Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Ингибирование роста Aspergillus flavus и афлатоксина производства трансгенных кукурузы выражая α-амилаза ингибиторов от Lablab пурпурный л

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Здесь мы представляем протокол для анализа роста Aspergillus flavus и производство афлатоксина в кукурузы ядра, выражая противогрибковые белка.  Мониторинг с помощью GFP-выражая A. flavus штамм мы инфекции и распространению гриба в зрелых ядра в режиме реального времени. Assay, быстрых, надежных и воспроизводимых.

Abstract

Серьезной проблемой во всем мире является загрязнение афлатоксина в пищевых и кормовых культур. Афлатоксины, производимые гриба Aspergillus flavus (A. flavus) являются мощными канцерогенами, которые существенно снижают стоимость урожая кукурузы и богатых культур других нефти как арахисовое помимо представляет серьезную угрозу для здоровья человека и животных. Различные подходы, включая традиционной селекции, трансгенных выражение сопротивления связанных белков и РНК-интерференции (RNAi)-на основе подавления экспрессии гена хост индуцированной из критических A. flavus гена целевых объектов, оцениваются для увеличения афлатоксин сопротивление в восприимчивых культур. Последние исследования показали, что важная роль α-амилазы в производстве A. flavus патогенеза и афлатоксин, предлагая этот ген/фермент является потенциальной мишенью для снижения роста A. flavus и производства афлатоксина. В этой связи текущее исследование было проведено для оценки гетерологичных выражение Lablab пурпурный л α-амилазы ингибиторы как белка (AILP) в кукурузы против A. flavus(под контролем учредительного промотора 35S CaMV). AILP — 36 kDa белок, который конкурентный ингибитор фермента α-амилазы A. flavus и принадлежит к семейству белков Лектин arcelin-α-амилазы ингибиторы в общем бин. Исследования in vitro до текущей работы продемонстрировал роль AILP в ингибирование активности α-амилазы A. flavus и роста плесени. Микоз и производство афлатоксина в зрелых ядра были мониторинг в режиме реального времени с помощью GFP-выражая A. flavus штамм. Это ядро отбора пробы (КСА) очень проста в настройке и предоставляет данные надежных и воспроизводимых на инфекции и масштабов распространения, которые могут быть количественно для оценки зародышевой плазмы и трансгенных линий. Флуоресценции от штамма GFP тесно взаимосвязанных чтобы грибковые роста и, путем расширения, это хорошо коррелированных афлатоксина ценностям.  Цель работы текущего было осуществлять предыдущие знания в коммерчески важных культур, как кукуруза для увеличения сопротивления афлатоксина. Наши результаты показывают снижение 35-72% A. flavus роста в AILP-выражая трансгенных кукурузы ядра, которые, в свою очередь, переведены на 62% – 88% снижение уровня афлатоксина.

Introduction

Контаминации, грибковых родов Aspergillus, фузариозу, Penicilliumи Alternaria является одной из основных проблем продовольствия и кормов культур во всем мире1,2,3. Среди этих Фитопатогенные грибов Aspergillus имеет наивысший негативное воздействие на стоимость урожая и здоровье человека и животных. Aspergillus flavus (A. flavus) это оппортунистическая завод возбудителя, который заражает нефти богатых культур, таких как кукуруза, хлопковое и арахиса и производит мощный канцерогенов, афлатоксинов, а также многочисленные токсичных вторичных метаболитов (SMs). Кукуруза является важной пищей и кормить культур выращивается во всем мире и очень чувствительны к загрязнению A. flavus. Экономические последствия загрязнения афлатоксином теряет и снижение стоимости в кукурузы может быть как $686.6 млн в год в США2 с прогнозируемые изменения глобального климата, воздействие афлатоксинов может привести к большей экономических потерь кукурузы с оценки как высокого как $1,68 млрд в год в ближайшем будущем2. С учетом экономических и медицинских последствий афлатоксинов в организме человека и животных, управления афлатоксина до сбора урожая кукурузы может быть наиболее эффективным способом предотвратить загрязнение афлатоксина в пищевых продуктах и кормить продуктов.

Основные управления до сбора урожая подход для сопротивления афлатоксина в кукурузы, которая широко используется в последние несколько десятилетий является главным образом путем селекции, которая требует значительного количества времени4. Недавно биоконтроль добился определенных успехов в сокращении афлатоксина в больших масштабах поля приложения5,6. Помимо биоконтроль применение передовых молекулярных инструменты, такие как «Хост индуцированной сайленсинга генов» (HIGS) через RNAi и трансгенных выражение сопротивления связанных белков добился определенных успехов в сокращении роста A. flavus и афлатоксина производство в небольших масштабах лабораторных и полевых исследований. Эти подходы являются в настоящее время осуществляется оптимизация Помимо выявления новых потенциальных A. flavus гена цели для будущих манипуляции.

Помимо генов, которые непосредственно участвуют в микотоксинов в качестве потенциальных целей стратегий трансгенных контроля было показано грибковых амилаз играть решающую роль в обеспечении успешного производства патогенеза и образование микотоксинов во время ранних стадиях хост завод инфекции. Несколько примеров Pythium pleroticum (возбудителя имбиря корневища гнилью), фузариозу Солани (возбудителя увяданию цветная капуста), где положительные корреляции между патогенности и α-амилазы выражение и деятельности были замечены 7,8. Ингибирование активности α-амилазы через Нокаут гена или нокдаун подходы отрицательно сказывается на грибковые роста и токсинного производства. Α-амилазы нокаут мутантов A. flavus был не в состоянии производить афлатоксинов при выращивании на крахмал субстрата или degermed кукурузы ядра9. Аналогичным образом в Fusarium verticillioides штамма нокаут α-амилазы не производить Фумонизин B1 (микотоксинов) во время инфекции кукурузы ядра10. В более недавнем исследовании Гилберт et al. (2018) показали, что на основе RNAi сбить A. flavus α-амилазы выражения через HIGS значительно сократить производство роста и афлатоксина A. flavus во время кукурузы ядра инфекции11 .

Специфичные ингибиторы активности α-амилазы также дали аналогичные результаты, полученные от вниз регуляцию экспрессии α-амилазы. Первый доклад по вопросу о роли ингибитор α-амилазы в грибковых сопротивления пришли из изоляции и характеристика ингибитор трипсина α-амилазы 14-кДа из кукурузы линии устойчивы к A. flavus12. Дальнейшего скрининга нескольких сотен видов растений Фахури и Woloshuk привели к выявлению 36 kDa белок α-амилазы ингибиторы как (AILP) из семян бобов гиацинт, пурпурный Lablab L.13. Пептид последовательность AILP напоминала лектинов, принадлежащих к семейству Лектин arcelin-α-амилазы ингибиторы сообщили в общем бин14,15. Очищенный AILP не проявляют любой ингибиторная активность на млекопитающих трипсина и далее в пробирке характеристика показали значительное торможение роста A. flavus и конидиальная всхожесть13. Доклады, представленные здесь ясно показывает α-амилазы может служить цели управления подходов к ограничению возбудителей болезней или вредителей, которые зависят от мобилизации крахмала (через активности α-амилазы) и приобретения растворимых сахаров в качестве источника энергии во время их патогенные взаимодействие с растений-хозяев.

Альфа амилаза, как известно, быть критическим в A. flavus патогенности9,10,11и с учетом важности AILP как мощным анти-A. flavus агент (α-амилазы ингибирование/опровергнут)13, Мы создали трансгенных растений кукурузы, выражая Lablab AILP гена под учредительного CaMV 35S промоутер. Целью было расследовать если гетерологичных выражение этой α-амилазы ингибиторы в кукурузу эффективна против A. flavus патогенеза и афлатоксина производства во время кукурузы ядра инфекции. Наши результаты показывают, что трансгенных кукурузы ядра, выражая AILP значительно сократить производство роста и афлатоксина A. flavus во время ядра инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. плазмидные конструкции и кукурузы преобразования

  1. PCR усиливает Lablab AILP вставить с помощью грунтовки, 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 "и 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3». Условия PCR включают первоначальный денатурации шаг на 98 ° C за 30 s (шаг 1), а затем денатурации на 98 ° C 10 s (шаг 2), отжиг при температуре 55 ° C за 30 s (шаг 3), удлинение 72 ° C для 20 s (шаг 4), 31 циклов 2 шага к шагу 4 , и окончательный удлинение шаг в 72 ° C за 5 мин клон продукт PCR в модифицированных pCAMBIA 1300 вектор с использованием Xbaя и Pstя места ограничения. Последовательность последний завод вектор назначения для подтверждения ориентацию и последовательность клонированного гена AILP в векторе.
  2. Как ранее описанных 16трансформировать Agrobacterium штамм EHA101 с помощью окончательного вектора конструкции (рис. 1).
  3. Использование преобразования Agrobacterium содержащие окончательный завод вектор назначения для преобразования незрелых кукурузы (Zea mays L. Hi-II) эмбрионов (выполняется в завод преобразования объекта в университете штата Айова) 16.
  4. Растут T0 растений в теплицах (26 – 29 ° C; 16/8 h фотопериода дополнена Na лампы высокого давления) и неоднократно самоопыляться получить T6 поколения для достижения homozygosity для трансгенных черта.

2. spore всхожесть пробирного

  1. Урожай листьев образцы и хранить при температуре-80 ° C. Измельчить листья образцы с ступку и пестик, с использованием жидкого азота. Весят, 0,5 г в 2 мл microcentrifuge трубы, 17 мкл ингибитора протеазы и место трубы на льду.
  2. Центрифуга трубы для 10 мин на 16000 x g. Передача 225 мкл концентрированного экстракта растения 0,5 мл microcentrifuge труб и место на льду.
  3. В 15 мл пластиковых пробирок Подготовьте 5 мл суспензии спор о Aspergillus flavus 70 – гена GFP в 1% картофеля декстроза бульон (w/v). Вортекс и регулировать споры до концентрации 105 споры/мл с haemocytometer.
    Предупреждение: A. flavus производит афлатоксинов, все с этим грибом следует проводить в биологической безопасности кабинета.
  4. Инкубируйте в PDB при 28 ° C, до тех пор, пока культура достигает 50% начала прорастания спор как указано выпячивание споры.
  5. Вортекс и аликвота 25 мкл споро решения к заводе 225 мкл экстракта. Проинкубируйте образцы для 20 часов на 28 ° C, периодически встряхивая.
  6. Аликвота 25 мкл раствора spore на микроскопа и мера длина зародыша трубки споры с помощью программного обеспечения цифровой камеры. Используйте как минимум 20 измерений для каждой строки.
    Примечание: На данном этапе, место всех культур на 4 ° C, чтобы остановить рост колонии до готовности для подсчета.

3. ядро отбора пробы (КСА)

  1. Постройте КСА шапки склеиванием 4 заглушки оснастки (22 мм) в чашку Петри 60 x 15 мм. Дать клею высохнуть в течение 48 часов перед использованием шапки. Каждая крышка KSA является один конгрессмен (рис. 2).
  2. В стерильные биологической безопасности кабинета спрей Поднос квадратный биопроб (24 x 24 см) с 70% этанол: H2O (v/v) и пусть воздух сухой. Добавьте стерильные хроматографии бумаги в лоток. Spray 9 КСА шапки с 70% этиловом спирте, пусть воздух сухой и поместите в лоток биопроб.
  3. Для каждой трансгенных кукурузы линии проходит проверку выберите 20 неповрежденных ядра и место в 50 мл пластиковых пробирок. Добавить 70% этанола и пусть сидят в течение 4 минут. Осторожно встряхните трубы во время стерилизации. Слить этанола и промыть ядра три раза в стерильных дейонизированной H2O.
  4. Подготовьте споро приостановление Aspergillus flavus 70 –17 GFP с 6 день старой культуры вырос на носителе V8 (5% сока V8, агар 2%, рН 5.2).
    1. Добавить 20 мл стерильной 0,02% Тритон X-100/деионизированная H2O (v/v) и лом от споры с помощью стерильного цикла. Накапайте посевным материалом и место в 300 мл стерильного стакан.
    2. Подготовить 5 раз разрежения с 0,02% Тритон X-100, затем выполнить подсчет спор с haemocytometer. Разбавьте снова, если необходимо получить 100 мл с концентрацией 4 х 106 споры/мл.
  5. Место ядра в стерильных 300 мл стакан с баром перемешать. Добавьте стакан посевным материалом.
    Предупреждение: Добавление ядра посевным материалом вызовет решение всплеск. Поместите стакан на тарелку, перемешать на 3 минуты. После 3 минут слейте посевным материалом в пустой стакан.
  6. С помощью щипцов, место ядра в bioassay блюдо (1 ядро/cap). Добавьте 30 мл деионизированной воды в нижней части каждого лотка биопроб и Инкубируйте на 31 ° C в темноте 7 дней.
  7. Подготовьте ядра для фотографии.
    1. Отложите 4 ядра из каждой строки для микроскопического анализа и фотографии.
      Примечание: Ядра можно хранить при 4 ° C не более чем за 5 дней до завершения фотографии.
    2. Возьмите фотографии ядер после семи дней вакцинации с A. flavus (рис. 3).
    3. Чистые внешние ядер с мягких тканей и обессоленной воды. Выполните продольных секций ядер и немедленно принимать фотографии под флуоресцентный Микроскоп.
  8. Подготовка ядра для анализа.
    1. Чистые внешние оставшихся ядер с мягких тканей и деионизированной водой.
    2. Место 4 ядра, составляющих 1 респ, поликарбонат колпачок 15 мл флакон содержащий 2 шариков из нержавеющей стали. Немедленно заморозить флаконов в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C до дальнейшей обработки и анализа.
    3. Удалить пузырьки из морозильной камеры-80 ° C и шлифуют ядра в гомогенизатор на 1500 об/мин за 3 минуты.
      Примечание: Держать ядра, заморожены жидким азотом.

4. PCR скрининг трансгенных кукурузы ядер

  1. Использование ДНК изоляции комплект изолировать genomic дна (геномная ДНК) из распыленного кукурузы ядра, инфицированных A. flavus согласно инструкциям производителя. Вкратце добавьте 280 мкл буфера F, 20 мкл протеазы и 3 мкл Дитиотреитол (DTT) 10-15 мг вдувания кукурузы ядер. Инкубировать и встряхните в thermomixer (56 ° C, 1200 об/мин, 30 мин). Центрифуга на 10000 x г за 1 мин и передаче ясно супернатант уравновешенной столбец. Инкубации при комнатной температуре 3 мин и центрифуги на 700 x g за 1 мин до элюировать геномная ДНК.
  2. Возьмите 0,8 мкл извлеченные геномная ДНК учредить 20 реакции PCR мкл для каждого образца, используя набор ПЦР. Следуйте thermocycling условия, как это рекомендовано в производителя протокол. Условия PCR включают первоначальный денатурации шаг на 98 ° C за 5 мин (шаг 1) следуют денатурации на 98 ° C за 5 s (шаг 2), отжиг при температуре 55 ° C за 5 s (шаг 3), удлинение 72 ° C для 20 s (шаг 4), 40 циклов 2 шага к шагу 4 и окончательный удлинение шаг в 72 ° C в течение 1 мин (шаг 5).
  3. Используйте вперед грунтовка 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' и обратить вспять грунтовка 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' для подтверждения наличия Lablab AILP гена в трансгенных кукурузы ядра.

5. РНК изоляции, синтез cDNA и полуколичественных RT-PCR

  1. Возьмите гомогенизированные A. flavus инфицированных кукурузы ядра, ранее хранятся при температуре-80 ° C для извлечение RNA. Извлечь РНК, с использованием всего комплекта РНК изоляции согласно протоколу производителя, но с небольшими изменениями18. После добавления 50 мг порошка гомогенизированные кукурузы ядра в буфере добычи, смешайте это хорошо (без vortexing) с помощью кончика пипетки 1 мл и оставить его на льду для 5-6 минут, прежде чем последующие шаги как описано в протоколе производителя.
  2. Подготовьте cDNA, используя набор для синтеза cDNA согласно производителя протокол 18.
  3. Используйте 0.5 мкл неразбавленном cDNA в реакции PCR для полуколичественного RT-PCR как ранее описанных18. Использование прямого и обратного праймеры qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' и qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' соответственно для выявления Lablab AILP экспрессии генов и вперед и обратить вспять праймеры qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ и qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ соответственно для выражения гена кукурузы рибосомных структурных (ребро), GRMZM2G02483819 как уборка ген.

6. GFP количественный

  1. Подготовка 50 мл 0,2 М монокальций фосфат натрия (NaH2PO4) и 0,2 М двуосновной фосфат натрия (Na2HPO4·7H2O) в дейонизированной H2O.
  2. Составляют 100 мл рН 7,0 Sorenson фосфатного буфера. Для рН 7,0 добавьте2PO4 NaH 19,5 мл бульона, 30,5 мл NaHPO4·7H2O фондовая и 50 мл деионизированная H2O.
  3. Весят материал ядра земли 25 мг (свежий вес, FW) и место в пробки microcentrifuge 1,0 мл. Добавьте 500 мкл рабочего раствора фосфатного буфера для пластиковых пробирок и вихрь 30 s.
  4. Центрифугуйте образцы на 15 минут в 16000 x g. Накапайте 100 мкл супернатант в черный 96 хорошо плиту. Прочитайте образцы с флуориметр (возбуждения 485 Нм, выбросов 528 Нм).

7. Общая афлатоксина анализ

  1. Пример обработки и афлатоксина добыча
    1. Сухие образцы ядра в духовке Принуждённая циркуляция воздуха для 2 дней при температуре 60 ° C. Взвесить образцы и место в 50 мл колбу Эрленмейера с стеклянной пробкой.
    2. В Зонта добавьте 25 мл хлористого метилена каждый флакон.
      Предупреждение: Хлорид метилена является крайне неустойчивым и считается опасным (раздражитель, канцероген). Латекс ни нитриловые перчатки являются безопасными для работы с хлорид метилена. Используйте более органических растворителей стойкие перчатки поливиниловый спирт.
    3. Встряхните образцы для 30 мин на запястье действий шейкер. После 30 мин медленно Налейте экстракт через круг рифленая Бумага фильтровальная 80 мл стакан. Пусть мензурки сухой ночлег в зонта.
    4. Следующий день, шприц Метилен хлористый (примерно 5 мл) вокруг внутри обода из сухой мензурки, вертеться вокруг и вылить в стеклянных флаконах 2 драм. Флаконов отпуск открыть для просушки в Зонта на ночь.
  2. Афлатоксин анализ
    1. Добавить 4.0 мл 80% метанола: деионизированная H2O (v/v) для флаконов.
    2. Использование набора извлечения афлатоксина для фильтрации очистки раствора метанола с заданного столбца. Анализ уровней всего афлатоксина с флуориметр, согласно инструкциям производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Кукурузы трансформации и молекулярных скрининг трансгенных растений

Незрелых зародышей кукурузы Hi-II линий были преобразованы с помощью Agrobacterium tumefaciens EHA101 штамма, содержащий последний завод назначения вектора выражения гена AILP Lablab пурпурный под контролем 35S CaMV промоутер. Пять линий независимо преобразованные кукурузы были выдвинуты T6 поколения для последующих исследований. Трансгенные растения кукурузы были намного меньше и менее энергичной, но не показывают каких-либо отклонений, по сравнению с растениями isogenic отрицательный контроль. PCR амплификация гена AILP целевой показал 548 ампликон bp, наблюдается только в линии трансгенных кукурузы по сравнению с контролем растений (рис. 4A). Джин AILP показал выражение в трансгенных линий, тогда как выражение не AILP наблюдался в контрольных растений (рис. 4B).

Aspergillus flavus экстракты пробирного спор с листьями

Сырой лист выдержки из молодых трансгенных кукурузы, что растения были подготовлены измельчения в жидкости N и центрифугирование в 16000 x g. Ранние стадии прорастания спор были подвержены листьев экстракт 20 часов и гиф Длина средняя спор был записан из 20 образцов. Гиф длина от споры воздействию экстрактов трансгенных листьев показали 58% – 80% снижение по сравнению с отрицательного контроля (рис. 5)

Aspergillus flavus рост во время ядра инфекции

Assay скрининг ядра (КСА) была выполнена для изучения роста A. flavus трансгенных и управления ядер. Экспрессия гена AILP в трансгенных ядер негативно A. flavus роста. A. flavus штамм, используемый в текущем исследовании содержит GFP репортер, который позволяет мониторинга и количественной оценки грибковые роста в реальном времени. Наблюдалось значительное снижение в GFP флуоресценции в трансгенных AILP ядра, по сравнению с isogenic отрицательный контроль (рис. 6). AILP линии 4 и 5 показали значительное снижение в микоз, 69% и 72%, соответственно, последовали другие линии, где наблюдалось снижение 35% – 60% по сравнению с управления ядра (рис. 7A).

Производство афлатоксина в зараженных ядра

Гетерологичных экспрессия гена AILP в кукурузы привели к значительному сокращению содержания афлатоксина в трансгенных линий против управления. Афлатоксин данные вот содержание всего афлатоксина, обнаруженных зараженных ядер. 62-88% сокращение содержания афлатоксина было отмечено в ядрах AILP по сравнению с контролем (рис. 7B). Среди 5 различных AILP линий 4 линии показали низкие содержание афлатоксина (486 нг/г DW), следуют другие линии в диапазоне от 640-1,498 нг/г DW в ядрах против управления (3,986 нг/г DW).

Figure 1
Рисунок 1: Векторный дизайн для трансгенных экспрессия гена Lablab AILP в кукурузы. 35S = вируса мозаики цветной капусты или CaMV учредительный промоутер; RB = правую границу; ФУНТ = левой границы; nptII = неомицин группы киназ канамицин сопротивления гена; нос и 35s = транскрипции терминаторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Ядро, скрининг Assay. (A, B) Стерилизовать ядра и вылить в стерильных стакан в биологической безопасности кабинета. (C-E) Прививать ядра с A. flavus споро подвеска. (F – H) С помощью стерильный пинцет, место ядра в bioassay блюдо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Свет микроскопии A. flavus роста. (A) Isogenic отрицательного контроля. (B – F) Трансгенные ядра, выражая AILP (линии 1-5) через одну неделю после прививки. Шкалы бар = 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Молекулярная скрининг трансгенных растений. (A) PCR подтверждения трансгенных растений кукурузы (полос 1-5) содержит Lablab AILP (548 bp диагностики фрагмент ДНК; C = isogenic отрицательный контроль; НЭБ 2-журнал трап дна используется в качестве маркера ДНК). (Б) выражение гена Lablab AILP в трансгенных кукурузы линий (полос 1-5) с помощью RT-PCR. Лейн C представляет isogenic отрицательного контроля. Кукурузы рибосомных генов структурных (ребро), GRMZM2G02483819 был использован в качестве домоустройства ген (NEB 2-журнал ДНК лестница: ДНК маркер). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Эффект сырой листа выдержки из трансгенных растений AILP кукурузы на A. flavus прорастание спор по сравнению с isogenic отрицательный контроль (ОТР). Средняя разделение было сделано posttest Дуннетт после ANOVA. Уровня значительного снижения обозначаются звездочками (***P ≤ 0,0001). Планки погрешностей указывают стандартная ошибка средства для 20 образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. GFP флуоресценции, вытекающих из A. flavus штамм 70-ГФП в трансгенных ядра, выражая AILP после одной недели биопроб. Isogenic негативный контроль (A) были использованы для оценки грибковой инфекции и распространение трансгенных ядер (B-F представляющих трансгенные линии 1-5). По крайней мере четыре ядра были экранированы для каждой строки под флуоресцентный Микроскоп. Шкалы бар = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Производство роста и афлатоксина flavus . (A) 70-GFP инфекции A. flavus и рост кукурузы ядра после 7 дней в ядро Assay скрининга. В среднем трех независимых экспериментов с четырьмя биологического реплицирует каждый раз. Квантификация гена GFP (в относительных единицах флуоресценции, РФС) указывает микоз трансгенных кукурузы линий выразить AILP isogenic отрицательного контроля. Средняя разделение было сделано posttest Дуннетт после ANOVA. Значительное снижение уровня обозначается звездочками (*P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Планки погрешностей указывают стандартная ошибка средства для четырех рандомизированных биологических реплицирует. (B) Производство афлатоксина A. flavus 70-ГФП в кукурузы ядра после 7 дней в ядро Assay скрининга. В среднем 12 биологических реплицирует и каждый репликации содержал четыре ядра. Афлатоксин уровни трансгенных AILP ядра (линии 1-5) по сравнению с isogenic отрицательный контроль (ОТР). Средняя разделение было сделано posttest Дуннетт после ANOVA. Значительное снижение уровня обозначается звездочками (**P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Планки погрешностей указывают стандартная ошибка средства для четырех рандомизированных биологических реплицирует. Просмотреть дополнительные цифры для просмотра данных в группа B лишен предвзятости вследствие грибкового ингибирование. Существует зависимость между GFP = РФС и афлатоксин также предоставляются значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Sup Figure 1
Дополнительные рисунок 1: Данные рисунок 7B повторно перетаскиваются, чтобы показать производства афлатоксина, A. flavus 70-ГФП в кукурузы ядра после 7 дней в скрининг Assay ядра для устранения предвзятости за счет ингибирования роста плесени. Афлатоксина значения были разделены ингибитированием микоз, представлены в виде значения GFP-РФС в Рисунок 7B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Sup Figure 2
Дополнительные рисунок 2: закрыть корреляции между значениями GFP-РФС (= микоз) и уровень афлатоксина (r2 = 0,86) сообщила в КСА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Потери урожая сельскохозяйственных культур вследствие патогенов и вредителей является глобальной проблемой20. В настоящее время применение синтетических фунгицидов и пестицидов является преобладающим средством для контроля патогенов растений и вредителей, но остаточной токсичности этих биохимикатов в пищевых продуктов и кормов может представлять серьезную угрозу для здоровья человека и животных21. Принимая во внимание экономическое значение кукурузы как еда и кормовых культур сокращения или ликвидации загрязнения афлатоксином имеет первостепенное значение2,3,22. Обычные селекции в восприимчивых разновидностях посредством интрогрессии устойчивостью генов является длительным процессом и такое сопротивление не всегда стабильное сопротивление афлатоксина является polygenic черта и значительно различаются экспрессии генов, участвующих с изменения в экологических параметров4. Для увеличения и стабилизации принимающей завод обороны против A. flavus экологично образом изучаются альтернативные подходы.

В текущем исследовании мы решили оценить эффективность AILP гена из гиацинтов зерен кукурузы против A. flavus. Как AILP конкурентный ингибитор α-амилазы и также обладает противогрибковыми свойствами, мы выразили этот ген под сильным учредительный промоутер CaMV 35S. Целью было увеличение производства этого гетерологичных белка в кукурузы независимо от стадии развития или тип ткани. Значительное выражение гена α-амилазы в линии трансгенных кукурузы (рис. 4AB) поддерживает стабильные выражение этого гена в гетерологичных системе. Это отрицательно сказалось микоз, как видно из сокращения пространственного распределения GFP флуоресценции внутри инфицированных AILP ядра и снижением общей GFP флуоресценции в ядрах (Рисунок 6 и рис. 7A).

Разработка ядра скрининг Assay (КСА) использует генетически A. flavus репортер штамм выражения гена кодирования Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) от медузы Aequorea victoriaв18, 23. разработать стратегии управления для любого патогена, это нужно понимать режим инфекции, распространение и колонизации в пределах растения-хозяина или ткани. Колонизации и распространение сапрофитные aflatoxigenic, A. flavus не очень хорошо понимал, потому что генетического регулирования сопротивление возбудителя, если таковой существует, не вполне понятно. Использование штамма GFP-выражая A. flavus позволяет отслеживать в режиме реального времени процесс инфицирования и колонизации. Штамм GFP и одичал типа не отличается существенно возбудителя агрессивность и афлатоксина производства23. Однако гена GFP в этом конкретного штамма помещается под контролем конститутивно выраженной Глицеральдегид фосфат дегидрогеназа (gpdA) Ген Промоутер 24 которая более уместна для отслеживания роста плесени. Однако используя это пятно на хлопковое и кукурузы ядра, мы показали тесную взаимосвязь между GFP флуоресценции, вытекающих из гриба микоз и афлатоксина уровнях18,23.

Установить тесные корреляции с производства способности афлатоксина, gfp обусловлен афлатоксина генным стимуляторам ПДОA или вер-125,26 будет более подходящим, чем gpdа. Флуоресценции GFP достаточно чувствительным, чтобы позволить для обнаружения и измерения в реальном времени даже небольшие изменения в грибковые роста, и в пробирке и в plantaи оценки деятельности ингибирующее неизвестных противогрибковые белков и пептидов Например, AILP и другие11,,1718,23. Кроме того результаты от КСА хорошо коррелирует с поля производительности устойчивостью или подверженных кукурузы линий относительно оценки загрязнения афлатоксином27.

KSA является очень полезным в нашей лаборатории с экрана классически разводят новых сортов4 и трансгенных линий11,18. Это легко для установки и выполнения КСА в любой лаборатории. Необходимо использовать неповрежденных чистой ядра для выполнения этот assay, так, что четкое понимание принимающей завод грибковые взаимодействия могут оцениваться. Мы регулярно проверять все ядра, которые мы используем в нашей лаборатории под стереомикроскопом до проведения анализа. Следует отметить, что условия, которые мы используем для КСА включают высокую влажность (95% RH) и постоянной температуре (31 ° C). С началом процесса моделирования прорастания в этих условиях assay обеспечивает идеальные условия для проверки целостности семян пальто, генетической ядер, включая противогрибковый генов/белки включен во время прорастания, или грибковых инфекции. Грибковые инфекции и афлатоксина производство всегда будет выше в КСА, по сравнению с их появления в этой области; Однако существует тесная связь был установленных4,27.

Мы продемонстрировали в этой КСА AILP уменьшает Грибковые рост кукурузы ядра. AILP обладает противогрибковыми свойствами растений лектинов и было показано, подавляют α-амилазы, снижение распад крахмала и ограничение роста плесени. В vitro исследования показали, что AILP был способен ингибирующих A. flavus рост сахара богатых картофеля декстроза бульон (PDB) искусственный рост средний, указанием его противогрибковые/роста ингибирование активности был независимо от его ингибирование амилаза деятельность13. Другие растения лектины изолированы от Крапива двудомная (общие крапивы), Hevea brasiliensis (Гевея) и клубни Solanum tuberosum (картофель) также показывают аналогичные противогрибковые свойства и препятствует росту Botrytis cinerea , Pyrenophora triticiи Fusarium oxysporum28,,2930,31. Альфа-амилаза ингибиторов, не только эффективны против грибков и бактерий, но были также доказала свою эффективность против насекомых-вредителей32. Альфа-амилазы, как сообщается, решающее значение для нормального роста и развития растений кормления насекомых, и несколько насекомых α-амилазы ингибиторы были изолированы от растений, таких как пшеница, общих фасоли и кукурузы12,33, 34,35. Значительное снижение грибковых гиф длиной от споры, подвергается сырой листьев экстракт (рис. 5), снижение роста плесени в AILP-выражая кукурузы ядра, как свидетельствует сокращение GFP флуоресценции оба качественно ( Рисунок 6) и количественно (рис. 7A), возможно, обусловлено сочетанием его α-амилазы торможение и противогрибковые свойства. Эксперименты с использованием этих AILP-выражая кукурузные растения против других патогенов и вредителей в будущем будет представлять большой интерес для проверки его эффективность против разнообразных биотического стресса семян и растительных тканей. Противогрибковые и росту ингибирования свойства лектина главным образом приписывается его cross-linking с хитин и ингибирование гиф кончик расширения28. В самом деле, в пробирке AILP-опосредованной ингибирование α-амилазы из различных грибковых и бактериальных происхождение показал свыше 65% ингибирования в грибковых патогенов, включая A. flavusи Magnaporthe мурены, гельминтоспориозу victoriae, 41 ингибирование % в бактериальных болезнетворного микроорганизма Bacillus subtilis13. Результаты на снижение темпов роста A. flavus , представленные здесь соответствуют роли α-амилазы ингибиторы как противогрибковых препаратов. Настоящее исследование далее показано практическое применение такой полезной информации, полученной от ранее исследования in vitro.

Снижение содержания афлатоксина (рис. 7B) в AILP-выражая кукурузы линий возможно благодаря ингибирование активности α-амилазы A. flavus , приводит к снижению пробоя хранимых крахмала и сократить приобретения сахара как источник энергии из кукурузы ядра во время патогенных взаимодействия. Как грибковые α-амилазы играет важную роль в разрушении крахмала ядра, любые изменения в деятельности грибковых α-амилазы, AILP вероятно изменяет растворимых сахаров во время ядра инфекции. Содержание растворимых сахаров, особенно сахарозы и глюкозы, было тесно связано с ростом производства AFB1 и общей афлатоксинов в кукурузы и других A. flavus восприимчивы культур, таких как арахис36,37. Увеличение содержания сахарозы в искусственного выращивания увеличивает A. flavus афлатоксина производства38. Других растворимых сахаров, как глюкоза и мальтоза также положительный вклад производства афлатоксина в искусственных средств массовой информации и семян субстратов38. Ингибирование активности α-амилазы и сокращение микотоксинов в других грибов подтверждает важную роль грибковых α-амилазы в производство токсинов во время ядра инфекции. Альфа амилаза нокаут мутантов ф verticillioides и A. flavus не производят Фумонизин B1 и афлатоксинов, соответственно после инфицирования кукурузы ядра9,10. Аналогичным образом вниз регулирование A. flavus α-амилазы значительно снижены грибковые роста и афлатоксина производства кукурузы ядра инфекции11. 62-88% сокращение афлатоксина в трансгенных линий в соответствии с ранее доклады о роли α-амилазы в производство афлатоксина. Это следует отметить, что в пробирке Assay скрининг ядра (КСА) является более строгим, чем обычно найдено в естественных условиях. Условия во время экстракорпорального assay способствуют также высоко для производства афлатоксина, поэтому процент изменения в содержание афлатоксина в трансгенных линий может быть более значимым, а не абсолютные показатели содержания афлатоксина в зараженных ядер. Представленные здесь результаты являются многообещающими и будущих экспериментов в полевых условиях важно изучить потенциал этих AILP-выражая кукурузы линии для афлатоксина сопротивления под естественный сценарий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Дэвида Майнтс, Университет штата Арканзас за его помощь в разработке и анализе трансгенных кукурузы во время ранних поколений. Эта работа получила финансовую поддержку проекта USDA-ARS Сири 6054-42000-025-00D. Торговые наименования или коммерческих продуктов в этой статье упоминаются исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Министерством сельского хозяйства. Политики равных возможностей занятости (РВЗ) USDA-ARS мандатов равных возможностей для всех лиц и запрещает дискриминацию во всех аспектах кадровой политики, практики и операций Агентства.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 144 α-амилазы ингибиторы афлатоксин Aspergillus flavus кукуруза ядра скрининг пробирного Lablab пурпурный кукуруза трансгенных
Ингибирование роста <em>Aspergillus flavus</em> и афлатоксина производства трансгенных кукурузы выражая α-амилаза ингибиторов от <em>Lablab пурпурный</em> л
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter