Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Hæmning af Aspergillus flavus vækst og aflatoksin produktion transgene majs udtrykker α-amylase hæmmer fra hjelmbønne purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at analysere Aspergillus flavus vækst og aflatoksin produktion i majs kerner udtrykker en svampedræbende protein.  Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis-udtrykker A. flavus stamme overvåges vi af infektion og spredning af svamp i modne kerner i realtid. Analysen er hurtig, pålidelig og reproducerbar.

Abstract

Aflatoksinforureningen i fødevare-og er en stor udfordring på verdensplan. Aflatoksiner, produceret af svampen Aspergillus flavus (A. flavus) er potent kræftfremkaldende, der væsentligt reducerer afgrøde værdi i majs og andre olie rig afgrøder som peanut udover alvorlig trussel for menneskers og dyrs sundhed. Forskellige metoder, herunder traditionelle avl, transgene udtryk for modstand knyttet proteiner og RNA-interferens (RNAi)-baseret vært-induceret genhæmning af kritiske A. flavus gen målene, evalueres for at øge aflatoksin modstand i modtagelige afgrøder. Tidligere undersøgelser har vist en vigtig rolle i α-amylase i A. flavus patogenese og aflatoksin produktion, tyder dette gen/enzym er et potentielt mål at reducere både A. flavus vækst og aflatoksin produktion. I denne forbindelse den aktuelle undersøgelse var forpligtet sig til at evaluere Heterolog ekspression (under kontrol af konstitutiv CaMV 35S -promotoren) af en hjelmbønne purpureus L. α-amylase inhibitor-lignende protein (AILP) i majs mod A. flavus. AILP er en 36-kDa protein, som er en kompetitiv inhibitor af A. flavus α-amylase enzym og tilhører lektin-arcelin-α-amylase inhibitor protein familie i fælles bønne. In vitro undersøgelser forud for det aktuelle arbejde havde vist AILP rolle i hæmning af A. flavus α-amylase aktivitet og svampevækst. Svampevækst og aflatoksin produktion i modne kerner blev overvåget i realtid ved hjælp af en normal god landbrugspraksis-udtrykker A. flavus stamme. Denne kerne screening assay (KSA) er meget enkel at sætte op og giver pålidelig og reproducerbar data på infektion og omfanget af spredning, der kunne kvantificeres for evalueringen af kimplasma og transgene linjer. Fluorescens fra stammen, normal god landbrugspraksis er tæt korreleret til svampe vækst, og i forlængelse heraf er det godt korreleret til aflatoksin værdier.  Målet med den nuværende arbejde var at gennemføre denne tidligere viden i et kommercielt vigtige afgrøder som majs til at øge aflatoksin modstand. Vores resultater viser en 35% – 72% reduktion i A. flavus vækst i AILP-udtrykker transgene majs kerner, som til gengæld oversat til en 62-88% reduktion i aflatoksinindholdet.

Introduction

Mykotoksin kontaminering af svampe slægterne, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumog Alternaria er et stort problem for fødevarer og foder afgrøder, der dyrkes på verdensplan1,2,3. Blandt disse plantepatogene svampe har Aspergillus den største skadelige indvirkning på afgrøde værdi og menneskers og dyrs sundhed. Aspergillus flavus (A. flavus) er en opportunistisk plante-patogen, der inficerer olie rig afgrøder såsom majs, bomuldsfrø og peanut og producerer de potent kræftfremkaldende stoffer, aflatoksiner, samt talrige giftige sekundære metabolitter (SMs). Majs er en vigtig fødevare og fodre afgrøder dyrkes på verdensplan og er meget modtagelige for forurening af A. flavus. De økonomiske konsekvenser af Aflatoksinforureningen på mister og reducerede værdi i majs kan være så meget som $686.6 mio i USA2 med forventede ændringer i globale klima, virkningen af aflatoksiner kunne resultere i større økonomiske tab i majs med skøn så højt som $1,68 milliarder pr. år i den i nærheden af fremtidige2. I betragtning af de negative økonomiske og sundhedsmæssige virkninger af aflatoksiner i mennesker og husdyr, kunne før høst aflatoksin kontrol i majs være den mest effektive måde at forhindre aflatoksinindholdet i levnedsmidler og foder produkter.

Den store før høst kontrol tilgang til aflatoksin resistens i majs, som har været udbredt i de seneste årtier er primært gennem avl, som kræver en betydelig mængde tid4. For nylig, biocontrol har haft en vis succes i aflatoksin reduktion i stor skala felt programmer5,6. Udover biocontrol, har anvendelse af avanceret Molekylær værktøjer såsom 'Vært induceret genhæmning' (HIGS) gennem RNAi og transgene udtryk for modstand-associerede proteiner haft en vis succes i reduktion af A. flavus vækst og aflatoksin produktion i lille målestok laboratorie- og undersøgelser. Disse tilgange er i øjeblikket ved at blive optimeret udover at identificere nye potentielle A. flavus gen mål for fremtidige manipulation.

Udover gener, der er direkte involveret i mykotoksin produktion som potentielle mål af transgene kontrolstrategier, har svampe amylaser vist sig at spille en afgørende rolle i at opretholde vellykket patogenese og mykotoksin produktion under vorden af værten plante infektion. Et par eksempler kan nævnes Pythium pleroticum (kausal agent af ingefær rhizom rot), Fusarium solani (kausal agent af blomkål visnesyge), hvor positive korrelationer mellem patogenicitet og α-amylase udtryk og aktivitet blev observeret 7,8. Hæmning af α-amylase aktivitet enten gennem gen knockout eller knockdown tilgange påvirker negativt svampe vækst og toksin produktion. En α-amylase knockout mutant af A. flavus var ude af stand til at producere aflatoksiner når dyrkes på stivelse substrat eller degermed majs kerner9. På samme måde i Fusarium verticillioides undladt en α-amylase knockout stamme at producere fumonisin B1 (mykotoksin) under infektion af majs kerner10. I en nyere undersøgelse viste Gilbert et al. (2018), at et RNAi-baserede banke ned af A. flavus α-amylase udtryk gennem HIGS betydeligt reduceret A. flavus vækst og aflatoksin produktion under majs kerne infektion11 .

Specifikke hæmmere af α-amylase aktivitet har også produceret lignende resultater som fremstillet af ned-regulering af α-amylase udtryk. Den første rapport om rollen af en α-amylase hæmmer i svampe modstand kom fra isolering og karakterisering af en 14-kDa trypsin-α-amylase hæmmer fra majs linjer resistente over for A. flavus12. Yderligere screening af flere hundreder af plantearter af Fakhoury og Woloshuk førte til identifikation af en 36-kDa α-amylase inhibitor-lignende protein (AILP) af frøene fra hyacinth bønner, hjelmbønne purpureus L.13. Peptid sekvensen af AILP lignede lektiner tilhører familien lektin-arcelin-α-amylase hæmmer rapporteret til fælles bean14,15. Renset AILP udviser ikke nogen hæmmende aktivitet mod pattedyr trypsin og yderligere in vitro-karakterisering viste betydelige hæmning af A. flavus vækst og conidial spiring13. Betænkninger her klart viser α-amylase kan tjene som et mål i kontrol tilgange til at begrænse patogener eller skadedyr, der afhænger af stivelse mobilisering (gennem α-amylase aktivitet) og erhvervelse af opløselige sukkerarter som energikilde under deres patogen interaktion med værtsplanter.

Alpha-amylase er kendt for at være kritiske i A. flavus patogenicitet9,10,11, og i betragtning af betydningen af AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylase hæmning/antigrowth)13, Vi genereret transgene majs planter at udtrykke hjelmbønne AILP gen den konstituerende CaMV 35S promotor. Målet var at undersøge hvis heterolog ekspression af denne α-amylase hæmmer i majs er effektiv mod A. flavus patogenese og aflatoksin produktion under majs kerne infektion. Vores resultater viser, at transgene majs kerner udtrykker AILP betydeligt reduceret A. flavus vækst og aflatoksin produktion under kerne infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmid konstruktioner og majs transformation

  1. PCR forstærke hjelmbønne AILP indsætte ved hjælp af primere 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'og 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. PCR omfatter en indledende denaturering skridt på 98 ° C til 30 s (trin 1), efterfulgt af denaturering på 98 ° C i 10 s (trin 2), udglødning ved 55 ° C i 30 s (trin 3), brudforlængelse ved 72 ° C i 20 s (trin 4), 31 cyklusser af trin 2 til trin 4 , og en afsluttende brudforlængelse trin ved 72 ° C i 5 min. klon PCR produktet i en modificeret pCAMBIA 1.300 vektor bruger Xbajeg og Pstjeg begrænsning websteder. Sekvens endelige plante destination vektor at bekræfte orientering og rækkefølgen af de klonede AILP gen i vektoren.
  2. Omdanne Agrobacterium stamme EHA101 med den endelige vektor konstruktion (figur 1) som tidligere beskrevet 16.
  3. Brug omdannet Agrobacterium indeholdende endelige plante destination vektor til at omdanne umodne majs (Zea mays L. Hi-II) embryoner (udføres på anlægget Transformation facilitet i Iowa State University) 16.
  4. Vokse T0 planter i drivhuset (26-29 ° C, 16/8 h lysperiode suppleret med højtryk Na-lamper) og gentagne gange selvbestøvende for at få T6 generation for at opnå homozygocitet for den transgene egenskab.

2. spore spiring assay

  1. Høste blad prøver og opbevares ved-80 ° C. Grind blad prøver med en morter og støder ved hjælp af flydende nitrogen. Afvejes 0,5 g i 2 mL microcentrifuge rør, tilføje 17 µL af protease hæmmer og placere rør på is.
  2. Der centrifugeres rør til 10 min på 16.000 x g. Overføre 225 µL af planteekstrakt 0,5 mL microcentrifuge rør og Anbring på is.
  3. Forbered en 5 mL sporeopslæmning af Aspergillus flavus 70 – normal god landbrugspraksis i 1% kartoffel dextrose bouillon (w/v) i en 15 mL-centrifugerør. Vortex og justere spore koncentration til 105 sporer/mL med et hæmocytometer.
    Forsigtig: A. flavus producerer aflatoksiner, alt arbejde med denne svamp bør gennemføres i en biologisk sikkerhed kabinet.
  4. Inkuber i FBF på 28 ° C, indtil kultur opnår 50% indledning af sporespiring som angivet af udbuling af sporer.
  5. Vortex og alikvot 25 µL spore løsning til 225 µL anlægget ekstrakt. Inkuber prøver i 20 timer ved 28 ° C med intermitterende rysten.
  6. Alikvot 25 µL af spore løsning på et objektglas og måle længden af Kim rør sporer ved hjælp af digitale kamera software. Bruge et minimum af 20 gentagne målinger for hver linje.
    Bemærk: På dette stadium, placere alle kulturer på 4 ° C for at stoppe koloni vækst indtil klar til at tælle.

3. kerne Screening Assay (KSA)

  1. Konstruere KSA caps ved at lime 4 snap caps (22 mm) i en 60 x 15 mm petriskål. Tillad limen skal tørre i 48 H før ved hjælp af caps. Hver KSA cap udgør en rep (figur 2).
  2. I en steril biologiske sikkerhed kabinet, spray en firkantet bioassay bakke (24 cm x 24 cm) med 70% ethanol: H2O (v/v) og lad lufttørre. Tilføje sterile kromatografi papir i bakken. Spray 9 KSA caps med 70% ethanol, lad luft tørre, og sætte i bakken bioassay.
  3. For hver transgene majs linje testes, Vælg 20 ubeskadigede kerner og anbringes i et 50 mL-centrifugerør. Tilføje 70% ethanol og lad sidde i 4 minutter. Ryst forsigtigt rør under sterilisering. Hæld ethanol og skyl kernerne tre gange i sterile deioniseret vand H2O.
  4. Forberede en sporeopslæmning af Aspergillus flavus 70 – normal god landbrugspraksis17 fra en 6 dage gammel kultur dyrket på V8 medium (5% V8 Juice, 2% agar, pH 5,2).
    1. Tilføj 20 mL sterilt 0,02% Triton X-100/deioniseret H2O (v/v) og skrot off sporer med en steril løkke. Med pipette overfoeres fra inokulum og sted i en 300 mL sterilt bæger.
    2. Forberede en 5-fold fortynding med 0,02% Triton X-100, derefter udføre en spore tæller med en hæmocytometer. Fortynd igen hvis det er nødvendigt at opnå 100 mL med en koncentration på 4 x 106 sporer/mL.
  5. Placere kernerne i en steril 300 mL bægerglas med rør bar. Tilføje inokulum over i bægerglasset.
    Forsigtig: Føje kerner til inokulum vil forårsage løsning til splash. Sted bægerglas på en røre pladen i 3 minutter. Efter 3 minutter, hæld inokulum i en tom bægerglas.
  6. Bruger en pincet, placere kernerne i bioassay parabol (1 kerne/cap). Tilsættes 30 mL deioniseret vand til bunden af hver bioassay bakke og inkuberes ved 31 ° C i mørke i 7 dage.
  7. Forberede kerner til fotografering.
    1. Der er afsat 4 kerner fra hver linje til mikroskopisk analyse og fotografering.
      Bemærk: Kerner kan opbevares ved 4 ° C i højst 5 dage før du fuldfører fotografering.
    2. Tage billeder af kerner efter syv dage efter podning med A. flavus (figur 3).
    3. Rent ydre af kerner med et blødt væv og deioniseret vand. Udføre langsgående dele af kerner og straks tage fotografier under fluorescerende mikroskop.
  8. Forberede kerner til analyse.
    1. Rent ydre af resterende kerner med et blødt væv og deioniseret vand.
    2. Sted 4 kerner, der udgør 1 rep, i en 15 mL skruelåg polycarbonat hætteglasset indeholdende 2 rustfrit stål bolde. Straks fryse hætteglas i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C indtil videre behandling og analyse.
    3. Fjerne hætteglas fra-80 ° C fryser og male kernerne i en homogeniseringsapparat på 1.500 rpm i 3 minutter.
      Bemærk: Hold kerner frosne med flydende kvælstof.

4. PCR screening af transgene majs kerner

  1. Bruge DNA isolering kit til at isolere genomisk DNA (gDNA) fra pulveriseret majs kerner inficeret med A. flavus ifølge producentens anvisninger. Kort, tilføje 280 µL buffer F, 20 µL protease og 3 µL dithiothreitol (DTT) til 10-15 mg pulveriseret majs kerner. Inkuber og ryste i en thermomixer (56 ° C, 1200 omdr. / min., 30 min). Der centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min og overføre klart supernatanten til afbalancerede kolonne. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min, og der centrifugeres ved 700 x g i 1 min til elueres gDNA.
  2. Tage 0,8 µL af uddraget gDNA at oprette en 20 µL PCR reaktion til hver prøve ved hjælp af en PCR kit. Følg termocycler betingelser, som det anbefales i producentens protokol. PCR omfatter en indledende denaturering skridt på 98 ° C i 5 min (trin 1) efterfulgt af denaturering på 98 ° C i 5 s (trin 2), udglødning ved 55 ° C i 5 s (trin 3), brudforlængelse ved 72 ° C i 20 s (trin 4), 40 cyklusser af trin 2 til trin 4 , og et afsluttende brudforlængelse skridt ved 72 ° C i 1 minut (trin 5).
  3. Brug fremad primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' og vende primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' til at bekræfte tilstedeværelsen af hjelmbønne AILP genet i transgene majs kerner.

5. RNA isolering, cDNA syntese og semi-kvantitative RT-PCR

  1. Take, homogeniseret A. flavus inficeret majs kerner tidligere opbevares ved-80 ° C for RNA udvinding. Uddrag RNA ved hjælp af en total RNA isolering kit efter producentens protokol, men med mindre ændring18. Efter tilføjer 50 mg af homogeniseret majs kerne pulver i udvinding buffer, bland det godt (uden vortexing) ved hjælp af en 1 mL pipette tip og overlade det på is i 5-6 minutter, før du fortsætter til efterfølgende trin som beskrevet i producentens protokol.
  2. Forberede cDNA ved hjælp af en cDNA syntese kit ifølge producentens protokol 18.
  3. Bruge 0,5 µL af ufortyndet cDNA pr. PCR reaktion til semi-kvantitative RT-PCR som tidligere beskrevet18. Bruge frem og bak primere qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' og qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' til henholdsvis opdage Hjelmbønne AILP genekspression, og frem og bak primere qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ og qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ henholdsvis for udtryk for majs ribosomale strukturel gen (Rib), GRMZM2G02483819 som et hus-holder gen.

6. normal god landbrugspraksis kvantitering

  1. Forberede 50 mL hver 0,2 M monobasic natriumfosfat (NaH2PO4) og 0,2 M dibasiske natriumfosfat (Na2HPO4·7H,2O) i ionbyttet H2O.
  2. Udgør 100 mL af pH 7,0 Sorenson fosfat buffer. Til pH 7,0, tilføje 19,5 mL NaH2PO4 bestand, 30,5 mL NaHPO4·7H2O lager og 50 mL deioniseret vand H2O.
  3. Afvejes 25 mg jorden kerne materiale (frisk vægt, FW) og placere i 1,0 mL microcentrifuge rør. Tilsæt 500 µL fosfat buffer til centrifugeglas og vortex for 30 s.
  4. Der centrifugeres prøver i 15 minutter på 16.000 x g. Afpipetteres 100 µL supernatanten ind i en sort 96 godt plade. Læs prøverne med en fluorometer (excitation 485 nm, emission 528 nm).

7. samlede aflatoksinindhold analyse

  1. Prøve behandling og aflatoksin udvinding
    1. Tør kerne prøver i en varmluft ovn i 2 dage ved 60 ° C. Vejer prøver og sted i en 50 mL Erlenmeyerkolben med en prop, glas.
    2. Tilføj 25 mL methylenchlorid til hver kolbe i et stinkskab.
      Forsigtig: Methylenchlorid er yderst flygtig og anses for farlige (irriterende, kræftfremkaldende). Hverken latex eller nitril handsker er sikker til at arbejde med methylenchlorid. Bruge forbedret organisk opløsningsmiddel resistente PolyVinylAlcohol handsker.
    3. Ryst prøver i 30 min. på et håndled handling shaker. Efter 30 min, langsomt hældes ekstraktet gennem et foldet filtrerpapir cirkel i en 80 mL bægerglas. Lad den tørre natten over i bægre i et stinkskab.
    4. Den næste dag, sprøjte methylenchlorid (ca. 5 mL) langs indvendigt kant af tørt bægerglas, hvirvles rundt og hæld 2 dram hætteglas. Efterlad hætteglas åbne til tørre i et stinkskab natten over.
  2. Aflatoksin analyse
    1. Tilføje 4,0 mL 80% methanol: deioniseret H2O (v/v) til hætteglas.
    2. Brug en aflatoksin udvinding kit til at filtrere rense metanolisk opløsning med den angivne kolonne. Analysere samlede aflatoksinindhold niveauer med en fluorometer, ifølge producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Majs transformation og molekylær screening af transgene planter

Umodne embryoner af majs Hi-II linjer var transformeret med Agrobacterium tumefaciens EHA101 stamme der indeholder den endelige plante destination vektor udtrykker hjelmbønne purpureus AILP genet under kontrol af CaMV 35S promotor. Fem uafhængigt transformerede majs linjer var avanceret til T6 generation for efterfølgende undersøgelser. De transgene majs planter var meget mindre og mindre energisk men viste ikke nogen andre abnormaliteter i forhold til isogene negativ kontrol planter. PCR-amplifikation af target AILP gen viste en 548 bp amplikon, observeret kun i de transgene majs linjer i forhold til kontrol planter (figur 4A). AILP gen viste udtryk i de transgene linjer der henviser til, at ingen AILP udtryk blev observeret i kontrol planter (figur 4B).

Aspergillus flavus spore assay med blad ekstrakter

Rå blad ekstrakter fra unge transgene majs planter blev udarbejdet af slibning i flydende N og centrifugering på 16.000 x g. Tidlige fase spire sporer blev udsat for bladekstrakt for 20 timer og den gennemsnitlige spore hyphal længde blev registreret fra 20 prøver. Hyphal længde fra sporer udsat for transgene blad ekstrakter viste en 58-80% reduktion i forhold til den negative kontrol (figur 5)

Aspergillus flavus vækst under kerne infektion

En kerne Screening Assay (KSA) blev udført for at undersøge væksten af A. flavus i de transgene og kontrol kerner. Udtryk af AILP -genet i transgene kerner påvirket negativt A. flavus vækst. A. flavus stamme bruges i den aktuelle undersøgelse indeholder en normal god landbrugspraksis reporter, som giver mulighed for overvågning og kvantificering af svampevækst i realtid. Betydelig reduktion i normal god landbrugspraksis fluorescens blev observeret i transgene AILP kerner i forhold til den isogene negative kontrol (figur 6). AILP linjer 4 og 5 viste en signifikant reduktion i svampevækst, 69 og 72%, henholdsvis, efterfulgt af de andre linjer hvor en nedsættelse på 35%-60% blev observeret i forhold til kontrol kerner (figur 7A).

Aflatoksin produktion i de inficerede kerner

Heterolog ekspression af AILP gen i majs resulteret i betydelig reduktion af aflatoksinindholdet i de transgene linjer vs kontrol. Aflatoksin dataene leveres her er den samlede aflatoksinindhold indhold fundet i inficeret kernerne. En 62-88% reduktion i aflatoksinindholdet blev observeret i AILP kerner i forhold til kontrol (figur 7B). Blandt de 5 forskellige AILP linier viste linje 4 laveste aflatoksinindholdet (486 ng/g DW), efterfulgt af andre linjer mellem 640-1,498 ng/g DW i kerner vs kontrol (3,986 ng/g DW).

Figure 1
Figur 1: Vektor design for transgene udtryk for Hjelmbønne AILP gen i majs. 35s = blomkålsmosaikvirus eller CaMV konstitutive promoter; RB = højre kant; LB = venstre kant; nptII = neomycin phosphotransferase-kanamycin resistens gen; NOS og 35s = transskription terminators. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kerne Screening Assay. (A, B) Sterilisere kerner og hæld i et sterilt bæger i en biologisk sikkerhed kabinet. (C-E) Podes kerner med A. flavus sporeopslæmning. (F-H) Med en steril pincet, placere kernerne i bioassay parabol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Lys micrographs af A. flavus vækst. (A) isogene negativ kontrol. (B-F) Gensplejsede kerner udtrykker AILP (linjer 1-5) en uge efter podning. Skalalinjen = 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Fig. 4. Molekylær screening af transgene planter. (A) PCR bekræftelse af transgene majs planter (baner 1-5) indeholdende Hjelmbønne AILP (548 bp diagnostiske DNA fragment; C = isogene negativ kontrol; NEB 2-Log DNA ladder anvendes som markør DNA). (B) udtryk for Hjelmbønne AILP genet i transgene majs linjer (baner 1-5) ved hjælp af RT-PCR. Lane C repræsenterer isogene negativ kontrol. Majs ribosomale strukturel gen (Rib), GRMZM2G02483819 blev brugt som et hus-holder gen (NEB 2-Log DNA ladder: markør DNA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Effekt af rå blad ekstrakter fra transgene AILP majs planter på A. flavus sporespiring sammenlignet med en isogene negativ kontrol (neg). Betyder adskillelse blev udført af Dunnett's posttest efter ANOVA. Niveauer af betydelig reduktion er angivet ved asterisker (***P ≤ 0,0001). Fejllinjer angive standard fejl af midler til 20 prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Normal god landbrugspraksis fluorescens stammer fra A. flavus stamme 70-NGL i gensplejsede kerner at udtrykke AILP efter en uge med bioassay. Isogene negative kontroller (A) blev brugt til at evaluere den svampeinfektion og spredes i gensplejsede kerner (B-F repræsenterer transgene linjer 1-5). Mindst fire kerner blev screenet for hver linje under de fluorescerende mikroskop. Skalalinjen = 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: En flavus vækst og aflatoksin produktion. (A) A. flavus 70-normal god landbrugspraksis infektion og vækst i majs kerner efter 7 dage i en kerne Screening Assay. Gennemsnittet af tre uafhængige forsøg med fire biologiske replikater hver gang. Normal god landbrugspraksis kvantificering (i Relative fluorescens enheder, RFU) angiver svampevækst i transgene majs linjer at udtrykke AILP til en isogene negativ kontrol. Betyder adskillelse blev udført af Dunnett's posttest efter ANOVA. Niveauer af betydelig reduktion er angivet med en asterisk (*P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Fejllinjer angive standard fejl af midler i fire randomiserede biologiske replikater. (B) aflatoksin produktion af A. flavus 70-NGL i majs kerner efter 7 dage i en kerne Screening Assay. Gennemsnit på 12 biologiske replikater og hver replikat indeholdt fire kerner. Aflatoksinindholdet i transgene AILP kerner (linjer 1-5) sammenlignet med en isogene negativ kontrol (neg). Betyder adskillelse blev udført af Dunnett's posttest efter ANOVA. Niveauer af betydelig reduktion er angivet ved asterisker (**P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Fejllinjer angive standard fejl af midler i fire randomiserede biologiske replikater. Se supplerende tal at se dataene i panelet B bias på grund af svampe hæmning. Tæt sammenhæng mellem normal god landbrugspraksis = RFU og aflatoksin værdier er også til rådighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sup Figure 1
Supplerende figur 1: Data fra figur 7B gentegnes for at vise aflatoksin produktion af A. flavus 70-NGL i majs kerner efter 7 dage i en kerne Screening Assay at fjerne skævheder på grund af svampevækst hæmning. Aflatoksin værdier blev divideret med svampevækst hæmning repræsenteret som normal god landbrugspraksis-RFU værdier i figur 7B. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sup Figure 2
Supplerende figur 2: tæt korrelation mellem normal god landbrugspraksis-RFU værdier (= svampevækst) og aflatoksinindholdet (r2 = 0,86) rapporteret i KSA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udbyttetab i landbrugsafgrøder som følge af patogener og skadedyr er et globalt problem20. I øjeblikket, anvendelse af syntetiske fungicider og pesticider er den fremherskende metode for kontrollerende plante patogener og skadedyr, men resterende toksicitet af disse biokemikalier i fødevarer og foder kan medføre alvorlig trussel for menneskers og dyrs sundhed21. I betragtning af den økonomiske betydning af majs som fødevarer og foder afgrøder, reduktion eller eliminering af Aflatoksinforureningen er af allerstørste betydning2,3,22. Konventionelle avl gennem resistente gen introgression i modtagelige sorter er en tidskrævende proces og så modstand er ikke altid stabile, som aflatoksin modstand er en polygeniske træk og udtryk for deltagende gener varierer betydeligt med ændringer i miljøparametre4. Alternative tilgange evalueres for at øge og stabilisere vært plante forsvar mod A. flavus på en miljøvenlig måde.

I den aktuelle undersøgelse valgte vi at evaluere effekten af AILP -genet fra hyacinth bønner i majs mod A. flavus. Som AILP er en kompetitiv inhibitor af α-amylase og også besidder svampedræbende egenskaber, udtrykt vi dette gen under en stærk konstitutive promoter CaMV 35S. Målet var at øge produktionen af denne heterolog protein i majs uanset udviklingsstadiet eller vævstype. Betydelig udtryk af α-amylase-genet i transgene majs linjer (figur 4AB) understøtter stabil udtryk for dette gen i en heterolog system. Dette påvirket negativt svampevækst som fremgår af reduktionen af rumlige fordeling af normal god landbrugspraksis fluorescens inde de inficerede AILP kerner og reduktion i samlede normal god landbrugspraksis fluorescens i kerner (figur 6 og figur 7A).

Udvikling af kerne Screening Assay (KSA) udnytter en gensplejsede A. flavus reporter stamme udtryk for et gen, der koder grøn fluorescerende proteiner (NGL) fra vandmænd Aequorea victoria18, 23. for at udforme strategier for enhver patogen, er det nødvendigt at forstå tilstanden af infektion, spredning og kolonisering i vært plante eller væv. Kolonisering og udbredelsen af aflatoxigenic saprophyte, A. flavus er ikke vel forstået fordi genetiske regulering af modstand mod patogenet, hvis en sådan findes, ikke er vel forstået. Anvendelse af normal god landbrugspraksis-udtrykker A. flavus stamme gør det muligt at spore i realtid infektion proces og kolonisering. Normal god landbrugspraksis stamme og wild-type ikke afviger væsentligt i pathogen aggressivitet og aflatoksin produktion23. Dog er normal god landbrugspraksis genet i denne særlige stamme anbragt under kontrol af den constitutively udtrykt glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (gpdA) gen promotor 24 som er mere tilbøjelig til at spore svampevækst. Dog har bruger denne plet på bomuldsfrø og majs kerner, vi vist en tæt sammenhæng mellem normal god landbrugspraksis fluorescens stammer fra svampen til svampevækst og aflatoksin niveauer18,23.

For at etablere en tæt sammenhæng med aflatoksin producerer evne, vil normal god landbrugspraksis drevet af aflatoksin gen initiativtagere omtA eller ver-125,26 være mere passende end gpdA. Normal god landbrugspraksis Fluorescens er følsom nok til at give mulighed for detektion og måling i realtid af selv små ændringer i svampevækst, både i in vitro og i plantaog evaluering af hæmmende aktiviteter af ukendt svampedræbende proteiner og peptider som AILP og andre11,17,18,23. Derudover resultater fra KSA korrelerer godt med feltet ydeevne af resistente eller modtagelige majs linjer med hensyn til evaluering for aflatoksin forurening27.

Af KSA er meget nyttig i vores laboratorium til skærmen klassisk avlet nye sorter4 og transgene linjer11,18. Det er nemt at oprette og udføre KSA i alle laboratorier. Man skal bruge ubeskadigede ren kerner til at udføre denne analyse, så en klar forståelse af vært plante-svampe interaktion kunne evalueres. Vi scanner rutinemæssigt alle kernerne, som vi bruger i vores laboratorium under et stereomikroskop før foretage analysen. Det skal bemærkes, at de betingelser, som vi anvender for KSA omfatter høj luftfugtighed (95% RH) og konstant temperatur (31 ° C). Med debut af simulerede spiringsproces under disse betingelser giver analysen ideelle betingelser at teste integritet af frø frakke, genetiske makeup af de kerner, herunder svampedræbende gener/proteiner tændt under spiringen, og/eller svampe infektion. Svampe infektion og aflatoksin produktion vil altid være højere i KSA i forhold til deres forekomst i feltet. imidlertid har en tæt sammenhæng blevet etableret4,27.

I denne KSA har vi vist, at AILP reducerer svampevækst i majs kerner. AILP besidder svampedræbende egenskaber af anlægget lektiner, og har vist at hæmme α-amylase, faldende stivelse opdeling og begrænse svampevækst. In vitro-undersøgelser viste, at AILP var i stand til at hæmme A. flavus var vækst i sukker-rige kartoffel dextrose bouillon (FBF) kunstig vækstmedium, med angivelse af dens svampedræbende/vækst hæmning aktivitet uafhængig af dets amylase hæmning aktivitet13. Andre plante lektiner isoleret fra Urtica dioica (fælles brændenælde), Hevea brasiliensis (gummi træ) og Solanum tuberosum (kartoffel) knolde også viser lignende svampedræbende egenskaber og hæmmet vækst af Botrytis cinerea , Pyrenophora triticiog Fusarium oxysporum28,29,30,31. Alpha amylase hæmmere er ikke kun effektiv mod svampe og bakterier, men også viste sig at være effektiv mod skadedyr32. Alpha amylaser er rapporteret at være kritisk for normal vækst og udvikling af plante-fodring insekter, og flere insekt α-amylase-hæmmere har været isoleret fra planter såsom hvede, fælles bean og majs12,33, 34,35. En betydelig reduktion i svampe hyphal længde fra sporer udsat for rå blad ekstrakter (figur 5), reduktion af svampevækst i AILP udtryk for majsen kerner som påvist ved reduktion af normal god landbrugspraksis fluorescens både kvalitativt ( Figur 6) og kvantitativt (figur 7A) er muligvis på grund af en kombination af dens α-amylase hæmning og svampedræbende egenskaber. Eksperimenter ved hjælp af disse AILP-udtrykker majs planter mod andre patogener og skadedyr i fremtiden vil være af stor interesse at teste dens effektivitet mod forskellige biotiske stressfaktorer af frø og vegetativt væv. Svampedræbende og vækst hæmning egenskaberne af lektin har primært tilskrevet sin cross-linking med chitin og hæmning af hyphal tip ekspansion28. I virkeligheden, in vitro-AILP-medieret hæmning af α-amylaser fra forskellige svampe- og bakterieinfektioner oprindelse viste over 65% hæmning i svampe patogener herunder A. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriaeog 41 % hæmning i den bakteriel patogen Bacillus subtilis13. Resultater på reduktion af A. flavus vækst præsenteres her er i overensstemmelse med betydningen af α-amylase hæmmere som svampedræbende midler. Den nuværende undersøgelsen yderligere viser praktiske anvendelse af sådanne nyttige oplysninger fra tidligere in vitro-undersøgelser.

Reduktion af aflatoksinindholdet (figur 7B) i AILP-at udtrykke majs linjer er muligvis på grund af hæmning af A. flavus α-amylase aktivitet, fører til formindsket opdeling af lagrede stivelse, og reduceret erhvervelse af sukker som en energikilde fra majs kerner under patogen interaktion. Som svampe α-amylase spiller en vigtig rolle i at bryde ned kerne stivelse, ændrer enhver ændring i svampe α-amylase aktivitet af AILP sandsynligt opløselige sukkerindhold under kerne infektion. Indhold af opløseligt sukker, især saccharose og glukose, er blevet stærkt korreleret med øget produktion af AFB1 og total aflatoksiner i majs og andre A. flavus modtagelige afgrøder som peanut36,37. Stigende saccharoseindhold i kunstig vækst medier øger A. flavus aflatoksin produktion38. Andre opløselige sukkerarter som glukose og maltose bidrager også positivt til aflatoksin produktion både i kunstige medier og frø substrater38. Hæmning af α-amylase aktivitet og reduktion af mykotoksin produktion i andre svampe styrker en vigtig rolle for svampe α-amylaser i toksin produktion under kerne infektion. Alpha-amylase knockout mutanter af både F. verticillioides og A. flavus undladt at fumonisin B1 og aflatoksiner henholdsvis efter infektion af majs kerner9,10. På samme måde, ned-regulering af A. flavus α-amylase væsentligt reduceret svampe vækst og aflatoksin produktion under majs kerne infektion11. En 62-88% reduktion i aflatoksin i de transgene linjer er i overensstemmelse med tidligere betænkninger om rollen af α-amylase i aflatoksin produktion. Det er værd at bemærke, at in vitro-kerne Screening Assay (KSA) er strengere end normalt findes under naturlige forhold. Betingelser under den in vitro assay er også yderst befordrende for aflatoksin produktion, så den procentvise ændring i aflatoksinindholdet i de transgene linjer kan være mere meningsfuld snarere end den absolutte tal af aflatoksinindholdet i inficeret kernerne. Resultaterne præsenteres her er lovende og fremtidige eksperimenter under feltforhold er vigtigt at undersøge potentialet i disse AILP-udtryk for majs linjer for aflatoksin modstand under et naturligt scenarium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker David Meints, University of Arkansas for hans hjælp med at udvikle og analysere den transgene majs under de tidlige generationer. Dette arbejde modtaget økonomisk støtte fra USDA-ARS CRIS-projektet 6054-42000-025-00D. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af den US Department of Agriculture. USDA-ARS' lig beskæftigelse lejlighed (EEO) politiske mandater lige muligheder for alle personer og forbyder diskrimination i alle aspekter af agenturets personalepolitik, praksis og operationer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Miljøvidenskab spørgsmålet 144 α-amylase inhibitor aflatoxin Aspergillus flavus majs kerne screening assay hjelmbønne purpureus majs genetisk modificeret
Hæmning af <em>Aspergillus flavus</em> vækst og aflatoksin produktion transgene majs udtrykker α-amylase hæmmer fra <em>hjelmbønne purpureus</em> L.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter