    4. 준비 및 레이블 (6) 무 균 10 cm 배양 접시. 페 트리 접시에 각 대 식 세포 감 별 법 미디어의 5 mL을 플레이트. 접시 당 10 ml 전체 볼륨에 대 한 각 샬레에 대 식 세포 감 별 법 미디어에서 resuspended 골 수 세포의 aliquot 5 mL. 37 ° C, 5%에서 5 일 동안 품 어 공동2.
    5. 주 5: 세포에서 미디어를 발음. 1-2 mL PBS의로 한 번 씻어 고 갓된 대 식 세포 감 별 법 미디어의 10 mL를 추가 합니다. 3 일 추가 대 한 품 어.
    6. 주 8: BMDMs을 수확 하는 아래 설명 된 대로 진행 합니다.

2. 수확, 시드 및 BMDMs의 못쓰게

  1. 성장 하는 대 식 세포 감 별 법 미디어에 BMDMs의 7 일 후에 상쾌한을 제거 합니다. 1-2 mL PBS의와 한 번 부착 세포를 씻어. PBS 발음
  2. 0.25%의 1 mL를 분배 트립 신-EDTA 각 macrophage에 접시 및 세포 분리를 자주 도청으로 5-10 분 동안 37 ° C 배양 기에서 그들을 떠나. P1000 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 trypsinized 대 식 세포를 해리 하 고 포함 하는 완전 한 DMEM 미디어의 10-15 mL 50 mL 튜브에 세포를 수집 합니다. 모든 나머지 세포 수확 추가 2 mL 완전 한 DMEM 미디어와 접시 세척.
    주의: 10 분 이상 trypsin에 대 식 세포를 두지 마십시오.
  3. 350 x g 5 분 삭제에서 50 mL 튜브는 상쾌한 원심. 부드럽게 펠 릿을 해리 하 고 완전 한 DMEM 미디어 10 mL에 셀 resuspend. 개수 대 식 세포는 생존 존재 hemocytometer를 사용 하 여 염색 등 trypan 블루 다음과 같습니다.
    1. 예를 들어 혼합 Trypan 블루의 90 µ L 10 µ L 셀의 1:10 희석.
    2. 이 혼합의를 hemocytometer 10 µ L 로드 및 중앙 광장 (5 x 5 격자). 총 세포 수 계산 x 10 희석 요소 (10) 배 볼륨 (10 mL) x4 =.
  4. 완전 한 DMEM 미디어 및 판 각 6 cm 접시에이 세포 현 탁 액 4 mL에 1 백만/mL 수를 셀 서 스 펜 션을 조정 합니다.
    참고: 최소 3 접시는 실험 당 필요. 셀의 한 접시 왼쪽 자극 될 것입니다, 두 번째 일련의 셀의 FcγRs의 cross-linking를 통해 자극 될 것 이다 그리고 셀의 세 번째 접시는 추가의 모든 사용 됩니다 실험 및 흐름 cytometric 컨트롤.
  5. 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 접시를 품 어.
  6. 다음 날, 상쾌한, 1-2 mL PBS의 한 번 세척 셀 발음. 각 접시에 100 ng/mL 마우스 IFN-γ를 포함 하는 완전 한 미디어의 4 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 접시를 품 어.
  7. 원하는 경우, cytometry에 의해 BMDMs의 적절 한 세대를 평가 하기 위해 셀의 약 수를 가져가 라. 테스트 당 1 x 106 셀을 사용 하 고 다음 조건에 대 한 폴리스 티 렌 FACs 튜브 준비: isotype 컨트롤 F4/80으로 물 (또는 양자 택일로, CD11b 물).
  8. 0.1%를 추가 하 여 버퍼를 얼룩 cytometry 준비 FBS 1 x PBS에. 이 양의 FBS만를 사용 하 여 혈 청-기아 나중 단계에서의 효과 깨뜨릴 수 없습니다.
  9. 튜브 및 5 분 동안 750 x g 에서 원심 분리기 aliquot 1 x 106 셀.
  10. Decanting 또는 상쾌한 발음 및 셀 흐름 cytometry 버퍼의 2 mL에 resuspending에 의해 한 번 세척. 5 분 동안 750 x g 에서 원심 분리기.
  11. 상쾌한 발음 하 고 셀 cytometry 버퍼 얼룩의 100 µ L에 resuspend. 각 튜브를 반대로 마우스 CD16/32 Fc 차단 항 체의 1 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 얼음에 품 어.
  12. 세척, 없이 "얼룩진된" 튜브 "isotype" 튜브에 해당 isotype 제어 항 체의 양과 비슷한에 FITC 반대로 마우스 F4/80의 2 µ L 또는 APC 반대로 마우스 CD11b 항 체의 1 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.
  13. 셀에 직접 PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 씻어. 5 분 동안 750 x g 에서 원심 분리기.
  14. 상쾌한 발음 하 고 PBS의 150 µ L에서 세포를 resuspend.
  15. 관심의 게이트 100 µ L 또는 10000 이벤트의 정지 상태를 사용 하 여 교류 cytometer에서 샘플을 수집 하 고 확인 그 FSC, SSC, FL1 (FITC 반대로 마우스 f 4/80) FL4 (APC 반대로 마우스 CD11b) 채널 분석 매개 변수에 대 한 선택.
  16. 교류 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 (x 축)에 FSC vs SSC (y 축)에 대 한 점 음모 열고 관심, 죽은 세포와 파편을 제외 하 고 셀 주위 게이트 그릴 (죽은 세포 파편 주요 세포 인구 보다 훨씬 작은 이벤트 및 로우에 나타납니다 r의 왼쪽 줄거리).
  17. 히스토그램 플롯 FL1 열고 관심, 셀에 게이팅 (FITC 반대로 마우스 f 4/80) 또는 FL4 (APC 반대로 마우스 CD11b) x 축에.
  18. "Isotype" 샘플을 실행 합니다. 그래서 그 "isotype" 샘플 이벤트 대부분의 게이트의 왼쪽에 표식 게이트를 생성 (< 1% 긍정적인). 얼룩진된 샘플 파일에이 템플릿을 적용.
  19. "얼룩진된" 샘플을 실행 합니다. BMDMs의 성공적인 세대 발생 합니다 > 95% 표현의 FITC 반대로 마우스 F4/80 또는 APC 반대로 마우스 CD11b (그림 1A), 동안 잘못 된 문화 조건 대 식 세포 (그림 1B)의 최적의 생성 될 수 있습니다.
    참고: 여러 genotypes에서 BMDMs를 생성, 생성,이 자극에 응답에서 선생님 세대 평가 때 샘플 분석에서 제외에 대 한 근거가 있을 경우에는 BMDM의 각 일괄 처리에 대 한 이러한 마커 식의 주를가지고 가십시오.

3. 선생님 측정 시 약 및 재료 준비

  1. 동결 건조 된 산화 스트레스 검출 시 약 5 m m 재고 솔루션을 무수 DMF의 60 µ L에서 reconstitute 부드럽게 사용 하기 전에 혼합.
    참고: 그것은 밝혔다 선생님 ID 키트 설명서에 재구성 된 시 약의 보관 수명을-20 ° c.에 약 1 주 Aliquoting 작은 광선이 튜브로 시 즉시 재구성의 산화를 최소화 하 고-20 ° c.에 선반 수명을 극대화합니다
  2. 동결 건조 된 초과 검출 시 약 5 m m 재고 솔루션을 무수 DMF의 60 µ L에서 reconstitute 부드럽게 사용 하기 전에 혼합.
    주의: 키트 설명서에 명시 된 대로 가능한 mutagens 모두 검출 시 약 취급, 각각의 관리와 처분을 제대로 처리.
  3. 50 m m 재고 솔루션을 무수 DMF의 20 µ L에서 선생님 유도 (Pyocyanin)를 다시 구성.
  4. 선생님 억제제 (N-아 세 틸-L-시스테인) 이온된 수의 123 µ L에서 0.5 M 재고 농도를 reconstitute합니다
  5. 폴리스 티 렌 튜브 (교류 cytometry 튜브) 실험 컨트롤 및 조건 라운드 5 mL 레이블을 지정 합니다. (참조 4. 시험 조건 및 컨트롤)
  6. 낮은 혈 청을 준비 DMEM (페 놀 레드) 0.1% 추가 하 여 페 놀 레드 무료 DMEM FBS.
  7. 약 수 (사용)에 따라 작은 aliquots에 반대로 BSA 항 체-80 ° c.에서 그들을 저장 하 고
  8. HBSS에 BSA 100 mg/mL의 재고 솔루션을 준비 (행 크 스 균형 소금 솔루션) 또는 PBS. 약 수로 100 µ L aliquots-20 ° c.에 게
  9. 선생님 프로브 (프로브 솔루션 x 2)의 2 배 솔루션 준비: 낮은 혈 청 DMEM의 각 10 ml, 산화 스트레스 탐지 시 약 (녹색 염료)의 4 µ L와 4 µ L 초과 검출 시 약 (주황색 염료)의 추가.
  10. 준비 만 포함 하는 프로브 솔루션 x 2 산화 스트레스 탐지 시 약 (프로브 솔루션, 그린만 x 2), 또는 포함 만 초과 검출 시 약 (프로브 솔루션, 오렌지만 x 2). 실험에 필요한 시 약의 양만 준비 하 고 항상 2 x 솔루션을 즉시 사용 하기 전에 준비.
    참고: 탐지 솔루션 x 2의 작은 볼륨을 준비 하려면 중간 1시 10분 DMEM 최종 희석 전에 그린 및 오렌지 검출 시 약의 희석. 예를 들어 감지 솔루션 x 2의 1 mL를 준비 하려면 DMEM의 9 µ L로 각 프로브 1 µ L를 희석 (1시 10분 희석 중간). 이 4 µ L를 희석 1시 10분 중급 DMEM 1 mL로 희석.

4. 시험 조건 및 컨트롤

  1. 각 실험에 대 한 흐름 cytometric 보상에 대 한 다음과 같은 실험 컨트롤이 포함 됩니다.
    a) 흠 없는 및 unstimulated 셀입니다.
    b) 세포 산화 스트레스 탐지 시 약 (녹색 시 약)로 얼룩진 고 선생님 유도로 치료.
    c) 셀만 초과 검출 시 약 (오렌지 시 약)로 얼룩진 고 선생님 유도로 치료.
  2. 각 마우스 또는 생물 복제, 6 다음과를 같습니다.
    셀 a) 흠 없는 및 unstimulated
    셀 b) 스테인드 및 unstimulated
    긍정적인 유도로 c) 스테인드 세포 치료
    긍정적인 유도 및 선생님 억제제로 치료 하는 d) 스테인드 셀
    e) 스테인드 셀 FcγR cross-linking를 통해 활성화
    f) 스테인드 셀 FcγR cross-linking를 통해 활성화 하 고 선생님 억제제로 치료
  3. 프로브 솔루션 필요 x 2의 금액 (200 µ L 프로브 솔루션 x 2의 얼룩을 요구 하는 각 조건에 대해 사용 됩니다) 마우스의 수에 따라 계산 합니다.
    참고: 분석 결과 6 마우스를 사용 하 여에 대 한 요구 조사와 얼룩 5 조건 마우스 당 필요할 것 이다. 이 30의 총 수를 제공합니다. 따라서, 필요한 2 x 프로브 솔루션의 총 금액은 적어도 6 mL (30 * 200 µ L).

5. 세포 준비

  1. 대 식 세포를 못쓰게 후 하룻밤, 발음은 상쾌한. PBS 한번 셀을 씻어.
  2. 혈 청의 낮은 혈 청 DMEM 동일한 볼륨 미디어를 대체 하 여 세포를 굶 어. 각 마우스에 대 한 하나의 접시로 취급 됩니다 반대로 BSA IgG1 혈 청, 배 고 파 하는 동안 다른 남아 있을 것입니다 하는 동안 치료. 치료 번호판만 낮은 혈 청 DMEM을 추가 합니다. 낮은 혈 청 DMEM murine 반대로 BSA IgG1 치료 번호판의 2.5 µ g/mL를 포함을 추가 합니다.
    참고: 하나의 추가 치료 플레이트 흐름 cytometric 보상 컨트롤에 대 한 각 실험에 대 한 필요 합니다.
  3. 37 ° C, 5% CO2에서 4 h에 대 한 번호판을 품 어.
  4. 혈 청 배 고 파, 후 부드러운 된다고 하 여 또는 PBS에 0.2 m m EDTA를 사용 하 여 셀을 수확. 하단 튜브 라운드 레이블된 5 mL에 그들을 수집 하 고 그들 750 x g 5 분에 대 한 셀의 원심 분리기 murine 반대로 BSA IgG1로 치료 했다.
  5. 셀 알 약 치료 세포에서 어떤 잔여 반대로 BSA의 제거에 PBS의 2 mL로 한 번 씻는 다.
  6. 낮은 혈 청 DMEM의 600 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
  7. 600 µ L 셀 정지에서 사전 이라는 5 mL로 aliquot 200 µ L 라운드 하단 튜브 다음과 같이:
    1. 치료 되지 않는 세포에서 걸릴 튜브 "unstimulated", 관 이라는 "긍정적인 유도"에 대 한 200 µ L와 200 µ L 튜브 "긍정적인 유도 + 억제제" 표시에 대 한 표시에 대 한 200 µ L
    2. 반대로 BSA IgG1 에서 치료 세포 걸릴 200 µ L 튜브 표시 "FcγR 가교/FcγR XL" 및 200 µ L 튜브에 대 한 표시 "FcγR XL + 억제 물"
    3. 보상 컨트롤에 사용할 치료 세포에서 200 µ L 셔 서 튜브에 대 한 "흠 없는 unstimulated", "녹색 + 유도" 200 µ L을가지고 제어 및 200 µ L "오렌지 + 유도"에 대 한 제어.
      참고: 지금까지 5.7.1 및 5.7.3 셀 같은 마우스에서 파생 하는 경우에 동일한 "흠 없는 unstimulated" 세포 실험 및 보상 제어에 사용할 수 있습니다. 셀의 추가 200 µ L에 대 한 "흠 없는 unstimulated" 실험 제어에 대 한 필요 하 게 됩니다 하지 않을 경우는).
  8. 얼룩이 지 고 자극까지 얼음에 튜브를 유지. 혈 청 중 기아와 바인딩 IgG1, 프로브, 특정 자극, 그리고 inducers 아래에 설명 된 대로 준비 합니다.
    참고:에 대 한 분석 결과 수행 하는 경우 템플릿이 없는 사용할 수, 또는 후--사실 보상 흐름 cytometer 및 해당 소프트웨어에서 사용할 수 있는 경우, 처음으로 자극 보상 컨트롤 얼룩 및 수행 흐름 cytometer에서 실행 수동 보정 하기 전에 또한 자극 실험 샘플의.

6. 수행 분석 결과

  1. 긍정적인 유도 솔루션 x 2 Pyocyanin 1: 100 프로브 솔루션 (단계 3.9에서에서 준비) x 2에서 pyocyanin의 500 µ M의 2 배 농도를 희석 하 여 준비 (최종 농도 250 µ M를 될 것입니다). 또한, 각각의 "프로브 솔루션 x 2만 그린"과 "2 x 프로브 솔루션, 오렌지만" 튜브 3.10에서 준비에 pyocyanin 1: 100 희석.
    참고: 두 조건이 모두 "긍정적인 유도"와 "긍정적인 유도 + 억제 물" 이라는 긍정적인 유도로 처리 됩니다. 준비 2 엑스 긍정적인 유도 솔루션의 금액을 계산할 때 그에 따라 계획. 예: 6 조건 (3 * 2) 긍정적인 유도로 취급 됩니다, 그래서 6 * 200 µ L를 준비 3 마우스와 분석 결과 수행 하는 경우 긍정적인 유도 솔루션 x 2의 1.2 mL =.
  2. 프로브 솔루션 2 µ g/mL의 농도를 x 2에서 BSA 재고 솔루션을 diluting 하 여 BSA 솔루션 x 2를 준비 (최종 농도 1 µ g/mL를 될 것입니다).
    참고: "FcγR XL" 및 "FcγR XL + 억제 물" 이라는 두 조건이 BSA 솔루션 x 2와 함께 처리 됩니다. 준비 하는 솔루션의 금액을 계산할 때 그에 따라 계획 합니다. 예: 3 쥐, 6 (3 * 2)를 사용 하 여 분석 결과 수행 조건 BSA 솔루션 및 그래서 6 * 200 µ L로 취급 됩니다 또는 BSA 솔루션 x 2의 1.2 mL 필요 하 게 됩니다.
  3. 시작 하기 전에 특정 자극 (FcγR 가교), 모든 시 약 및 셀 준비 되어 있는지 확인 합니다. 그들은 자극 될 것 이다 순서에 있는 얼음에 튜브를 놓습니다.
  4. 교류 cytometers는 autosampler는 cytometer 하나의 샘플을 분석 하 고, 다음 이동 하는 데 걸리는 시간의 주의와 혼합 및 단계 (예: 3.5 분)를 세척 하는 프로브를 포함 한.
    참고: 이 분석 결과 대 한 매우 중요 한 타이밍은. 잘 제어 하려면 모든 조건에 대 한 순서, 자극 각 조건에 대해 정확한 시간 (30 분) 실시 될 필요가 있다. 순서에 있는 세포를 자극 하 고 교류 cytometer 샘플 인수 사이의 지연 시간을 통합. 예를 들어 하나의 샘플을 분석 하 여 다음 이동 cytometer 시간 3.5 분 이면 그들은 모든 3.5 분 분석 될 것 이다 순서에 있는 세포를 자극.
  5. 수동 보상 시점에서를 수행 하는 경우 보상 (단계 5.7.3)에 사용할 제어 튜브를 자극. 200 µ L "프로브 솔루션 x 2만 그린"의 추가 "녹색 + 유도" 표시 (6.1)에서 유도 포함 하는 튜브로 (단계 5.7.3). 200 µ L "프로브 솔루션, 오렌지만 x 2"의 추가 "오렌지 + 유도" 표시 튜브로 유도 (6.1 단계)를 포함 된 (단계 5.7.3).
  6. 37 ° C에서 30 분, 5% CO2 어둠에 대 한 셀을 품 어.
  7. 교류 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 생성 및 라벨 3 샘플 파일은 컨트롤 "흠 없는, 치료", "녹색 + 유도", 및 "오렌지 + 유도" 샘플, 채널/매개 변수 수를 분석 (FSC, SSC, FL1, FL2) 표시를 확인 하 고 원하는 중지 조건 (100 µ L, 3 분, 등.). 생성 및 레이블 실험 샘플 파일의 비슷한 설정.
  8. "흠 없는, 치료" 샘플을 실행 합니다. (X 축)에 FSC vs SSC (y 축)에 대 한 점 음모를 열고 관심, 죽은 세포와 파편을 제외 하 고 셀 주위 게이트 그릴 (죽은 세포와 파편 주요 세포 인구 보다 훨씬 작은 이벤트와 플롯의 왼쪽 하단에 표시).
  9. 이 "셀" 게이트를 사용 하 여 열고 FL1의 다른 점 줄거리 (x 축) vs FL2 (y 축). 초기 사분면 게이트를 그립니다. 이벤트 FL1 vs FL2 플롯의 왼쪽된 하단 사분면에 표시 사분면 게이츠를 조정 합니다.
  10. "녹색 + 유도" 샘플을 실행 합니다. 이벤트 FL1 vs FL2 플롯의 더 낮은 왼쪽 및 오른쪽 사분면에 표시 되도록 전압을 조정 합니다. 모든 3 샘플 파일에이 보상 매트릭스를 적용 합니다.
  11. "오렌지 + 유도" 샘플을 실행 합니다. 이벤트는 위 및 아래에 표시 되도록 전압을 조정 FL1 vs FL2 플롯의 사분면 왼쪽. 모든 3 샘플 파일에이 보상 매트릭스를 적용 합니다.
  12. 각 보상 파일을 확인 하 고는 "흠 없는, 치료" 이벤트 낮은 왼쪽된 사분면에 표시, "녹색 + 유도" 이벤트는 낮은 왼쪽 및 오른쪽 사분면에 표시 되 고 "오렌지 + 유도" 이벤트 상단 및 하단에 표시를 확인 FL1 대의 사분면 왼쪽 FL2 줄거리입니다. 실험 샘플 파일의 모든 보상 매트릭스를 적용 합니다.
    1. 적절 한 보상 실험 샘플 파일의 모든 보상 매트릭스를 적용 하기 전에 모든 컨트롤 샘플 파일에 적용 됩니다 확인 하십시오. Uncompensated 보여주는 대표적인 데이터와 제대로 보상된 샘플 그림 2 를 참조 하십시오.
      참고: 많은 cytometers 표준 FITC/GFP 채널 (블루 488 nm 레이저에 의해 흥분 하 고 530/30 필터 집합으로 감지)와 표준 PE 채널 (블루 488 nm 레이저에 의해 흥분 하 고 585/40 필터 집합으로 감지) FL2 FL1 지정 합니다. 우리 자신의 cytometer 유사 하 게 구성 하 고 적절 한 채널이이 프로브를 감지 하는 데 사용 됩니다 그들의 흐름 cytometry 핵심 관리자와 상담 하 주의 새로운 흐름 cytometry 사용자 하지만이 동일한 규칙을 사용 합니다. 교류 cytometer 그리고 소프트웨어를 동반의 모델에 따라 하기 전에 또는 샘플 획득 후 보정을 수행할 수 수 있습니다. 후--사실 보상은 가능 하면 모든 실험 샘플은 cytometer에 의해 획득 후 보상 단계를 수행할 수 있습니다. Cytometers 어디 PMT 전압 조정이 필요 하지 않습니다, 동적 범위에 대 한 보상 실험 또한 별도 하루에 수행할 수 있습니다. 및 수행 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 (를 포함 하 여 보상 매트릭스) 실험 서식 파일을 저장할 수 있습니다. 수동 한 보상
  13. 일단 수동 보정을 수행 하 고 실험 템플릿을 가져온, 실험 샘플의 처리를 시작 합니다. 긍정적인 유도 또는 FcγR 세포 자극으로 치료 하기 전에 튜브 얻을 선생님 억제제 표시 합니다. 긍정적인 유도 또는 FcγR 자극 전에 선생님 억제제 적어도 30 분으로이 셀을 취급 합니다.
  14. 선생님 억제제를 추가 하려면 (없이 반대로 BSA IgG1) resuspended 셀의 200 µ L에는 억제제의 1 µ L을 추가 하 여 5 mM의 최종 농도 준비 합니다.
  15. 자극 (또는 긍정적인 유도) 세포를 치료 하 고 선생님 프로브 셀을 다음과 같은 로드:
    1. Unstimulated 셀에 대 한: "스테인드, unstimulated" 이라는 세포 현 탁 액의 200 µ L에 어떤 자극 없이 프로브 솔루션 x 2의 200 µ L를 추가.
    2. 긍정적인 컨트롤: 세포 현 탁 액 "긍정적인 유도" 또는 "긍정적인 유도 + 억제제" 표시의 200 µ L를 긍정적인 유도 솔루션 (단계 6.1에서에서 준비) x 2의 200 µ L를 추가.
    3. FcγR 상호 (특정 자극)에 의해 자극 하는 셀에 대 한: "Fcγr XL" 또는 "FcγR XL + 억제 물" 이라는 세포 현 탁 액의 200 µ L을 BSA 솔루션 (6.2에서 준비) x 2의 200 µ L를 추가.
      참고: 자극 모든 x 분 x가 한 샘플의 수집 및 다음 사이의 지연 시간을 추가 하 여 샘플 분석 사이의 지연 시간을 포함 하도록 하십시오.
  16. 37 ° C에서 30 분, 5% CO2 어둠에 대 한 셀을 품 어. 그들은 장비 교류 cytometer는 autosampler 함께 사용 하 여 자극 했다 순서에서 샘플을 분석 합니다. 초기 보상 단계 중에 생성 된 분석 템플릿을 사용 합니다. 분석 이전 셀 세척 하지 마십시오.

7. flow cytometry 데이터 분석 및 예상된 결과

  1. 교류 cytometry 소프트웨어 실험 샘플에 대 한 이전에 생성 된 분석 파일을 엽니다 (서식 파일 6.7-6.12 단계에서 생성 된 및 샘플 단계 6.16 실행 했다). 수동 보정을 수행 보상 매트릭스 실험 샘플에 올바르게 적용 된 확인 하십시오.
    참고: 흐름 cytometers 및 흐름 cytometry 소프트웨어 후--사실 보상의 보상 매트릭스는 이전 실험 샘플 파일에 적용 하지 않으면, 적용이 시점에서.
  2. 올바른 수동 보정, 확인 유사한 확인 실험 샘플 내에서 컨트롤이 예상 대로 작동 합니다.
    1. "긍정적인 유도" 이벤트 쇼 증가 형광 왼쪽 상단에 상단 오른쪽, 및 낮은 오른쪽 사분면 FL1 vs FL2 플롯, 그리고 그의 "흠 없는, 치료" 이벤트 FL1 vs FL2 플롯의 왼쪽된 하단 사분면에 표시 됩니다 확인 " 긍정적인 유도 + 선생님 억제제"이벤트 표시 감소 형광에서 왼쪽 상단, 상단 오른쪽, 그리고 오른쪽 사분면 FL2 플롯 형광에 비해"긍정적인 유도"샘플 관찰 FL1 대의 낮은.
    2. 실험 샘플 컨트롤 어떤 증가 형광 표시 되지 않을, 모든 분석 결과 단계를 수행한 확인, 적절 한 생성 및 골 수 유래 세포 (2.7-2.19)의 못쓰게 확인 하 고 실험을 반복. 실험 샘플 컨트롤 예상된 추세 표시, 분석 실험 샘플 자극된 FcγR (그림 3A)를 통해 진행 합니다.
  3. FcγR 특정 자극 적절 하 게 작동 하는지 확인 합니다. C57BL/6J WT 마우스에서 다음 샘플을 실행: "흠 없는, unstimulated", "스테인드, unstimulated", "스테인드는 FcγR을 통해 자극", 및 "스테인드, FcγR + 선생님을 통해 자극 억제 물". 이들은 각각 예제 4.2 a, 4.2 b, 4.2e, 및 섹션 4, 4.2f에 해당합니다.
    1. "흠 없는, unstimulated" 이벤트 "스테인드, unstimulated" 이벤트 또한 FL1 vs FL2 플롯의 왼쪽된 하단 사분면에 표시 됩니다를 FL1 vs FL2 작의의 더 낮은 왼쪽된 사분면에 표시 됩니다 것을 "스테인드, 자극 하는 FcγR를 통해" 이벤트 증가 형광에에서 표시 왼쪽 상단, 상단 오른쪽, 그리고 낮은 FL1 vs FL2 음모, 그리고 그의 오른쪽 사분면 "스테인드, FcγR + 선생님을 통해 자극 억제 물" 이벤트 왼쪽 위, 오른쪽 위, 오른쪽 아래에 있는 형광을 감소 표시 됩니다 "스테인드는 FcγR을 통해 자극" 샘플 (그림 3A)에 비해 FL1 vs FL2 음모 하는 사분면
    2. 이러한 기대 충족 되지 않는 경우 예를 들어 "스테인드는 FcγR을 통해 자극" 샘플 보여 최소한의 또는 이미 "스테인드, unstimulated" 샘플 또는 "스테인드, unstimulated" 샘플에 비해 아무 증가 형광 현저 하 게 "흠 없는, unstimulated" 샘플에 비해 형광의 증가 수준 모든 시험 단계를 제대로 수행한 것을 확인, 적절 한 세대, 프라이 밍, BMDMs (2.7-2.19)의 처리를 확인 하 고 실험을 반복. 이러한 기대를 충족 하는 경우 분석 실험 샘플의 나머지 부분을 진행 합니다.
      참고: 녹색 프로브 (과산화 수소, peroxynitrite, 수 산 기 유리 기, 산화 질소, peroxy 급진 파, 등)과 반응 하는 선생님을 생산 하는 셀 오른쪽 상단에 표시 되며 로그 FL2 대 FL1 로그의 오른쪽 사분면 (x 축)를 낮은 (y 축) 점 플롯. (크게 그러나 독점적으로 superoxide) 오렌지 프로브 반작용 하는 선생님을 생산 하는 셀 것 이다은 사분면에 나타납니다 두 위 로그 FL1의 (x 축) FL2 로그 대 (y 축) 점 플롯.
  4. FL1 및 FL2 형광의 분석에 대 한 관심의 세포에 문이 개별 히스토그램을 생성 합니다. "흠 없는, unstimulated" 샘플을 사용 하 여, 모든 "흠 없는, unstimulated" 이벤트가이 표시의 왼쪽에 표시 되도록 히스토그램 마커를 생성 합니다. 실험 샘플 (그림 3B)의 나머지 부분에는 표시와 함께이 음모를 적용 합니다.
  5. 선생님 프로브 또는 컨트롤 (그림 3C) 대 자극된 샘플의 평균 형광 강도 (MFI)를 표시 하 여 각각에 대 한 긍정적인 세포의 비율으로 실험의 결과 제시.

8. 세포 표면 흐름 cytometric 분석 선생님 생산 (옵션)와 함께 얼룩

참고:이 단계 이전에 FcγR 및 선생님 측정의 자극 세포 표면 마커와 대 식 세포를 얼룩에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이 혼합된 세포 인구에서 선생님 생산 평가에 유용할 수 있습니다. 그것은 산화 스트레스 또는 초과 검출 시 약에서 형광에 방해가 되지 않는 적절 한 fluor에 활용 된 대 식 세포 표면 표식에 대 한 항 체를 선택 하는 것이 중요. 이 프로토콜 F4/80 알 렉 사 fluor 647에 활용 된 마우스에 대 한 항 체를 사용 합니다.

  1. BMDMs를 생성 하 고 수확 한 프라임 그들 이전 설명 (섹션 1과 2).
    참고: 최소 세 6 cm 접시의 모든 실험 제어 및 조건 아래 설명 된 대로 수행 하기 위해 필요 합니다. 한 접시 배 다른 두 접시에 남아 있을 것입니다 하는 동안 혈 청 치료 하는 동안 반대로 BSA IgG1 로 처리 됩니다.
    1. 4 실험 제어 흐름 cytometric 보상 (실험) 당을 위해 사용 될 것입니다 포함:
      a) 흠 없는 및 unstimulated 셀입니다.
      b) 세포 산화 스트레스 탐지 시 약 (녹색 시 약)와 선생님 유도 치료.
      c) 셀 초과 검출 시 약 (오렌지 시 약)와 선생님 유도 치료.
      d) 셀 f 4/80 알 렉 사 647에 활용 된 반대로 마우스 만으로 스테인드.
    2. 각 마우스 또는 생물 복제, 3 다음과를 같습니다.
      a) 스테인드 F4/80과 왼쪽 unstimulated
      b) F4/80으로 얼룩이 지 고는 FcγR를 통해 활성화
      c) F4/80으로 물 하 고는 FcγR를 통해 활성화 선생님 억제제로 치료
  2. 대 식 세포를 못쓰게 후 하룻밤, 발음은 상쾌한. 1-2 mL PBS의 한 번 셀을 씻어. 혈 청의 낮은 혈 청 DMEM 동일한 볼륨 미디어를 대체 하 여 세포를 굶 어. 각 마우스 한 접시 혈 청 배 고 파 하는 동안 반대로 BSA IgG1 로 취급 됩니다, 그리고 다른 두 판 하는 동안 것입니다 수 왼쪽 치료. 37 ° C, 5% CO2에서 4 h에 대 한 번호판을 품 어.
  3. 혈 청 배 고 파, 후 부드러운 된다고 하 여 또는 PBS에 0.2 m m EDTA를 사용 하 여 셀을 수확. 하단 튜브 라운드 레이블된 5 mL에 각 접시를 수집 하 고 그들 750 x g 5 분에 대 한 셀의 원심 분리기 murine 반대로 BSA IgG1로 치료 했다.
  4. 셀 알 약 치료 세포에서 어떤 잔여 반대로 BSA의 제거에 PBS의 1-2 mL로 한 번 씻는 다.
  5. Resuspend는 낮은 혈 청 DMEM의 600 µ L에 반대로 BSA IgG1 못해서 접시에서 셀 알 약 중 하나. 이 셀 것 이다 하지 셀 표면 얼룩을 받. 이러한 보상 컨트롤을 사용 합니다. (3)로이 셀 서 스 펜 션의 aliquot 200 µ L 5 mL 라운드 하단 튜브 레이블이 a) 흠 없는, unstimulated b) 녹색 산화 스트레스 시 약 + 선생님 유도, c) 오렌지 초과 검출 시 약 + 선생님 유도.
  6. Resuspend 셀 중 하나는 반대로 BSA 못해서 접시에서 펠 릿1, cytometry 버퍼 얼룩의 300 µ L에서 IgG (PBS + 0.1 %FBS). (2)에이 셀 서 스 펜 션의 aliquot 100 µ L 5 mL 라운드 하단 튜브 알 렉 사 647 안티 마우스 F4/80 얼룩.
  7. 반대로 BSA IgG1 흐름 cytometry 얼룩 버퍼의 300 µ L에서 받은 접시에서 셀 펠 릿 resuspend (2)에이 셀 서 스 펜 션의 aliquot 100 µ L 5 mL 라운드 하단 튜브 알 렉 사 647 안티 마우스 F4/80 얼룩.
  8. 8.6에서 8.7, 어둠 속에서 얼음에 30 분 알 렉 사 647 반대로 마우스 F4/80의 5 µ L와 aliquoted 했다 세포 얼룩.
  9. 얼룩, 750 x g에 PBS와 원심 분리기의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 세척 후 상쾌한, 발음 하 고 페 놀 레드 없이 낮은 혈 청 DMEM의 200 µ L에서 각 튜브를 resuspend. 단독으로 얼룩진된 FL4 제어 역할을 1 개의 치료 관을 따로 설정 합니다. 3.9, 3.10, 6.1, 6.2, 및 6.14 섹션에 표시 된 프로브, 유도, FcγR 자극 및 선생님 억제제를 준비 합니다.
    1. 반대로 BSA 받지 셀1IgG, 대 한 레이블을 다음 튜브:는) 자극 또는 b) 선생님 유도.
    2. 반대로 BSA를 받은 세포 IgG1에 대 한 다음 레이블:는) Fc XL 또는 b) Fc XL + 억제제.
  10. 6.5-6.6, 통합 한 샘플 및 다음의 취득 사이 지연 시간 교류 cytometer에서 읽을 수 것입니다 순서에 표시 된 대로 그들의 각각 치료에 따라 보상에 사용 될 샘플을 자극.
  11. 37 ° C에서 30 분, 5% CO2 어둠에 대 한 셀을 품 어. 그들은 장비 교류 cytometer는 autosampler 함께 사용 하 여 자극 했다 순서에서 샘플을 분석 합니다.
  12. 섹션 7에에서 설명 된 대로 6.7-6.12 및 데이터 분석의 설명 대로 수동 보정을 수행 합니다.
  13. 교류 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 생성 하 고 "흠 없는, 치료", "녹색 + 유도" 4 샘플 파일 컨트롤에 대 한 레이블, "오렌지 + 유도" 샘플 "F4/80 얼룩진", (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) 분석 채널/매개 변수 수를 나타내는 확인 하 그리고 원하는 정지 조건 (100 µ L, 3 분, 등.).
  14. 샘플을 실행 하 고 수동 보정을 수행 하려면 점 플롯을 생성.
    1. 세포 표면 얼룩에 대 한 두 개의 추가 플롯 생성: FL1 (x 축) vs FL4 (y 축) 및 FL2 (x 축) vs FL4 (y 축). 7A를 그림에서 같이 적절 한 보상 적용 전압을 조정 합니다. 모든 보상은 제대로 수행 되 면 실험 샘플 파일의 모든 보상 행렬을 적용.
  15. 일단 수동 보정을 수행 하 고 실험 템플릿을 가져온, 6.13-6.15.3에 표시 된 대로 실험 샘플의 처리를 시작 하 고 6.16에 설명 된 대로 교류 cytometer에 샘플을 취득.

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Representative Results

내에서 설명 된 프로토콜을 사용 하는 FcγR 통해 WT C57BL/6J BMDMs의 자극에서 발생 하는 선생님 생산의 흐름 cytometric 탐지를 보여주는 대표적인 데이터 선물이. 예상 대로, 우리 unstimulated 셀에 배경 수준 이상의 FL1 또는 FL2 형광에서 최소한의 변화 관찰 (그림 3A, "스테인드, unstimulated" vs "흠 없는, unstimulated" 점 플롯 비교). 우리는 셀 FcγR cross-linking 대리인 (그림 3A, 대 비교 "얼룩이 지 고 Fc cross-linking 통해 자극" 샘플 "스테인드, unstimulated" 점 플롯)와 자극은 때 FL1 및 FL2 형광에 표시 된 증가 관찰 합니다. 마지막으로 때 셀 FcγR cross-linking 이전 선생님 억제제로 치료 했다,이 증가 된 형광은 돌아온 기초 수준에 (그림 3A, 비교 "스테인드과 선생님 억제제로 치료와 Fc cross-linking 통해 자극" vs "스테인드과 Fc cross-linking 통해 자극"점 플롯). 이것은 또한 분명 데이터 (그림 3B) 각 채널에 대 한 히스토그램으로 표시 하거나 데이터 중 녹색 또는 주황색 선생님 프로브 (그림 3C)에 대 한 긍정적인 세포의 백분율로 표시 됩니다. 유사한 동향은 또한 명백한 데이터 MFI로 선물 될 때 비록 선생님 억제제와 전처리와 오렌지 형광 감소 캡처되지 않습니다 또한 백분율 (그림 3C) 대 MFI로 선물 될 때. 우리는 또한 다른 일 (그림 3, 실험 1, 2, 및 3)에서 수행 하는 3 독립적인 실험의 결과 제시. 평균 값과 해당 표준 오차의 의미 (그림 3C) 그래프에 표시 됩니다.

우리는 또한 FcγR 자극 결과로 최적의 선생님 생산 (그림 4)을 관찰 했다 실패 한 실험, 제시. "스테인드과 Fc cross-linking 통해 자극" 샘플 대 "스테인드, unstimulated" 샘플 (그림 4A, B, C)을 비교할 때 FL1 및 FL2 형광에 있는 최소 증가 감지 되었습니다. 이 실패 한 실험에서 예상된 백분율 또는 MFI 증가 고 관찰된 값의 큰 차이점을 강조 하는 성공적인 실험 함께 제공 됩니다.

현재 프로토콜 24 h 못쓰게 단계를 사용합니다. 48 h 못쓰게 시간 대 24 시간을 비교할 때 우리가 관찰 세포의 비율에 표시 된 차이가 녹색, 산화 스트레스 시 (그림 5A, 가기 막대 그래프 및 그림 5B 녹색 프로브, 긍정적인 %)에 대 한 긍정적인. 그러나, 48 h에 시간을 못쓰게 하는 것은 오렌지 형광 (그림 5A, 낮은 히스토그램 및 그림 5B 오렌지 프로브, 긍정적인 %)에 대 한 긍정적인 세포의 비율을 증가 않았다 . 이 마찬가지로 데이터 MFI로 제시 했다 반영 되었다. 이 모든 선생님의 최적의 검출, 48 h 못쓰게 시간 수 있습니다 더 이상 나왔다.

비용 또는 실험에 필요한 시간,을 감안할 때,이 분석 결과 수행 하는 키트의 사용 옵션을 않을 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 또한 키트에 제공 된 유사한 구성 요소를 테스트 하 고 표준 공급 업체 (Thermofisher, EMD 라면, 케이맨)에서 구입. 우리는 로드 셀에 대 한 구성 요소와 동일한 실험 프로토콜을 조달 개별적으로 사용 하 고 FcγR 자극, 우리는 우리가 관찰 키트 (그림 6A, B)를 사용 하 여 동일한 결과의 많은 정리 수 찾으십시오. 그러나, 형광 증가 자극 명백 했지만, 선생님 생산의 더 높은 수준의 키트를 사용 하 여 관찰 되었다. 이 개별적으로 조달된 부품의 사용 가능한 수 있습니다 하지만이 특정 분석 결과 대 한 최적화 추가 될 필요가 있을 것입니다 나타낼 수 있습니다.

마지막으로, 그것은 또한 세포 표면 얼룩이 선생님 프로브와 결합 수 설명 합니다. 우리는 알려진된 macrophage 마커, F4/80을 사용 하 여, 알 렉 사 647 활용 및 세포 표면 선생님 억제제, 선생님 유도, 또는 선생님 생산을 유도 하기 위해 특정 자극 치료 전에 얼룩을 수행. 그림 7B FcγR 교차 결합 시키는 대리인 및 FcγR 가교 에이전트 + 선생님 억제제 (그림 7B, 오렌지 vs 녹색 점 플롯) 대우 될 때 예상 대로 응답 하는 대 식 세포는에서 설명 합니다. 또한, 우리가 증가 오렌지를 볼 수 있습니다 또는 특별히 표시 된 F4/80에 의해 생성 된 녹색 형광 FcγR 교차 결합 시키는 대리인을 가진 처리에 따라 세포 선생님 억제제와 전처리와 감소 (그림 7Bf 4/80 대 녹색 및 F4/80 vs 오렌지 도트 플롯).

Figure 1
그림 1: 흐름 BMDMs의 적절 한 세대의 cytometric 평가. 야생 타입 BMDMs 생성 된 흠 없는 또는 FITC 반대로 마우스 F4/80 또는 알 렉 사 647 반대로 마우스 CD11b. FSC (x 축) vs SSC (y 축) 플롯 생성 된 스테인드 남았다 고 대 식 세포 (BMDMs)는 죽은 세포 파편을 제외 문이 되었다. FSC-H(x-axis) vs FSC-A (y 축)의 줄거리를 사용 하 여, 일 중 문 생성 되었습니다. Singlets에 게이팅, 히스토그램 중 FITC f 4와 함께/80 스테인드 셀 표시 생성 된 또는 APC CD11b는 isotype 비교 스테인드 컨트롤. A) CD11b 또는 f 4/80에 대 한 긍정적인 얼룩이 지는 세포의 95% 이상의 정확한 BMDM 차별화. B) 잘못 된 BMDM 차별화 어디 셀의 95%를 f 4/80에 대 한 긍정적인 얼룩이 지는 존재 하 고 2 봉우리 CD11b. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 녹색과 주황색 선생님을 사용 하 여 조사 하는 때 보상을 수행. 보상은 흠 없는 치료 셀 필요 합니다, 녹색 선생님과 스테인드 프로브 전지와 선생님 유도, 치료 그리고 셀 오렌지 선생님과 스테인드 프로브 선생님 유도로 치료. 흠 없는 치료 셀 점 플롯 사분면 게이트를 확인 하는 데 사용 됩니다. 데이터 셀 단독으로 어느 녹색 선생님 프로브 스테인드 또는 오렌지 선생님 프로브 및 선생님 유도 치료 이전에 표시 되 고, 후 보정 적용. 보상 매트릭스 다음 모든 후속 실험 샘플에 적용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 선생님 프로브와 평가 분석 결과 재현성의 녹색과 주황색을 사용 하 여 특정 FcγR 자극에 응답에서 선생님의 측정. 오렌지 선생님 프로브 및 야생-타입 골 수 유래 세포 (BMDMs) 생성, 액, 고 흠 없는 또는 녹색의 칵테일 스테인드 남았다. 얼룩진된 BMDMs FcγR cross-linking 통해 치료, 30 분, murine 반대로 BSA IgG1 + BSA를 사용 하 여 그들의 FcγRs를 통해 자극 또는 자극 전에 선생님 억제제로 치료 남아도 있었다. A) 점 플롯, 왼쪽 위, 오른쪽 위, 그리고 선생님 억제제의 감소는 특정 FcγR 자극에 따라 낮은 오른쪽 사분면에 셀의 비율에 있는 증가 보여주는. B) 막대 그래프 각 형광 채널의 각 프로브에 대 한 긍정적인 결정 셀 표식 게이트를 보여주는. C) 프레젠테이션 데이터의 각 프로브에 대 한 긍정적인 세포의 백분율 또는 MFI에 증가. 3 개의 독립적인, 대표적인 실험 되 게 됩니다. 3 실험 및 의미의 표준 오류에 대 한 평균 그래프에서 선으로 표시 됩니다. Fc XL, Fc cross-linking; NAC, N-아 세 틸-L-시스테인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 성공적이 고 차선 FcγR 자극의 예. 야생-타입 골 수 유래 세포 (BMDMs) 생성, 액, 고 흠 없는 또는 녹색의 칵테일 스테인드 남았다 고 오렌지 선생님 프로브. 얼룩진된 BMDMs FcγR cross-linking 통해 치료, 30 분, murine 반대로 BSA IgG1 + BSA를 사용 하 여 그들의 FcγRs를 통해 자극 또는 자극 전에 선생님 억제제로 치료 남아도 있었다. A) 점 플롯으로 성공적이 고 차선 자극에 대 한 대표적인 결과 표시 됩니다, 그리고 B) 히스토그램, 또는 C)의 비율 증가 MFI 또는 각 프로브에 대 한 긍정적인 세포. 성공적인 자극 쇼 오른쪽 왼쪽 상단, 상단에 형광을 증가 하 고 낮은 FL1 vs FL2 플롯의 오른쪽 사분면 MFI와 긍정적인 셀 FcγR 자극에 따라 각 프로브 스테인드의 비율을 증가. 차선의 자극 MFI 또는 긍정적인 세포의 비율에 최소한의 증가 보여줍니다. Fc XL, Fc cross-linking; NAC, N-아 세 틸-L-시스테인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. 못쓰게 시간 FcγR 자극 시 선생님 세대에 미치는 영향. BMDMs 생성 된, 24 또는 48 h에 대 한 준비가 끝났다 고 흠 없는 또는 녹색의 칵테일 스테인드 남았다 고 오렌지 선생님 프로브. 얼룩진된 BMDMs FcγR cross-linking 통해 치료, 30 분, murine 반대로 BSA IgG1 + BSA를 사용 하 여 그들의 FcγRs를 통해 자극 또는 자극 전에 선생님 억제제로 치료 남아도 있었다. 형광에 대 한 막대 그래프 A) 24 또는 48 h. B에 대 한 준비 하는 대 식 세포의 자극에 따라 각 프로브에 의해 유도 된) 24 또는 48 h. 못쓰게 세포에 대 한 준비 하는 대 식 세포의 자극에 따라 각 프로브에 대 한 긍정적인 세포의 비율 48 h에 대 한 결과 못쓰게 24 h에 대 한 대 식 세포에 비해 세포 오렌지 형광에 대 한 긍정적인 (또는 MFI FL2 채널 증가)의 % 증가. 3 실험 및 의미의 표준 오류에 대 한 평균 그래프에서 선으로 표시 됩니다. Fc XL, Fc cross-linking; NAC, N-아 세 틸-L-시스테인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6입니다. FcγR cross-linking에 cytometric 선생님 측정 흐름 서로 다른 업체에서 시 약을 사용 하 여. BMDMs 생성 했다, 24 h에 대 한 준비가 끝났다 고 흠 없는 또는 산화 스트레스와 초과 검출 프로브 칵테일 스테인드 남았다. 얼룩이 BMDMs 중 왼쪽된 치료, 자극과 선생님 유도, 30 분, murine 반대로 BSA IgG1 + BSA를 사용 하 여 그들의 FcγRs를 통해 자극 또는 FcγR cross-linking 통해 자극 전에 선생님 억제제로 치료를 했다. 프로브, 선생님 유도 및 선생님 억제제 했다 키트에서 사용 하거나 다른 공급 업체에서 별도로 구입 되었고 비슷한 농도에서 사용. A) 점 키트 및 비 키트 구성 요소를 사용 하 여 얻은 결과의 측면-의해-측면 비교를 보여주는 플롯. B) 히스토그램 키트 및 비 키트 구성 요소를 사용 하 여 얻은 결과의 측면-의해-측면 비교를 보여주는. Fc XL, Fc cross-linking; NAC, N-아 세 틸-L-시스테인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7입니다. FcγR cross-linking에 선생님 생산의 흐름 cytometric 측정으로 얼룩이 지는 세포 표면 결합. 사용 하 여 다양 한 형광 채널에 대 한 플롯 흠 없는 A) 점 또는 단독으로 얼룩진된 보상 컨트롤. 야생-타입 BMDMs 생성 했다, 24 h에 대 한 준비가 끝났다 고 흠 없는, 알 렉 사 647 안티 마우스 F4/80만, 녹색 선생님 프로브만 얼룩이 지 고 치료 선생님 유도, 스테인드 또는 오렌지 선생님만 조사 하 고 선생님 유도 치료와 스테인드 남았다. 흠 없는 치료 셀 점 플롯 사분면 게이트를 확인 하는 데 사용 됩니다. 플롯 채널 제대로 보상 하는 경우 예상 된 결과 보여 줍니다. 보상 행렬은 다음 모든 후속 실험 샘플에 적용 됩니다. B) 야생-타입 BMDMs 생성 했다, 24 h에 대 한 준비가 끝났다 고 알 렉 사 647 반대로 마우스 F4/80으로 물. 그 후, BMDMs 또는 왼쪽 unstimulated, 30 분, murine 반대로 BSA IgG1 + BSA를 사용 하 여 그들의 FcγRs를 통해 자극 자극 FcγR cross-linking 통해 이전 선생님 억제제로 치료 했다. 점 작 입증 특별히 F4/80 세포에 의해 생산 하는 녹색 또는 주황색 형광 검출 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

DCFH2-다 고 선생님의 DHE 기반 탐지 기술은 널리 사용14,15입니다. 사용의 용이성과 이러한 선생님 프로브 키네틱 microplate 형식에 대 한 적응성, 형광 현미경 검사 법 또는 흐름 cytometric 분석은 그들의 인기에 기여 했다. 그러나, 우리의 연구에서 FcγR 중재 하는 대 식 세포 기능, 거기 보이지 않았다 될 FcγR 상호 연결 된 셀의 흐름 cytometric 분석을 위한이 분석을 수행 하기 위한 표준 프로토콜. 평가 되는 analytes의 반응 특성을 감안할 때, 우리는 발견 타이밍 확인 재현성을 달성에 중요 한 중요성의 이다. 우리 또한 키네틱 microplate 분석 실험을 수행 했습니다, 하지만 있을 수 있습니다 넓은 가변성 형광의 강도 실험에서 실험, 통계 분석에 대 한 복제 집계 생물에 게 어려운. 흐름 cytometric 사용이이 프로브는 이러한 문제를 해결 하지만 합병증 없이 아니다 "선생님 양성" 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다. 이것은 특히 사실 교류 cytometer는 autosampler 장착 됩니다. 이 경우에, 많은 수의 샘플의 분석 셀 다양 한 자극에 노출 되는 시간의 양을 영향을 줍니다. 이 줄이기 위해 우리는 통합 샘플 분석 사이 지연 시간 분석 셀 비슷한 양의 시간에 대 한 자극된에 수행 되도록 프로토콜.

흐름 cytometric 선생님 분석에 또 다른 중요 한 요인은 적절 한 컨트롤의 포함 이다. 그것은 모든 실험 (이상) 모든 실험 있어야 하며 보상 컨트롤 우리가 나열이 프로토콜에는 과장 된 수 없습니다. 이들은 justifiably 샘플 필요한 경우를 제외 할 수 있을 뿐만 아니라 각 실험의 유효성을 확인 하는 것이 중요입니다. 이의 예로 세포 않았다 차별화/성숙 하지 적절 하 게 훨씬 낮은 선생님 생산 유도 치료도 함께 전시 하는 경우 있습니다. 또 다른 경우 높은 기저 선생님 신호 인 FcγR cross-linking, 이전 대 식 세포의 부적당 한 활성화 될 수 있습니다. 특정 FcγR 형광 신호 상호 표시 실종은 우리가 종종 발견 부족 유사한 분석을 수행 하는 다른 연구에서 또 다른 중요 한 제어와 함께에서 선생님 억제제의 사용. 이 연구에 사용 된 선생님 억제제 N-아 세 틸-L-시스테인, 보편적인 선생님 억제제로 간주 됩니다. 그러나, 하나는 특정 효소에 의해 생성 하는 선생님에 관심이, 다른 특정 선생님 억제제는 뿐만 아니라 분석 결과에 포함할 수 있습니다. 몇 가지 예로 mefanamic 산 (cyclooxygenase 종속 선생님 억제제), apocynin (NADPH 산화 효소-종속 선생님 억제제), 또는 allopurinol (세 산화 효소-종속 선생님 억제제) 등이 있습니다.

그것은 또한 무슨 실제로이 해독에 측정 되 고 이해 하는 중요 한입니다. 앞서 언급 했 듯이, DCFH2-다 여러 선생님 종,이 고 그래서, 다른14에서 한 선생님 종 차별 형광 녹색 조사에서 결과 사용할 수 없습니다. 마찬가지로, 오렌지 프로브 (가능성이 DHE), 비록 특정, superoxide로 자주 인용을 생산할 수 모두 초과 및 독립적인 superoxide 산화 HPLC 같은 추가 기술 사용 하지 않고 구별 수 없습니다. 그러나 15., "총 선생님" 또는 "유도 선생님" 호흡 파열 동안 측정의 목적을 위해 적절 한 제어와 함께 이러한 프로브를 사용에 대 한 수 있습니다 가능. 많은 새로운 형광 기반의 선생님 센서 등장 하거나 되 고 개발된11,13. 산화 환 원에 민감한 형광 단백질 같은 일부 그들의 가역 산화 때문에 선생님 생산의 동적 측정의 이점이 있다. 그러나,이 가능한 또는 원하는 항상 되지 않을 수 있습니다 세포의 유전자 조작 필요. 많은 경우에, 형광 프로브 기반 선생님 검색은 여전히 유효 하 고 유용한 도구, 같은 실험 하지 과장 실험은 표준화 된, 잘 통제 하 고 결론에서 파생 된.

이 상용 선생님 키트를 사용 하 여 혜택은 선생님 inducers, 청소부, 그리고 적정 한 조사를 포함 하 여 모든 필요한 시 약 포함 및 "준비--사용". 경우에 실험의 기간 (1 주일 이내 완료) 간단 하 게 것으로 예상 됩니다,이 키트를 구입 하거나 각 특정 구성 요소를 개별적으로 최적화할 필요 없이 흐름 cytometry 기반 선생님 탐지를 수행 하기 위한 더 비용 효율적인 방법을 제공할 수 있습니다. 우리 또한이 키트를 사용 하 여 특정 주 작동 근 (FcγR 자극)으로 설명 하 고 실험; 걸쳐 재현성을 보여 우리 선생님 세대;에 못쓰게 번의 효과 평가 우리는 비슷한 프로브, 억제제, 및 다른 회사;에서 inducers를 사용 하 여 비교 우리는 실패 한 실험;의 예를 제공 그리고 마지막으로, 우리는 이러한 선생님 프로브를 사용 하 여 얼룩이 지는 세포 표면 결합. 이 잠재적으로 적은 샘플 및 시 약 혼합된 인구 내의 다른 세포 유형에서 선생님의 동시 탐지를 위해 허락할 것 이다. 예를 들어,이 유용할 수 있습니다 특히 대 식 세포와 neutrophil 파생 선생님, FcγR 결 찰에 응답 수 있는 주요 세포 유형 사이 분화 하는 때. 긴 중간 기간 사이 수행 하는 여러 실험에 대 한 키트의 사용으로 이상적인 않을 수 있습니다. 시험의 여러 aliquots를 제공 하지 않습니다 하 고 재구성, 일단 제조업체만을 권장 (로 선생님 프로브는 반응성이 매우 높은) 시 약 일주일 내에서 사용할 수 있습니다. 그것은 예상이 기간 실험와 호환 되지 않습니다, 경우는 개별 시 약 보다는 키트를 별도로 구입 고 실험의 하루 동안에 재구성 하는 것이 좋습니다. 우리가 여기 보여줍니다, 더 개별적으로 구입한 부품의 최적화 또한 필요할 수 있습니다 이전에 분석 결과. 전반적으로, 우리는이 작품 cytometry 선생님 세대 reproducibly 측정을 사용 하 여 연구원에 대 한 유용한 리소스를 제공 합니다 바랍니다.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

저자는 Madelyn H. 밀러, 등 오마르 카 르도 나, Andjie Jeudy, Roopin 싱 실험실 유지와 마우스 식민지 유지 관리에 그들의 도움에 대 한 Tigno-아 랑 페 즈 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 연구에 대 한 지원 그랜트 R00 HL122365와 J.T.T-a 시작 자금에 의해 제공 된

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

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References

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면역학 그리고 감염 문제 145 반응성 산소 종 (선생님) flow cytometry Fc 감마 수용 체 (FcγR) Fc 수용 체 세포 호흡기 버스트
선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정
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Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J.… More

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

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