Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Hemming av Aspergillus flavus vekst og Aflatoxin produksjon i transgene mais uttrykke den α-amylase Inhibitor fra Lablab purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å analysere Aspergillus flavus vekst og aflatoxin produksjon i mais kjerner uttrykke en soppdrepende protein.  Bruke en GFP-uttrykke A. flavus belastning overvåket vi infeksjon og spredning av soppen i eldre kjerner i sanntid. Analysen er rask, pålitelig og reproduserbar.

Abstract

Aflatoxin forurensning i mat og fôret avlingene er en stor utfordring over hele verden. Aflatoxins, produsert av soppen Aspergillus flavus (A. flavus) er potente kreftfremkallende som betydelig reduserer beskjære verdien i mais og andre olje rike avlinger som peanut foruten posing alvorlig trussel mot mennesker og dyr sunnhet. Ulike tilnærminger, inkludert tradisjonelle avl, transgene uttrykket av motstanden forbundet proteiner og RNA-interferens (RNAi)-basert vert-indusert genet stanse kritiske A. flavus genet mål, evalueres for å øke aflatoxin motstand i utsatt avlinger. Tidligere studier har vist en viktig rolle for α-amylase i A. flavus patogenesen og aflatoxin, antyder dette genet/enzymet er et mulig mål å redusere både A. flavus vekst og aflatoxin produksjon. I denne forbindelse, ble denne studien gjennomført for å vurdere heterologous uttrykk (under kontroll konstituerende CaMV 35S ) for en Lablab purpureus L. α-amylase inhibitor som protein (AILP) i mais mot A. flavus. AILP er en 36-kDa protein, som er en konkurransedyktig hemmer av A. flavus α-amylase enzym og tilhører Lektiner-arcelin-α-amylase hemmer protein familien felles bønne. In vitro studier før arbeidet hadde vist AILP rolle i Hemming av A. flavus α-amylase aktivitet og soppvekst. Soppvekst og aflatoxin produksjon i eldre kjerner ble kartlagt i sanntid ved hjelp av en GFP-uttrykke A. flavus belastning. Denne kjernen screening analysen (KSA) er svært enkelt å sette opp og gir pålitelig og reproduserbar infeksjon og omfanget av spredning som kan kvantifiseres for evaluering av germplasm og transgene linjer. Fluorescens fra GFP stammen er nært korrelert til sopp vekst, og dermed er det godt korrelert til aflatoxin verdier.  Målet med arbeidet var å implementere denne forkunnskaper i en kommersielt viktig avling som mais å øke aflatoxin motstand. Våre resultater viser en 35%-72% reduksjon i A. flavus vekst i AILP-uttrykke transgene mais kjerner som igjen oversettes til 62%-88% reduksjon i aflatoxin nivåer.

Introduction

Mycotoxin forurensning av sopp slektene, Aspergillus, Fusarium, penicillinog Alternaria er et stort problem av næringen og mate avlinger vokst verdensomspennende1,2,3. Blant disse phytopathogenic sopp har Aspergillus størst ugunstig innvirkning på beskjære verdi og dyrs og helse. Aspergillus flavus (A. flavus) er en opportunistisk anlegget patogen som infiserer olje rike avlinger som mais, bomullsfrøolje og peanut og produserer potente kreftfremkallende stoffer, aflatoxins, samt mange giftige sekundære metabolitter (SMs). Mais er et viktig mat og mate avling dyrkes over hele verden og er svært utsatt for forurensning av A. flavus. Den økonomiske virkningen av aflatoxin forurensning på taper og redusert verdien i mais kan være så mye som $686.6 millioner/år i USA2 anslåtte endringer i globale klima, virkningen av aflatoxins kan resultere i større økonomiske tap i mais med estimater så høyt som $1.68 milliarder i året i nær fremtid2. Gitt de negative økonomiske og helsemessige effektene av aflatoxins hos mennesker og husdyr, kan før innhøsting aflatoxin kontroll i mais være den mest effektive måten å hindre aflatoxin forurensning i mat og fôr produkter.

Den store før innhøsting kontroll tilnærmingen for aflatoxin motstand i mais som har vært brukt mye i de siste tiårene er primært gjennom formering, som krever en betydelig mengde tid4. Nylig har biocontrol hatt suksess i aflatoxin reduksjon i stor skala feltet programmer5,6. Foruten biocontrol, har bruken av banebrytende molekylære verktøy som 'Host indusert Gene Silencing' (HIGS) gjennom RNAi og transgene uttrykk for motstand-assosiert proteiner hatt suksess i reduksjon av A. flavus vekst og aflatoxin produksjon i liten skala laboratory og felt studier. Disse metodene er optimaliseres i tillegg til å identifisere nye potensielle A. flavus genet mål for fremtidige manipulasjon.

Foruten gener som er direkte involvert i mycotoxin produksjon som potensielle mål av transgene kontroll strategier, har sopp amylases vist seg å spille en avgjørende rolle i å opprettholde vellykket patogenese og mycotoxin produksjon i tidlige fasen verten anlegget infeksjon. Noen eksempler er Pythium pleroticum (kausal agent av ingefær rhizome råte), Fusarium solani (kausal agent av blomkål wilt), der positive sammenhenger mellom virusets og α-amylase uttrykk og aktivitet ble observert 7,8. Hemming av α-amylase aktivitet enten gjennom genet knockout eller pusse tilnærminger påvirker negativt fungal vekst og gift produksjon. En α-amylase knockout mutant av A. flavus klarte ikke å produsere aflatoxins når dyrket på stivelse substrat eller degermed mais kjerner9. Tilsvarende i Fusarium verticillioides mislyktes en α-amylase knockout belastning å produsere fumonisin B1 (mycotoxin) under infeksjon mais kjerner10. En nyere studie viste Gilbert et al. (2018) at en RNAi-baserte slå ned A. flavus α-amylase uttrykk, via HIGS betydelig redusert A. flavus vekst og aflatoxin produksjon under mais kjernen infeksjon11 .

Bestemt hemmere α-amylase aktivitet har også produsert lignende resultater som hentes fra ned-regulering av α-amylase uttrykk. Den første rapporten om rollen som en α-amylase hemmer i fungal motstand kom fra isolering og karakterisering av en 14-kDa trypsin-α-amylase hemmer fra mais linjer motstandsdyktig mot A. flavus12. Ytterligere screening av flere hundre av plantearter av Fakhoury og Woloshuk førte til identifisering av en 36-kDa α-amylase inhibitor som protein (AILP) fra frø av Jacinto bønner, Lablab purpureus L.13. Peptid sekvensen av AILP lignet lectins Lektiner-arcelin-α-amylase hemmer gultrefamilien rapportert felles bønne14,15. Renset AILP viser ikke noen hemmende aktivitet mot pattedyr trypsin og videre i vitro karakterisering viste betydelig hemming av A. flavus vekst og conidial spiring13. Rapporter presentert her tydelig viser α-amylase kan fungere som et mål i kontroll tilnærminger til begrense patogener eller skadedyr som avhenger av stivelse mobilisering (gjennom α-amylase aktivitet) og oppkjøpet av løselig sukker som energikilde under deres patogene interaksjon med verten planter.

Alpha-amylase er kjent for å være kritisk i A. flavus virusets9,10,11, og betydningen av AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylase hemming/antigrowth)13, Vi generert transgene mais planter uttrykke Lablab AILP gen under konstituerende CaMV 35S arrangøren. Målet var å undersøke om heterologous uttrykk for denne α-amylase hemmer i mais er effektiv mot A. flavus patogenese og aflatoxin produksjon under mais kjernen infeksjon. Våre resultater viser at transgene mais kjerner uttrykke AILP betydelig redusert A. flavus vekst og aflatoxin produksjon under kjernen infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmider konstruksjoner og mais transformasjon

  1. PCR forsterke Lablab AILP sett med primerne 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 "og 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3". PCR betingelsene inkluderer et innledende rødsprit skritt på 98 ° C for 30 s (trinn 1), etterfulgt av rødsprit 98 ° c for 10 s (trinn 2), annealing ved 55 ° C for 30 s (trinn 3), forlengelse ved 72 ° C for 20 s (trinn 4), 31 sykluser av trinn 2 til 4 , og en siste forlengelse trinn ved 72 ° C i 5 min. klone PCR produktet i en modifisert pCAMBIA 1300 vektor med Xbajeg og Pstjeg begrensning nettsteder. Rekkefølgen siste anlegget destinasjon vektoren å bekrefte retning og sekvens av klonet AILP genet i vektoren.
  2. Transformere Agrobacterium belastning EHA101 med den endelige vektor konstruere (figur 1) som tidligere beskrevet 16.
  3. Bruk forvandlet Agrobacterium som inneholder siste anlegget destinasjon vektoren transformere umodne mais (Zea mays L. Hi-II) embryo (utført på anlegget transformasjon anlegget i Iowa State University) 16.
  4. Vokse T0 planter i drivhuset (26-29 ° C, 16/8 h fotoperiode med høyt trykk Na-lamper) og gjentatte ganger self-pollinate for å få T6 generasjon for å oppnå homozygosity for transgene trekk.

2. spore spiring analysen

  1. Høste blad prøver og lagre på-80 ° C. Grind blad prøver med en morter med flytende nitrogen. Veie ut 0,5 g i 2 mL microcentrifuge rør, legge til 17 µL av protease hemmer og plassere rør på is.
  2. Sentrifuge rør for 10 min 16.000 x g. Overføre 225 µL av planteekstrakter til 0,5 mL microcentrifuge rør og plasser på isen.
  3. Forbered en 5 mL spore suspensjon av Aspergillus flavus 70-GFP i 1% potet druesukker kjøttkraft (w/v) i en 15 mL sentrifuge tube. Vortex og justere spore konsentrasjon til 105 sporer/mL med et haemocytometer.
    FORSIKTIG: A. flavus produserer aflatoxins, alle arbeider med denne soppen bør gjennomføres på en biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
  4. Inkuber i PDB på 28 ° C til kultur oppnår 50% initiering av spore spiring som indikert av svulmende av spores.
  5. Vortex og aliquot 25 µL spore løsning til 225 µL anlegget ekstrakt. Inkuber prøver i 20 timer på 28 ° C med periodisk risting.
  6. Aliquot 25 µL av spore løsning microscope skyve og måle lengden av bakterie rør sporer programmvre digitalkamera. Bruk minst 20 Repliker målinger for hver linje.
    Merk: På dette stadiet, plassere alle kulturer i 4 ° C for å stoppe kolonien veksten helt klar til å telle.

3. kjernen Screening analysen (KSA)

  1. Konstruere KSA caps ved liming 4 snapin caps (22 mm) i en 60 x 15 mm Petriskål. Tillat lim. tørke 48 timer før du bruker caps Hver KSA cap utgjør en rep (figur 2).
  2. I et sterilt biologiske sikkerhetskabinett skap, spray en firkantet bioassay skuff (24 cm x 24 cm) med 70% etanol: H2O (v/v) og la luften tørr. Legge til sterilt kromatografi papir i skuffen. Spray 9 KSA caps med 70% etanol, la luften tørr, og plasser i bioassay skuffen.
  3. For hver transgene mais linje blir testet, Velg 20 uskadet kjerner og plasser i en 50 mL sentrifuge rør. Legg til 70% etanol og la sitte i 10 minutter. Forsiktig risting rør i steriliseringsprosessen. Hell av etanol og skyll kjerner tre ganger i sterilt deionisert H2O.
  4. Forberede en spore suspensjon av Aspergillus flavus 70-GFP17 fra en 6 dagers gammel kultur dyrket på V8 medium (5% V8 Juice, 2% agar, pH 5.2).
    1. Legge til 20 mL steril 0.02% Triton X-100/vaskebuffer H2O (v/v) og skrap av sporer med en bakteriefri loop. Pipetter av inoculum og sted i en 300 mL steril kanne.
    2. Forberede en 5-fold fortynning med 0,02% Triton X-100, deretter utføre en spore greven med en haemocytometer. Fortynne igjen hvis det er nødvendig for å oppnå 100 mL med en konsentrasjon av 4 x 106 sporer/mL.
  5. Plasser kjerner i et sterilt 300 mL beaker med rør bar. Legge til inoculum i begeret.
    Advarsel: Legge til kjerner i inoculum vil føre løsning å plaske. Plasser kanne på en røre plate i 3 minutter. Etter 3 minutter, hell av inoculum i en tom kanne.
  6. Bruker en tang, sett kjerner i bioassay parabolen (1 kjernen/cap). Legge til 30 mL vaskebuffer vann til bunnen av hver bioassay skuff og ruge på 31 ° C i mørket i 7 dager.
  7. Forberede kjerner for fotografering.
    1. Avsette 4 kjerner fra hver linje for microscopic analyse og fotografi.
      Merk: Kjerner kan lagres på 4 ° C lenger enn 5 dager før fotografering.
    2. Ta bilder av kjerner etter syv dager med kontaminert med A. flavus (Figur 3).
    3. Rengjør utsiden av kjerner bløtvev og deionisert vann. Utfør langsgående deler av kjerner og umiddelbart ta bilder under fluorescerende mikroskop.
  8. Forberede kjerner for analyse.
    1. Rengjør utsiden av gjenværende kjerner bløtvev og deionisert vann.
    2. Sted 4 kjerner, utgjør 1 representant, i en 15 mL skrukork polykarbonat medisinglass inneholder 2 rustfritt stål baller. Umiddelbart fryse ampuller i flytende nitrogen og store-80 ° c til videre bearbeiding og analyse.
    3. Fjern flasker fra-80 ° C fryseren og male kjerner i en homogenizer på 1500 rpm i 3 minutter.
      Merk: Holde kjerner frosset med flytende nitrogen.

4. PCR screening av transgene mais kjerner

  1. Bruke DNA isolering kit for å isolere genomisk DNA (gDNA) fra pulverisert mais kjerner infisert med A. flavus i henhold til produsentens instruksjoner. Kort, legge til 280 µL buffer F, 20 µL protease og 3 µL dithiothreitol (DTT) i 10-15 mg av pulverisert mais kjerner. Ruge og riste i en thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 min). Sentrifuge 10.000 x g for 1 min og overføre klart nedbryting equilibrated kolonne. Inkuber ved romtemperatur for 3 min og sentrifuger 700 x g for 1 min til elute gDNA.
  2. Ta 0,8 µL av utdraget gDNA å sette opp en 20 µL PCR reaksjon for hvert utvalg bruker en PCR kit. Følg thermocycling forhold som anbefalt i produsentens protokollen. PCR betingelsene inkluderer en innledende rødsprit trinn på 98 ° C i 5 min (trinn 1) etterfulgt av rødsprit ved 98 ° C i 5 s (trinn 2), annealing ved 55 ° C i 5 s (trinn 3), forlengelse ved 72 ° C for 20 s (trinn 4), 40 sykluser av trinn 2 til 4 , og et siste forlengelse skritt ved 72 ° C i 1 min (trinn 5).
  3. Bruke frem primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3 "og reversere primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' å bekrefte tilstedeværelse av Lablab AILP gene i transgene mais kjerner.

5. RNA isolasjon, cDNA syntese og semi kvantitative RT PCR

  1. Ta homogenisert A. flavus infisert mais kjerner lagrede-80 ° c for RNA utvinning. Ekstra RNA bruker en total RNA isolasjon utstyr i henhold til produsentens protokollen, men med liten endring18. Etter tilføyer 50 mg homogenisert mais kjernen pulver i utvinning bufferen, bland det godt (uten vortexing) ved hjelp av en 1 mL Pipetter tips og la den på is for 5-6 minutter før du fortsetter til neste trinn som beskrevet i produsentens protokollen.
  2. Utarbeide cDNA ved hjelp av en cDNA syntese kit i henhold til produsentens protokollen 18.
  3. Bruk 0,5 µL av ufortynnet cDNA per PCR reaksjon for semi kvantitative RT PCR som tidligere beskrevet18. Bruk forover og bakover grunning qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3 "og qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3 å oppdage Lablab AILP genekspresjon, og videresende og reversere primere qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ og qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ for uttrykket av mais ribosomal strukturelle genet (vrbord) GRMZM2G02483819 som en vaktmester genet.

6. GFP kvantifisering

  1. Forberede 50 mL 0,2 M monobasic natrium fosfat (NaH2PO4) og 0,2 M dibasic natrium fosfat (Na2HPO4·7H2O) i deionisert H2O.
  2. Utgjør 100 mL pH 7.0 Sorensons fosfatbuffer. For pH 7.0, legge 19,5 mL NaH2PO4 lager, 30,5 mL NaHPO4·7H2O lager og 50 mL vaskebuffer H2O.
  3. Veie ut 25 mg bakken kjernen materiale (frisk vekt, FW) og plasser i en 1,0 mL microcentrifuge tube. Legg til 500 µL fosfatbuffer sentrifuge rør og vortex for 30 s.
  4. Sentrifuge prøver i 15 minutter på 16.000 x g. Pipetter 100 µL nedbryting i en svart 96 godt plate. Lese prøvene med en fluorometer (eksitasjon 485 nm, utslipp 528 nm).

7. total aflatoxin analyse

  1. Eksempel behandling og aflatoxin utvinning
    1. Tørr kjernen prøver en tvungen luft ovn for 2 dager på 60 ° C. Veie prøver og plasser i en 50 mL Erlenmeyer kolbe korket.
    2. I avtrekksvifte, legge til 25 mL methylene klorid hver kolbe.
      FORSIKTIG: Methylene klorid er svært ustabilt og anses farlig (irriterende, kreftfremkallende). Latex verken nitril hansker er trygt for arbeid med Methylene klorid. Bruke forbedret organisk motstandsdyktig PolyVinylAlcohol hansker.
    3. Riste prøver for 30 min på en håndleddet handling shaker. Etter 30 min, sakte hell ekstrakt gjennom en riflet filter papir sirkel i en 80 mL kanne. La kanner tørr overnatting i avtrekksvifte.
    4. Neste dag, sprute methylene klorid (ca 5 mL) rundt indre rim av tørr kanner virvle rundt og hell i 2 dram hetteglass. La ampuller åpnes tørke i avtrekksvifte over natten.
  2. Aflatoxin analyse
    1. Legge til 4.0 mL 80% metanol: vaskebuffer H2O (v/v) til hetteglass.
    2. Bruk en aflatoxin utvinning kit å filtrere rense metanol løsning med den angitte kolonnen. Analysere samlet aflatoxin nivåer med en fluorometer, i henhold til produsentens instruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mais transformasjon og molekylære screening av transgene planter

Umodne embryo mais Hi-II linjer ble forvandlet ved hjelp av Agrobacterium tumefaciens EHA101 belastning som inneholder siste anlegget destinasjon vektoren uttrykke Lablab purpureus AILP genet under kontroll av CaMV 35S arrangøren. Fem uavhengig transformert mais linjer var avansert T6 generasjon for studier. Transgene mais planter var mye mindre og mindre energisk, men vise ikke noen andre misdannelser sammenlignet isogenic negativ kontroll planter. PCR forsterkning av målet AILP genet viste en 548 bp amplicon, bare i transgene mais linjene i forhold til control planter (figur 4A). AILP genet viste uttrykk i transgene linjene mens ingen AILP uttrykk ble observert i control planter (figur 4B).

Aspergillus flavus spore analysen med blad ut

Råolje blad utskrifter fra unge transgene mais planter ble utarbeidet av sliping i væske N og sentrifugering 16.000 x g. Tidlig stadium spirende sporer ble utsatt for blad ekstrakt i 20 timer og mener spore hyphal lengden ble innspilt fra 20 prøver. Hyphal lengde ellipseformede utsatt for transgene blad ekstrakter viste en 58%-80% reduksjon i forhold til kontrollen negative (figur 5)

Aspergillus flavus vekst under kjernen infeksjon

En kjerne Screening analysen (KSA) ble utført for å undersøke veksten av A. flavus i transgene og kontroll kjerner. Uttrykk av AILP genet i transgene kjerner påvirket negativt A. flavus vekst. A. flavus påkjenningen brukes i denne studien viser GFP journalist som gjør overvåking og kvantifisering av soppvekst i sanntid. Betydelig reduksjon i GFP fluorescens ble observert i transgene AILP kjerner i forhold til isogenic negativ kontroll (figur 6). AILP linjer 4 og 5 viste en betydelig reduksjon i soppvekst, 69% og 72%, henholdsvis etterfulgt av de andre linjene der en 35%-60% reduksjon ble observert i forhold til kontrollen kjerner (figur 7A).

Aflatoxin produksjon i infiserte kjerner

Heterologous uttrykk av AILP genet i mais resulterte i betydelig reduksjon av aflatoxin innhold i transgene linjene vs kontroll. Aflatoxin dataene gitt her er totalt aflatoxin innholdet i infiserte kjerner. 62%-88% reduksjon i aflatoxin innhold ble observert i AILP kjerner i forhold til kontrollen (figur 7B). Blant de 5 forskjellige AILP linjene viste linje 4 det laveste aflatoxin innholdet (486 ng/g DW), etterfulgt av andre linjer varierer mellom 640-1,498 ng/g DW i kjerner vs kontroll (3,986 ng/g DW).

Figure 1
Figur 1: Vektor design for transgene uttrykk for Lablab AILP gene i mais. 35S = blomkål mosaikk virus eller CaMV grunnleggende promoter; RB = høyre kantlinje; LB = venstre kantlinje; nptII = neomycin phosphotransferase-kanamycin motstand genet; NOS og 35s = transkripsjon terminatorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Kjernen Screening analysen. (A, B) Sterilisere kjerner og hell i et sterilt beaker i en biologisk sikkerhet regjering. (C-E) Vaksinere kjerner med A. flavus spore suspensjon. (F-H) Bruker et sterilt tang, sett kjerner i bioassay parabolen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Lys micrographs A. flavus vekst. (A) Isogenic negativ kontroll. (B-F) Transgene kjerner uttrykke AILP (linje 1-5) en uke etter vaksinering. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Molekylært screening av transgene planter. (A) PCR bekreftelse av transgene mais planter (baner 1-5) som inneholder Lablab AILP (548 bp diagnostiske DNA fragment; C = isogenic negativ kontroll; NB 2-Log DNA stige som en DNA-markør). (B) uttrykk for Lablab AILP gene i transgene mais linjer (baner 1-5) bruker RT PCR. Lane C representerer isogenic negativ kontroll. Mais ribosomal strukturelle genet (vrbord) GRMZM2G02483819 ble brukt som en vaktmester genet (NB 2-Log DNA stigen: DNA markør). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Effekten av råolje blad utdrag fra transgene AILP mais planter på A. flavus spore spiring mot en isogenic negativ kontroll (neg). Mener separasjon ble gjort av Dunnett's posttest etter ANOVA. Nivåer av betydelig reduksjon er merket med stjerner (***P ≤ 0,0001). Feilfelt viser standardfeil betyr for tjue prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. GFP fluorescens fra A. flavus belastning 70-GFP i transgene kjerner uttrykke AILP etter en uke med bioassay. Isogenic negative kontroller (A) ble brukt til å evaluere fungal infeksjon og spredt i transgene kjerner (B-F representerer transgene linjer 1-5). Minst fire kjerner ble vist for hver linje under fluorescerende mikroskop. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: En flavus vekst og aflatoxin produksjon. (A) A. flavus 70-GFP infeksjon og vekst i mais kjerner etter 7 dager i en kjerne Screening analysen. Gjennomsnittlig tre uavhengige eksperimenter med fire biologiske replikerer hver gang. GFP kvantifisering (i Relative fluorescens enheter, RFU) angir soppvekst transgene mais linjer uttrykke AILP en isogenic negativ kontroll. Mener separasjon ble gjort av Dunnett's posttest etter ANOVA. Nivåer av betydelig reduksjon er merket med stjerner (*P ≤ 0,05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0,001). Feilfelt viser standardfeil betyr for fire randomisert biologiske gjentak. (B) Aflatoxin produksjon av A. flavus 70-GFP i mais kjerner etter 7 dager i en kjerne Screening analysen. Gjennomsnitt 12 biologiske gjentak og hver replikere inneholdt fire kjerner. Aflatoxin nivåer i transgene AILP kjerne (linje 1-5) mot en isogenic negativ kontroll (neg). Mener separasjon ble gjort av Dunnett's posttest etter ANOVA. Nivåer av betydelig reduksjon er merket med stjerner (**P ≤ 0.01; ***P ≤ 0,001). Feilfelt viser standardfeil betyr for fire randomisert biologiske gjentak. Se flere figurer til å vise dataene i panelet B uten bias på grunn av sopp hemming. Nær sammenheng mellom GFP = RFU og aflatoxin verdier tilbys også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sup Figure 1
Supplerende figur 1: Data fra figur 7B trukket tilbake for å vise aflatoxin produksjon av A. flavus 70-GFP i mais kjerner etter 7 dager i en kjerne Screening analysen å eliminere skjevhet på grunn av soppvekst hemming. Aflatoxin verdier ble delt soppvekst hemming representert som GFP-RFU verdier i figur 7B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sup Figure 2
Ekstra figur 2: nær sammenheng mellom GFP-RFU verdier (= soppvekst) og aflatoxin nivåer (r2 = 0,86) rapportert i KSA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gi tap i jordbruksprodukter patogener og skadedyr er et globalt problem20. Foreløpig anvendelse av syntetiske soppmidler og plantevernmidler er dominerende kontroll plante-patogener og skadedyr, men gjenværende giftigheten av disse biokjemikalier i mat og feed kan utgjøre alvorlig trussel mot mennesker og dyr helse21. Den økonomiske betydningen av mais mat og fôr beskjære, reduksjon eller eliminasjon av aflatoxin forurensning er av største betydning2,3,22. Konvensjonell avl gjennom motstandsdyktig genet introgression i utsatt varianter er en tidkrevende prosess og slik motstand er ikke alltid stabile aflatoxin motstand er en polygenic egenskap og uttrykk for deltakende gener variere betydelig endringer i miljøparametere4. Alternative tilnærminger evalueres for å øke og stabilisere verten anlegget forsvar mot A. flavus på en miljøvennlig måte.

I denne studien valgte vi å evaluere effekten av AILP genet fra Jacinto bønner i mais mot A. flavus. AILP er en konkurransedyktig hemmer av α-amylase og også besitter soppdrepende egenskaper, uttrykte vi dette genet under en sterk konstituerende promoter CaMV 35S. Målet var å øke produksjonen av dette heterologous proteinet i mais uansett utviklingsstadiet eller vev type. Betydelig uttrykk for α-amylase genet transgene mais linjene (figur 4AB) støtter stabil uttrykk for dette genet i et heterologous system. Dette påvirket negativt soppvekst som tydelig fra reduksjon i romlige fordelingen av GFP fluorescens inne infiserte AILP kjerner og reduksjon i samlet GFP fluorescens i kjerner (figur 6 og figur 7A).

Utviklingen av kjernen Screening analysen (KSA) benytter en genmodifisert A. flavus reporter belastning uttrykke et gen koding grønne fluorescerende protein (GFP) fra maneter Aequorea victoria18, 23. for å utvikle kontroll strategier for noen patogen, er det nødvendig å forstå infeksjon, spre og kolonisering i verten anlegget eller vev. Kolonisering og spredning av aflatoxigenic saprophyte, A. flavus er ikke godt forstått fordi genetisk regulering av motstand mot patogen, hvis det finnes en ikke er godt forstått. Bruk av GFP-uttrykke A. flavus belastningen gjør det mulig å spore i sanntid infeksjon prosessen og kolonisering. GFP belastning og vill-type ikke avvike betydelig i patogen aggressivitet og aflatoxin produksjon23. Men er GFP genet i denne belastningen plassert under kontroll av de constitutively uttrykt glyceraldehyde fosfat dehydrogenase (gpdA) genet promoter 24 som er mer tilbøyelige til å spore soppvekst. Imidlertid har bruker denne flekken på bomullsfrøolje og mais kjerner, vi vist en nær sammenheng mellom GFP fluorescens kommer fra soppen soppvekst og aflatoxin nivåer18,23.

For å etablere en nær sammenheng med aflatoxin produksjon evne, vil gfp drevet av aflatoxin genet arrangører som omtA eller ver-125,26 være mer passende enn gpdA. GFP fluorescens er følsom nok for deteksjon og måling i sanntid av selv små endringer i soppvekst, både i vitro og plantaog evaluering av inhibitoriske aktiviteter ukjent soppdrepende proteiner og peptider som AILP og andre11,17,18,23. I tillegg resultater fra KSA samsvarer med feltet ytelse av motstandsdyktig eller utsatt mais linjer med hensyn til evalueringen for aflatoxin forurensning27.

I KSA er veldig nyttig i vårt laboratorium skjermen klassisk-avlet nye varianter4 og transgene linjer11,18. Det er lett å sette opp og utføre KSA i et laboratorium. Må bruke uskadet ren kjerner til å utføre denne analysen slik at en klar forståelse av verten anlegget-fungal samhandling kan evalueres. Vi skanne rutinemessig alle kjerner som vi bruker i vårt laboratorium under en stereomicroscope før gjennomfører analysen. Det bør bemerkes at forholdene som vi bruker for KSA inkluderer høy luftfuktighet (95% RH) og konstant temperatur (31 ° C). Med utbruddet av simulert spiring prosessen under disse forholdene gir analysen ideelle forhold å teste integriteten til frø jakke, genetiske sammensetningen av kjerner inkludert soppdrepende gener/proteiner aktivert under spiring, og/eller sopp infeksjon. Fungal infeksjon og aflatoxin produksjon vil alltid være høyere i KSA sammenlignet sin forekomst i feltet. men har en nær sammenheng vært etablert4,27.

Vi har vist i denne KSA at AILP reduserer soppvekst i mais kjerner. AILP besitter soppdrepende egenskaper av anlegget lectins, og har vist seg å hemme α-amylase redusere stivelse sammenbrudd og begrense soppvekst. I vitro studier vist at AILP var i stand til å hemme A. flavus var vekst i sukker-rik potet druesukker kjøttkraft (PDB) kunstig vekst medium, som viser sin soppdrepende/vekst hemming aktivitet uavhengig av sin amylase hemming aktivitet13. Andre plante lectins isolert fra Urtica dioica (Stornesle), Ekte gummitre (gummitre) og Solanum tuberosum (potet) knoller også vise lignende soppdrepende egenskaper og hemmet veksten av Botrytis cinerea , Pyrenophora triticiog Fusarium oxysporum28,29,30,31. Alpha amylase hemmere er ikke bare effektiv mot sopp og bakterier, men ble også vist å være effektiv mot insekt skadedyr32. Alfa amylases er rapportert å være viktig for normal vekst og utvikling av plante-fôring og flere insekt α-amylase hemmere har vært isolert fra planter som hvete, felles bønne og mais12,33, 34,35. En betydelig reduksjon i fungal hyphal lengde sporer utsatt for grov blad ekstrakter (figur 5), reduksjon i soppvekst i AILP-uttrykke mais kjerner som demonstrert av reduksjon av GFP fluorescens både kvalitativt ( Figur 6) og kvantitativt (figur 7A) er muligens på grunn av en kombinasjon av egenskapene α-amylase hemming og soppdrepende. Eksperimenter med disse AILP-uttrykke mais planter mot andre patogener og skadedyr i fremtiden vil være av stor interesse å teste effekt mot ulike biotiske stressfaktorer av frø og vegetative vev. Egenskapene soppdrepende og vekst hemming av Lektiner har blitt hovedsakelig tilskrevet sin cross-linking chitin og hemming av hyphal tips ekspansjon28. Faktisk i vitro AILP-mediert hemming av α-amylases fra ulike sopp og bakteriell opprinnelse viste over 65% hemming i fungal patogener inkludert A. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriaeog 41 % hemming i bakteriell patogen Bacillus subtilis13. Resultatene på reduksjon av A. flavus vekst presenteres her er i tråd med rolle α-amylase hemmere som soppdrepende midler. Denne studien videre viser praktisk anvendelse av slike nyttig informasjon fra tidligere in vitro studier.

Reduksjon i aflatoxin innhold (figur 7B) i AILP-uttrykke mais linjer er muligens hemming av A. flavus α-amylase aktivitet, fører til redusert sammenbrudd av lagrede stivelse, og redusert oppkjøpet av sukker som en energikilde fra mais kjerner under patogene samhandling. Som sopp α-amylase spiller en viktig rolle i å bryte ned kjernen stivelse, endrer noen endring i fungal α-amylase aktivitet av AILP sannsynlig løselig sukkerinnhold under kjernen infeksjon. Innholdet i løselig sukker, spesielt sucrose og glukose, har vært svært korrelert med økt produksjon av AFB1 og totalt aflatoxins mais og andre A. flavus utsatt avlinger som peanut36,37. Økende sukrose innhold i kunstig vekst medier øker A. flavus aflatoxin produksjon38. Andre løselig sukker som glukose og maltose bidra positivt til aflatoxin produksjon både i kunstig media og frø underlag38. Hemming av α-amylase aktivitet og reduksjon i mycotoxin produksjon i andre sopp forsterker en viktig rolle i fungal α-amylases i gift produksjon under kjernen infeksjon. Alpha-amylase knockout mutanter F. verticillioides og A. flavus kunne produsere fumonisin B1 og aflatoxins henholdsvis etter infeksjon av mais kjerner9,10. Tilsvarende redusert ned-regulering av A. flavus α-amylase betydelig fungal vekst og aflatoxin produksjon under mais kjernen infeksjon11. En 62% - 88% reduksjon i aflatoxin i transgene linjene er i samsvar med tidligere rapporter rollen α-amylase i aflatoxin produksjon. Det skal bemerkes at det i vitro kjernen Screening analysen (KSA) er strengere enn normalt under naturlige forhold. Forholdene under i vitro analysen er også svært fremmer for aflatoxin produksjon, så Prosentvis endring i aflatoxin innhold i transgene linjene kan være mer meningsfylt enn absolutte tall aflatoxin innhold i infiserte kjerner. Resultatene presenteres her er lovende og senere eksperimenter under feltforhold er viktig å undersøke av disse AILP-uttrykke mais linjer for aflatoxin motstand under et naturlig scenario.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker David Meints, University of Arkansas for hans hjelp i utviklingen og analysere transgene mais under tidlig generasjoner. Dette arbeidet mottok økonomisk støtte av USDA-ARS CRIS prosjektet 6054-42000-025-00D. Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende for å gi informasjon, og innebærer ikke anbefaling eller oppfordring av det oss Department of Agriculture. USDA-ARS' lik sysselsetting mulighet (EEO) mandater likestilling for alle personer og forbyr diskriminering i alle aspekter av byrået personell politikk, praksis og operasjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Miljøfag problemet 144 α-amylase inhibitor aflatoxin Aspergillus flavus mais kjernen screening analysen Lablab purpureus mais transgene
Hemming av <em>Aspergillus flavus</em> vekst og Aflatoxin produksjon i transgene mais uttrykke den α-amylase Inhibitor fra <em>Lablab purpureus</em> L.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter