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コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

ここでコウジカビ flavusの生育および抗真菌性蛋白を発現するトウモロコシのアフラトキシン生産を分析するためのプロトコルを提案する. 我々 は、感染とリアルタイムで成熟したカーネルでは菌の拡散を監視 gfp 発現するA. flavusひずみを用いたします。アッセイは、急速な信頼性と再現性です。

Abstract

食品及び飼料作物のアフラトキシン汚染は、世界中の主要な課題です。アフラトキシン、病菌Aspergillus flavus (A. flavus) は、トウモロコシと人間や動物の健康に深刻な脅威のポーズ以外にもピーナッツのような他の石油の豊富な作物作物の値を大幅に削減する強力な発ガン性物質です。従来の育種、遺伝子組換え発現の抵抗性関連蛋白質と RNA 干渉 (RNAi) など、さまざまなアプローチ-重要なA. flavusのホスト-誘導性遺伝子のサイレンシングを用いた遺伝子ターゲットが増加する評価されて影響を受けやすい作物でアフラトキシン抵抗。過去の研究では、α-アミラーゼこの遺伝子・酵素を示唆、 A. flavus病態とアフラトキシン生産の重要な役割は、 A. flavusの生育とアフラトキシン生産の両方を削減する潜在的な目標を示しています。この点で、現在の研究は、 A. flavusに対するトウモロコシのフジマメ属液体l. の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の (構成 CaMV 35Sプロモーターの制御) の下で異種の式を評価する行われました。AILP A. flavus α-アミラーゼ酵素の競合阻害であり共通の豆のレクチン-arcelin-α-アミラーゼ阻害剤タンパク質ファミリーに属する 36 kDa 蛋白質であります。現在の仕事の前に、in vitro 試験は、 A. flavus α-アミラーゼ活性と真菌の増殖の抑制における AILP の役割を発揮していた。真菌の成長および成熟したカーネルでアフラトキシン生産は、gfp 発現するA. flavusひずみを使用してリアルタイムで監視されました。このカーネル スクリーニングアッセイ (サウジアラビア) を非常に簡単に設定し、感染症・定量化することができる広がりの程度遺伝と形質転換線の評価のため信頼性が高く、再現性のあるデータを提供します。GFP のひずみから蛍光が密接に相関する真菌の成長、延長によって、それはアフラトキシンの値に相関関係にあります。 現在の仕事の目標は、アフラトキシンの抵抗を増加するためにトウモロコシのような商業的に重要な作物でこの前知識を実装することでした。我々 の結果は、AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシのカーネルではターンでは、アフラトキシンの 62-88% 減少に翻訳するA. flavus成長 35-72% 減少を示します。

Introduction

真菌属、アルテルナリアペニシリウム、フザリウム麹菌によるマイコトキシン汚染食品の主要な問題は、飼料作物栽培世界中1,2,3.これらの植物病原性菌の中で麹菌がトリミングの値と人間や動物の健康に及ぼす悪影響最高です。コウジカビ flavus(A. flavus) は、トウモロコシ、綿、ピーナッツなどのオイル豊富な作物に感染する、強力な発ガン性物質アフラトキシン、多数の有毒な二次代謝産物 (SMs) を生成日和見植物病原体です。トウモロコシの重要な食糧は、世界的な栽培作物をフィードし、 A. flavusによる汚染に非常に敏感であります。アフラトキシン汚染の経済的影響を失うとトウモロコシの減少値が地球規模の気候に限り $ 6 億 8660 万/年の米国2予測の変更をすることができます、アフラトキシンの影響とトウモロコシの大きな経済的損失につながる近い将来2に $ 16 億 8000 万/年として、高い見積もり。人間や家畜にアフラトキシンの経済と健康の悪影響を考えると、トウモロコシの収穫前アフラトキシン コントロールは食品のアフラトキシン汚染を防止し、飼料製品を最も効率的な方法かもしれない。

最後の数十年間で広く使用されているトウモロコシのアフラトキシン抵抗の主要な収穫前コントロール アプローチは、4時間のかなりの量を必要とする繁殖を中心にです。最近、生物的防除は、大規模なフィールド アプリケーション5,6アフラトキシン削減いくつかの成功を収めています。生物的防除、ほか 『 ホストによる遺伝子サイレンシング 』 (HIGS) を RNAi など最先端の分子ツールのアプリケーションと耐性関連蛋白の遺伝子組換え発現は、 A. flavusの生育とアフラトキシンの削減にいくつかの成功を収めています。小規模な実験室とフィールド研究の生産。これらのアプローチは、今後の操作のための新しい潜在的なA. flavus遺伝子ターゲットを識別する作業に加えて現在最適化されています。

初期段階の間に成功した病態とマイコトキシンの生産を維持するために重要な役割を再生するマイコトキシン産生遺伝子制御戦略の潜在的なターゲットとしてプロセスに直接かかわる遺伝子以外にも真菌アミラーゼが示されています。ホスト植物の感染。いくつかの例を含めるPythium pleroticum (ショウガ根茎腐敗病菌)、新称(カリフラワー病の病原)、α-アミラーゼと病原性の発現と活性と正の相関関係がを認められました。7,8。遺伝子ノックアウトまたはノックダウン アプローチを通じての α-アミラーゼ活性の阻害は、真菌の成長および毒素生産悪影響を与えます。A. flavusの α-アミラーゼ欠損株では、澱粉基板または degermed トウモロコシ9上に成長した場合、アフラトキシンを生成できませんでした。同様に、フザリウム関係でノックアウト、α-アミラーゼのひずみはトウモロコシ10の感染中のフモニシン B1 (マイコトキシン) を生成する失敗しました。最近の研究でギルバートら (2018 年) を示した HIGS を行ったところ A α-アミラーゼ式の RNAi によるノックダウンがトウモロコシ カーネル感染11 A. flavusの生育とアフラトキシン生産を大幅に削減.

Α-アミラーゼの発現のダウンレギュレーションをから得られる、同様の結果を作り出したの α-アミラーゼ活性の特異的阻害剤も。カビ抵抗性の α-アミラーゼ阻害剤の役割の最初のレポートは、分離・ A. flavus12に抵抗力があるトウモロコシ系統から 14 kDa のトリプシン-α-アミラーゼ阻害剤の同定から来た。さらにヒヤシンス豆、フジマメ属液体l.13の種子から Fakhoury と 36 kDa の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の同定につながった Woloshuk によって植物種の数百のスクリーニング。レクチン-arcelin-α - アミラーゼインヒビターの家族に属しているに似ている AILP レクチンのペプチッド シーケンスは共通豆14,15を報告しました。精製 AILP は、哺乳類のトリプシンとさらに体外評価A. flavusの成長と胞子の発芽13, 有意に阻害を示した方はまったく阻害活性を示しません。報告書ここではっきりショー α-アミラーゼとして使用できる病原体または澱粉 (α - アミラーゼ) を動員と中にエネルギー源としての糖の獲得に依存する害虫を制限する制御アプローチでターゲットの宿主植物と病原菌の相互作用。

Α-アミラーゼは、 A. flavus病原性9,10、11、として強力な抗 -A. flavusエージェント (α-アミラーゼ阻害/antigrowth)13AILP の重要性を考えると重要なことに知られています。フジマメ属AILPを表現する遺伝子組換えトウモロコシ植物を生成した構成 CaMV 35S プロモーター遺伝子。目標は、トウモロコシのこの α - アミラーゼインヒビターの異種発現トウモロコシ カーネル感染時にA. flavus病態とアフラトキシン生産に対して有効である場合、調査することでした。大幅 AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシがカーネル感染時にA. flavusの生育とアフラトキシン生産を減らしたことを示した。

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Protocol

1 プラスミドの構造とトウモロコシの変換

  1. PCR 増幅フジマメ属AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'と 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' プライマーを使用して挿入します。PCR 条件を含める 30 98 ° C で初期変性ステップ 10 98 ° C で変性続いて s (ステップ 1)、s (手順 2)、30 55 ° C で熱処理 s (ステップ 3)、延長 20 の 72 ° C、s (ステップ 4)、ステップ 2 からステップ 4 の 31 のサイクル、と私は、 pst ファイル、最終伸長は 72 ° c で 5 分間Xbaを使用してベクトルの変更された pCAMBIA 1,300 に PCR の製品をクローン ステップ私制限のサイト。最終工場キャスト先のベクトル方向とベクトルでクローン化したAILP遺伝子のシーケンスを確認するシーケンスします。
  2. 以前説明した16としてアグロバクテリウムひずみ EHA101 最終的なベクトル構造 (図 1) を変換します。
  3. アグロバクテリウム植物キャスト先のベクトルを含む未熟なトウモロコシ (Zea mays l. こんにちは II) 胚 (アイオワ州立大学植物変換施設で実行されます) を変換するために変換された使用16。
  4. 温室効果 (26-29 ° C; 高圧ナトリウム ランプを添加した 16/8 h 日長) T0植物を育てるし、形質転換形質 homozygosity を達成するために T6世代を取得する繰り返し自家受粉します。

2. 胞子発芽アッセイ

  1. 葉のサンプルを収穫し、-80 ° C で保存乳鉢と乳棒を使用して液体窒素と葉のサンプルを挽きます。2 mL マイクロ遠心チューブ用で 0.5 g を量り、プロテアーゼ阻害剤、17 μ L を追加し、氷の上チューブを置きます。
  2. 16,000 x gで 10 分間のチューブを遠心します。0.5 mL の遠心管に植物エキスの 225 μ L を転送し、氷の上に配置。
  3. 15 mL 遠心管でコウジカビ flavus 70-1% ジャガイモ ブドウ糖液 (w/v) GFP の 5 mL 胞子懸濁液を準備します。渦と、haemocytometer と 10 の5胞子/mL に胞子濃度を調整します。
    注意: A. flavusはアフラトキシンを生成する、この菌で作業をすべては、生物学的安全キャビネットで 。
  4. 文化が胞子発芽胞子の隆起によって示されるように 50% 開始を達成するまで、28 ° C で PDB 内インキュベートします。
  5. 渦と 225 μ L 工場に分注 25 μ L 胞子ソリューションを抽出します。断続的な揺れの 28 ° C で 20 時間サンプルをインキュベートします。
  6. 胞子液顕微鏡スライドとメジャー生殖の長さ 25 μ L 分注チューブ デジタル カメラ ソフトウェアを使用しての胞子です。各ラインの 20 レプリケート測定値の最小値を使用します。
    注: この段階では、カウントする準備が整うまでコロニー成長を止めることの 4 ° C ですべての文化を配置します。

3. カーネル スクリーニングアッセイ (サウジアラビア)

  1. 4 スナップ キャップ (22 mm) 60 × 15 mm のペトリ皿を接着してサウジアラビア キャップを構築します。キャップを使用する前に 48 時間乾燥して接着剤を許可します。サウジアラビア cap ごと次々 (図 2) を構成します。
  2. 無菌生物学的安全キャビネット、70% エタノール: H2O (v/v) 正方形のバイオアッセイ トレイ (24 cm × 24 cm) をスプレーし、空気乾燥してみましょう。滅菌の濾紙をトレイに追加します。9 サウジアラビア キャップを 70% エタノール スプレー、空気乾燥とバイオアッセイのトレイに配置してみましょう。
  3. 遺伝子組換えトウモロコシ、各ラインのテストされている 20 破損していないカーネルを選択し、50 mL の遠心管に配置します。70% エタノールを加えて 4 分間座ってみましょう。滅菌中のチューブを軽く振る。3 回滅菌脱イオン H2o. でエタノールとリンスのカーネルを注ぐ
  4. コウジカビ flavus 70-6 日間の古い文化から GFP17 V8 培 (5 %v8 ジュース、2% 寒天、pH が 5.2) の胞子懸濁液を準備します。
    1. 20 mL 滅菌 0.02% トリトン X 100/脱イオン H2O (v/v) を追加し、滅菌ループを持つ胞子をスクラップします。接種と 300 mL 滅菌ビーカーに場所をピペットで移しなさい。
    2. 0.02 5-fold 希釈を準備 % トリトン X-100、haemocytometer と胞子カウントを行います。4 x 106胞子/mL の濃度で 100 mL を取得する必要に応じて再度希釈します。
  5. 攪拌棒滅菌 300 mL ビーカーにカーネルを配置します。接種をビーカーに加えます。
    注意: 接種にカーネルを追加するスプラッシュへの解決策になります。3 分間撹拌プレートにビーカーを置きます。3 分後に、空のビーカーに接種を注ぐ。
  6. バイオアッセイ皿 (1 カーネル/キャップ) カーネルを配置、鉗子を使用して、します。30 mL 各生物検定トレイの底には、純水し、7 日間, 暗闇の中で 31 ° C で追加します。
  7. 写真撮影のためのカーネルを準備します。
    1. 顕微鏡分析、写真撮影のために、各行から 4 のカーネル置いておきます。
      注: カーネルは、もはや写真を完了する前に 5 日間以上のための 4 ° C で保存できます。
    2. A. flavus (図 3) 接種の 7 日後に、カーネルの写真を撮る。
    3. 軟部組織と脱イオン水でカーネルのきれいな外観です。カーネルの縦断を実行し、すぐに蛍光顕微鏡下で写真を撮る。
  8. 分析用のカーネルを準備します。
    1. 軟部組織と脱イオン水で残りのカーネルのきれいな外観です。
    2. 場所 4 カーネルでは、15 mL スクリュー キャップ ポリカーボネートで、1 担当者を構成するバイアル含む 2 ステンレス鋼球です。すぐに液体窒素、-80 ° c 店でバイアルを凍結処理・解析まで。
    3. -80 ° C のフリーザーからバイアルを外し、3 分間、1,500 rpm でホモジナイザーでカーネルを挽きます。
      注意: カーネルを液体窒素で凍結します。

4 遺伝子組換えトウモロコシの PCR のスクリーニング

  1. DNA 抽出用キットを使用して、 A. flavus製造元の指示に従って感染粉砕トウモロコシからゲノム DNA (gDNA) を分離します。簡単に言えば、粉砕のトウモロコシの 10-15 mg 280 μ L バッファー F、20 μ L プロテアーゼ 3 μ L ジチオトレイトール (DTT) を追加します。孵化させなさい、(56 ° C、1,200 rpm, 30 分) thermomixer で振る。1 分の 10,000 × g で遠心分離し、明確な上澄みを釣合い列に転送します。3 分および gDNA を溶出する 1分間 700 × gで遠心するため室温で孵化させなさい。
  2. 0.8 μ L の PCR キットを使用して各サンプルの 20 μ L の PCR 反応を設定する抽出された gDNA を取る。製造元のプロトコルで推奨されているサイクル条件に従います。PCR 条件を含める 5 98 ° C で変性が続く 5 分 (ステップ 1) 98 ° C で初期変性ステップ s (手順 2)、5 55 ° C で熱処理 s (ステップ 3)、延長 20 の 72 ° C、s (ステップ 4)、ステップ 2 からステップ 4 の 40 のサイクル、と 72 ° c 1 分 (ステップ 5) 最終的な延長のステップ。
  3. 前方プライマー 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3 を使用して、' 逆プライマー 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3、' フジマメ属AILPの存在を確認する遺伝子組換えトウモロコシの遺伝子。

5. RNA の隔離、cDNA 合成と半定量的 RT-PCR

  1. 均質化を取るA. flavus感染-80 ° C、RNA の抽出に以前格納されているトウモロコシ。トータル RNA 分離キット製造元のプロトコルによると、わずかな修正18を使用して RNA を抽出します。抽出バッファーで均質化されたトウモロコシ カーネル粉末 50 mg を追加した後も (ボルテックス) なしで 1 mL ピペット チップを使用してそれをミックスしておきます氷の上進む前に 5-6 分以降の手順を製造元のプロトコルで説明されているよう。
  2. 製造元のプロトコル18によると cDNA 合成キットを使用して cDNA を準備します。
  3. 以前説明した18として半定量 RT-PCR のため 0.5 μ L の PCR 反応あたり原液 cDNA を使用します。前方および逆プライマー qAILP F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3 の使用 ' と qAILP-R は 5'フジマメ属 AILPの遺伝子発現を検出し、前方および逆引きプライマー qRib F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ と qRib-R にそれぞれ 3' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA -トウモロコシ リボソーム構造遺伝子 (リブ) GRMZM2G02483819の家は維持遺伝子としての表現のためにそれぞれ 3ʹ 5ʹ TCAGTCCAACTTCCAGAATGG

6. GFP 定量

  1. 各 0.2 M 塩基性リン酸ナトリウム (NaH2PO4) と 0.2 M 塩基リン酸ナトリウム (Na2HPO4·7H2O) 脱イオン H2o. の 50 mL を準備します。
  2. 100 mL pH 7.0 ソレンソン リン酸バッファーを構成します。PH 7.0, 追加 19.5 mL NaH2PO4株、30.5 mL4NaHPO ·7H2O 株式と 50 mL の脱イオン H2o.
  3. 25 mg 地面カーネル素材 (新鮮な重量、FW) 重量を量り、1.0 mL 遠心チューブに配置します。遠心管と 30 の渦に 500 μ L リン酸バッファーを追加 s。
  4. 16,000 x gで 15 分遠心分離機のサンプル。黒 96 well プレートにピペット 100 μ L 清。蛍光光度計 (励起 485 nm、発光 528 nm) とサンプルを読みます。

7. 総アフラトキシン分析法

  1. サンプルの処理とアフラトキシンの抽出
    1. 60 ° C で 2 日間の強制空気オーブンで乾燥カーネル サンプルサンプルの重量を量る、50 mL のガラス栓付け三角フラスコに配置します。
    2. 発煙のフード各フラスコに 25 mL の塩化メチレンを追加します。
      注意: 塩化メチレンは非常に揮発性と有害 (刺激、発ガン性物質) であります。ラテックスもニトリル手袋は、塩化メチレンの使用に対して安全です。改良された有機溶媒耐性ポリビニル アルコール手袋を使用します。
    3. 手首のアクション シェーカーで 30 分間試料を振る。30 分後ゆっくりと 80 mL ビーカーにフルーティングを施されたフィルター ペーパー サークルを通じて抽出液を注ぐ。ヒューム フードのビーカー一晩乾燥をしましょう。
    4. 次の日、噴出中を塩化メチレン (約 5 mL) 乾燥ビーカーのリム、周り旋回、2 dram ガラス瓶に注ぐ。発煙のフードで一晩乾燥させる残すバイアルを開きます。
  2. アフラトキシン分析法
    1. 4.0 mL 80% メタノールを追加: H2O (v/v) バイアルに純水します。
    2. フィルターするアフラトキシン抽出キットを使用は、指定された列のメタノール溶液を浄化します。製造元の指示に従って、蛍光光度計の総アフラトキシン レベルを分析します。

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Representative Results

トウモロコシの変換と遺伝子組換え植物の分子のスクリーニング

フジマメ属液体 AILP発現 CaMV 35Sの制御の下で最終的な工場先ベクターを含むアグロバクテリウムEHA101 ひずみを用いたトウモロコシのやあ II 系統の未熟胚が変形しました。プロモーター。5 独立して変換されたトウモロコシ系統 T6 世代その後の研究のために高度であった。遺伝子組換えトウモロコシ植物ははるかに小さいとより積極的なが同質遺伝子陰性対照の植物に比べて他の異常を示さなかった。AILPの標的遺伝子の PCR 増幅を示した 548 bp の増幅、制御植物 (図 4 a) と比較して遺伝子組換えトウモロコシ系統でのみ観測されました。コントロール植物 (図 4 b) AILP式認められなかったに対し、 AILP遺伝子は形質転換線の式を示した。

コウジカビ flavusエキスの葉と胞子の試金

原油の葉は植物が研削液 N と 16,000 × gで遠心分離により作製した若い遺伝子組み換えトウモロコシから抽出します。初期段階の発芽胞子が葉エキス 20 時間にさらされ、20 個のサンプルから平均胞子菌糸長さが記録されました。胞子から菌糸の長さはネガティブ コントロール (図 5) と比較して 58%-80% の減少を示した遺伝子組換え葉抽出物にさらさ

コウジカビ flavusカーネル感染中の成長

カーネル スクリーニング アッセイ (サウジアラビア) は形質転換および制御のカーネルでは、 A. flavusの生育を検討を行った。トランスジェニック カーネルにおけるAILP遺伝子の発現は、 A. flavusの生育を悪影響を及ぼします。現在の研究で使用されるA. flavusひずみには、監視を可能にする GFP レポーターとリアルタイムで真菌の増殖の定量が含まれています。(図 6) 同質遺伝子陰性対照と比較して遺伝子の AILP カーネルで GFP 蛍光の有意な減少が観察されました。AILP ライン 4 と 5 を示した大幅に削減 69%, 72% で菌の増殖で、コントロール カーネル (図 7 a) と比較して 35%-60% 減少を認めた他の行が続きます。

感染したカーネルでアフラトキシン生産

トウモロコシにおけるAILP遺伝子の異種発現はアフラトキシン コンテンツ コントロールと形質転換線での大幅な削減で起因しました。アフラトキシン データ記載の感染したカーネルで検出された総アフラトキシンのコンテンツです。アフラトキシン コンテンツ 62-88% 減は、コントロール (図 7 b) と比較して AILP カーネルで観察されました。5 つの AILP 行の間では、ライン 4 は 640 1,498 ng/g コントロール (3,986 ng/g DW) 対カーネルで DW の範囲内の他の行に続いて最低アフラトキシン コンテンツ (486 ng/g DW) を示した。

Figure 1
図 1:トウモロコシのフジマメ属 AILP遺伝子の形質発現のベクター デザイン。35 秒 = カリフラワー モザイク ウイルスまたは CaMV 構成プロモーター。RB = 右側の境界線。LB = 左の境界線。nptII = ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ カナマイシン耐性遺伝子;nos と 35 秒転写ターミネータを =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:カーネル スクリーニングアッセイします。(A, B)カーネルを殺菌し、生物学的安全キャビネット滅菌ビーカーに注ぐ。(C – E)A. flavus胞子懸濁液とカーネルを接種します。(F – H)滅菌鉗子を使用して、バイオアッセイ皿にカーネルを配置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: A. flavus成長の顕微鏡の光します。(A) 同質遺伝子陰性対照。(B – F)トランスジェニックのカーネルは接種 1 週間後 AILP (ライン 1-5) を表現します。スケール バー = 1 cm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4 。遺伝子組換え植物の分子スクリーニングします。遺伝子組換えトウモロコシ (レーン 1-5) の (A) PCR 確認フジマメ属 AILPを含む (548 bp 診断 DNA 断片;C = 同質遺伝子陰性対照;NEB 2 ログ DNA ラダー DNA マーカーとして使用)。フジマメ属 AILP遺伝子組換えトウモロコシ系統 (レーン 1-5) の (B) 式 RT-PCR を使用しています。C レーンは、同質の否定的なコントロールを表します。トウモロコシ リボソーム構造遺伝子 (肋骨)、19の家は維持遺伝子として使われていた GRMZM2G024838 (NEB 2 ログ DNA ラダー: DNA マーカー)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5 。原油葉の効果を同質のネガティブ コントロール (neg) と比較してA. flavus胞子発芽に遺伝子組換えトウモロコシ AILP 植物から抽出します。平均分離は、分散分析後 Dunnett のポストテストによって行われました。レベルの大幅な削減は、アスタリスクによって示されます (* * *P ≤ 0.0001)。誤差範囲は、20 サンプルの平均の標準誤差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6 。生物検定の 1 週間後 AILP を表現する遺伝子組換えのカーネルではA. flavusひずみ 70-GFP から発せられる GFP 蛍光します。同質のネガティブ コントロール (A) は、真菌感染症の評価、トランスジェニック カーネル (B Fトランスジェニックは行 1-5 を表す) で広がるに使用されました。少なくとも 4 つのカーネルは、蛍光顕微鏡下で行ごとに上映されました。スケール バー = 2 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 、Flavusの生育とアフラトキシン生産。(A) A. flavus 70 GFP 感染とカーネルのスクリーニングの試金で 7 日後トウモロコシの成長。4 生物と 3 つの独立実験の平均は、たびにレプリケートします。GFP の定量化 (相対蛍光単位、RFU) では、同質のネガティブ コントロールにAILPを表現する遺伝子組換えトウモロコシ系統で真菌の増殖を示します。平均分離は、分散分析後 Dunnett のポストテストによって行われました。レベルの大幅な削減は、アスタリスクによって示されます (*P ≤ 0.05; * *P ≤ 0.01; * * *P ≦ 0.001)。誤差範囲は、4 つの無作為化比較生物学的複製手段の標準誤差を示します。(B) カーネルのスクリーニングの試金で 7 日後トウモロコシのA. flavus 70 GFP によるアフラトキシン生産。12 生物的複製し、各レプリケートのなかには、4 つのカーネルが含まれています。アフラトキシン同質のネガティブ コントロール (neg) と比較して遺伝子組換えAILPカーネル (ライン 1-5)。平均分離は、分散分析後 Dunnett のポストテストによって行われました。レベルの大幅な削減は、アスタリスクによって示されます (* *P ≤ 0.01; * * *P ≦ 0.001)。誤差範囲は、4 つの無作為化比較生物学的複製手段の標準誤差を示します。真菌の抑制によるバイアスを欠いているパネルBにデータを表示する補足の図を参照してください。GFP の相関を閉じる = RFU とアフラトキシン値はまた提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Sup Figure 1
補足図 1: データから図 7 b アフラトキシン生産をトウモロコシでA. flavus 70 GFP で真菌の増殖抑制によるバイアスを排除するためにカーネル スクリーニング アッセイで 7 日後に再描画されます。アフラトキシン値図 7Bの GFP RFU 値として表される真菌の増殖阻害によって分けられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Sup Figure 2
補足図 2: GFP RFU 値 (= 真菌の増殖) とアフラトキシン レベルの相関を閉じます (r2 = 0.86)、サウジアラビアの報告します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

病原体や害虫による農作物の収量の損失は、地球規模の問題20です。現在、合成殺菌剤と殺虫剤のアプリケーションが制御する植物病原菌や害虫のための有力な手段が、これらの発酵食品や飼料中の残留毒性は人間と動物の健康21に深刻な脅威を提起できます。食品と飼料作物としてトウモロコシの経済的重要性を考えるの削減やアフラトキシン汚染の除去は最も重要な2,3,22のです。時間のかかるプロセスであり、そのような抵抗は常に不安定なアフラトキシン抵抗はポリジーン形質と参加している遺伝子の発現が大きく異なる罹病性品種に抵抗性遺伝子遺伝子浸透を通じて従来の育種環境パラメーター4の変化。代替的なアプローチが増加し、環境にやさしい方法で行ったところ Aに対するホスト植物防御の安定評価されます。

現在の研究では、 A. flavusに対するトウモロコシのヒヤシンス豆からAILP遺伝子の有効性の評価にしました。AILP は α-アミラーゼの競争力阻害剤も抗真菌特性を持っている、我々 は強力な構成プロモーター CaMV 35Sこの遺伝子を表明しました。目標は、この異種タンパク質の発達段階や組織の種類に関係なくトウモロコシの生産を増加させることでした。Α-アミラーゼ遺伝子組換えトウモロコシ系統 (図 4 a, B) の重要な式は、異種システムでこの遺伝子を安定に発現をサポートします。これは、GFP 蛍光感染 AILP カーネル内部の空間分布の緩和、(図 6および図 7 a) のカーネルでは全体的な GFP 蛍光から明らかなように真菌の成長に悪影響。

カーネル スクリーニング アッセイ (サウジアラビア) の開発を利用して遺伝子組み換えオワンクラゲ18,クラゲから緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子を表現するA. flavus記者ひずみ23. すべての病原体の制御戦略を考案する、感染と宿主植物または組織内で植民地化のモードを理解する必要があります。植民地化および aflatoxigenic 腐生植物の広がりでは、 A. flavusはよく理解して、病原体抵抗性の遺伝的制御 1 の場合はよくわかりませんので。Gfp 発現するA. flavusひずみの使用感染プロセスや植民地化をリアルタイムで追跡することが可能になります。GFP ひずみと野生型は、病原体の攻撃性とアフラトキシン生産23で有意差はなかった。ただし、この特定の緊張で GFP 遺伝子は恒常発現グリセルアルデヒド リン酸脱水素酵素 (gpdA) 遺伝子プロモーターの24真菌の成長を追跡するよりがちである制御の下で配置されます。ただし、綿実、トウモロコシのこの汚れを使用して、我々 は、真菌の成長とアフラトキシン レベル18,23に菌から発せられる GFP 蛍光の密接な関係を示しています。

アフラトキシン生産能と密接な相関関係を確立、 omtA などver-125,26アフラトキシン遺伝子プロモーターによるgfpにgpdA. よりもより適切ななりますGFP の蛍光が検出と菌の増殖の些細な変化のリアルタイムでの測定を可能にするのには十分に敏感な体外との植物、内外未知の抗真菌タンパク質・ ペプチドの阻害活性の評価AILP など11,17,18,23。さらに、結果、サウジアラビアからアフラトキシン汚染27評価に関しての耐性や影響を受けやすいトウモロコシ系統のフィールドのパフォーマンスとよく相互に関連付けます。

サウジアラビアは画面古典的な繁殖新しい品種4およびトランスジェニックは行11,18研究室で非常に便利です。設定し、研究室では、サウジアラビアを実行する簡単です。1 つは破損していないきれいなカーネルを使用して、植物と菌類との相互作用の明確な理解を評価できるように、この分析を実行する必要があります。我々 は日常的にアッセイを行う前に顕微鏡下で研究室で用いているすべてのカーネルをスキャンします。高湿度 (相対湿度 95%) と一定した温度 (31 ° C)、サウジアラビアの採用条件が含まれていることに注意してください。これらの条件の下でシミュレートされた発芽過程の始まり、アッセイ、種皮の整合性、オンに発芽、または真菌抗真菌の遺伝子/蛋白質を含むカーネルの遺伝的構成をテストするための理想的な条件を提供します。感染症。真菌感染とアフラトキシン生産はフィールドの発生と比較してサウジアラビアで高く常になります。しかし、密接な相関関係は確立された4,27をされています。

このサウジアラビアで AILP がトウモロコシで真菌の増殖を減少させることを確認しました。AILP 植物レクチンの抗真菌特性を持っているし、デンプンの分解を減少し、真菌の増殖を制限する α-アミラーゼを阻害することが示されています。研究を示したこと AILP A. flavusを妨げることができる生体外で砂糖豊富なジャガイモ デキスト ロース スープ (PDB) 人工的な成長媒体、その抗真菌剤・成長抑制活性を示すの成長はアミラーゼ阻害から独立しました。活動13。その他植物レクチンパラゴムノキ(ゴムの木) およびジャガイモ(バレイショ) 塊茎も同様の抗真菌薬のプロパティ表示セイヨウイラクサ(一般的なイラクサ) から分離され、灰色かび病菌の増殖を阻害、 Pyrenophora コムギ、とフザリウム病菌の28,29,30,31。Α アミラーゼ阻害剤は、カビや細菌に対する効果しますですが、また害虫32に対して有効であることが示されました。Α アミラーゼは正常な成長と植物餌昆虫の開発の重要なことが報告され、いくつかの昆虫の α-アミラーゼ阻害剤は小麦、インゲン、トウモロコシ12,33など植物から分離されています。 34,35。原油葉抽出物 (図 5)、AILP 表現するトウモロコシにおけるカビの減少にさらさの胞子から真菌の菌糸の長さを大幅に削減質的 GFP 蛍光両方の減少によって示されるようにカーネル (図 6) (図 7 a) はおそらくその α-アミラーゼの阻害と抗真菌薬のプロパティの組み合わせによる定量的と。その他の病原体に対する植物のこれらの AILP を表現するトウモロコシを用いた実験、害虫は、将来的に種子や植物組織の多様な生物的ストレッサーに対してその有効性をテストするのには大きな関心のされます。レクチンの抗真菌剤と成長阻害特性は、主にキチンと菌糸先端拡大28の阻害、架橋に起因しています。実際には、多様な真菌や細菌の起源の α-アミラーゼの in vitro における AILP を介した抑制を示した 65% 以上A. flavus、いもち病、胡麻ウィクトリアェ、41 など病原菌の抑制細菌の病原体枯草13% 抑制。ここに示すA. flavus成長の減少の結果は、抗真菌薬としての α-アミラーゼ阻害剤の役割の沿ったものです。さらに現在の研究は、in vitro 試験以前からこのような有用な情報の実用的なアプリケーションを示します。

AILPでアフラトキシン コンテンツ (図 7 b) の削減-トウモロコシ系統を表現するストアド澱粉の減少の内訳につながる、 A. flavus α-アミラーゼ活性の阻害が原因は可能性ありとして糖の買収を削減、病原性の相互作用の中にトウモロコシの穀粒からエネルギー源。真菌の α-アミラーゼは、カーネル澱粉分解において重要な役割を果たしていると AILP 可能性が高い真菌の α-アミラーゼ活性の変化は、カーネル感染中に可溶性糖含量を変更します。糖、スクロース、グルコース、特にコンテンツと高い AFB トウモロコシ1と総アフラトキシン ピーナッツ36,37などその他A. flavus敏感な穀物の生産は増加と相関しています。人工的な成長メディアにおけるスクロース含量を増加すると、 A. flavusアフラトキシン生産38。グルコースやマルトースなど他の糖はアフラトキシン生産両方の人工メディアと種子基板38にも積極的に貢献します。Α-アミラーゼ活性および他の菌類にマイコトキシン産生量の減少の抑制は、真菌の α-アミラーゼ カーネル感染中に毒素産生の重要な役割を強化します。Α-アミラーゼ ノックアウト変異体関係とA. flavusフモニシン B1及びアフラトキシン トウモロコシ9,10の感染をそれぞれ次の生成に失敗しました。同様に、 A. flavus α-アミラーゼの発現低下はトウモロコシ カーネル感染11中に真菌の成長とアフラトキシン生産を大幅削減。形質転換線中のアフラトキシンの 62% から 88% 削減、α-アミラーゼ アフラトキシン生産の役割の以前の報告書。体外カーネル スクリーニング アッセイ (サウジアラビア) は自然条件下で通常見られるより厳しく注意されるべきです。アフラトキシン含有形質転換線の変化率は感染したカーネルでアフラトキシン コンテンツの絶対数ではなくわかりやすいかもしれないので、in vitro アッセイ中条件が高いアフラトキシン生産を助長も。ここで示した結果が有望と圃場条件下での実験が将来、これらのAILPの可能性を検討することが重要-自然なシナリオの下でアフラトキシン抵抗性トウモロコシの線を表現します。

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Disclosures

著者は利害の対立があります。

Acknowledgments

デビッド Meints、アーカンソー大学の開発と初期世代の中に遺伝子組み換えトウモロコシを分析の彼の援助に感謝いたします。この仕事は、USDA-ARS クリス プロジェクト 6054-42000-025-00D の金融サポートを受け取った。商号またはこの資料の商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省アルス ' 平等雇用機会均等政策すべての人に平等な機会を義務付けし、代理店の人事政策、プラクティス、および操作のすべての面で差別を禁止します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

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References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

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<em>コウジカビ flavus</em>の生育と遺伝子組換えトウモロコシは<em>フジマメ属液体</em>l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害
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