Summary
이 프로토콜 포함 힘 제어와 것 밸브 전단의 characterizations 변위 제어, 스트레스 이완 biaxial 기계 테스트 절차. 이 프로토콜 인수 결과 유한 요소 시뮬레이션 프레임 워크에서 작동 밸브의 기계적 동작을 시뮬레이션 하기 위해 구성 모델 개발에 대 한 사용할 수 있습니다.
Abstract
광범위 한 biaxial 기계 테스트 것 심장 밸브 전단의 수학적 표현의 그 구조체의 기계적 기능을 제공 하는 구성 모델에서 사용 되는 최적의 매개 변수를 파생을 활용할 수 있습니다. 이 제시 biaxial 기계 테스트 프로토콜 (i) 조직 수집, (ii) 조직 표본, (iii) biaxial 기계 테스트 및 수집 된 데이터의 후 처리 (iv)의 준비를 포함 한다. 첫째, 조직 수집 밸브 전단지를 검색 하는 로컬 음식과 나중 해 부에 대 한 도살 장 약국 승인에서 돼지 또는 양 마음을 얻는 필요 합니다. 둘째, 조직 준비 테스트에 대 한 명확한 영역 추출 전단지 조직에 조직 표본 커터를 사용 하 여 필요 합니다. 셋째, biaxial 기계 전단지 샘플의 테스트 해야 힘 제어의 구성, 상업 biaxial 기계 테스터를 사용 하 여 변위 제어, 전단지 조직 특성 프로토콜 스트레스 이완 테스트 및 기계적 속성입니다. 마지막으로, 후 처리는 데이터 이미지 상관 관계 기술 및 힘 및 변위 리딩 외부 로드에 대 한 응답에서 조직의 기계적 동작을 요약을 사용을 해야 합니다. 일반적으로, biaxial 테스트 결과 전단지 조직 비선형, 이방성 기계적 응답을 얻을 보여줍니다. 이후 메서드를 여기 수 있습니다 더 포괄적인 밸브 전단 조직 특성에 대 한 별도 테스트 프로토콜에 반대 한 통합된 테스트 계획에 제시 biaxial 테스트 절차는 다른 방법에 유리 다른 조직의 표본 제안 된 시험 방법의 한계는에 전단 응력은 잠재적으로 조직 샘플에 존재. 그러나, 어떤 잠재적인 전단 무시할 수 추정 됩니다.
Introduction
적절 한 심장 기능 심장 밸브 전단의 적절 한 기계적 동작에 의존합니다. 심장 밸브 전단 기계 손상 된 경우에 심장 밸브 질병 발생는 다른 심장 관련 문제가 발생할 수 있습니다. 계산 모델 및 치료 개발에 사용 하기 위해 전단지 적절 한 기계적 동작의 철저 한 이해를 필요로 하는 심장 밸브 질병을 이해 하 고 정확 하 게 건강 한 검색을 테스트 계획을 개발 해야 합니다 같은, 전단지의 기계적 속성입니다. 이전 문학에서이 기계적 특성 biaxial 기계 테스트 절차를 사용 하 여 실시 되었습니다.
다른 테스트 프레임 워크를 활용 하는 다른 특성1,2,3,4,를 검색 하는 문학을 통해 다 부드러운 조직에 대 한 biaxial 기계 테스트 절차 5,6,7,,89,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. 테스트 방법 심장 밸브 전단의 기계적 특성의 조사에 대 한 확장 되었습니다. 일반적으로, 2 개의 주 방향에서 동시 세력 심장 밸브 조직 로드 포함 기계 테스트 하지만 다릅니다이 테스트 수행 방법을 biaxial 관찰 biomechanical 속성에 따라. 이러한 프로토콜을 테스트의 일부는 (i) 변형 율, 크 리프 (ii), (iii) 스트레스-휴식, 그리고 테스트 (4) 힘 제어 포함 됩니다.
첫째, 변형 속도 테스트 조직 전단지18,20의 시간에 따라 행동을 결정 하 이용 되어 있다. 이 테스트 프로토콜에서 전단지 다른 반 주기 시간에 최대 막 긴장에 로드 됩니다 (즉, 1, 0.5, 0.1, 0.05 s) 로딩 시간 사이 피크 스트레치 또는 히스테리시스에 상당한 차이 확인 하기 위해. 그러나, 이러한 테스트에서 다양 한 변형 률 관찰된 스트레칭 무시할 수 차이 설명 했다. 둘째, 크 리프 시험에 조직은 로드 피크 막 긴장 하 고 피크 막 긴장에서 개최. 이 테스트는 어떻게 조직의 변위 피크 막 긴장을 유지 하기 위해 섬뜩한의 데모 수 있습니다. 그러나, 그것은 보였다 크 리프 순수 기능에서 심장 밸브 전단에 대 한 중요 하지 않습니다3,20. 셋째, 스트레스 이완 테스트, 조직 피크 막 긴장을 로드 하 고 관련 된 변위는 일정 하 게 유지 시간3,,2122의 오랜된 기간에 대 한 키를 누릅니다. 시험의이 유형은 조직 스트레스에 피크 막 긴장에서 주목할 만한 감소 합니다. 마지막으로, 테스트 힘 제어, 조직 각 방향17,23에 피크 막 긴장의 다양 한 비율에서 로드으로 순환 됩니다. 이러한 테스트 공개 재료의 이방성 및 비선형 응력 응답, 그리고 다양 한 비율에 따라 조직, 로드 하 여 잠재적인 생리 변형 수 있습니다 더 나은 이해. 이러한 최근 조사 했다 그것은 명백한 그 스트레스 이완 그리고 힘 제어 프로토콜 증명 심장 밸브 전단의 기계적 특성 분석을 수행 하기 위해 가장 도움이. 심장 밸브 biomechanical 특성화,이 진보에도 불구 하 고 테스트 수행 되지 않은 아래 하나의 통합 계획, 테스트 하 고 방향 사이의 커플링을 조사 하기 위해 한정 된 방법이 있다.
이 방법의 목적은 통합된 biaxial 기계 테스트 계획에 의해 심장 밸브 전단의 전체 소재 특성화를 촉진 하기 위하여. 통합된 테스트 계획 한 하나의 세션에서 모든 테스트 프로토콜에서 각 전단지는 테스트 하는 곳으로 간주 됩니다. 이것은 유리, 조직으로 속성은 본질적으로, 전단지 사이 가변 그래서 각 전단지에 대 한 전체 특성화 증명 수행 각 프로토콜 독립적으로 다양 한 전단지에 보다 설명자 더 정확. 세 가지 주요 구성 요소, 즉 (i)는 힘 제어 biaxial 테스트 프로토콜, (ii) 변위 제어 biaxial 테스트 프로토콜, 및 (iii) biaxial 스트레스 이완 테스트 프로토콜 테스트 체계에 의하여 이루어져 있다. 모든 테스트 계획 4.42 N/min, 로딩 속도 이용 하 고 응력을 보장 하기 위해 10 로드-언로드 주기 10 사이클 (이전 작품에서 발견)로23에 의해 replicability 곡선. 모든 프로토콜 또한 두께 효과적인 표본 길이의 10% 미만 있어야 막 긴장 가정에 따라 구성 됩니다.
10 로드 및 언로드 주기 100 N/m와 75 N/m의 피크 막 긴장으로 승 모 판 (MV)와 tricuspid 벨 브 (TV), 각각15,17이 제시 방법에 사용 되는 힘 제어 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. 5 로드 비율 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1, 및 1:0. 5이 힘 제어 테스트 프로토콜, 즉 1:1에 간주 됩니다. 이 5 개의 로딩 비율 vivo에서 전단의 모든 잠재적인 생리 개 악을 그리고 긴장 특 파 원에 유용 합니다.
이 방법에 제시 하는 변위 제어 프로토콜 두 가지 변형 시나리오의 구성, 즉 (i) 제한 매치 스트레칭 및 (ii) 순수 전단. 제한 된 매치 스트레칭에서 다른 방향으로 고정 시키는 동안 피크 막 긴장 조직의 한 방향을 전치 했다. 순수한 전단 설치에서 조직은 한 방향으로 뻗어 이며 조직의 영역 변형에서 일정 하 게 유지 그래서 신중 하 게 다른 방향에서 단축. 이러한 변위 제어 테스트 절차의 각 각 두 조직 방향 (원주 및 반경 방향)에 대해 수행 됩니다.
제시 방법에 사용 되는 스트레스 이완 프로토콜 로드 양방향에서 피크 막 긴장을 조직 및 조직의 스트레스 이완 동작 모니터링을 15 분에 대 한 특 파 원 치환 조직 유지 함으로써 이루어집니다. 자세한 실험 절차는 다음 설명 합니다.
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Protocol
설명 하는 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 오클라호마 대학에 의해 승인 되었다. 모든 동물의 조직 농업 농 무부 승인 도살 장 (국가 집 고기 주식에 드 몬 드, 확인)의 미국 부에서 인수 했다.
1. 조직 수집 및 청소
- 동물 학살 동물 마음 같은 날 검색 하 고 조직의 신선도 보장 하기 위해 얼음 가슴에 마음을 저장 합니다. 실험실 공간을 마음을 전송 합니다.
- 연구실에 도착에, 인산 염 버퍼 (PBS) 염 씻어 어떤 과잉 혈액을 양동이에 심장 잠수함. 집게는 플레이스매트, 외과 블레이드, PBS 솔루션, 표 백제, 그리고 비닐 봉투의 양동이 검색 합니다. 혈액 관련 혼란의 쉽게 정리에 대 한 허용 해 부 카운터에 누워 여는 플레이스매트를 준비 합니다. 마음은 충분히 씻어 서 되었습니다, 후 플레이스매트 (그림 1a)에 마음을 놓습니다.
- 집게를 사용 하 여 심장의 양쪽에는 심 방 하 고는 심 실 사이의 파팅 라인을 찾습니다. 면도날을 사용 하 여 신중 하 게이 파팅 라인을 따라 절 개 하 고 심장 밸브와 심 (그림 1b). 심장의 전체 외부 둘레를 따라 절 개 하는 심 방 및 심 우수한 모든 심장 자료 제거 될 수 있습니다 확인 하십시오.
- 겸 자, 함께 어떤 관찰 된 혈 병 심 (그림 1c)에 밖으로 조심 스럽게 빼냅니다. 시도 하는 경우 혈액 응고 하지만 그것을 제거 하 않습니다 하지 이동, 보장 chordae tendineae 또는 전단지 잡고 하지 있다. 폐기물 처리에 대 한 생물 학적 가방에 혈전을 배치 합니다.
- 심에서 모든 혈전 제거 되었을 때, 마지막 시간 PBS 솔루션 양동이에 마음을 씻어. 비닐 봉지에서 깨끗 한 마음을 놓고 냉동 실에 보관 합니다.
- 10% 블리치, 90%의 솔루션을 사용 하 여 물, 혼합 성공적인 표 백제 처리 표 백제 솔루션와 약 10 분에 대 한 지속적으로 저 어 혈액 찾아 빨간색에서 노란색으로 전환 하는 솔루션으로 표시. 배수를 통해 표 백제 처리 혈액의 폐기.
주의: 표 백제는 독성 물질 그리고 유해한 경우 섭취 하실 수 있습니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
2. 심장의 해 부 및 해부학의 검사
- 이전 정화 마음을 검색 하 고 따뜻한 물 욕조에 녹여 수 있습니다. 해 부에 대 한 필요한 자료 등 집게, 외과 블레이드, placemats, PBS, 작은 스토리지 컨테이너입니다. 마음은 완전히 해 동, 모든 나머지 혈액을 흡수 하는 플레이스매트에 넣어.
- 최적의 밸브 구조를 관찰 하는 탑-다운 (우수한) 보기에 대 한 마음 잡으십시오. 심장의 왼쪽에 MV부터, 집게를 신중 하 게 조작 하는 전단지 고 commissure, 또는 전단지 사이 파팅 라인 식별 사용 하 여.
- commissure 따라 절 개를 만들고는 전단지를 손상 하지 않도록 만드는 심 실 벽을 통해 조심 스럽게 잘라. 그것은이 프로세스를 완벽 하 게는 심 실 동안 현 첨부 파일을 필요할 수 있습니다. 완전 절 개 후 심 실 (그림 2a)을 엽니다.
- MV 앞쪽 및 후부 전단지를 식별 하 고 외과 블레이드 젖꼭지 근육에 현 첨부 파일 서버를 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 긴장 된 전단지 스트레칭 하 고 환대에서는 전단지를 분리 하는 상처. 삭제 전단지 PBS 솔루션으로 가득 레이블이 표시 된 용기에 놓고 약 4 ° c.에 냉장고에 보관
- 내려 보기에 대 한 마음을 잡고 하 고 심장의 오른쪽에 TV를 식별 합니다. commissures 찾아서는 commissures 및 심 실 벽 (그림 2b) 중 하나를 통해 절 개 합니다.
- TV septal, 후부, 그리고 앞쪽 전단지를 식별 하 고 전단지 추출 단계 2.4에서 수행. 모든 취득된 전단지 PBS 솔루션으로 가득 레이블이 지정 된 컨테이너에 배치 하 고 약 4 ° c.에 냉장고에서 컨테이너를 저장
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 그러나, 조직 biomechanical 테스트 및 후속 조직학 분석 심장 해 부의 2 일 이내에 발생 한다.
3. 조직 해 부
- 냉장고, 지정된 된 단면 크기, 수술 펜, 집게, 면도날, 및 커팅 매트에 대 한 조직 커터에서 전단지를 검색 합니다.
- 집게를 사용 하 여 PBS 솔루션에서 표본을 제거 하 고 방사형 (R) Y-방향, 정렬 방향과 원주 방향 (C) X-방향 (그림 3a)에 정렬 된 커팅 매트에 누워. 테스트 섹션으로 전단지의 중앙 영역 을 식별 합니다.
- 원하는 조직 테스트는 경계 내에 면도날의 조직 커터를 맞춥니다. 가로로 잘라 만들기 그리고 다른 형성 (그림 3b) 원하는 크기의 사각형 영역을 수직으로. 수술 펜을 사용 하 여 레이블을 조직의 반지름 방향 (그림 3b).
- 면도날을 사용 하는 집게와 전단지에서 chordae 스트레칭 하 고 전단지에 손상을 유발 하지 않고 주의 컷 하 여 현 첨부 파일 트림.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 프로토콜 일시 중지 PBS 솔루션으로 가득 레이블이 지정 된 컨테이너에서 sectioned 조직을 저장 하 고 컨테이너에에서 저장할 약 4 ° C에서 냉장고 (2.6 단계에서 설명). 그러나, 조직 테스트 해 부의 2 일 안에 발생 한다.
4. 두께 측정 및 biaxial 시험기 설치
- Sectioned 조직 표본, 디지털 캘리퍼스, 및 작은 금속 주걱을 검색 합니다. 디지털 캘리퍼스를 사용 하 여 측정 하 고 금속 주걱의 두께 기록 합니다.
- 집게를 사용 하 여 금속 주걱에 조직 견본을 하다. 디지털 캘리퍼스를 사용 하 여, 3 개의 다른 전단지 위치에서 주걱 조직 쌍 (그림 3c)의 두께 측정 합니다. 주걱의 두께 각 측정에서 빼기 하 고 평균 두께 기록 합니다.
- 조직의 생리 적 조건에 해당 하는 37 ° C에서 PBS 목욕을 준비 합니다.
5. 조직 설치 및 표준 마커 배치
- 집게, 조직 표본, 장착 하드웨어, 뾰족한 도구, (와 함께 300-500 µ m의 직경), 유리 구슬 및 슈퍼 접착제를 검색 합니다.
- 조직 (그림 3de) biaxial 테스트 시스템에 탑재 합니다. 장착 하는 동안 조직의 원주 및 반경 방향으로 컴퓨터의 X-및 Y-방향으로 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다.
- 표준 마커 배치에 대 한 하나의 작은 오픈 컨테이너와 또 다른 컨테이너에 슈퍼 접착제의 작은 수영장으로 유리 구슬 놓습니다. 뾰족한 도구를 사용 하 여 슈퍼 접착제의 작은 금액으로 팁 코트 고 도구 팁을 개별 구슬 스틱.
- 신중 하 게 조직의 테스트 지역 (그림 3 층)의 중간 제 3의 한 모퉁이에 비드를 전송 하는 도구를 사용 합니다. (그림 3 g)을 형성 하는 4 개의 구슬의 사각형 배열 될 때까지이 단계를 반복 합니다.
참고: 초과 접착제 피해와 최신 디지털 이미지 상호 관계 (DIC) 기법 쓸모 없는 추적 결과 생산할 예정 이다로 표준 마커 함께 스틱을 하지 않는 결정적 이다. 사각형 배열 해야 합니다 내 조직의의 중간 제 3 테스트 지역 중요 하다.
6. 늘어진 단계 및 기간 타이밍
- 적절 한 막 긴장을 계산 하려면 조직의 효과적인 테스트 가장자리 길이 하 고 다음과 같은 방정식을 사용 하 여.
(1)
참고: 여기, T 는 힘/길이, f 의 단위에서 막 긴장 힘, 그리고 L 은 시료의 효과적인 테스트 길이입니다. - 조직 관련 4.42 N/min, 최대 힘 (그림 4)의 2.5%의 미리 로드를 포함 하 여 로드 속도에서 피크 막 긴장 된 힘에서 10 로드/언로드 사이클을 받게 될 것 이다 있도록 preconditioning 프로토콜을 만듭니다.
- 미래의 계산에 필요 하기 때문에 preconditioning 데이터를 임시로 저장 하는 새로운 임의의 테스트 디렉터리를 만듭니다. 후속 테스트 4.42 N/min의 로딩 속도 설정 합니다.
- 매개 변수를 테스트의 새로운 세트 만들고 Preconditioning0 (그림 4a)는 프로토콜의 이름을 설정 합니다. X 축과 y 축의 제어 모드 를 강제 하 고 제어 기능 단계수를 설정 합니다. 힘과 관련 된 대상 피크 막 긴장 (cf. 단계 6.1) 로드 크기 설정 (그림 4b). 첫 번째 반복만 (그림 4c)에 대 한 최대 힘의 2.5%로 미리 크기 를 설정 합니다. 기간을 스트레칭 과 복구 기간 모두 25 미 세트는 반복의 숫자 10 (그림 4e)으로 설정 합니다.
- Preconditioning 단계 끝나면 적어 조직의 변형에 X-및 Y-방향. 표본 기록된 크기에서 시작 하는 최대 힘 이동 하려면 프로토콜을 준비 합니다.
- 타이밍 목적을 위한 스톱 워치를 검색 합니다. 최대 힘 프로토콜을 로드를 시작 하 고 기계 작동 (그림 5a) 시작 될 때 동시에 초시계를 시작. 작동 중지 때 스톱 워치를 중지 합니다. 중지는 청각 신호를 통해 분명 있을 것입니다.
- 포스트 preconditioning 피크 조직 변형 조직의 최적의 스트레칭 시간 (그림 5b)을 나타내는 초시계에서 시간을 함께 기록 합니다.
(1)7. biaxial 기계 테스트
- 4.42 N/min의 로딩 속도로 힘 제어 프로토콜을 준비 합니다.
- 새 테스트 디렉터리를 열고 테스트 이름을. 이후 스트레스와 긴장 계산에 사용 하기 위해 알려진된 위치에 저장 하도록 데이터를 설정 합니다. 다시 원래 장착 구성 표본을 이동 합니다.
- FirstImage라는 프로토콜 집합을 만듭니다. 하 고 단계로 제어 기능 을 x 축 과 y 축 제어 모드 를 설정 합니다. 0미네소타 로드 크기 를 설정 합니다. 1 초에 기간 스트레칭 및 복구 기간 각을 설정 합니다. 1 반복의 수 를 설정 합니다. 데이터 출력 주파수 및 이미지 출력 주파수 각 1 Hz로 설정 합니다.
- PreconditioningA라는 새로운 테스트 집합을 생성 합니다. 조직 10 번 반복 순환 로드/언로드 단계 6.2에서에서 준비한 대로 정확 하 게 원하는 막 긴장에 대 한 대상으로 힘을 받게 될 것 이다 그런 테스트 매개 변수를 설정 합니다. 지금 유의 스트레칭 시간 및 복구 시간 단계 6.3.2에서에서 기록 하는 시간 이어야 한다. 이미지가 설정, 테스트 A 에 캡처됩니다 있지만 데이터 15 Hz에서 캡처.
- 다른 테스트, 명명 된 PreconditioningB을 생성 합니다. 모든 테스트 매개 변수가 같아야 그 이전 단계에서 언급 한 대로, 예외와 함께 그 이미지 출력 주파수 15 Hz, 설정 되 고 없음 미리 적용 됩니다.
- 4.42 N/min의 로딩 속도로 다음 원주 방사형 로딩 비율에 피크 막 긴장 하는 조직 로드 되도록 만들 테스트 프로토콜을 preconditioning 프로토콜 후: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1, 및 1:0.5 (그림 6 ). 후속 데이터 처리 및 분석 섹션 10에서에서 설명에 대 한 각 로드 비율의 마지막 두 주기에서 데이터를 검색 합니다. 설립 프로토콜의 자세한 설명은 표 1 을 참조 하십시오.
- 4.42 N/min의 로딩 속도에서 변위 제어 테스트 프로토콜을 다음과 같이 준비 합니다. (i) X 방향 및 Y 방향 변위 피크 원주 및 반경 뻗어 각각 연관 (그림 7a)에 Biaxial 스트레칭 . X 방향을 따라 순수 전단 (ii)-피크 원주 스트레치와 관련 된 X-방향으로 스트레칭과 변형 (그림 7b)에서 일정 한 점선된 영역을 유지 하면서 Y 방향에서 단축. (iii) X-방향 (그림 7c)에 따라 제한 된 매치 스트레칭 . (4) Y-방향 (그림 7 d)에 따라 순수 전단 . (v) Y-방향 (그림 7e)에 따라 제한 된 매치 스트레칭 .
- 각이 단계 사이 나머지 원래 장착된 구성에서 조직을 보유 하 고 1 분의 "주기" 생성 합니다. 데이터 처리 및 분석 (9 단원)에 대 한 각 로드 비율의 마지막 두 주기에서 데이터를 검색 합니다. 설립 프로토콜의 자세한 내용은 표 2 를 참조 하십시오.
- 각 방향, 로드 4.42 N/min, 치환 및 피크 막 긴장 (단계 7.2)와 관련 된 그 변위 (그림 8 및 15 분에서 개최 하는 조직 로드 스트레스 이완 프로토콜 준비 그림 9). 15 분 후 원래 장착 구성으로 조직을 복구 하는 프로토콜을 설정 해야 합니다.
참고: 경우 조직 끊어지고, biaxial 테스트 시스템에 잠재적인 피해를 방지 하기 위해 즉시 테스트를 중단 합니다.
8. 조직 고정 조직학 분석을 위한
- 조직 biaxial 테스트 시스템에서 분리 합니다. 조직 컨테이너 10% 포 르 말린으로 가득로 놓고 약 4 ° c.에 냉장된 환경에서 컨테이너를 놓습니다 직물의 두께 따라 24-48 h에 대 한 조직 수정.
주의: 말린 알려진된 발암 물질 이며, 호흡, 초과 폐 고정 될 발생할 수 있습니다. 포 르 말린 모든 작업 적절 한 환기와 연기 후드에서 수행 되어야 합니다. - 조직이 24-48 h에 대 한 포 르 말린에 고정 후 조직 나중 조직학에 대 한 80% 에탄올 솔루션에 전송. 조직의는 솔루션 4 ° c.에 냉장된 환경에서에서 저장 되어야 한다
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 일단 조직 고정 된 표본 언제 든 지 분석할 수 있습니다. 프로토콜을 일시 중지 하는 경우 조직의 80% 에탄올으로 가득 레이블이 지정 된 컨테이너에 저장 고 컨테이너에에서 저장할 약 4 ° C에서 냉장고 (8.2 단계에서 설명). - 공급 업체의 지침에 따라 상업 조직학 분석을 위한 조직 준비. 콜라겐, 엘라 스 틴, 있다, 등, 특정 전단지 구성, 연구의 관심은, 적절 한 조직학 얼룩 고용 확인 합니다.
참고: 조직학 슬라이드 수 있습니다 구상 될 원하는 성분 (그림 10)을 관찰 하는 현미경을 사용 하 여. - ImageJ 프로그램을 처리 하는 이미지를 사용 하 여 조직에 얼룩진된 각 성분의 비율을 결정 하기 위해 색상 deconvolution 방법을 수행 합니다. 에 대 한 자세한 내용은이 절차, Ruifrok 및 존스턴24를 참조 하십시오.
9. biaxial 테스트 데이터 후 처리 절차
- 시간에 따라 마커 위치를 확인 하려면 biaxial 기계 (그림 11)를 테스트 하는 동안 촬영 한 이미지에서 4 개의 표준 마커에 DIC 기반 추적을 수행 합니다.
(2)- 장착 구성에 대해 분석을 수행 하기 위해 필요한 경우 X나 biaxial 테스트의 시작 부분에서 undeformed 상태에 마커 위치 될 하자. 포스트 preconditioning 변형에 대해 분석을 수행 하기 위해 필요한 경우 X나 preconditioning 프로토콜의 끝 마커 위치 될 하자.
참고: 다음 단계 선택 참조 구성에 동일한 방식으로 실시 됩니다.
참고: 여기, X나 x나 있으며 undeformed 및 변형 위치 마커, 각각, 그리고 d나 각 표식의 변위 벡터 이다.
- 장착 구성에 대해 분석을 수행 하기 위해 필요한 경우 X나 biaxial 테스트의 시작 부분에서 undeformed 상태에 마커 위치 될 하자. 포스트 preconditioning 변형에 대해 분석을 수행 하기 위해 필요한 경우 X나 preconditioning 프로토콜의 끝 마커 위치 될 하자.
- 4 개 노드 이중 선형 유한 요소2,,2325를 사용 하 여 표준 마커의 변형 그라데이션 (F)을 계산 합니다.
(3)
참고: 여기, B사이 ByI는 유한 요소 모양 함수 파생 상품에는 X-및 Y-방향 노드에 대 한 나, 각각, 및 uI(t)와 v나( t)는 시간에 따른 X-및 Y-변위, 각각 이전 단계 9.1에서에서 결정 됩니다. 참고 X 및 Y 좌표는 조직의 원주 및 반경 방향으로 정렬 됩니다. - 코시-그린 변형 텐서 (C)과 녹색 변형 텐서 (E)를 계산 합니다.
(4)
참고: 여기에, 나 는 2 차 신원 텐서입니다. 원주 및 반경 C의 원리 값의 제곱근을 취해서 뻗어 결정 합니다. - 첫 번째 피올라-키 르 히 호프 (1-PK) 스트레스 텐서 (P)을 결정 합니다.
(5)
참고: 여기, t 는 시료의 두께, 그리고 TC TR 은 각각 원주 및 반경 방향에 적용 된 막 긴장. - 또한, 다른 스트레스 tensors 코시 스트레스 텐서 (σ)와 두 번째 피올라 Kirchoff (2-PK) 스트레스 텐서 (S) 등을 계산 합니다.
(6)
참고: 여기, J 변형 그라데이션 텐서 FJacobian입니다.
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Representative Results
힘 제어 biaxial 기계 테스트에서 스트레스 스트레치 데이터 일부 닮 았는 지 수 곡선 (그림 12) 비선형 곡선을 보여준다. 각 주 방향에서 응답에 관한 소재 동작은 transversely 등방성, 방사형 스트레치 보다 완곡 한 변형입니다. 경우에 따라 반지름 방향 보다 더 준수 전시 원주 방향으로 이방성의 방향 플립 수 있습니다. 이 뒤집힌된 응답은 TV에서 더 자주 보다 MV에서 관찰 된다.
변위 제어 테스트, 스트레스-스트레치 데이터 긴장 (순수 전단, 제한 된 단축 긴장 [그림 13])를 받고 주 방향에 대 한 비선형 응답을 다음과 같습니다. 조직의 다른 주 방향에서 단축, "부정적인 (압축) 스트레스" 관찰 됩니다. 제한 된 단축 긴장 프로토콜에서 거기 또한에 제한 된 방향으로, 다른 주 방향에서 적용 된 스트레칭의 결합을 보여주는 증가 스트레스 스트레치 응답을 전시 한다.
스트레스 이완 테스트에서 정규화 막 긴장 시간 데이터 다음과 비선형 부패 곡선 (그림 14a, b). 뮤직 비디오와 TV 전단지 조직 전시 원주 방향에서에 비해 레이디얼 방향에 큰 스트레스 감소.
승 모 판 앞쪽 전단지 (MVAL)와 tricuspid 벨 브 앞쪽 전단지 (TVAL) 조직 사용 Masson의 대표적인 조직학 결과 trichrome 그림 10에 표시 됩니다. Masson의 trichrome 얼룩 보여줍니다 것 심장 밸브, 콜라겐 섬유 (파란색) 등에서 발견 하는 일반적인 성분 및 판 막 병 중간 셀 (빨간색 세포질과 검은 핵). 다른 얼룩 엘라 스 틴 (Verhoeff 반 Gieson 얼룩), 있다 (Alcian 블루 얼룩) 등 성분 시각화를 사용할 수 있습니다.
그림 1: 로컬 도살에서 돼지 마음의 실험적인 사진 검색. (한) A의 전체 심 혼은 혈액 PBS 솔루션의 씻어 서. (b) A 컷 mitral 및 tricuspid 밸브를 공개 하는 심 방 및 뇌 실 사이 이루어집니다. (c) 혈전 저장 전에 마음에서 다음 제거 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 실험적인 사진 공개 것 5 열린된 돼지 심장의 심장 밸브 전단지 및 밸브 기구의 다른 구성 요소. 보여 주는 앞쪽 전단지 (MVAL) 및 후부 전단지 (MVPL), 그리고 (b) 비슷한 해 부와 tricuspid 벨 브의 오른쪽에 (는) 둘 사이의 commissure 따라 왼쪽된 심장의 해 부와 승 모 판 전단 심장, 앞쪽 전단지 (TVAL), 후부 전단지 (TVPL), 그리고 septal 전단지 (TVSL)를 공개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: biaxial 기계적 테스트를 위해 준비 되 고 삭제 전단지의 실험적인 사진. 심장 밸브 전단 테스트 필요 합니다 (한) 수 (b)는 10 x 10 mm으로 sectioned 테스트 지역 (반지름 방향 외과 펜 마커 의해) 대량 전단지. (c) 전단지 두께 측정 됩니다. 표본은 피어 싱 금속 tines와 조직 (d)는 biaxial 테스트 시스템 (e)에 의해 거치 된다. 장착 후 (f) 표준 마커 (g) 37 ° c.에 PBS 솔루션에 잠수 하기 전에 조직의 표면에 붙어있다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 예제 프로토콜 매개 변수는 7.5 x 7.5 mm 영역 테스트의 승 모 판 앞쪽 전단지의 preconditioning 테스트. Preconditioning 프로토콜 테스트 제어 모드와 x 축, (c)는 미리 조건, x 축에서 동일한 매개 변수 (d)는 y 축에 힘 (는) 프로토콜 이름, (b)를 설정 하 여 만들어집니다 및 (e. ) 주기 매개 변수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 승 모 판 앞쪽 전단지는 7.5 m m x 7.5 m m의 테스트 영역에 대 한 타이밍 단계에 대 한 프로토콜 매개 변수를 예. 타이밍 단계 필요 (a)는 조직에서에서 이동 후 preconditioning 변형 피크 막 긴장 (및 해당 피크 변형) 동시에 스트레칭 시간을 기록 하는 stopwatch을 시작 하는 동안. 대상 힘에 도달 하면 (b) 후 preconditioning 변형 기록 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 힘 제어 biaxial 테스트 절차 테스트용 mitral tricuspid 벨 브 전단의 도식. 각 조직 방향 (Tx:Ty)에서 피크 막 긴장의 다양 한 로드 비율 이어서 vivo에서 상태로 조직 운동 단계를 거치기는 equibiaxial 로드 테스트 프로토콜 구성: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1, 및 1:0. 5. 힘 제어 테스트 프로토콜의 각 하위 10 로드/언로드 주기 위해 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 변위 제어 biaxial 테스트 절차 테스트용 mitral tricuspid 벨 브 전단의 도식. 테스트 프로토콜 관련 된 피크 막 긴장, X 방향에서 (b) 순수 전단 (는) biaxial 변위, (c) X-방향, (d) 순수 전단에 매치 변위를 제한 합니다 Y-방향, 및 (e) Y 방향에서 단축 변위 제한. 변위 제어 테스트 프로토콜의 각 하위 10 로드/언로드 주기 위해 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 예를 들어 스트레스 이완 7.5 m m x 7.5 m m의 효과적인 테스트 지역으로 승 모 판 앞쪽 전단지에 대 한 테스트 매개 변수. 스트레스 이완 승 모 판 앞쪽 전단지 타겟된 변위가이 조직에 특정 피크 조직 변형에 대 한 테스트에 대 한 매개 변수 설정된 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 15 분 스트레스 이완 테스트 절차 테스트용 mitral tricuspid 벨 브 전단의 도식. 테스트 프로토콜 포함 후 조직 장착 구성 하 되 15 분, 피크 막 긴장 연관 biaxial 변위를 들고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 예 조직학 데이터 것 심장 밸브의 앞쪽 전단지에서. (한) 승 모 판 앞쪽 전단지와 (b) 후부 tricuspid 벨 브 전단의 대표적인 조직학 이미지. 둘 다 Masson의 trichrome 얼룩으로 얼룩이 있습니다: 콜라겐, 세포질 파란색과 빨간색, 각 질과 블랙에 핵에서. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11: biaxial 기계적 테스트 데이터를 사용 하 여 동안 4 개의 표준 마커의 좌표 추적을 보여주는 대표적인 이미지 이미지 상관 (DIC) 기술. (한) 조직 장착 구성. (b) preconditioning 단계 후 구성. (c) 변형된 구성 조직 표본에서 기계적 부하와 관련 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12: 승 모 판 앞쪽 전단지 (MVAL)에 대 한 강제 제어 프로토콜에서 대표적인 데이터. 대표적인 데이터 소재 이방성 및 각 조직 방향 (Tx:Ty)에서 피크 막 긴장의 로드 비율을 다양 한 biaxial 로드 아래 조직의 비선형 긴장 응답을 보여줍니다: (는) 1:1, (b) 0.75:1, (c) 1:0.75, (d) 0.5:1, 그리고 (e) 1:0. 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13: 승 모 판 앞쪽 전단지 (MVAL)에 대 한 변위 제어 프로토콜에서 대표적인 데이터. 대표적인 데이터 연관 피크 막 긴장, X-방향으로, (c) (b) 순수 전단 (는) biaxial 변위 중 소재 이방성 및 조직의 비선형 긴장 응답을 보여 줍니다. X 방향, Y 방향에서 (d) 순수 전단에에서 매치 변위를 제한 하 고 (e) Y 방향에서 단축 변위 제한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 14: mitral 및 tricuspid 스트레스 이완 프로토콜에서 대표적인 데이터 밸브 앞쪽 전단지. (A)는 MVAL 대표 데이터 그리고 (b) 시간이 지남에 따라 지 수 스트레스 감소를 보여주는 TVAL. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 설정된 이름 | X 축 | Y 축 | 스트레치 (s) | 홀드 (s) | 복구 (s) | 나머지 (s) | XPreload (미네소타) | YPreload (미네소타) | 담당자 | 데이터 (Hz) | 이미지 (Hz) | |
| FirstImage | 단계 0.0 (미네소타) | 단계 0.0 (미네소타) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (첫 번째) | 0.0 (첫 번째) | 1 | 1 | 1 | |
| PreconditioningA | 단계 F (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (첫 번째) | 0.025*F (첫 번째) | 8 | 15 | 0 | |
| PreconditioningB | 단계 F (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 | |
| 1:1A | 단계 F (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 | |
| 1:1B | 단계 F (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 | |
| 0.75:1A | 단계 (0.75*F) (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 | |
| 0.75:1B | 단계 (0.75*F) (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.75A | 단계 F (미네소타) | 단계 (0.75*F) (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.75B | 단계 F (미네소타) | 단계 (0.75*F) (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 | |
| 0.5:1A | 단계 (0.5*F) (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 | |
| 0.5:1B | 단계 (0.5*F) (미네소타) | 단계 F (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.5A | 단계 F (미네소타) | 단계 (0.5*F) (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.5B | 단계 F (미네소타) | 단계 (0.5*F) (미네소타) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 | |
표 1: 전체 힘 제어 테스트 계획의 모든 프로토콜에 대 한 매개 변수를 테스트. 힘 (millinewtons)에 연결 대상된 피크 막 긴장 된 힘을 나타내는 F 로 작성 됩니다. 스트레치 시간 t 로 테스트 되 고 조직에 특정 (초)에서 스트레칭 시간을 나타내는 기록 됩니다.
| X 축 | Y 축 | 스트레치 (s) | 홀드 (s) | 복구 (s) | 나머지 (s) | XPreload (미네소타) | YPreload (미네소타) | 담당자 | 데이터 (Hz) | 이미지 (Hz) |
| 단계 0.0 (미네소타) | 단계 0.0 (미네소타) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (첫 번째) | 0.0 (첫 번째) | 1 | 1 | 1 |
| 램프 dx (%) | 램프 dy (%) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (첫 번째) | 0.025*F (첫 번째) | 10 | 15 | 0 |
| 램프 dx (%) | 램프 dy (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 |
| 램프 0.0 (%) | 램프 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 없음 | 없음 | 1 | 15 | 0 |
| 램프 dx (%) | 램프 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 |
| 램프 dx (%) | 램프 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 |
| 램프 0.0 (%) | 램프 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 없음 | 없음 | 1 | 15 | 0 |
| 램프 1 /dx (%) | 램프 dy (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 |
| 램프 1 /dx (%) | 램프 dy (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 |
| 램프 0.0 (%) | 램프 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 없음 | 없음 | 1 | 15 | 0 |
| 램프 dx (%) | 램프 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 |
| 램프 dx (%) | 램프 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 |
| 램프 0.0 (%) | 램프 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 없음 | 없음 | 1 | 15 | 0 |
| 램프 0.0 (%) | 램프 dy (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 10 | 15 | 0 |
| 램프 0.0 (%) | 램프 dy (%) | t | 0 | t | 0 | 없음 | 없음 | 2 | 15 | 15 |
표 2: 전체 변위 제어 테스트 계획의 모든 프로토콜에 대 한 매개 변수를 테스트. 변위 (백분율)에 각각 비율 신장에는 X-및 Y-방향을 거치기 후 피크를 나타내는 dx dy 로 작성 됩니다. 스트레치 시간 t 로 테스트 되 고 조직에 특정 (초)에서 스트레칭 시간을 나타내는 기록 됩니다. 약어: PS = 순수 전단; CU = 단축 제한.
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Discussion
이 biaxial 기계 테스트에 대 한 중요 한 단계 (i) 전단지, (ii) 적절 한 biaxial 테스터 무시할 수 전단에 대 한 설정과 표준 마커 (iii)는 신중한 응용 프로그램의 적절 한 방향을 포함합니다. 전단지의 방향 재료는 자연에서 이방성으로 전단지 조직의 얻은 기계적 특성에 결정적 이다. 따라서, 방사형 및 원주 방향 제대로 조직 표본으로 테스트 X-및 Y-방향 정렬에 대 한 알려져 있이 필요가 있다. 또한 표본 무시할 수 전단 응력 도입으로 시스템에 탑재 되는 biaxial 테스터 제대로 보정 필수적 이다. 전단의 무시할 수 없는 금액, 관찰 하는 경우 후속 조직 긴장과 스트레스를 계산에서 결과 크게 비우는 수 있습니다. 특별 한 주의 표식 중 조직 긴장의 부정확 한 계산을 피하기 위해 다른 사람에 게 충실 하도록 4 개의 표준 마커의 응용 프로그램에 필요 합니다. 조직 변형 계산 관련 관심 있는 독자 이전 연구2,,2325에서 상술 된 대로 절차를 이라고 합니다.
현재 프로토콜을 만들 수 있는 몇 가지 수정 변형 속도 추가 포함 하 고 테스트 프레임 워크에 테스트 크 리프. 이러한 테스트 대동맥 심장 밸브 (AHV) 전단지의 다른 점 탄성 속성에 대 한 통찰력을 허용 하지만 그것에 표시 되었습니다 이전 문학 변형 속도 변형 하지 않는 심장 밸브 전단 조직 아래에 대 한 중요 한 순수 작동 조건입니다.
이 방법의 제한 표본의 부적 절 한 평면 정렬의 경우에 전단 소개에 대 한 가능성을 포함 하 고 표준 마커 위에서 데이터 무효화를 붙어. 이 방법의 다른 한계 표본만 제어 견본 가장자리에 전체 클램핑 하는 것 보다는 각 모서리에 5 포인트에 의해 제어 되므로 장착, 표본에 대 한 타인의 사용을 포함 합니다. 클램핑 방법을 통해 타인의 사용 하면 문제 매치 테스트 프로토콜 같은 가지 가지 끝의 변위에도 불구 하 고 작은 개 악 되 고 상수 biaxial 테스트 시스템에 연결을 허용할 수 있습니다. 그러나, 개별 가지 운동에서이 변형 추정 무시할 수 있습니다.
이 메서드는 장점이 있기 때문에 다른 방법에 비해 큰 모든 프로토콜 테스트 (힘 제어, 변위 제어, 그리고 스트레스 이완) 하나의 통합된 조직 표본에 수행 됩니다. 대안 제시 방법론을 각 조직에 대 한 테스트 프로토콜을 수행할 수 있습니다만 보다는 3 테스트 프로토콜을 결합. 이 수반으로 조직의 속성 조직에서 다른 동물 주제 사이 크게 다를 수 있습니다 그 대안 조직 행동의 그들의 설명에 정확 하 게 않을 수 있습니다.
이 메서드는 것 심장 밸브 전단지 외 다른 재료를 응용 프로그램으로 확장할 수 있습니다. 예를 들어 이러한 메서드는 다른 부드러운 조직, 또는 고분자/고무 형 재료 특성화에 유용할 수 있습니다. 제공 된 적합 한 로드셀 용량 및 견본 크기 같은 적절 한 설치는 제공 체계 biaxial 테스트 장치와 호환 되는 그러한 자료의 전체 특성에 대 한 제공 하는 것.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 16SDG27760143에 의해 지원 되었다. 저자 또한 오클라호마 대학 사무실의 학부 연구에서 콜 튼은 로스와 데 빈 로렌스를 지원 하기 위한 멘토링 연구 친교를 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Bufffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope | AmScope | SKU: T120C | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5N Load Cell Capacity | |
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2018b | |
| Phosphate-Buffered Saline | n/a | Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures |
References
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