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Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Abstract

Contaminação por aflatoxinas em culturas alimentares e alimentos para animais é um grande desafio em todo o mundo. As aflatoxinas, produzidas pelo fungo Aspergillus flavus (a. flavus) são potentes agentes cancerígenos que reduzem substancialmente o valor das culturas de milho e outras culturas de óleo rico como amendoim além de posar uma ameaça grave para a saúde humana e animal. Diferentes abordagens, incluindo tradicionais de reprodução, expressão transgênica da resistência associada a proteínas e RNA de interferência (RNAi)-com base induzida pelo anfitrião silenciamento de crítica a. flavus alvos de gene, estão sendo avaliados para aumentar resistência de aflatoxina em culturas sensíveis. Após estudos têm mostrado um importante papel de α-amilase em produção de patogênese e aflatoxina a. flavus , sugerindo que este gene/enzima é um alvo potencial para reduzir o crescimento da . flavus e produção de aflatoxina. A este respeito, o atual estudo foi realizado para avaliar uma expressão heteróloga (sob controle do promotor constitutivo CaMV 35S ) de uma proteína de como inibidor de α-amilase Lablab purpureus L. (AILP) no milho contra a. flavus. AILP é uma proteína de 36-kDa, que é um inibidor competitivo da enzima α-amilase da . flavus e pertence à família de proteína lectina – arcelin – α-amilase inibidor em comum feijão. Estudos in vitro, antes do trabalho atual tinham demonstrado o papel de AILP na inibição da atividade de α-amilase da . flavus e crescimento fúngico. Crescimento de fungos e produção de aflatoxina em grãos maduros foram monitorados em tempo real usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus . Este kernel triagem ensaio (KSA) é muito simples de configurar e fornece dados confiáveis e reprodutíveis na infecção e a extensão da propagação que pode ser quantificada para avaliação de germoplasma e linhas transgénicas. A fluorescência da estirpe GFP é estreitamente correlacionados com fungal crescimento e, por extensão, é bem correlacionado aos valores de aflatoxina.  O objetivo do trabalho atual foi implementar esse conhecimento anterior em uma colheita comercialmente importante como milho para aumentar a resistência de aflatoxina. Nossos resultados mostraram uma redução de 35% e 72% no crescimento da . flavus em sementes de milho transgênicos AILP-expressando que, por sua vez, traduzida em uma redução de 62% e 88% nos níveis de aflatoxina.

Introduction

Contaminação por micotoxinas pelos gêneros de fungos, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria é um grande problema de alimentos e alimentação de culturas cultivadas em todo o mundo1,2,3. Entre estes fungos fitopatogênicos, Aspergillus tem o maior impacto adverso na saúde humana e animal e o valor de colheita. Aspergillus flavus (A. flavus) é um patógeno oportunista planta que infecta rico oleaginosas tais como o milho, caroço de algodão e de amendoim e produz os potentes carcinógenos, aflatoxinas, bem como numerosos metabólitos secundários tóxicos (SMs). Milho é um alimento importante e alimenta das culturas cultivadas em todo o mundo e é altamente suscetível à contaminação pela . flavus. O impacto econômico da contaminação por aflatoxinas em perde e valor reduzido no milho pode ser tanto quanto $ 686,6 milhões/ano no EUA2 com previstas alterações no clima global, o impacto de aflatoxinas pode resultar em maiores perdas económicas no milho com estimativas tão elevadas quanto $ 1,68 bilhões/ano no futuro próximo2. Tendo em conta os efeitos adversos econômicos e saúde de aflatoxinas em humanos e animais, controle pré-colheita aflatoxina no milho pode ser a maneira mais eficiente para prevenir a contaminação por aflatoxinas em alimentos e produtos de alimentação.

A abordagem de controle pré-colheita principal para a resistência de aflatoxina em milho que tem sido amplamente utilizado nas últimas décadas é principalmente por meio de reprodução, que requer uma quantidade significativa de tempo4. Recentemente, a biocontrol teve algum sucesso na redução de aflatoxina em grande escala campo aplicações5,6. Além de biocontrole, aplicação de ferramentas moleculares de ponta como 'Host induzidas pelo silenciamento de genes' (HIGS) através de RNAi e transgênico expressão de proteínas associadas a resistência tem tido algum sucesso na redução do crescimento da . flavus e a aflatoxina produção em estudos de laboratório e de campo de pequena escala. Essas abordagens são atualmente sendo otimizadas além de identificar novos alvos potenciais do gene a. flavus para manipulação futura.

Além de genes que estão diretamente envolvidos na produção de micotoxinas como alvos de estratégias de controle de transgênicos, amilases de fungosas têm sido mostradas para desempenhar um papel crítico na manutenção de uma produção bem sucedida de patogênese e micotoxinas durante as fases iniciais de infecção de planta do anfitrião. Alguns exemplos incluem Pythium pleroticum (agente causal da podridão do rizoma de gengibre), Fusarium solani (agente causal da murcha de couve-flor), onde a correlação positiva entre a expressão de patogenicidade e α-amilase e atividade foram observadas 7,8. Inibição da atividade de α-amilase através de gene nocaute ou abordagens "knockdown" afeta negativamente a produção de crescimento e toxina fúngica. Um mutante de nocaute de α-amilase da . flavus foi incapaz de produzir aflatoxinas quando cultivadas em amido substrato ou degermed grãos de milho9. Da mesma forma, em Fusarium verticillioides uma estirpe de nocaute de α-amilase não conseguiu produzir fumonisina B1 (micotoxinas) durante a infecção de sementes de milho,10. Em um estudo mais recente, Gilbert et al. (2018) demonstraram que uma baseada em RNAi derrubar de expressão de α-amilase a. flavus através de HIGS reduziu significativamente a. flavus produção crescimento e aflatoxina durante a infecção de milho do kernel11 .

Inibidores específicos da atividade de α-amilase também produziram resultados semelhantes como obtido para baixo-regulação da expressão de α-amilase. O primeiro relatório sobre o papel de um inibidor de α-Amilase fúngica resistência veio o isolamento e caracterização de um inibidor de tripsina-α-amilase 14-kDa de linhagens de milho resistentes à . flavus12. Rastreio suplementar de várias centenas de espécies de plantas por Fakhoury e Woloshuk levado à identificação de uma proteína de como inibidor de α-amilase 36-kDa (AILP) das sementes de feijão de hyacinth, Lablab purpureus L.13. A sequência do peptídeo de lectinas AILP se assemelhava, pertencente à família de inibidor de lectina – arcelin – α-amilase em comum relatado feijão14,15. AILP purificado não apresentam qualquer atividade inibitória para mamíferos tripsina e mais in-vitro caracterização mostraram inibição significativa do crescimento da . flavus e germinação conidiais13. Os relatórios apresentados aqui claramente, shows de α-amilase pode servir como um alvo em abordagens de controle para restringir patógenos ou pragas que dependem de mobilização do amido (através da atividade de α-amilase) e aquisição de açúcares solúveis, como fonte de energia durante a sua patogénica interação com as plantas hospedeiras.

Alfa-amilase é conhecido por ser crítico na . flavus patogenicidade9,10,11e dada a importância do AILP como um potente antia. flavus agente (inibição/antigrowth α-amilase)13, geramos plantas de milho transgênicas expressando Lablab AILP gene sob o promotor constitutivo de CaMV 35S. O objetivo foi investigar se a expressão heteróloga deste inibidor de α-amilase no milho é eficaz contra a produção da . flavus patogênese e aflatoxina durante a infecção de milho do kernel. Nossos resultados demonstram que sementes de milho transgênicos expressando AILP significativamente reduziram a. flavus produção crescimento e aflatoxina durante a infecção do kernel.

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Protocol

1. plasmídeo construções e transformação de milho

  1. PCR amplificar Lablab AILP inserir usando as primeiras demão 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'e 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. As condições PCR incluem uma etapa de desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s (etapa 1), seguido por desnaturação a 98 ° C, durante 10 s (etapa 2), recozimento a 55 ° C por 30 s (etapa 3), alongamento a 72 ° C, durante 20 s (etapa 4), 31 ciclos da etapa 2 para o passo 4 , e um alongamento final passo a 72 ° C por 5 min. Clone do produto do PCR em um pCAMBIA modificado 1.300 vetor usando Xba Pste eu locais da limitação. O vetor de destino final da planta para confirmar a orientação e a sequência do gene AILP clonado no vetor de sequência.
  2. Transforme o Agrobacterium estirpe EHA101 com a construção de vetor final (Figura 1) como anteriormente descrito, 16.
  3. Uso transformado Agrobacterium contendo o vetor de destino final da planta para transformar embriões imaturos de milho (Zea mays L. Hi-II) (realizados na planta transformação facilidade da Iowa State University) 16.
  4. Crescer T0 plantas na estufa (26 – 29 ° C, fotoperíodo de 16/8 h, suplementado com at-lâmpadas de alta pressão) e self-pollinate repetidamente para obter geração de6 T para atingir a homozigotia para o traço de transgénico.

2. ensaio de germinação dos esporos

  1. Colheita de amostras de folha e armazenar a-80 ° C. Moa as amostras de folha com um almofariz e um pilão usando nitrogênio líquido. Pesar 0,5 g em tubos de microcentrifuga de 2 mL, adicionar 17 µ l de inibidor da protease e colocar os tubos em gelo.
  2. Centrifugar tubos por 10 min a 16.000 x g. Transfira a 225 µ l do extrato da planta para tubos de microcentrifuga de 0,5 mL e no gelo.
  3. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, prepare uma suspensão de esporos de 5ml de Aspergillus flavus 70-GFP em caldo de dextrose de batata 1% (p/v). Vórtice e ajustar a concentração de esporos a 105 esporos/mL com um haemocytometer.
    Atenção: A. flavus produz aflatoxinas, todo o trabalho com este fungo deve efectuar-se em uma câmara de segurança biológica.
  4. Incube em PDB a 28 ° C até cultura atinge 50% início de germinação dos esporos conforme indicado pelo abaulamento de esporos.
  5. Extraem o vórtice e a alíquota 25 µ l de esporos solução a planta 225 µ l. Incube as amostras por 20 horas a 28 ° C, com agitação intermitente.
  6. Alíquota 25 µ l de solução de esporos em um microscópio e medida do comprimento do germe tubos esporos usando o software da câmera digital. Use um mínimo de 20 medições replicar para cada linha.
    Nota: Nesta fase, Coloque todas as culturas a 4 ° C para parar o crescimento da colônia até estar pronto para contar.

3. o kernel triagem ensaio (KSA)

  1. Construa as tampas KSA por colagem 4 tampas de snap (22 mm) em uma placa de Petri 60 x 15 mm. Permitir que a cola secar durante 48 H antes de usar tampões. Cada tampa KSA constitui um Rep (Figura 2).
  2. Um estéril de segurança microbiológica, pulverize uma bandeja de bioensaio quadrada (24 cm x 24 cm) com 70% de etanol: H2O (v/v) e deixar o ar seco. Adicione papel para cromatografia estéril para a bandeja. Pulverizador 9 bonés KSA com etanol a 70%, deixe o ar seco e coloque na bandeja de bioensaio.
  3. Para cada linha de milho transgénica sendo testada, selecione 20 sementes defeituosas e coloque em um tubo de centrífuga de 50 mL. Adicionar etanol a 70% e deixe descansar por 4 minutos. Agite os tubos durante a esterilização. Despeje os kernels de etanol e enxaguar três vezes em desionizada estéril H2O.
  4. Prepare uma suspensão de esporos de Aspergillus flavus 70-GFP17 de uma cultura de 6 dia de idade cultivadas em meio de V8 (5% de suco V8, 2% de ágar, pH 5.2).
    1. Adicionar 20 mL estéril 0.02% Triton X-100/desionizada H2O (v/v) e sucata de esporos com uma ansa estéril. Pipetar fora o inóculo e coloque num copo de 300 mL estéril.
    2. Preparar uma 5-fold diluição com 0,02% Triton X-100, em seguida, executar uma contagem de esporos com um haemocytometer. Dilua novamente se necessário para obter 100 mL com uma concentração de 4 x 106 esporos/mL.
  5. Coloque o miolo em um copo de 300ml esterilizado com uma barra de agitação. Adicione o inóculo para o copo.
    Cuidado: Adicionar miolo de inóculo fará com solução de respingo. Colocar o copo num prato misture por 3 minutos. Após 3 minutos, despeje inóculo para um copo vazio.
  6. Usando uma pinça, coloque o miolo no prato de bioensaio (1 do kernel/tampão). Adicione 30 mL deionizada à parte inferior de cada bandeja de bioensaio e incubar a 31 ° C, no escuro, durante 7 dias.
  7. Prepare sementes para a fotografia.
    1. Reserve 4 núcleos de cada linha para análise microscópica e fotografia.
      Nota: O miolo pode ser armazenado a 4 ° C, para não mais do que 5 dias antes de completar a fotografia.
    2. Tire fotos de kernels após sete dias de inoculação com a. flavus (Figura 3).
    3. Limpo exterior de kernels com um tecido macio e água deionizada. Executar cortes longitudinais de kernels e imediatamente tirar fotografias ao microscópio fluorescente.
  8. Prepare sementes para análise.
    1. Exterior limpo de kernels restantes com um tecido macio e água deionizada.
    2. Coloque 4 núcleos, constituindo 1 representante, de um policarbonato e tampa de rosca 15 mL frasco contendo 2 bolas de aço inoxidável. Congele imediatamente frascos em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C até posterior processamento e análise.
    3. Remover os frascos de-80 ° C congelador e moer grãos em um homogeneizador a 1.500 rpm por 3 minutos.
      Nota: Mantenha o miolo congelado com nitrogênio líquido.

4. rastreio de PCR de sementes de milho transgênicos

  1. Use o kit de isolamento do DNA para isolar o DNA genômico (gDNA) de grãos de milho pulverizados infectados com a. flavus , de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, adicione 280 µ l buffer F, 20 protease µ l e 3 µ l ditiotreitol (DTT) de 10-15 mg de grãos de milho pulverizados. Incubar e agitar em um thermomixer (56 ° C, 1.200 rpm, 30 min). Centrifugar a 10.000 x g por 1 min e transferir o sobrenadante claro para coluna equilibrada. Incube a temperatura ambiente por 3 min e centrifugar a 700 x g por 1 min eluir gDNA.
  2. Leve 0,8 µ l de gDNA extraído para configurar uma reação de PCR 20 µ l de cada amostra, usando um kit PCR. Siga as condições thermocycling como recomendado no protocolo do fabricante. As condições PCR incluem uma etapa de desnaturação inicial a 98 ° C por 5 min (etapa 1), seguida por desnaturação a 98 ° C por 5 s (etapa 2), recozimento a 55 ° C por 5 s (etapa 3), alongamento a 72 ° C, durante 20 s (etapa 4), 40 ciclos da etapa 2 para o passo 4 e uma etapa de alongamento final a 72 ° C, durante 1 min (passo 5).
  3. Use para a frente da primeira demão 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' e reverter a primeira demão 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' para confirmar a presença do Lablab AILP gene nos kernels milho transgénicos.

5. RNA isolamento, síntese do cDNA e RT-PCR semi-quantitativa

  1. Tome homogeneizado a. flavus infectado milho miolo previamente armazenado a-80 ° C para a extração de RNA. Extraia o RNA usando um kit de isolamento do RNA total de acordo com o protocolo do fabricante, mas com ligeira modificação18. Depois de adicionar 50 mg de pó homogeneizada do kernel milho no buffer de extração, misture bem (sem a utilização do Vortex) usando uma ponta da pipeta de 1 mL e deixá-lo no gelo por 5-6 minutos antes de prosseguir para as etapas subsequentes conforme descrito no protocolo do fabricante.
  2. Prepare o cDNA usando um kit de síntese do cDNA de acordo com protocolo 18 do fabricante.
  3. Utilize 0,5 µ l de cDNA não diluído por reação de PCR por RT-PCR semi-quantitativa como anteriormente descrito,18. Use as primeiras demão para diante e reverso qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' e qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectivamente para detectar a expressão do gene Lablab AILP e para a frente e reverter as primeiras demão qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ e qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ, respectivamente, à manifestação de milho gene ribosomal estrutural (costela), GRMZM2G02483819 , como um gene de manutenção da casa.

6. quantificação de GFP

  1. Preparar 50 mL cada de 0,2 M de fosfato monobásico de sódio (NaH2PO4) e fosfato de sódio dibásico 0,2 M (Na2HPO4·7H2O) em desionizada H2O.
  2. Compõem-se 100 mL de tampão de fosfato do pH 7.0 Sorenson. Para pH 7,0, adicione 19,5 mL NaH2PO4 caldo, 30,5 mL NaHPO4·7H estoque de O2e 50 mL de água deionizada H2O.
  3. Pesar 25 mg terra do kernel material (peso fresco, FW) e coloque em um tubo de microcentrifugadora de 1,0 mL. Adicionar tampão de fosfato 500 µ l para o tubo de centrifugação e vórtice por 30 s.
  4. Centrifugar as amostras durante 15 minutos a 16.000 x g. Sobrenadante µ l de Pipetar 100 em uma placa bem preto 96. Leia as amostras com um dados (excitação 485 nm, emissão 528 nm).

7. análise de aflatoxina total

  1. Processamento e aflatoxina extração de amostra
    1. Secar as amostras do kernel em um forno de ar forçado por 2 dias a 60 ° C. Amostras de pesar e colocar em um frasco de Erlenmeyer com uma rolha de vidro de 50 mL.
    2. Em uma coifa, adicione cloreto de metileno 25 mL para cada frasco.
      Cuidado: Cloreto de metileno é altamente volátil e é considerado perigoso (irritativa, cancerígeno). Luvas de nitrilo nem látex são seguras para trabalhar com cloreto de metileno. Use o melhor luvas de PolyVinylAlcohol resistentes a solventes orgânicas.
    3. Agite amostras durante 30 min num agitador de acção do pulso. Após 30 min, lentamente despeje o extrato através de um círculo de papel de filtro de pregas em um copo de 80 mL. Deixe a béquer secar durante a noite em uma coifa.
    4. No dia seguinte, esguinchar cloreto de metileno (cerca de 5 mL) em torno do interior da borda de copos a seco, giram em torno e despeje em frascos de vidro de 2 dram. Frascos de deixar aberto para secar em uma coifa durante a noite.
  2. Análise de aflatoxina
    1. Adicionar 4,0 mL 80% de metanol: água deionizada H2O (v/v) para tubos de ensaio.
    2. Usar um kit de extração de aflatoxinas para filtrar purificar solução de metanol com a coluna fornecida. Analise os níveis de aflatoxinas totais com um dados, de acordo com as instruções do fabricante.

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Representative Results

Transformação de milho e triagem molecular de plantas transgênicas

Os embriões imaturos de linhagens de milho Hi-II foram transformados usando estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA101 contendo o vetor de destino final planta expressando o gene AILP Lablab purpureus sob o controle dos CaMV 35S promotor. Cinco linhas de milho independente transformadas eram avançadas para a geração de T6 para estudos posteriores. As plantas de milho transgênicas foram muito menores e menos vigoroso mas não mostrou qualquer outras anormalidades em comparação com as plantas isogénicas de controlo negativo. Amplificação por PCR do gene alvo AILP mostrou um amplicon bp 548, observados somente nas linhagens de milho geneticamente modificadas em comparação com as plantas de controle (Figura 4A). O gene da AILP mostrou expressão nas linhas transgénicas, Considerando que nenhuma expressão AILP observou-se nas instalações de controle (Figura 4B).

Aspergillus flavus ensaio de esporo com folha extrai

Folha crua extrai do milho transgénico jovens plantas foram preparadas por moagem em líquido N e centrifugação a 16.000 x g. Esporos de germinação precoce estágio foram expostos para o extrato de folhas para 20 horas, e o comprimento das hifas esporo média foi gravado a partir de 20 amostras. Comprimento das hifas, esporos de expostos a extratos de folhas transgênicas mostraram uma redução de 58% e 80% em comparação com o controle negativo (Figura 5)

Aspergillus flavus crescimento durante a infecção do kernel

Um ensaio de triagem de Kernel (KSA) foi realizada para examinar o crescimento de a. flavus nos kernels transgénicos e controle. Expressão do gene da AILP em sementes transgênicas afetou negativamente o crescimento da . flavus . A cepa da . flavus usada no estudo atual contém um repórter GFP que permite o monitoramento e a quantificação do crescimento fúngico em tempo real. Redução significativa na fluorescência de GFP foi observada em transgênicos sementes AILP, comparados com o controle negativo isogénicas (Figura 6). AILP linhas 4 e 5 mostraram uma redução significativa no crescimento de fungos, 69% e 72%, respectivamente, seguido por outras linhas onde observou-se uma redução de 35% a 60% em comparação com os kernels de controle (Figura 7A).

Produção de aflatoxinas nos kernels infectados

Expressão heteróloga do gene no milho AILP resultou em significativa redução do teor de aflatoxina nas linhas transgénicas vs controle. Os dados de aflatoxina fornecido aqui é o teor de aflatoxinas totais detectado nos kernels infectados. Observou-se uma redução de 62% e 88% no teor de aflatoxinas nos kernels AILP em comparação com o controle (Figura 7B). Entre as 5 linhas diferentes de AILP, linha 4 mostrou o menor teor de aflatoxina (486 ng/g DW), seguido por outras linhas que variam entre 640-1.498 ng/g DW nos kernels vs controle (3.986 ng/g DW).

Figure 1
Figura 1: Design de vetor para expressão transgênica da AILP Lablab gene no milho. 35S = vírus do mosaico da couve-flor ou promotor constitutivo CaMV; RB = borda direita; LB = borda esquerda; nptII = gene de resistência fosfotransferase-canamicina neomicina; n º s e 35s = terminadores de transcrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Kernel triagem ensaio. (A, B) Esterilizar as sementes e despeje em um copo estéril em uma câmara de segurança biológica. (C-E) Inocule kernels com suspensão de esporos da . flavus . (F-H) Usando uma pinça estéril, coloque o miolo em prato de bioensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Luz micrografias de crescimento da . flavus . (A) isogénicas controle negativo. (B-F) Sementes transgênicas expressando AILP (linhas 1-5) uma semana após a inoculação. Barra de escala = 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Triagem molecular de plantas transgênicas. (A), PCR confirmação das plantas de milho transgénicas (faixas 1-5) contendo Lablab AILP (548 bp diagnóstico fragmento de DNA; C = isogénicas controle negativo; NEB 2-Log escada de DNA usada como um marcador de DNA). (B) expressão do gene AILP Lablab em linhagens de milho geneticamente modificadas (faixas 1-5) usando RT-PCR. Lane C representa isogénicas controle negativo. Milho gene ribosomal estrutural (costela), GRMZM2G02483819 foi usado como um gene de domésticas (escada de DNA NEB 2-Log: marcador de DNA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Efeito de folha bruta extrai de plantas transgênicas de milho AILP na germinação de esporos da . flavus em comparação com um isogénicas controlo negativo (neg). Separação média foi feita por depois do teste de Dunnett depois ANOVA. Níveis de redução significativa são denotados por asteriscos (* * *P ≤ 0,0001). Barras de erro indicam o erro padrão de meios para vinte amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Fluorescência de GFP, emanando o . flavus cepa 70-GFP em sementes transgênicas expressando AILP após uma semana de bioensaio. Isogénicas controles negativos (A) foram usados para avaliar a infecção fúngica e espalhar em sementes transgênicas (B-F representando linhas transgénicas 1-5). Pelo menos quatro núcleos foram projectados para cada linha sob o microscópio fluorescente. Barra de escala = 2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Produção de crescimento e de aflatoxina um flavus . (A) a. flavus 70-GFP infecção e crescimento em sementes de milho após 7 dias em um ensaio de triagem do Kernel. Média de três experimentos independentes com quatro biológicos Replica cada vez. Quantificação de GFP (em unidades relativas de fluorescência, RFU) indica crescimento fúngico em linhagens de milho transgênicos expressando AILP para um controlo negativo isogénicas. Separação média foi feita por depois do teste de Dunnett depois ANOVA. Níveis de redução significativa é indicado por asteriscos (*P ≤ 0,05; * *P ≤ 0.01; * * *P ≤ 0,001). Barras de erro indicam o erro padrão de meios para quatro repetições biológicas ao acaso. (B) produção de aflatoxina pela . flavus 70-GFP em sementes de milho após 7 dias em um ensaio de triagem do Kernel. Média de 12 repetições biológicas e cada replicar continha quatro núcleos. Níveis de aflatoxina em kernels AILP transgénicos (linhas 1-5), em comparação com um isogénicas controlo negativo (neg). Separação média foi feita por depois do teste de Dunnett depois ANOVA. Níveis de redução significativa é indicado por asteriscos (* *P ≤ 0.01; * * *P ≤ 0,001). Barras de erro indicam o erro padrão de meios para quatro repetições biológicas ao acaso. Veja as figuras suplementar para exibir os dados no painel B desprovido de preconceito devido à inibição de fungo. Fechar a correlação entre GFP = RFU e aflatoxina valores também são fornecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sup Figure 1
Suplementar Figura 1: Dados da figura 7B redesenhada para mostrar a produção de aflatoxina pela . flavus 70-GFP em sementes de milho após 7 dias em um ensaio de peneiramento de Kernel para eliminar o viés devido à inibição do crescimento fúngico. Valores de aflatoxinas foram divididos pela inibição do crescimento fúngico representada como valores de GFP-RFU na Figura 7B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sup Figure 2
Suplementar Figura 2: Feche a correlação entre valores de GFP-RFU (= crescimento fúngico) e níveis de aflatoxinas (r2 = 0.86) relatou em KSA o. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As perdas de rendimento em culturas agrícolas devido a pragas e patógenos é um problema global de20. Atualmente, a aplicação de fungicidas sintéticas e pesticidas é o predominante para controlar patógenos vegetais e pragas, mas toxicidade residual destes compostos bioquímicos na alimentação humana e animal pode representar uma ameaça grave para a saúde humana e animal21. Considerando a importância econômica do milho como comida e cultura alimentar, redução ou eliminação da contaminação por aflatoxinas é de extrema importância2,3,22. A criação convencional através de introgressão de genes resistentes em variedades suscetíveis é um processo demorado e tal resistência não é sempre estável como resistência de aflatoxina é uma característica poligênica e expressão de genes participantes variam significativamente com as alterações em parâmetros ambientais4. Abordagens alternativas estão sendo avaliadas para aumentar e estabilizar a defesa do vegetal hospedeiro contra a. flavus de modo ecofriendly.

No estudo atual, nós escolhemos avaliar a eficácia do gene da AILP de feijão de hyacinth no milho contra a. flavus. AILP é um inibidor competitivo da α-amilase e também possui propriedades antifúngicas, nós expressa este gene sob um forte promotor constitutivo CaMV 35S. O objetivo era aumentar a produção desta proteína heteróloga em milho, independentemente do grau de desenvolvimento ou tipo de tecido. Significativa expressão do gene da α-amilase nas linhas de milho geneticamente modificados (Figura 4AB) suporta estável expressão deste gene em um sistema heterólogo. Isso afetou negativamente o crescimento de fungos, como é evidente a redução da distribuição espacial da fluorescência de GFP dentro os kernels AILP infectados e redução geral da fluorescência de GFP nos kernels (Figura 6 e Figura 7A).

O desenvolvimento do Kernel triagem ensaio (KSA) utiliza um geneticamente estirpe de repórter da . flavus expressando um gene que codifica a proteína verde fluorescente (GFP) de água-viva Aequorea victoria18, 23. para elaborar estratégias de controle para qualquer agente patogénico, é necessário compreender o modo de infecção, espalhar e colonização dentro da planta hospedeira ou tecido. A colonização e a propagação de Saprófita a aflatoxigenic, a. flavus não é bem compreendido porque a regulação genética da resistência ao patógeno, se existir, não é bem compreendida. Uso da estirpe de GFP-expressando a. flavus torna possível rastrear em tempo real, o processo de infecção e colonização. A estirpe GFP e o selvagem-tipo não diferiu significativamente no patógeno agressividade e aflatoxina produção23. No entanto, o gene da GFP nesta estirpe é colocado sob o controle do constitutivamente expressa gliceraldeído fosfato desidrogenase (gpdA) gene promotor 24 que é o mais apto para acompanhar o crescimento dos fungos. No entanto, usando esta mancha de algodão e grãos de milho, mostramos uma relação estreita entre fluorescência de GFP, emanando o fungo para o crescimento de fungos e aflatoxinas níveis18,23.

Para estabelecer uma correlação estreita com capacidade de produção de aflatoxina, gfp conduzido pelos promotores de gene aflatoxina como omtA ou ver-125,26 será mais adequado do que o gpdA. A fluorescência de GFP é sensível o suficiente para permitir a detecção e medição em tempo real de mesmo as pequenas alterações no crescimento dos fungos, tanto in vitro e em plantae avaliação das atividades inibitórias do desconhecido antifúngicas proteínas e peptídeos como AILP e outros11,17,18,23. Além disso, os resultados da KSA correlaciona-se bem com o desempenho em campo de linhagens de milho resistentes ou sensíveis em relação à avaliação de contaminação de aflatoxina27.

A KSA é muito útil em nosso laboratório para tela classicamente raça novas variedades4 e linhas transgénicas11,18. É fácil de configurar e executar KSA em qualquer laboratório. Um precisa usar miolo limpo sem danos para executar este ensaio para que um claro entendimento da interação planta-fungo hospedeiro pode ser avaliado. Nós rotineiramente digitalizar todos os kernels que usamos no nosso laboratório sob um estereomicroscópio, antes de realizar o ensaio. Note-se que as condições que empregamos para a KSA incluem temperatura constante (31 ° C) e umidade elevada (95% RH). Com o início do processo de germinação simulado sob essas condições, o ensaio fornece condições ideais para testar a integridade do revestimento de semente, composição genética do miolo incluindo genes/proteínas antifúngicas ligadas durante a germinação, e/ou fúngica infecção. Infecção fúngica aflatoxina produção será sempre superior em KSA comparado a sua ocorrência no campo; no entanto, uma estreita correlação foi estabelecida4,,27.

Temos demonstrado nesta KSA que AILP reduz o crescimento de fungos em sementes de milho. AILP possui propriedades antifúngicas de lectinas de planta e foi mostrado para inibir a α-amilase, diminuindo a degradação do amido e limitar o crescimento dos fungos. Em vitro estudos demonstraram que a AILP era capaz de inibir a. flavus crescimento em meio de crescimento artificial de batata rica em açúcar de caldo (PDB) de dextrose, indicando sua atividade de inibição de crescimento/antifúngico foi independente de sua inibição da amilase atividade13. Outras lectinas vegetais isolaram de Urtica dioica (comum urtiga), Hevea brasiliensis (seringueira) e os tubérculos de Solanum tuberosum (batata) também mostram semelhantes propriedades antifúngicas e inibiu o crescimento de Botrytis cinerea , Pyrenophora triticie Fusarium oxysporum28,29,30,31. Inibidores de alfa-amilase não só são eficazes contra fungos e bactérias, mas também foram mostrados para ser eficaz contra insetos-pragas32. Alfa-amilases são relatadas para ser crítico para o crescimento normal e desenvolvimento da planta-alimentação de insetos, e vários inibidores da α-amilase insetos foram isoladas de plantas como trigo, feijão e milho12,33, 34,35. Uma redução significativa no comprimento das hifas fúngica de esporos expostos a extratos de folha crua (Figura 5), diminuição do crescimento de fungos no milho da AILP-expressando miolo conforme demonstrado pela redução de fluorescência de GFP ambos qualitativamente ( Figura 6) e quantitativamente (Figura 7A) é possivelmente devido a uma combinação de suas propriedades de inibição e antifúngico de α-amilase. Experimentos utilizando estes milho AILP-expressando plantas contra outros patógenos e pragas, no futuro, será de grande interesse para testar sua eficácia contra diversos estressores bióticos de sementes e tecidos vegetativos. As propriedades de inibição antifúngico e crescimento da lectina foi atribuída principalmente a seu cross-linking com quitina e inibição da ponta das hifas expansão28. Na verdade, inibição in vitro de AILP-mediada de α-amilases de diversas origens fúngicas e bacterianas mostrou mais 65% inibição em fungos patogénicos, incluindo a. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriaee 41 % de inibição no patógeno bacteriana Bacillus subtilis13. Os resultados na redução do crescimento da . flavus aqui apresentado estão em consonância com o papel dos inibidores da α-amilase como agentes antifúngicos. O estudo atual mais demonstra a aplicação prática dessas informações úteis obtidos anteriormente em estudos in vitro.

Diminuição do teor de aflatoxinas (Figura 7B) no AILP-expressando de linhagens de milho é possivelmente devido à inibição da atividade de α-amilase da . flavus , levando à desagregação diminuída de amido armazenado e reduziu a aquisição de açúcares como um fonte de energia das sementes milho durante interação patogénica. Como α-Amilase fúngica desempenha um papel importante na quebra de amidos do kernel, qualquer mudança na atividade da α-Amilase fúngica por AILP provável altera o teor de açúcares solúveis durante a infecção do kernel. Teor de açúcares solúveis, especialmente a sacarose e a glicose, tem sido altamente correlacionada com o aumento da produção de aflatoxinas1 e o total de AFB no milho e outras culturas susceptíveis da . flavus , como amendoim36,37. Aumentar o teor de sacarose em meios de crescimento artificial aumenta a. flavus aflatoxina produção38. Outros açúcares solúveis como glicose e maltose positivamente também contribuem para a produção de aflatoxina em meios artificiais e semente substratos38. Inibição da atividade de α-amilase e redução na produção de micotoxinas em outros fungos reforça o papel importante de α-amilases fungos na produção de toxinas durante a infecção do kernel. Mutantes de alfa-amilase nocaute de F. verticillioides e a. flavus não conseguiu produzir fumonisina B1 e aflatoxinas respectivamente após infecção de sementes de milho9,10. Da mesma forma, para baixo-regulamento da . flavus α-amilase significativamente reduzida produção fúngica de crescimento e aflatoxina durante do kernel milho infecção11. Uma redução de 62% - 88% aflatoxina nas linhas transgénicas estão de acordo com os relatórios anteriores sobre o papel da α-amilase na produção de aflatoxina. É de notar que o Kernel triagem ensaio (KSA) em vitro é mais rigorosos do que normalmente encontrado em condições naturais. Condições durante o ensaio in vitro também são altamente favoráveis para a produção de aflatoxina, a taxa de variação percentual no teor de aflatoxinas nas linhas transgénicas pode ser mais significativa, em vez dos números absolutos de teor de aflatoxinas nos kernels infectados. Os resultados apresentados aqui são promissores e futuros experimentos sob condições de campo são importantes para analisar o potencial destas AILP-expressando de linhagens de milho para resistência de aflatoxina sob um cenário natural.

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Disclosures

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos a David Meints, Universidade de Arkansas por sua assistência no desenvolvimento e analisando o milho transgénico durante as primeiras gerações. Este trabalho recebeu o apoio financeiro do projeto CRIS USDA-ARS 6054-42000-025-00D. Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura. Política de oportunidade de emprego igual (EEO) dos USDA-ARS mandatos de igualdade de oportunidades para todas as pessoas e proíbe a discriminação em todos os aspectos das operações, práticas e políticas de pessoal da agência.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

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Inibição do crescimento de <em>Aspergillus flavus</em> e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de <em>Lablab purpureus</em> L.
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