Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Abstract

Contamination par les aflatoxines dans les cultures de l’alimentation humaine et animale est un défi majeur dans le monde entier. Les aflatoxines, produites par le champignon Aspergillus flavus (a. flavus) sont des agents cancérigènes qui réduisent considérablement la valeur des récoltes de maïs et autres plantes oléagineuses riches comme l’arachide en plus qui posent une menace sérieuse pour la santé humaine et animale. Différentes approches, y compris la reproduction traditionnelle, transgénique expression des protéines de résistance liée et l’interférence ARN (Arni)-base de gène induite par le hôte faire taire des critiques a. flavus gènes cibles, sont envisagées pour augmenter résistance d’aflatoxine dans les cultures sensibles. Des études antérieures ont montré un rôle important de le α-amylase dans la production de pathogénie et d’aflatoxines a. flavus , suggérant cette gène/enzyme est une cible potentielle pour réduire la croissance d’a. flavus et la production d’aflatoxine. À cet égard, la présente étude visait à évaluer l’expression hétérologue (sous contrôle du promoteur CaMV 35 s constitutif) d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase Lablab purpureus L. (AILP) chez le maïs contre a. flavus. AILP est une protéine de 36 kDa, qui est un inhibiteur compétitif de l’enzyme α-amylase a. flavus et appartient à la famille de protéine inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase en commun haricot. Des études in vitro avant les travaux en cours avaient démontré le rôle de AILP dans l’inhibition de l’activité de le α-amylase a. flavus et la croissance fongique. La croissance fongique et la production d’aflatoxine dans les grains mûrs ont été suivis en temps réel en utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus . Ce noyau screening test (KSA) est très simple à mettre en place et fournit des données fiables et reproductibles sur les maladies infectieuses et le degré de propagation qui ont pu être quantifiée pour l’évaluation des ressources génétiques et les lignées transgéniques. La fluorescence de la souche GFP est étroitement corrélés aux champignons de la croissance et, par extension, il est bien corrélé aux valeurs de l’aflatoxine.  Les travaux en cours visait à mettre en œuvre cette connaissance préalable dans une récolte commercialement importante comme le maïs pour augmenter la résistance de l’aflatoxine. Nos résultats montrent une réduction de 35 % à 72 % de croissance d’a. flavus dans les grains transgéniques maïs exprimant l’AILP qui, à son tour, traduit par une réduction de 62 % à 88 % dans les niveaux d’aflatoxine.

Introduction

Contamination par les mycotoxines par les genres fongiques, Alternaria , Fusarium, Penicilliumet Aspergillusest un problème majeur de la nourriture et nourrissent de plantes cultivées dans le monde1,2,3. Parmi ces champignons phytopathogènes, Aspergillus a le plus d’impact défavorable sur la valeur des récoltes et de la santé humaine et animale. Aspergillus flavus (A. flavus) est un plante opportuniste pathogène qui infectent les plantes oléagineuses riches telles que le maïs, le coton et d’arachide et produit les agents cancérigènes, aflatoxines, ainsi que de nombreux métabolites secondaires toxiques (SMs). Le maïs est un aliment important et nourrir des cultures dans le monde entier et est très sensible à la contamination par a. flavus. L’impact économique de la contamination par les aflatoxines sur perd et valeur réduite chez le maïs peut être autant que $ 686,6 millions/an dans l’US2 avec les changements prévus dans le climat mondial, l’incidence des aflatoxines peut entraîner de plus grandes pertes économiques dans le maïs avec aussi hautes que $ 1,68 milliards/an dans le futur proche2estimations. Étant donné les conséquences économiques et sanitaires des aflatoxines chez les humains et le bétail, contrôle avant la récolte aflatoxines dans le maïs peut être le moyen le plus efficace pour prévenir la contamination par les aflatoxines dans les denrées alimentaires et aliments pour animaux.

L’approche du contrôle de pré-récolte majeur pour la résistance des aflatoxines dans le maïs qui a été largement utilisé dans les dernières décennies est principalement par le biais de sélection, ce qui nécessite une quantité importante de temps4. Récemment, biocontrol a eu un certain succès dans la réduction des aflatoxines dans la zone de grande échelle pour les applications5,6. En plus de la lutte biologique, application de pointe outils moléculaires tels que « Hôte induite par Gene Silencing » (HIGS) par le biais de RNAi et expression transgénique de protéines associées à la résistance a eu un certain succès dans la réduction de la croissance d’a. flavus et d’aflatoxines production dans les études de laboratoire et de terrain à petite échelle. Ces approches sont actuellement en cours d’optimisation en plus de l’identification de nouvelles cibles potentielles de gène a. flavus pour manipulation future.

Outre les gènes qui sont directement impliqués dans la production de mycotoxines comme cibles potentielles des stratégies de lutte transgéniques, amylases fongiques auraient dû être divulgués à jouer un rôle crucial dans le maintien de production réussie de pathogénie et de mycotoxine pendant les premiers stades de l’infection des plantes hôtes. Quelques exemples incluent Pythium pleroticum (agent causal de la pourriture du rhizome de gingembre), Fusarium solani (agent causal de la flétrissure de chou-fleur), où des corrélations positives entre la pathogénicité et le α-amylase expression et l’activité ont été observées à 7,,8. Inhibition de l’activité de le α-amylase par knock-out du gène ou approches knockdown affecte négativement la production de toxine et de croissance fongique. Un mutant de knock-out de α-amylase d’a. flavus a été incapable de produire des aflatoxines lorsqu’il est cultivé sur amidon substrat ou dégermées grains de maïs9. De même, au Fusarium verticillioides une souche de α-amylase n’ont pas produit de fumonisine B1 (mycotoxines) au cours de l’infection des grains de maïs10. Dans une étude plus récente, Gilbert et coll. (2018) ont montré qu’un axée sur l’ARNi Démantelez d’a. flavus expression de α-amylase par HIGS significativement réduit a. flavus production de croissance et d’aflatoxines pendant l’infection noyau maïs11 .

Inhibiteurs spécifiques de l’activité de le α-amylase ont également produit des résultats similaires obtenus de down-régulation de l’expression de le α-amylase. Le premier rapport sur le rôle d’un inhibiteur de le α-amylase fongique résistance provenait de l’isolement et la caractérisation d’un inhibiteur de la trypsine-α-amylase 14 kDa de lignées de maïs résistants à a. flavus12. Outre le dépistage de plusieurs centaines d’espèces de plantes par Fanfan et Woloshuk conduit à l’identification d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase 36 kDa (AILP) des graines de haricots de Jacinthe, Lablab purpureus L.13. La séquence peptidique de lectines AILP ressemblait à appartenant à la famille de l’inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase déclarés en commun haricot14,15. AILP purifiée ne présente pas toute activité inhibitrice envers la trypsine mammifères et plus de caractérisation in vitro ont montré une inhibition significative de la croissance d’a. flavus et la germination des conidies13. Les rapports présentés ici clairement montre α-amylase peut servir d’objectif dans les approches de contrôle pour limiter les agents pathogènes ou parasites qui dépendent de la mobilisation d’amidon (à travers l’activité de le α-amylase) et l’acquisition des sucres solubles comme source d’énergie au cours de leur pathogène interaction avec les plantes hôtes.

Alpha-amylase est connu pour être critique dans a. flavus pathogénicité9,10,11et compte tenu de l’importance de AILP comme un puissant anti-a. flavus agent (α-amylase inhibition/antigrowth)13, Nous avons généré des plants de maïs transgéniques exprimant Lablab AILP gène sous le promoteur CaMV 35 s constitutif. Le but était de vérifier si une expression hétérologue de cet inhibiteur de le α-amylase dans le maïs est efficace contre a. flavus pathogenèse et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau de maïs. Nos résultats démontrent que les grains de maïs transgéniques exprimant AILP significativement réduit l’a. flavus croissance et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmide constructions et la transformation de maïs

  1. PCR amplification Lablab AILP insert en utilisant les amorces 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'et 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Les conditions de la PCR incluent une étape de dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s (étape 1), suivie de la dénaturation à 98 ° C pendant 10 s (étape 2), recuit à 55 ° C pendant 30 s (étape 3), l’allongement à 72 ° C pendant 20 s (étape 4), 31 cycles de l’étape 2 à l’étape 4 , et un allongement final étape à 72 ° C pendant 5 min. Clone le produit PCR dans un pCAMBIA mis à jour le 1 300 vector à l’aide de XbaI et Pstj’ai des sites de restriction. Séquence le vecteur de destination finale végétale pour confirmer l’orientation et la séquence du gène AILP cloné dans le vecteur.
  2. Transformer la souche Agrobacterium EHA101 avec la construction du vecteur final (Figure 1) comme précédemment décrit 16.
  3. Utilisation transformé Agrobacterium contenant le vecteur de destination finale usine pour transformer les embryons immatures maïs (Zea mays L. Hi-II) (effectuées à l’usine de Transformation installation de Iowa State University) 16.
  4. Faire pousser des plantes0 T dans la serre (26 – 29 ° C, photopériode de 16/8 h additionné de Na-lampes à haute pression) et à plusieurs reprises auto-polliniser pour obtenir la génération6 T pour atteindre l’homozygotie pour le caractère transgénique.

2. test de germination de spores

  1. Récolter des échantillons de feuilles et de conserver à-80 ° C. Moudre les échantillons de feuilles dans un mortier à l’aide d’azote liquide. Peser avec 0,5 g en tubes de microcentrifuge de 2 mL, ajouter 17 µL d’inhibiteur de protéase et placer les tubes sur la glace.
  2. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 16 000 x g. Transférer 225 µL d’extrait de plante aux tubes de microcentrifuge de 0,5 mL et placer sur la glace.
  3. Dans un tube à centrifuger 15 mL, préparer une suspension 5 mL de spores d' Aspergillus flavus 70 – GFP dans un bouillon de dextrose de pomme de terre 1 % (p/v). Vortex et ajuster la concentration de spores à5 10 spores/mL avec un hémocytomètre.
    Attention : A. flavus produit des aflatoxines, tous les travaux avec ce champignon devraient être conduite dans une armoire de sécurité biologique.
  4. Incuber dans APB à 28 ° C jusqu'à ce que la culture atteint 50 % début de la germination de la spore comme indiqué par le renflement des spores.
  5. Extraient de vortex et aliquote 25 µL spore de solution à l’usine de 225 µL. Incuber les échantillons pendant 20 heures à 28 ° C sous agitation intermittente.
  6. Aliquote 25 µL de solution de spores sur une lame de microscope et mesurez la longueur du germe de tubes de spores en utilisant le logiciel de l’appareil photo numérique. Utiliser un minimum de 20 mesures répétées pour chaque ligne.
    Remarque : À ce stade, placer toutes les cultures à 4 ° C pour arrêter la croissance de la colonie jusqu’au moment de compter.

3. noyau Screening Test (KSA)

  1. Construire des casquettes KSA en collant les 4 capuchons de clin d’oeil (22 mm) dans un plat de pétri de 60 x 15 mm. Laissez la colle sécher pendant 48 H avant d’utiliser des bouchons. Chaque capuchon KSA constitue une Rep (Figure 2).
  2. Dans une armoire de sécurité biologique stérile, pulvériser un plateau carré bio-essai (24 x 24 cm) avec 70 % éthanol : H2O (v/v) et laissez l’air sec. Papier pour chromatographie stérile s’ajoute la barre d’état. 9 sélections KSA de pulvérisation avec l’éthanol à 70 %, laisser l’air sec et placez dans le bac de dosage biologique.
  3. Pour chaque ligne de maïs transgénique mis à l’essai, sélectionnez 20 cerneaux intacts et placer dans un tube à centrifuger 50 mL. Ajouter de l’éthanol à 70 % et laisser reposer pendant 4 minutes. Secouer doucement les tubes pendant la stérilisation. Égoutter les amandes éthanol et rincer trois fois dans stérile désionisée H2O.
  4. Préparer une suspension de spores d' Aspergillus flavus 70 – GFP17 d’une culture vieille de 6 jour cultivées sur un milieu V8 (5 % jus V8, 2 % d’agar, pH 5,2).
    1. Ajouter 20 mL stérile 0,02 % Triton X-100/désionisée H2O (v/v) et les débris hors des spores avec une anse stérile. Pipette au large de l’inoculum et le place dans un bécher stérile de 300 mL.
    2. Préparer une dilution de 5 fois avec 0,02 % X-100 Triton, puis effectuez un comte de spore avec un hémocytomètre. Diluer à nouveau si nécessaire pour obtenir 100 mL avec une concentration de 4 x 106 spores/mL.
  5. Placer les grains dans un bécher stérile de 300 mL avec une barre de remuer. Ajouter l’inoculum dans le bécher.
    Attention : Ajout des noyaux à inoculum cause solution éclabousse. Placer le bécher sur une plaque de remuer pendant 3 minutes. Après 3 minutes, égoutter inoculum dans un récipient vide.
  6. À l’aide d’une pince, placer les noyaux dans le plat de biodosage (1 noyau/cap). Ajouter 30 mL désionisée au fond de chaque bac de dosage biologique et incuber à 31 ° C dans l’obscurité pendant 7 jours.
  7. Préparer les noyaux pour la photographie.
    1. Mettre de côté 4 noyaux de chaque ligne pour analyse microscopique et la photographie.
      Remarque : Les amandes peuvent être stockés à 4 ° C pendant pas plus de 5 jours avant la fin de la photographie.
    2. Prendre des photos des grains après sept jours après l’inoculation avec a. flavus (Figure 3).
    3. Nettoyer l’extérieur des noyaux avec un tissu mou et l’eau désionisée. Effectuer des coupes longitudinales de cerneaux et immédiatement prendre des photos sous le microscope à fluorescence.
  8. Préparer les noyaux pour l’analyse.
    1. Nettoyer l’extérieur des grains restants avec un tissu mou et l’eau désionisée.
    2. Placer 4 noyaux, constituant 1 rep, dans un polycarbonate de bouchon à vis 15 mL flacon contenant 2 boules d’acier inoxydable. Immédiatement geler les flacons dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu'à l’analyse et le traitement ultérieur.
    3. Retirer les flacons du congélateur-80 ° C et moudre les amandes dans un homogénéisateur à 1 500 tr/min pendant 3 minutes.
      Remarque : Conservez les grains gelés à l’azote liquide.

4. dépistage de la PCR de grains de maïs transgéniques

  1. Utilisez le kit d’isolation de l’ADN pour isoler l’ADN génomique (Adng) de grains de maïs pulvérisés infectées par a. flavus selon les instructions du fabricant. Brièvement, ajouter 280 µL de tampon de F, 20 µL protéase et 3 µL le dithiothréitol (DTT) à 10-15 mg de grains de maïs pulvérisés. Incuber et agiter dans un thermomixer (56 ° C, 1200 tr/min, 30 min). Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min et transvaser le liquide clair surnageant dans colonne équilibré. Incuber à température ambiante pendant 3 min et centrifuger à 700 x g pendant 1 min éluer Adng.
  2. Prendre 0,8 µL d’extrait Adng à mettre en place une réaction de PCR 20 µL de chaque échantillon à l’aide d’un kit PCR. Vous devez remplir les conditions cyclage thermique tel que recommandé dans le protocole du fabricant. Les conditions de la PCR incluent une étape de dénaturation initiale à 98 ° C pendant 5 min (étape 1) suivie de dénaturation à 98 ° C pendant 5 s (étape 2), recuit à 55 ° C pendant 5 s (étape 3), l’allongement à 72 ° C pendant 20 s (étape 4), 40 cycles d’étape 2 à l’étape 4 et une étape d’élongation finale à 72 ° C pendant 1 min (étape 5).
  3. Utiliser l’apprêt avant 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' et inverser l’apprêt 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' pour confirmer la présence de la Lablab AILP gène dans les grains de maïs transgéniques.

5. les ARN, synthèse de cDNA et RT-PCR semi-quantitative

  1. Prenez homogénéisé a. flavus infectés grains de maïs préalablement stockées à-80 ° C pour l’extraction de l’ARN. Extraire l’ARN utilisant un kit d’isolation de RNA total selon le protocole du fabricant mais avec légère modification18. Après l’ajout de 50 mg de poudre de noyau maïs homogénéisé dans le tampon d’extraction, mélangez-le bien (sans utilisation du vortex) à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et laissez-le sur glace pendant 5 à 6 minutes avant de procéder aux étapes suivantes comme décrit dans le protocole du fabricant.
  2. Préparer le cDNA utilisant un kit de synthèse de cDNA selon protocole 18 les directives du fabricant.
  3. Utiliser 0,5 µL d’ADNc non dilué par réaction PCR pour RT-PCR semi-quantitative comme précédemment décrit18. Utiliser des amorces et inverses qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' et qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectivement à détecter Le Lablab AILP l’expression des gènes et avant et fait reculer les amorces qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ et qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ, respectivement pour l’expression du gène structural ribosomique maïs (Rib), GRMZM2G02483819 , comme un gène ménager.

6. quantification de la GFP

  1. Préparation de 50 mL chacun de phosphate monobasique de sodium 0,2 M (NaH2PO4) et 0,2 M phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4·7H2O) dans désionisée H2O.
  2. Composent de 100 mL de tampon phosphate pH 7.0 Sorenson. Pour pH 7.0, ajouter 19,5 mL NaH2PO4 stock, 30,5 mL NaHPO4·7H stock d’O2et 50 mL eau désionisée H2O.
  3. Peser 25 mg produit de noyau broyé (poids frais, FW) et placer dans un tube de microcentrifuge de 1,0 mL. Ajouter 500 µL de tampon de phosphate au tube à centrifuger et vortexer pendant 30 s.
  4. Centrifuger les échantillons pendant 15 minutes à 16 000 x g. Surnageant du pipette 100 µL dans une assiette bien noir 96. Lire les échantillons avec un fluorimètre (excitation 485 nm, émission 528 nm).

7. analyse des aflatoxines totales

  1. Échantillons de traitement et aflatoxines d’extraction
    1. Des échantillons de noyau dans un four à air pulsé à sec pendant 2 jours à 60 ° C. Peser les échantillons et introduire dans un Erlenmeyer avec un bouchon en verre de 50 mL.
    2. Sous une hotte, ajouter 25 mL de chlorure de méthylène dans chaque fiole.
      Attention : Le chlorure de méthylène est très volatil et est considéré comme dangereux (cancérigène irritant,). Gants latex ni nitrile sont sûrs pour l’utilisation de chlorure de méthylène. Utiliser des gants alcool polyvinylique résistant aux solvants organiques d’améliorée.
    3. Secouez les échantillons pendant 30 min sur un agitateur oscillant. Après 30 min, verser lentement l’extrait à travers un filtre plissé cercle dans un bécher de 80 mL. Laisser sécher jusqu’au lendemain béchers dans une hotte de laboratoire.
    4. Le lendemain, squirt chlorure de méthylène (5 mL environ) autour de l’intérieur de la jante des secs béchers, tourbillonnent autour et verser dans dram 2 flacons en verre. Congé de flacons ouvrent pour sécher toute la nuit sous une hotte.
  2. Analyse des aflatoxines
    1. Ajouter 4,0 mL 80 % méthanol : eau désionisée H2O (v/v) de flacons.
    2. Utiliser un kit d’extraction d’aflatoxine pour filtrer purifier la solution méthanolique avec la colonne fournie. Analyser les niveaux d’aflatoxine totale avec un fluorimètre, selon les instructions du fabricant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transformation de maïs et de criblage moléculaire des plantes transgéniques

Les embryons immatures de lignées de maïs Hi-II ont été transformées à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens EHA101 souche contenant le vecteur de destination final plante exprimant le gène AILP Lablab purpureus sous le contrôle du CaMV 35 s promoteur. Cinq lignées de maïs transformées de façon indépendante ont été poussées à la génération de T6 pour des études ultérieures. Les plants de maïs transgéniques étaient beaucoup plus petits et moins vigoureux mais n’a pas montré toutes les autres anomalies par rapport aux plantes isogéniques de contrôle négatif. Amplification par PCR du gène cible AILP a montré un amplicon bp 548, observé uniquement dans les lignées de maïs transgéniques par rapport à des plantes de contrôle (Figure 4 a). Le gène AILP a montré l’expression dans les lignées transgéniques alors qu’aucune expression de AILP a été observée chez les plantes témoins (Figure 4 b).

Aspergillus flavus analyse de spore avec feuille extrait

Feuille de brut extrait de jeune maïs transgénique, les plantes ont été préparés par broyage dans un liquide N et centrifugation à 16 000 x g. Les spores en germination stade précoce ont été exposés à l’extrait de feuilles pendant 20 heures et la longueur des hyphes spore moyenne a été enregistrée sur 20 échantillons. Longueur des hyphes de spores exposés à des extraits de feuilles transgéniques ont montré une réduction de 58 % à 80 % par rapport au témoin négatif (Figure 5)

Aspergillus flavus croissance au cours de l’infection de noyau

Un test de dépistage Kernel (KSA) a été réalisée afin d’examiner la croissance d' a. flavus dans les grains transgéniques et de contrôle. L’expression du gène dans les grains transgéniques AILP affecté négativement la croissance d’a. flavus . La souche d’a. flavus utilisée dans la présente étude contienne un journaliste GFP qui permet la surveillance et la quantification de la croissance fongique en temps réel. Réduction significative de la fluorescence de la GFP a été observée dans les noyaux AILP transgéniques par rapport au témoin négatif isogénique (Figure 6). AILP lignes 4 et 5 ont montré une réduction significative de la croissance fongique, 69 % et 72 %, respectivement, suivie par les autres lignes, où il a observé une réduction de 35 % à 60 % en comparaison avec les noyaux de contrôle (Figure 7 a).

Production d’aflatoxine dans les grains infectés

L’expression hétérologue du gène AILP chez le maïs a entraîné une réduction significative de la teneur en aflatoxines dans les lignées transgéniques vs contrôle. Les données de l’aflatoxine fourni ici est la teneur en aflatoxines totales détectée en grains infectés. A observé une réduction de 62 % à 88 % de la teneur en aflatoxines dans les noyaux AILP par rapport à la commande (Figure 7 b). Parmi les différentes lignes AILP 5, ligne 4 a montré la plus faible teneur en aflatoxine (486 ng/g PS), suivie d’autres lignes allant de 640-1 498 ng/g PS dans les noyaux vs contrôle (3 986 ng/g PS).

Figure 1
Figure 1 : Conception de vecteur pour l’expression transgénique du Lablab AILP gène dans le maïs. 35 s = virus de mosaïque de chou-fleur ou promoteur constitutif du CaMV ; RB = bordure droite ; LB = bordure gauche ; nptII = gène de résistance néomycine phosphotransférase-kanamycine ; amendements et 35 s = terminaisons de transcription. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Noyau test de dépistage. (A, B) Stériliser les grains et verser dans un bécher stérile sous une hotte de sécurité biologique. (C – E) Inoculer les noyaux avec suspension de spores d’a. flavus . (F-H) À l’aide d’une pince stérile, placez les amandes dans bioessai plat. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Lumière micrographies de croissance d’a. flavus . (A) contrôle négatif isogéniques. (B-F) Grains transgéniques exprimant AILP (lignes 1-5), une semaine après l’inoculation. Echelle = 1 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Dépistage moléculaire des plantes transgéniques. (A), PCR confirmation des plants de maïs transgéniques (voies 1-5) contenant Le Lablab AILP (fragment de DNA de diagnostic de bp 548 ; C = contrôle négatif isogénique ; NEB 2 Log échelle d’ADN utilisée comme marqueur d’ADN). (B) l’Expression du gène de Lablab AILP dans les lignées de maïs transgéniques (voies 1-5) par RT-PCR. Lane C représente isogénique contrôle négatif. Gène de structure ribosomique maïs (Rib), GRMZM2G02483819 a été utilisé comme un gène ménager (échelle d’ADN de 2 Log NEB : marqueur d’ADN). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Effet de feuille brut extrait de plantes AILP maïs transgéniques sur la germination des spores a. flavus contre un isogénique contrôle négatif (neg). Post-test de Dunnett a fait séparation moyenne après analyse de la variance. Niveaux de réduction significative sont signalées par des astérisques (***P ≤ 0,0001). Barres d’erreur indiquent erreur-type d’un dispositif de vingt échantillons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Fluorescence GFP émanant de la souche d’a. flavus 70-GFP dans les grains transgéniques exprimant AILP après une semaine d’essai biologique. Les témoins négatifs isogéniques (A) ont servi à évaluer l’infection fongique et la propagation dans les grains transgéniques (B-F représentant les lignées transgéniques 1-5). Au moins quatre noyaux ont été examinés pour chaque ligne sous le microscope à fluorescence. Echelle = 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Production de croissance et d’aflatoxines un flavus . (A) maladies infectieuses 70-GFP a. flavus et croissance dans les grains de maïs après 7 jours dans un test de dépistage du noyau. Moyenne de trois expériences indépendantes avec quatre biologique réplique à chaque fois. Quantification de la GFP (en unités relatives de Fluorescence, RFU) indique la croissance fongique dans les lignées de maïs transgéniques exprimant AILP à un contrôle négatif isogénique. Post-test de Dunnett a fait séparation moyenne après analyse de la variance. Niveaux de réduction significative est notée par des astérisques (*P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001). Barres d’erreur indiquent erreur-type d’un dispositif de quatre réplicats biologiques aléatoires. (B) la production d’aflatoxine par a. flavus 70-GFP dans des grains de maïs après 7 jours dans un test de dépistage du noyau. Moyenne de 12 réplicats biologiques et chaque réplicat contenait quatre noyaux. Niveaux d’aflatoxine dans les grains transgéniques de AILP (lignes 1-5) contre un isogénique contrôle négatif (neg). Post-test de Dunnett a fait séparation moyenne après analyse de la variance. Niveaux de réduction significative est notée par des astérisques (**P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001). Barres d’erreur indiquent erreur-type d’un dispositif de quatre réplicats biologiques aléatoires. Voir les Figures supplémentaires pour afficher les données dans le panneau B dépourvues de biais dû à l’inhibition fongique. Fermer la corrélation entre la GFP = RFU et aflatoxine valeurs sont également fournis. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Sup Figure 1
Supplemental Figure 1 : Données de la Figure 7 b redessiné pour montrer la production d’aflatoxine par a. flavus 70-GFP dans des grains de maïs après 7 jours dans un test de dépistage du noyau afin d’éliminer le biais dû à l’inhibition de la croissance fongique. Valeurs d’aflatoxines ont été divisés par l’inhibition de la croissance fongique représentée sous forme de valeurs de GFP-RFU en Figure 7 b. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Sup Figure 2
Supplémentaire Figure 2 : fermer la corrélation entre les valeurs de GFP-RFU (= croissance fongique) et les niveaux d’aflatoxine (r2 = 0,86) signalés dans le Royaume d’Arabie saoudite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Des pertes de rendement dans les cultures agricoles en raison des agents pathogènes et parasites est un problème mondial20. Actuellement, application de pesticides et fongicides synthétiques est le moyen prédominant pour contrôle pathogènes et parasites, mais toxicité résiduelle de ces substances biochimiques dans l’alimentation humaine et animale peut constituer une menace sérieuse pour la santé humaine et animale,21. Compte tenu de l’importance économique du maïs comme aliments et cultures fourragères, réduction ou élimination de la contamination par les aflatoxines est d’une importance capitale2,3,22. Sélection classique par le biais de l’introgression des gènes résistants sur les variétés sensibles est un processus long et cette résistance n’est pas toujours stable comme résistance de l’aflatoxine est un caractère polygénique et expression des gènes participants varient de façon significative avec les changements de paramètres environnementaux4. Approches alternatives sont envisagées pour accroître et stabiliser la défense plante hôte contre a. flavus de manière écologique.

Dans la présente étude, nous avons choisi d’évaluer l’efficacité du gène AILP de Jacinthe haricots maïs contre a. flavus. AILP est un inhibiteur compétitif de le α-amylase et possède également des propriétés antifongiques, nous avons exprimé cet gène sous un promoteur constitutif fort CaMV 35 s. Le but était d’augmenter la production de cette protéine hétérologue chez le maïs quel que soit le stade de développement ou le type de tissu. Une expression significative du gène α-amylase dans les lignées de maïs transgéniques (Figure 4 aB) prend en charge l’expression stable de ce gène dans un système hétérologue. Cela affecté négativement la croissance fongique comme il ressort de la réduction de la distribution spatiale de la fluorescence GFP à l’intérieur des grains infectés AILP et réduction globale fluorescence GFP dans les noyaux (Figure 6 et Figure 7 a).

La mise au point du noyau Screening Test (KSA) utilise un génétiquement a. flavus souche de journaliste exprimant un gène codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) de la méduse Aequorea victoria18, 23. pour élaborer des stratégies de contrôle pour tout agent pathogène, il est nécessaire de comprendre le mode de propagation et de la colonisation dans la plante hôte ou tissu. La colonisation et la propagation de l’aflatoxigènes saprophyte, a. flavus n’est pas bien compris, car la régulation génétique de la résistance à l’agent pathogène, s’il en existe, n’est pas bien comprise. Utilisation de la souche exprimant le GFP a. flavus permet de suivre en temps réel le processus d’infection et de la colonisation. La souche GFP et le sauvage ne diffèrent pas significativement à l’agent pathogène agressivité et aflatoxine production23. Toutefois, le gène de la GFP dans cette souche particulière est placé sous le contrôle de l’exprimé constitutivement glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (gpdA) gène promoteur 24 qui est plus apte pour le suivi de la croissance des champignons. Toutefois, à l’aide de cette tache sur coton et grains de maïs, nous avons montré un lien étroit entre la fluorescence GFP émanant de ce champignon à la croissance fongique et aflatoxine niveaux18,23.

Afin d’établir une étroite corrélation avec l’aflatoxine, capacité de production, gfp conduit par les promoteurs de gènes d’aflatoxine tels que l' omtA ou ver-125,26 sera plus adapté que le GallA. La fluorescence GFP est assez sensible pour la détection et de mesure en temps réel de même les petits changements dans la croissance des champignons, in vitro et in plantaet évaluation des activités inhibitrices des peptides et protéines antifongiques inconnus comme AILP et d’autres11,17,18,23. En outre, les résultats de l’Arabie saoudite correspond bien au rendement sur le terrain des lignées de maïs résistantes ou sensibles en ce qui concerne l’évaluation pour l’aflatoxine contamination27.

L’Arabie saoudite est très utile dans notre laboratoire à écran classique race nouvelles variétés4 et lignées transgéniques11,18. Il est facile à configurer et exécuter KSA dans n’importe quel laboratoire. Il faut utiliser grains propres intacts pour effectuer ce test afin qu’une bonne compréhension de l’interaction plante-champignon hôte a pu être évaluée. Nous scannons systématiquement tous les noyaux que nous utilisons dans notre laboratoire sous un stéréomicroscope avant d’effectuer le test. Il est à noter que les conditions que nous employons pour l’Arabie saoudite incluent une humidité élevée (95 % RH) et à température constante (31 ° C). Dès le début du processus de germination simulées dans ces conditions, le dosage offre les conditions idéales pour tester l’intégrité du tégument, génétique des grains dont les gènes/protéines antifongiques allumés pendant la germination, et/ou fongique infection. Fungal infection et aflatoxine production sera toujours plus élevée en Arabie saoudite par rapport à leur présence sur le terrain ; Toutefois, une étroite corrélation a été établie4,27.

Nous avons démontré dans cette Arabie saoudite que AILP réduit la croissance fongique dans les grains de maïs. AILP possède des propriétés antifongiques des lectines végétales et il a été démontré pour inhiber le α-amylase, diminuant la dégradation de l’amidon et en limitant la croissance fongique. In vitro, des études ont démontré que l’AILP est capable d’inhiber a. flavus croissance dans un milieu de croissance artificielle de bouillon (APB) dextrose riche en sucre de pomme de terre, indiquant son inhibition de l’activité antifongique/croissance était indépendante de l’inhibition de l’amylase activité13. Autres lectines végétales isolement de Urtica dioica (ortie), Hevea brasiliensis (arbre à caoutchouc) et les tubercules de Solanum tuberosum (pomme de terre) montrent aussi des propriétés antifongiques similaires et inhibent la croissance de Botrytis cinerea , Pyrenophora triticiet Fusarium oxysporum28,29,30,31. Inhibiteurs de l’Alpha amylase ne sont pas efficaces contre les champignons et les bactéries, mais se sont révélés aussi efficaces contre les insectes ravageurs,32. Alpha amylases sont signalés comme étant essentiel pour une croissance normale et le développement des insectes qui se nourrissent de végétaux, et plusieurs inhibiteurs α-amylase insectes ont été isolés de plantes comme le blé, haricot et le maïs12,33, 34,35. Une réduction significative de spores exposés à des extraits de feuilles brutes (Figure 5), réduction de la croissance fongique dans le maïs exprimant l’AILP de longueur des hyphes fongiques noyaux comme en témoigne la réduction de la fluorescence GFP tant qualitativement ( Figure 6) et quantitativement (Figure 7 a) est probablement due à une combinaison de ses propriétés d’inhibition et antifongique de le α-amylase. Expériences utilisant ces maïs exprimant l’AILP plantes contre d’autres agents pathogènes et parasites seront à l’avenir d’un grand intérêt pour tester son efficacité contre les divers facteurs de stress biotiques des semences et des tissus végétatifs. Les propriétés d’inhibition antifongique et croissance de lectine a été principalement attribuée à sa réticulation avec chitine et inhibition de la pointe des hyphes expansion28. En fait, d’inhibition in vitro de α-amylases de diverses origines fongiques et bactériennes par AILP montré plus 65 % inhibition chez les pathogènes fongiques, notamment a. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriaeet 41 % d’inhibition dans la bactérie pathogène, Bacillus subtilis,13. Les résultats sur la réduction de la croissance d’a. flavus présentée ici correspondent au rôle des inhibiteurs de le α-amylase comme agents antifongiques. La présente étude plus illustre l’application pratique de ces renseignements utiles obtenus plus tôt des études in vitro.

Réduction de la teneur en aflatoxine (Figure 7 b) dans l' AILP-exprimant des lignées de maïs est peut-être due à l’inhibition de l’activité de le α-amylase a. flavus , conduisant à une ventilation diminuée d’amidon entreposé et réduit l’acquisition des sucres comme un source d’énergie des grains de maïs au cours de l’interaction pathogène. Comme α-amylase fongique joue un rôle important pour faire tomber les amidons de noyau, tout changement dans l’activité de α-amylase fongique par AILP probable modifie teneur en sucres solubles pendant l’infection de noyau. Teneur en sucres solubles, en particulier le saccharose et le glucose, a été fortement corrélée avec l’augmentation de la production de l’AFB1 et total aflatoxines dans le maïs et autres cultures sensibles a. flavus telles que l’arachide36,37. Augmentant la teneur en saccharose dans les milieux de culture artificiel augmente a. flavus aflatoxine production38. Autres sucres solubles tels que le glucose et le maltose également contribuent à la production d’aflatoxine en milieu artificiel et semences substrats38. L’inhibition de l’activité de le α-amylase et la réduction de la production de mycotoxines chez d’autres champignons renforce un rôle important de α-amylases fongiques dans la production de toxines pendant l’infection de noyau. Mutants de l’Alpha-amylase knockout de F. verticillioides et a. flavus , a échoué à produire des fumonisines B1 et aflatoxines respectivement suite à une infection des grains de maïs9,10. De même, vers le bas-règlement d’a. flavus α-amylase significativement réduite fongiques croissance et aflatoxine la production au cours de l' infection de noyau maïs11. Une réduction de 62 % à 88 % en aflatoxine dans les lignées transgéniques sont conformes à précédents rapports sur le rôle de le α-amylase dans la production d’aflatoxine. Il est à noter que le test de dépistage noyau in vitro (KSA) est plus strict que normalement trouvés dans des conditions naturelles. Conditions au cours de l’essai in vitro sont également très propices à la production d’aflatoxine, ainsi le taux de variation de la teneur en aflatoxines dans les lignées transgéniques pourrait être plus explicite plutôt que le nombre absolu de la teneur en aflatoxines dans les grains infectés. Les résultats présentés ici sont prometteurs et de futures expériences dans des conditions de terrain sont importants examiner le potentiel de ces AILP-exprimant des lignées de maïs pour la résistance à l’aflatoxine dans un scénario naturel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions David Meints, Université de l’Arkansas pour son aide dans l’élaboration et l’analyse du maïs transgénique au cours des premières générations. Cet ouvrage a reçu le soutien financier du projet de l’USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cet article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le US Department of Agriculture. Offre d’emploi égale (EEO) politique des USDA-ARS exige l’égalité des chances pour toutes les personnes et interdit la discrimination dans tous les aspects des politiques relatives au personnel, pratiques et opérations de l’Agence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Sciences de l’environnement question 144 inhibiteur de le α-amylase aflatoxine Aspergillus flavus maïs noyau maïs transgénique dosage Lablab purpureus de dépistage
Inhibition de la croissance <em>d’Aspergillus flavus</em> et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de <em>Lablab purpureus</em> L.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter