Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Abstract

Contaminación por aflatoxinas en los cultivos de alimentos y piensos es un grave problema en todo el mundo. Las aflatoxinas, producidas por el hongo Aspergillus flavus (a. flavus) son potentes carcinógenos que reducen sustancialmente el valor de la cosecha de maíz y otros cultivos ricos del aceite como maní además de amenaza grave para la salud humana y animal. Diferentes enfoques, incluyendo la cría tradicional, expresión transgénica de proteínas de resistencia asociada y ARN de interferencia (ARNi)-basado en el silenciamiento génico inducido por el anfitrión del crítico a. flavus objetivos gene, están siendo evaluados para aumentar resistencia a aflatoxinas en cultivos susceptibles. Últimos estudios han demostrado un papel importante de α-amilasa en la producción de patogenesia y aflatoxina a. flavus , sugiriendo a este gen enzimático es un blanco potencial para reducir el crecimiento de a. flavus y la producción de aflatoxina. En este sentido, el actual estudio fue emprendido para evaluar expresión heteróloga (bajo control del CaMV 35S promotor constitutivo) de una proteína Lablab purpureus L. como inhibidor de la α-amilasa (IABP) en maíz contra a. flavus. IABP es una proteína de 36 KD, que es un inhibidor competitivo de la enzima α-amilasa de a. flavus y pertenece a la familia de proteínas lectin-arcelin-α-amilasa inhibidor en común haba. Estudios in vitro antes de los trabajos actuales han demostrado el papel de la IABP en la inhibición de la actividad de la α-amilasa de a. flavus y crecimiento del hongo. Crecimiento fúngico y la producción de aflatoxina en granos maduros fueron monitoreados en tiempo real utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus . Este núcleo investigación ensayo (KSA) es muy fácil de configurar y proporciona datos fiables y reproducibles en la infección y el grado de extensión que podría cuantificarse para evaluación de germoplasma y de líneas transgénicas. La fluorescencia de la cepa de la GFP es crecimiento estrechamente correlacionada a hongos y, por extensión, está bien correlacionada con valores de aflatoxina.  El objetivo del presente trabajo fue implementar este conocimiento previo en un cultivo comercialmente importante como el maíz para aumentar la resistencia de la aflatoxina. Nuestros resultados muestran una reducción del 35% – 72% en a. flavus crecimiento expresando AILP transgénicos granos de maíz que, a su vez, traducido en una reducción de 62% a 88% en los niveles de aflatoxina.

Introduction

Contaminación por micotoxinas de los géneros de hongos, Alternaria , Aspergillus, Penicilliumy Fusariumes un problema importante de los alimentos y cultivos en todo el mundo1,2,3. Entre estos hongos fitopatógenos, Aspergillus tiene el mayor impacto adverso en el valor de cultivos y salud humana y animal. Aspergillus flavus (A. flavus) es un patógeno oportunista de la planta que infecta cultivos ricos aceite tales como semilla de algodón, maíz y maní y produce el potente carcinógeno, aflatoxinas, así como numerosos metabolitos secundarios tóxicos (SMs). Maíz es un alimento importante y alimenta de cultivo en todo el mundo y es altamente susceptible a la contaminación por a. flavus. El impacto económico de la contaminación por aflatoxinas en pierde y valor reducido en el maíz puede ser tanto como $ 686,6 millones/año en los Estados Unidos2 con los cambios previstos en el clima global, el impacto de las aflatoxinas podría resultar en mayores pérdidas económicas en maíz con estimaciones tan altas como $ 1,68 billones/año en el futuro cercano2. Teniendo en cuenta los efectos adversos de la económicos y la salud de las aflatoxinas en los seres humanos y ganado, control de aflatoxinas antes de la cosecha de maíz podría ser la manera más eficiente para prevenir la contaminación por aflatoxinas en los alimentos y productos comestibles.

El enfoque de control previo a la cosecha principal de resistencia de aflatoxina en el maíz que se ha utilizado ampliamente en las últimas décadas es principalmente a través de la crianza, que requiere una cantidad significativa de tiempo4. Recientemente, el control biológico ha tenido cierto éxito en la reducción de aflatoxina en gran escala campo aplicaciones5,6. Además de biocontrol, aplicación de vanguardia herramientas moleculares como 'Host inducida por el silenciamiento del gen"(HIGS) a través de RNAi y expresión transgénica de proteínas asociadas a resistencia ha tenido cierto éxito en la reducción del crecimiento de a. flavus y aflatoxina producción en estudios de laboratorio y de campo a pequeña escala. Estos enfoques están siendo optimizados actualmente además de identificar nuevos blancos potenciales del gene de a. flavus para la futura manipulación.

Además de genes que están directamente involucrados en la producción de micotoxinas como potenciales blancos de estrategias para el control transgénicos, amilasas fúngicas han demostrado jugar un papel crítico en mantener la producción exitosa de la patogenesia y micotoxinas durante las primeras etapas de la infección de la planta del anfitrión. Algunos ejemplos incluyen Pythium pleroticum (agente causal de la pudrición del rizoma de jengibre), Fusarium solani (agente causal de la marchitez de la coliflor), donde una correlación positiva entre la actividad y expresión de la patogenicidad y la α-amilasa se observaron 7,8. Inhibición de la actividad de la α-amilasa por golpe de gracia del gene o enfoques precipitación afecta negativamente el crecimiento fungicida, producción de toxina. Un mutante de octavos de final de la α-amilasa de a. flavus fue incapaz de producir aflatoxinas cuando se cultiva en almidón sustrato o degermed granos de maíz9. Del mismo modo, en Fusarium verticillioides una cepa de octavos de final de la α-amilasa no fumonisina B1 (micotoxinas) durante la infección de granos de maíz10. En un estudio más reciente, Gilbert et al., (2018) demostró que una basada en RNAi derribar de la expresión de α-amilasa de a. flavus a través de HIGS redujo significativamente el crecimiento y aflatoxina producción de a. flavus durante la infección del maíz núcleo11 .

Inhibidores específicos de la actividad de la α-amilasa también han producido resultados similares, obtenidos de la abajo-regulación de la expresión de α-amilasa. El primer informe sobre el papel de un inhibidor de la α-amilasa en resistencia fungicida vino desde el aislamiento y la caracterización de un inhibidor de la tripsina-α-amilasa de 14 kDa de líneas de maíz resistentes a . flavus12. Mayor proyección de varios centenares de especies de plantas por Fakhoury y Woloshuk conducido a la identificación de una proteína de tipo inhibidor de la α-amilasa 36 kDa (IABP) de las semillas de frijol Jacinto, Lablab purpureus L.13. La secuencia del péptido de lectinas de IABP se asemejó a perteneciente a la familia de lectinas – arcelin-α-amilasa inhibidor en común registrados haba14,15. IABP purificada no exhibe ninguna actividad inhibidora de tripsina mamífero y mayor caracterización in vitro demostrada una inhibición significativa del crecimiento de a. flavus y la germinación de conidios13. Los informes presentados aquí claramente muestra la α-amilasa puede servir como un destino en los enfoques de control para restringir patógenos o plagas que dependen de la movilización de la almidón (a través de la actividad de la α-amilasa) y adquisición de azúcares solubles como fuente de energía durante su interacción patógena con plantas hospederas.

Alpha-amilasa es conocida por ser crítico en a. flavus patogenicidad9,10,11y dada la importancia de la AILP como un potente anti-a. flavus agente (inhibición de la α-amilasa/antigrowth)13, hemos generado plantas de maíz transgénicas expresando Lablab AILP gene bajo el promotor CaMV 35S constitutivo. El objetivo era investigar si la expresión heteróloga de este inhibidor de la α-amilasa en maíz es eficaz contra a. flavus producción patogenia y aflatoxinas durante la infección del núcleo de maíz. Nuestros resultados demuestran que granos de maíz transgénicos expresando AILP significativamente reducción a. flavus crecimiento y aflatoxina la producción durante la infección del núcleo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. construcciones plásmidos y transformación de maíz

  1. PCR amplificación Lablab AILP insertar usando los cebadores 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'y 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Las condiciones PCR incluyen un paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s (paso 1), seguido de la desnaturalización a 98 ° C durante 10 s (paso 2), recocido a 55 ° C para 30 s (paso 3), elongación a 72 ° C por 20 s (paso 4), 31 ciclos del paso 2 al paso 4 , y una elongación final a 72 ° C por 5 min clon el producto PCR en un modificado pCAMBIA 1.300 vector con XbaI y PstI sitios de restricción. Secuencia el vector del destino final de la planta para confirmar la orientación y la secuencia del gen clonado de IABP en el vector.
  2. Como anteriormente descrito 16transformar la Agrobacterium cepa EHA101 con la construcción final del vector (figura 1).
  3. Uso transformado Agrobacterium que contiene el vector de destino final de la planta a transformar embriones inmaduros de maíz (Zea mays L. Hi-II) (realizados en la instalación de planta de transformación de la Iowa State University) 16.
  4. T0 plantas en el invernadero (26 – 29 ° C, fotoperíodo de 16/8 h con Na-lámparas de alta presión) y autofecundarse repetidamente para obtener T6 generación para lograr la calidad de homozigoto para el rasgo transgénico.

2. ensayo de germinación de esporas de

  1. Las muestras de hojas de la cosecha y almacenar a-80 ° C. Moler las muestras de hojas con un mortero y una maja con nitrógeno líquido. Pesar 0.5 g en tubos de microcentrífuga de 2 mL, Añadir 17 μl de inhibidor de la proteasa y coloque los tubos en hielo.
  2. Centrifugar los tubos durante 10 min a 16.000 x g. Transferencia de 225 μL de extracto de la planta a tubos de microcentrífuga de 0, 5 mL y coloque en hielo.
  3. En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una suspensión 5 mL de esporas de Aspergillus flavus 70-GFP en caldo de dextrosa de papa de 1% (p/v). Vórtice y ajustar la concentración de esporas a 10 esporas/mL,5 con un hemocitómetro.
    PRECAUCIÓN: A. flavus produce aflatoxinas, todo el trabajo con este hongo debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad biológica.
  4. Incubar en PDB a 28 ° C hasta que la cultura logra 50% inicio de la germinación de las esporas según lo indicado por abultamiento de las esporas.
  5. Vórtice y alícuota 25 μl solución, espora a la planta 225 μL del extracto. Incubar las muestras durante 20 horas a 28 ° C con agitación intermitente.
  6. Alícuota de 25 μl de solución de esporas en un portaobjetos de microscopio y mida la longitud del germen tubos esporas mediante el software de la cámara digital. Utilizar un mínimo de 20 mediciones replicadas de cada línea.
    Nota: En esta etapa, coloque todas las culturas a 4 ° C para detener el crecimiento de la colonia hasta que esté listo para contar.

3. núcleo investigación ensayo (KSA)

  1. Construir tapas de KSA pegando 4 snap caps (22 mm) en caja Petri 60 x 15 mm. Permitir el pegamento se seque durante 48 H antes de usar gorras. Cada tapa KSA constituye un representante (figura 2).
  2. En un estéril gabinete de seguridad biológica, rocíe una bandeja cuadrada bioensayo (24 cm x 24 cm) con 70% etanol: H2O (v/v) y deje secar al aire. Añadir papel de cromatografía estéril a la bandeja. Aerosol 9 casquillos KSA con etanol al 70%, deje que el aire seque y coloque en la bandeja del bioensayo.
  3. Para cada línea de maíz transgénico está probando, seleccione 20 núcleos indemnes y colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL. Añadir etanol al 70% y dejar reposar durante 4 minutos. Agitar suavemente los tubos durante la esterilización. Retirar los granos etanol y enjuague tres veces en estéril desionizada H2O.
  4. Preparar una suspensión de esporas de Aspergillus flavus 70-GFP17 de una cultura de 6 días de edad cultivadas en medio V8 (5% jugo V8 agar al 2%, pH 5.2).
    1. Añadir 20 mL estéril 0.02% Triton X-100/desionizada H2O (v/v) y desechos de las esporas con un asa estéril. Pipeta el inóculo y el lugar en un vaso de precipitados estéril 300 mL.
    2. Preparar una dilución de 5-fold con 0,02% Tritón X-100, luego realizar un conteo de esporas con un hemocitómetro. Diluir más si es necesario para obtener 100 mL con una concentración de 4 x 106 esporas/mL.
  5. Colocar los granos en un vaso de precipitados estéril 300 mL con una barra de agitación. Añadir el inóculo en el vaso.
    Atención: Agregar granos a inóculo se causa solución a splash. Coloque el vaso en un plato mezclar durante 3 minutos. Después de 3 minutos, vierta de inóculo en un vaso de precipitación vacío.
  6. Usando un fórceps, coloque los granos en el plato de prueba (1/tapadera). Añadir 30 mL agua a la parte inferior de cada bandeja de prueba e incubar a 31 ° C en la oscuridad durante 7 días.
  7. Preparar los granos para la fotografía.
    1. Dejar reposar 4 núcleos de cada línea para análisis microscópico y la fotografía.
      Nota: Los granos pueden almacenarse a 4 ° C durante no más de 5 días antes de completar la fotografía.
    2. Tomar fotografías de granos después de siete días de la inoculación con a. flavus (figura 3).
    3. Limpieza exterior de granos con un tejido blando y agua desionizada. Realizar secciones longitudinales de núcleos y fotografiar inmediatamente bajo el microscopio de fluorescencia.
  8. Preparación de núcleos para análisis.
    1. Limpieza exterior de núcleos restantes con un tejido blando y agua desionizada.
    2. Colocar 4 núcleos, constituyendo 1 rep, en un policarbonato de tapón de rosca 15 mL vial que contiene 2 bolas de acero inoxidable. Congelar inmediatamente los frascos en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C hasta el posterior procesamiento y análisis.
    3. Saque los frascos del congelador de-80 ° C y moler los granos en un homogeneizador a 1.500 rpm durante 3 minutos.
      Nota: Mantenga los núcleos congelados con nitrógeno líquido.

4. proyección PCR de granos de maíz transgénicos

  1. Utilice el kit de aislamiento de DNA para aislar ADN genómico (gDNA) de granos de maíz pulverizados infectados por a. flavus según las instrucciones del fabricante. Añadir brevemente, 280 μl de tampón de F 20 proteasa μl y 3 μl dithiothreitol (DTT) a 10-15 mg de granos de maíz pulverizados. Incubar y agitar en un Termomezcladores (56 ° C, 1.200 rpm, 30 min). Centrifugar a 10.000 x g durante 1 min y transferir el sobrenadante a la columna equilibrado. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos y centrifugar a 700 x g durante 1 min eluir gDNA.
  2. Tomar 0,8 μl de gDNA extraído para configurar un 20 μl PCR la reacción para cada muestra usando un kit PCR. Siga las condiciones de termociclaje rápido como se recomienda en el protocolo del fabricante. Las condiciones PCR incluyen un paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 5 min (paso 1) seguido de la desnaturalización a 98 ° C durante 5 s (paso 2), recocido a 55 ° C durante 5 s (paso 3), elongación a 72 ° C por 20 s (paso 4), 40 ciclos de paso 2 al paso 4 y a un paso de elongación final a 72 ° C durante 1 minuto (paso 5).
  3. Use primer forward 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' y primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' para confirmar la presencia de Lablab AILP gene en los granos de maíz transgénicos.

5. aislamiento RNA, síntesis de cDNA y RT-PCR semicuantitativa

  1. Tomar homogeneizada a. flavus infectados los granos de maíz previamente almacenados a-80 ° C para la extracción de RNA. Extracto de RNA utilizando un kit de aislamiento de RNA total según protocolo del fabricante pero con ligera modificación18. Después de agregar 50 mg de polvo del núcleo de maíz homogeneizada en el buffer de extracción, mezcla bien (sin Vortex) usando una punta de la pipeta de 1 mL y dejarla en hielo durante 5-6 minutos antes de proceder a realizar los siguientes pasos como se describe en el protocolo del fabricante.
  2. Preparar el cDNA usando un cDNA síntesis kit según protocolo 18 el fabricante.
  3. Utilizar 0,5 μl de cDNA sin diluir por reacción de polimerización en cadena para RT-PCR semicuantitativa como anteriormente descrito18. Usar primers de avance y retroceso qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' y qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectivamente para detectar genes de IABP Lablab y adelante y atrás iniciadores qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ y qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ respectivamente para la expresión del gen de estructural ribosomal maíz (costilla), GRMZM2G02483819 como un gen de mantenimiento de la casa.

6. cuantificación de GFP

  1. Preparar 50 mL de cada una de 0.2 M de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) y 0.2 M fosfato sódico dibásico (Na2HPO4·7H2O) desionizada H2O.
  2. Hacer 100 mL de tampón de fosfato de pH 7.0 Sorenson. Para pH 7.0, agregue 19,5 mL NaH2PO4 acción, 30,5 mL NaHPO4·7H2O existencia y 50 mL desionizada H2O.
  3. Pesar 25 mg de núcleo triturado (peso fresco, FW) y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,0 mL. Añadir 500 μl de tampón de fosfato al tubo de centrífuga y vortex durante 30 s.
  4. Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 16.000 x g. Sobrenadante en una placa bien negro 96 en Pipetee 100 μl. Leer las muestras con un fluorómetro (excitación 485 nm, emisión 528 nm).

7 análisis de aflatoxina total

  1. Extracción procesamiento y aflatoxina muestra
    1. Muestras de núcleo seco en un horno de aire forzado durante 2 días a 60 ° C. Pesar las muestras y colocar en un matraz de Erlenmeyer con un tapón de vidrio de 50 mL.
    2. En una campana de humos, añadir cloruro de metileno 25 mL en cada matraz.
      PRECAUCIÓN: Cloruro de metileno es muy volátil y se considera peligroso (irritante, cancerígeno). Guantes de látex ni de nitrilo son seguras para trabajar con cloruro de metileno. Utilice guantes de alcohol polivinílico resistentes solventes orgánicos mejorado.
    3. Agitar las muestras durante 30 minutos en un agitador de acción de la muñeca. Después de 30 min, verter lentamente el extracto a través de un círculo de papel de filtro estriado en un vaso de precipitado de 80 mL. Dejó la vasos seque durante la noche en una campana de humos.
    4. Al día siguiente, squirt cloruro de metileno (aproximadamente 5 mL) en el interior del borde de los vasos secos, Remolino alrededor y verter en frascos de vidrio de 2 dram. Dejar los frascos abrirán para que se seque durante la noche en una campana de humos.
  2. Análisis de aflatoxinas
    1. Añadir 4,0 mL 80% metanol: desionizada H2O (v/v) viales.
    2. Uso un kit de extracción de aflatoxinas para purificar solución de metanol con la columna proporcionada. Analizar los niveles de aflatoxina total con un fluorómetro, según las instrucciones del fabricante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transformación de maíz y detección molecular de las plantas transgénicas

Embriones inmaduros de maíz líneas Hi-II fueron transformados usando la cepa EHA101 de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de destino final planta expresando el Lablab purpureus AILP gen bajo el control del CaMV 35S promotor. Cinco líneas de maíz transformadas independientemente fueron avanzadas para la generación de T6 para estudios posteriores. Las plantas de maíz transgénicas eran mucho más pequeñas y menos vigorosas pero no presentaron ninguna otras anormalidades en comparación con las plantas control negativo isogénicas. Amplificación por PCR del gen objetivo AILP demostró un amplicon de bp 548, observado solamente en las líneas de maíz transgénicas en comparación con las plantas testigo (Figura 4A). El gen de la AILP demostró la expresión en las líneas transgénicas mientras que ninguna expresión de IABP fue observada en las plantas control (Figura 4B).

Aspergillus flavus extractos del ensayo de esporas con la hoja de

Hoja cruda se extrae del maíz transgénico jóvenes plantas prepararon moliendo en líquido N y centrifugar a 16.000 x g. Esporas de germinación de etapa temprana fueron expuestas el extracto de hoja de 20 horas y se registró la longitud hifal espora media de 20 muestras. Longitud hifal de esporas expuestas a extractos de las hojas transgénicas mostraron una reducción de 58% – 80% en comparación con el control negativo (figura 5)

Aspergillus flavus crecimiento durante la infección del núcleo

Se realizó un ensayo de detección de núcleo (KSA) para examinar el crecimiento de a. flavus en los granos transgénicos y control. Expresión del gen de IABP en granos transgénicos había afectado negativamente el crecimiento de a. flavus . La cepa de a. flavus empleada en el estudio actual contiene un reportero GFP que permite la monitorización y cuantificación del crecimiento fúngico en tiempo real. Reducción significativa en la fluorescencia de GFP fue observada en núcleos de IABP transgénicos en comparación con el control negativo isogénicas (figura 6). IABP líneas 4 y 5 mostraron una reducción significativa en el crecimiento del hongo, 69% y 72%, respectivamente, seguido por las otras líneas donde se observó una reducción de 35% – 60% en comparación con los núcleos de control (Figura 7A).

Producción de aflatoxinas en los granos infectados

Expresión heteróloga del gen de IABP en maíz resultó en una reducción significativa del contenido de aflatoxinas en las líneas transgénicas vs control. Los datos de aflatoxina proporcionan aquí es el contenido de aflatoxinas totales en los granos infectados. Se observó una reducción de 62% a 88% en contenido de aflatoxinas en los granos de IABP en comparación con el control (figura 7B). Entre las 5 líneas de IABP, línea 4 mostró el más bajo contenido de aflatoxinas (486 ng/g DW), seguido de otras líneas que van entre 640-1.498 ng/g DW en los kernels vs control (3.986 ng/g DW).

Figure 1
Figura 1: Diseño vectorial para la expresión transgénica de Lablab AILP gene en maíz. 35S = virus del mosaico del coliflor o CaMV promotor constitutivo; RB = borde derecho; LB = borde izquierdo; nptII = gen de neomicina fosfotransferasa kanamicina resistencia; nos y 35s = terminadores de transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Núcleo investigación análisis. (A, B) Esterilizar los granos y vierta en un vaso de precipitados estéril en un gabinete de seguridad biológica. (C – E) Sembrar granos con suspensión de esporas de a. flavus . (F-H) Usando una pinza estéril, colocar granos en plato de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Luz micrografías de a. flavus crecimiento. (A) control negativo isogénicas. (B-F) Granos transgénicos expresando AILP (líneas 1-5) una semana después de la inoculación. Barra de escala = 1 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Investigación molecular de las plantas transgénicas. (A) PCR confirmación de las plantas de maíz transgénicas (carriles 1-5) que contengan Lablab AILP (548 bp diagnóstico fragmento de la DNA; C = control negativo isogénicas; NEB 2 registro ADN escalera utilizada como un marcador de ADN). (B) expresión de gene de Lablab IABP en líneas de maíz transgénicas (carriles 1-5) mediante RT-PCR. Carril C representa isogénicas control negativo. Gen de estructural ribosomal maíz (costilla), GRMZM2G02483819 fue utilizado como un gen de mantenimiento de la casa (escalera de DNA de 2-Log de NEB: marcadores de ADN). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Efecto de la hoja cruda de extractos de plantas transgénicas de maíz de la IABP en la germinación de esporas de a. flavus en comparación con un control negativo isogénicas (neg). Separación de media fue realizada por postest de Dunnett después de ANOVA. Niveles de reducción se indican por asteriscos (***P ≤ 0.0001). Barras de error indican el error estándar de medias para muestras de veinte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Fluorescencia de GFP que emana de la cepa de a. flavus 70-GFP en granos transgénicos expresando IABP después de una semana de prueba. Se utilizaron controles negativos isogénicas (A) para evaluar la infección micótica y se separó en granos transgénicos (B-F que representan líneas transgénicas 1-5). Se revisaron al menos cuatro núcleos para cada línea bajo el microscopio de fluorescencia. Barra de escala = 2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Un flavus crecimiento y aflatoxina producción. (A) infección de 70-GFP de a. flavus y el crecimiento de granos de maíz después de 7 días en un ensayo de detección de núcleo. Promedio de tres experimentos independientes con cuatro biológicos repeticiones cada vez. Cuantificación de GFP (en unidades relativas de fluorescencia, RFU) indica crecimiento fúngico en líneas de maíz transgénicos expresa AILP a un control negativo isogénicas. Separación de media fue realizada por postest de Dunnett después de ANOVA. Niveles de reducción se denota por asteriscos (*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001). Barras de error indican el error estándar de medios para cuatro repeticiones biológicos aleatorios. (B) producción de aflatoxina por 70-GFP de a. flavus en granos de maíz después de 7 días en un ensayo de detección de núcleo. Promedio de 12 réplicas biológicas y cada repetición contiene cuatro núcleos. Niveles de aflatoxina en granos transgénicos de IABP (líneas 1-5) en comparación con un control negativo isogénicas (neg). Separación de media fue realizada por postest de Dunnett después de ANOVA. Niveles de reducción se denota por asteriscos (**P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001). Barras de error indican el error estándar de medios para cuatro repeticiones biológicos aleatorios. Ver figuras adicionales para ver los datos en el panel B carente de sesgo debido a la inhibición de hongos. Cierre correlación entre GFP = RFU y aflatoxina también cuentan con valores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sup Figure 1
Suplementario Figura 1: Datos de la figura 7B dibujar para mostrar la producción de aflatoxina por 70-GFP de a. flavus en granos de maíz después de 7 días en un ensayo de detección de núcleo para eliminar el sesgo debido a la inhibición del crecimiento fúngico. Valores de aflatoxina se dividieron por la inhibición del crecimiento fúngico representada como GFP-RFU valores en la figura 7B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sup Figure 2
Suplementario Figura 2: cerrar la correlación entre valores de GFP-RFU (= crecimiento fúngico) y niveles de aflatoxina (r2 = 0.86) divulgado en la KSA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pérdidas de rendimiento en cultivos agrícolas debido a patógenos y plagas es un problema global de20. Actualmente, la aplicación de plaguicidas y fungicidas sintéticos es el medio predominante para controlar patógenos y plagas, pero toxicidad residual de estos productos bioquímicos en los alimentos y los piensos puede representar grave amenaza para la salud humana y animal21. Teniendo en cuenta la importancia económica del maíz como alimento y cultivo de alimento, reducción o eliminación de contaminación por aflatoxinas es de suma importancia2,3,22. Mejoramiento convencional a través de la introgresión de genes de resistencia en las variedades susceptibles es un proceso desperdiciador de tiempo y esa resistencia no es siempre estable, resistencia de aflatoxina es un rasgo poligénico y expresión de los genes participantes varían significativamente con los cambios en parámetros ambientales4. Están evaluando alternativas para aumentar y estabilizar la defensa de la planta del anfitrión contra a. flavus de manera ecológica.

En el estudio actual, hemos optado por evaluar la eficacia del gen AILP de Jacinto de granos de maíz contra el a. flavus. IABP es un competitivo inhibidor de α-amilasa y también posee propiedades antifúngicas, expresamos este gen bajo un fuerte constitutivo promotor CaMV 35S. El objetivo era incrementar la producción de esta proteína heteróloga en maíz independientemente de la etapa de desarrollo o tipo de tejido. Significativa expresión del gen de la α-amilasa en las líneas de maíz transgénicos (Figura 4AB) compatible con expresión estable de este gen en un sistema heterólogo. Esto afectó negativamente crecimiento fúngico como evidente de la reducción en la distribución espacial de la fluorescencia de GFP dentro de los granos infectados de la IABP y reducción de la fluorescencia de GFP total en los granos (figura 6 y Figura 7A).

El desarrollo del ensayo de Screening Kernel (KSA) utiliza un genéticamente cepa de reportero de a. flavus expresando un gen que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) de las medusas Aequorea victoria18, 23. para diseñar estrategias de control para cualquier patógeno, es necesario entender el modo de infección, propagación y colonización dentro de la planta huésped o tejido. La colonización y propagación de los saprofitos de aflatoxigenic, a. flavus no es bien comprendido porque regulación genética de la resistencia al patógeno, si existe, no se entiende bien. Uso de la cepa de expresión de GFP de a. flavus es posible rastrear en tiempo real el proceso de infección y colonización. La GFP de la tensión y el tipo salvaje no difirió significativamente en el patógeno agresividad y aflatoxina producción23. Sin embargo, el gen de la GFP en esta cepa particular se coloca bajo el control de la expresada constitutivamente gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (gpdA) gene promotor 24 que es más apto para el seguimiento de crecimiento fúngico. Sin embargo, mediante esta tinción en semillas y granos de maíz, hemos demostrado una estrecha relación entre la fluorescencia de GFP que emana del hongo al crecimiento de hongos y aflatoxinas niveles18,23.

Para establecer una estrecha correlación con la capacidad de producción de aflatoxina, gfp impulsado por promotores de genes de la aflatoxina como TMDA o ver-125,26 será más conveniente que el gpdA. La fluorescencia de GFP es lo suficientemente sensible para permitir la detección y medición en tiempo real incluso pequeños cambios en el crecimiento de hongos, tanto en vitro y en plantay evaluación de las actividades inhibidoras de péptidos y proteínas antifúngicas desconocidas como IABP y otros11,17,18,23. Además, los resultados de la KSA se correlaciona bien con el funcionamiento del campo de líneas de maíz resistentes o susceptibles con respecto a la evaluación de la contaminación de aflatoxina27.

La KSA es muy útil en nuestro laboratorio y pantalla clásico criado nuevas variedades4 líneas transgénicas11,18. Es fácil de configurar y realizar la KSA en cualquier laboratorio. Uno necesita utilizar granos limpiamos buenas condiciones para realizar este análisis por lo que podría evaluarse un claro entendimiento de la interacción planta-hongo huésped. Rutinariamente a la exploración de todos los kernels que utilizamos en nuestro laboratorio bajo un estereomicroscopio antes de realizar el ensayo. Cabe señalar que las condiciones que empleamos para la KSA incluyen alta humedad (95% RH) y temperatura constante (31 ° C). Con el inicio del proceso de germinación simulado bajo estas condiciones, el análisis proporciona las condiciones ideales para probar la integridad de la capa de semilla, la composición genética de los granos incluyendo antimicóticas genes/proteínas activadas durante la germinación, u hongos infección. Infección hongos, producción de aflatoxina siempre será mayor en KSA en comparación con su ocurrencia en el campo; sin embargo, una correlación estrecha ha sido establecido4,27.

Hemos demostrado en esta KSA que AILP reduce el crecimiento del hongo en granos de maíz. IABP posee propiedades antifúngicas de lectinas de planta y se ha demostrado que inhiben la α-amilasa, disminuyendo la degradación de almidón y limitar el crecimiento del hongo. En vitro los estudios demostraron que el IABP fue capaz de inhibir a. flavus crecimiento en el medio rico en azúcar papa dextrosa caldo (PDB) crecimiento artificial, indicando su actividad de inhibición de crecimiento antihongos era independiente de la inhibición de la amilasa actividad13. Otras lectinas de plantas aislaron de Urtica dioica (Ortiga común), Hevea brasiliensis (árbol del caucho) y los tubérculos de Solanum tuberosum (papa) también muestran similares propiedades antifúngicas e inhibición el crecimiento de Botrytis cinerea , Pyrenophora triticiy Fusarium oxysporum28,29,30,31. Inhibidores de la alfa amilasa no sólo son efectivos contra hongos y bacterias pero también fueron demostrados para ser eficaz contra las plagas de insectos32. Alfa amilasas se divulgan para ser crítico para el crecimiento normal y desarrollo de los insectos de alimentación de planta y varios inhibidores de la α-amilasa insectos han sido aislados de plantas como el trigo, frijol y maíz12,33, 34,35. Una reducción significativa de longitud hifal hongos de esporas expuestas a extractos de la hoja cruda (figura 5), reducción en el crecimiento del hongo en el maíz expresando AILP núcleos según lo demostrado por la reducción de la fluorescencia de GFP tanto cualitativo ( Figura 6) y cuantitativamente (Figura 7A) es posiblemente debido a una combinación de sus propiedades de inhibición y antihongos de la α-amilasa. Experimentos usando estas expresando AILP maíz plantas contra otros patógenos y plagas en el futuro será de gran interés para probar su eficacia contra diversos factores de estrés bióticos de semillas y tejidos vegetales. Las propiedades de inhibición antifúngica y crecimiento de lectinas se ha atribuido principalmente a su Cross-linking con quitina e inhibición de punta hifal extensión28. De hecho, la inhibición mediada por el AILP in vitro de α-amilasas de diversos orígenes de hongos y bacterias más demostró 65% inhibición de hongos patógenos como a. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriae, 41 % de inhibición en el patógeno bacteriano Bacillus subtilis13. Los resultados en la reducción del crecimiento de a. flavus aquí presentado están en consonancia con el papel de los inhibidores de la α-amilasa como antifúngicos. El actual estudio muestra la aplicación práctica de dicha información útil obtenida anteriormente en estudios in vitro.

Reducción del contenido de aflatoxinas (figura 7B) en el AILP-expresar líneas de maíz es posiblemente debido a la inhibición de la actividad de la α-amilasa de a. flavus , llevando a disminución descomposición del almidón almacenado y reducido la adquisición de azúcares como un fuente de energía de los granos de maíz durante la interacción patógena. Como la α-amilasa fungicida desempeña un papel importante en romper los almidones del núcleo, cualquier cambio en la actividad de la α-amilasa fungicida por IABP probablemente altera contenido de azúcares solubles durante la infección del núcleo. Contenido de azúcares solubles, especialmente sacarosa y glucosa, se ha correlacionado altamente con mayor producción de AFB1 y total aflatoxinas en maíz y otros cultivos susceptibles de a. flavus como maní36,37. Contenido de sacarosa en medios de crecimiento artificiales, se incrementa a. flavus aflatoxinas producción38. Otros azúcares solubles tales como glucosa y maltosa también positivamente contribuyen a la producción de aflatoxina tanto en medios artificiales y semillas sustratos38. Inhibición de la actividad de la α-amilasa y reducción en la producción de micotoxinas en otros hongos refuerza un papel importante de α-amilasas fúngicas en la producción de toxinas durante la infección del núcleo. Mutantes de la alfa-amilasa nocaut de F. verticillioides y a. flavus ha podido producir fumonisina B1 y aflatoxinas respectivamente después de la infección de granos de maíz9,10. Del mismo modo, abajo-regulación de a. flavus α-amilasa redujo significativamente hongos producción crecimiento y aflatoxina en maíz núcleo infección11. Una reducción de 62% - 88% de aflatoxina en las líneas transgénicas están de acuerdo con informes anteriores sobre la función de α-amilasa en la producción de aflatoxina. Debe tenerse en cuenta que el análisis de proyección de núcleo in vitro (KSA) es más estricto que normalmente encontrados en condiciones naturales. Condiciones durante el ensayo in vitro también son altamente propicias para la producción de aflatoxinas, por lo que el porcentaje de cambio en el contenido de aflatoxina en las líneas transgénicas podría ser más significativo en lugar de las cifras absolutas de contenido de aflatoxinas en los granos infectados. Los resultados aquí presentados son prometedores y futuros experimentos en condiciones de campo son importantes para examinar el potencial de estos AILP-expresar líneas de maíz para resistencia a aflatoxinas en un escenario natural.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen conflicto de interés.

Acknowledgments

Agradecemos a David Meints, Universidad de Arkansas para su asistencia en el desarrollo y análisis de maíz transgénico durante las primeras generaciones. Este trabajo recibió el apoyo financiero del proyecto de USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura. Política de igual oportunidad de empleo (EEO) de USDA-ARS exige igualdad de oportunidades para todas las personas y prohibe la discriminación en todos los aspectos de las políticas de personal, prácticas y operaciones de la Agencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Ciencias ambientales edición 144 inhibidor de la α-amilasa aflatoxina Aspergillus flavus maíz núcleo de detección de maíz transgénico del ensayo Lablab purpureus,
Inhibición del crecimiento de <em>Aspergillus flavus</em> y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de <em>Lablab purpureus</em> L.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter