Summary
Este protocolo envolve caracterizações dos folhetos da válvula atrioventricular com força controlada, deslocamento controlado, e procedimentos de teste mecânico biaxial de stress-relaxamento. Resultados adquiridos com este protocolo podem ser usados para o desenvolvimento do modelo constitutivo para simular o comportamento mecânico de válvulas de funcionamento sob um quadro de simulação de elementos finitos.
Abstract
Extensos testes mecânicos biaxial dos folhetos da válvula atrioventricular coração podem ser utilizados para derivar parâmetros ideais, usados nos modelos constitutivos, que fornecem uma representação matemática da função mecânica das estruturas. Este protocolo de teste mecânico biaxial apresentado envolve a aquisição de tecido (i), (ii) a preparação de amostras de tecido, (iii) biaxial teste mecânico e (iv) o pós-processamento dos dados adquiridos. Primeiro, aquisição de tecido exige a obtenção de suínos ou ovinos corações de uma comida local e matadouro aprovados pelo FDA para posterior dissecação para recuperar os folhetos da válvula. Em segundo lugar, preparação do tecido requer o uso de cortadores de amostra de tecido no tecido dos folhetos para extrair uma zona clara para testes. Terceiro, biaxial teste mecânico do espécime folheto requer o uso de um testador de mecânico biaxial comercial, que consiste de força controlada, controlada por deslocamento, e testes de stress-relaxamento protocolos para caracterizar o tecido folheto Propriedades mecânicas. Finalmente, pós-processamento requer o uso de técnicas de correlação de dados imagem e leituras de força e deslocamento para resumir comportamentos de mecânica do tecido em resposta a carga externa. Em geral, os resultados de ensaio biaxial demonstram que os tecidos de folheto produzem uma resposta de mecânica não-linear, anisotrópica. O procedimento de ensaio biaxial apresentado é vantajoso para outros métodos, desde que o método aqui apresentado permite uma caracterização mais abrangente do tecido dos folhetos da válvula sob um regime de teste unificado, em oposição a protocolos de testes separados na amostras de diferentes tecidos. O método de teste proposto tem suas limitações, em que a tensão de cisalhamento é potencialmente presente na amostra de tecido. No entanto, qualquer potencial cisalhamento presume-se insignificante.
Introduction
Função cardíaca adequada depende de comportamentos mecânicos apropriados dos folhetos da válvula coração. Em situações onde a mecânica de folheto de válvula de coração está comprometidas, doença valvular cardíaca ocorre, que pode conduzir a outros problemas relacionados com o coração. Compreender a doença valvular cardíaca requer uma compreensão completa dos comportamentos de mecânica adequada dos folhetos para uso em modelos computacionais e desenvolvimento de terapêutico, e como tal, um esquema de ensaio deve ser desenvolvido para recuperar com precisão o saudável Propriedades mecânicas dos folhetos. Na literatura anterior, esta caracterização mecânica tem sido conduzida usando procedimentos de teste mecânicos biaxial.
Procedimentos de ensaio biaxial mecânicos para tecidos moles variam em toda a literatura, com diferentes estruturas de teste utilizadas para recuperar diferentes características1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. métodos de teste foram estendidos para investigações das características mecânicas dos folhetos da válvula de coração. Em geral, biaxial teste mecânico envolve carregar o tecido da válvula de coração com forças simultâneas nas duas direções principais, mas como este teste é realizado varia com base nas propriedades biomecânicas que devem ser observados. Alguns destes testes protocolos incluem (i) taxa de deformação, fluência (ii), (iii) stress-relaxamento e (iv) força controlada testando.
Primeiro, o teste de tensão-taxa tem sido utilizada para determinar os comportamentos de tempo-dependente do tecido folhetos18,20. Neste protocolo teste, folhetos são carregados para uma tensão máxima de membrana em momentos diferentes da metade do ciclo (ou seja, 1, 0,5, 0,1 e 0,05 s) para determinar se há uma diferença significativa no trecho de pico ou histerese entre tempos de carregamento. No entanto, esses testes demonstraram uma diferença insignificante no trecho observado com diferentes taxas de estirpe. Em segundo lugar, em testes de fluência, o tecido é carregado para o pico de tensão de membrana e realizado no pico de tensão de membrana. Este teste permite uma demonstração de como o deslocamento do tecido arrasta-se para manter a tensão de membrana de pico. No entanto, foi demonstrado que o patife é insignificante para folhetos de válvula do coração sob fisiologicamente funcionamento3,20. Em terceiro lugar, em testes de stress-relaxamento, o tecido é carregado para o pico de tensão de membrana e o deslocamento associado é mantido constante por um longo período de tempo,3,21,22. Neste tipo de teste, o stress de tecido tem uma notável redução desde o pico de tensão de membrana. Por último, em testes de força controlada, tecidos são carregados ciclicamente em várias relações da tensão de membrana de pico em cada direção17,23. Estes testes revelam a anisotropia do material e a resposta de tensão-deformação não-linear, e carregando o tecido sob várias relações, deformações fisiológicas potenciais podem ser melhor compreendidas. Estas investigações recentes feitas aparente stress-relaxamento e protocolos controlados por força ser mais benéficos para realizar uma caracterização mecânica dos folhetos da válvula de coração. Apesar destes avanços na caracterização biomecânica do coração da válvula, o teste não foi realizado sob uma unificada regime de teste, e existem métodos limitados para investigar o acoplamento entre as direções.
A finalidade desse método é facilitar uma caracterização completa material dos folhetos da válvula coração por um regime de teste mecânico biaxial unificado. Um esquema unificado de teste é considerado como um onde cada folheto é testado em todos os protocolos de testes em uma sessão. Isto é vantajoso, como tecido propriedades são inerentemente variáveis entre folhetos, portanto, uma caracterização completa de cada folheto prova mais precisa como um descritor que realizando cada protocolo independentemente em vários folhetos. O esquema de teste consiste de três componentes principais, nomeadamente (i) um protocolo de teste biaxial força controlada, (ii) um protocolo de teste biaxial deslocamento controlado e (iii) um protocolo de teste de stress-relaxamento biaxial. Todos os regimes de testes utilizam uma taxa de carregamento de 4,42 N/min e 10 ciclos de carga e descarga para garantir tensão-deformação curva replicabilidade pelo 10º ciclo (como os encontrados em trabalhos anteriores)23. Todos os protocolos também são construídos com base no pressuposto de tensão da membrana, que exige que a espessura seja inferior a 10% dos comprimentos de amostra eficaz.
O protocolo força controlada usado neste método apresentado é composto por 10 de carga e descarga de ciclos com as tensões de membrana de pico de 100 N/m e 75 N/m para a válvula mitral (MV) e a válvula tricúspide (TV), respectivamente de15,17. Rácios de carregamento cinco são considerados neste protocolo teste controlado por força, ou seja 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 e 1:0. 5. Estas relações de cinco carga provar útil em descrever o stress e tensões correspondente para todos os possíveis deformações fisiológicas do folheto in vivo.
O protocolo de deslocamento controlado apresentado neste método consiste em dois cenários de deformação, nomeadamente (i) restrito uniaxial alongamento e (ii) puro cisalhamento. No alongamento uniaxial restrita, uma direção do tecido é deslocada para o pico de tensão de membrana ao reparar na outra direção. Na configuração do cisalhamento puro, o tecido é esticado em uma direção e criteriosamente encurtado em outra direção, então a área do tecido permanece constante sob deformação. Cada um desses procedimentos de teste controlado por deslocamento é executado para cada uma das direções dois tecidos (direções radiais e circunferenciais).
O protocolo de stress-relaxamento usado no método apresentado é conseguido por carregar o tecido para o pico de tensão de membrana em ambos os sentidos e segurando o tecido para os deslocamentos correspondentes por 15 min monitorar o comportamento de relaxamento do tecido stress. Os procedimentos experimentais detalhados são discutidos em seguida.
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Protocol
Todos os métodos descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na The University of Oklahoma. Todos os tecidos animais foram adquiridos de um departamento de Estados Unidos de agricultura USDA-aprovado matadouro (país Home co. de carne, Edmond, Okey).
1. tecido aquisição e limpeza
- Recuperar os corações animais no mesmo dia, como o animal é abatido e armazenar os corações em uma caixa de gelo para garantir a frescura de tecido. Transporte os corações para o espaço do laboratório.
- À chegada ao laboratório, mergulhe o coração em um balde de tampão fosfato (PBS) solução salina para enxaguar qualquer excesso de sangue. Recupere o fórceps, um placemat, uma lâmina, um balde de PBS solução alvejante e um saco de plástico. Prepare o placemat colocando ele no balcão da dissecação, permitindo uma limpeza mais fácil da bagunça de parentes. Depois que o coração tenha sido suficientemente lavado, coloque o coração sobre o placemat (Figura 1a).
- Usando a pinça, localize a linha de separação entre os átrios e o ventrículo de cada lado do coração. Usando uma lâmina de barbear, cuidadosamente, fazer uma incisão ao longo desta linha de despedida e revelar as válvulas cardíacas e os ventrículos (Figura 1b). Fazer a incisão ao longo da circunferência exterior inteira do coração, que podem ser removidos dos átrios e todo coração material superior para os ventrículos.
- Com a pinça, puxe cuidadosamente qualquer observados coágulos de sangue nos ventrículos (Figura 1C). Se for feita uma tentativa remover um coágulo de sangue, mas isso não se mover, assegurar o dever tendineae ou folhetos não tem sido pego. Coloque os coágulos de sangue no saco para eliminação de resíduos de risco biológico.
- Quando todos os coágulos de sangue foram retirados dos ventrículos, enxágue o coração uma vez final em um balde com solução de PBS. Coloque o coração limpo num saco de plástico e armazená-lo no congelador.
- Usando uma solução de água sanitária 10% e 90% água, misturar o sangue com a solução de água sanitária e mexa continuamente por cerca de 10 min. procure um tratamento bem sucedido lixívia, indicado pela solução em transição de vermelho para amarelo. Descarte do sangue através de drenagem tratada com água sanitária.
Atenção: A água sanitária é uma substância tóxica e pode ser prejudicial se ingerido.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. dissecção e análise da anatomia do coração
- Recuperar o coração previamente limpo e deixe-a descongelar em banho de água morna. Os materiais necessários para dissecação incluem pinças, lâminas cirúrgicas, placemats, PBS e recipientes de armazenamento pequena. Depois do coração é completamente descongelado, colocá-lo em um placemat para absorver qualquer sangue restante.
- Segure o coração para a exibição (superior) otimamente observar as estruturas de válvula de cima para baixo. Começando com o MV no lado esquerdo do coração, use fórceps para manipular os folhetos e identificar uma comissura, ou linha de separação, entre os folhetos cuidadosamente.
- Fazer uma incisão ao longo da comissura e corte com cuidado através da parede ventricular, certificando-se de não danificar os folhetos. Pode ser necessário cortar os anexos cordal durante este processo para abrir completamente o ventrículo. Uma vez que a incisão completa é feita, abra o ventrículo (Figura 2a).
- Identificar os folhetos anteriores e posteriores de MV e usar uma lâmina cirúrgica para separar os anexos cordal para músculos papilários. Usando fórceps, esticar os folhetos tensos e fazer cortes para separar os folhetos do annulus. Coloque os folhetos extirpados em um recipiente devidamente etiquetado, preenchido com solução de PBS e armazená-lo no frigorífico, a cerca de 4 ° C.
- Segure o coração por uma visão de cima para baixo e identificar a TV no lado direito do coração. Localize as comissuras e faça uma incisão dentre as comissuras e da parede ventricular (Figura 2b).
- Identificar os folhetos de septal, posteriores e anteriores de TV e realizar a extração do folheto como feito no passo 2.4. Coloque folhetos todos obtidos em um recipiente rotulado com solução de PBS e armazenar o recipiente no frigorífico, a cerca de 4 ° C.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. No entanto, testes biomecânicos de tecido e as análises subsequentes histologia devem ocorrer no prazo de 2 dias a dissecação do coração.
3. dissecção de tecidos
- Recupere um folheto da geladeira, o cortador de tecido para o tamanho de corte especificado, uma caneta cirúrgica, pinças, lâminas de barbear e uma esteira de corte.
- Usando a pinça, retirar a amostra da solução PBS e coloque-o sobre o tapete de corte com a direção radial (R), alinhado à direção Y e a direção circunferencial (C) alinhada à direção X (Figura 3a). Identifica do folheto região central como a seção de teste.
- Alinhe o cortador de tecido para que a região de teste de tecido desejado é dentro dos limites das lâminas de barbear. Faça um corte horizontal e outra na vertical para formar uma quadrado da região as dimensões desejadas (Figura 3b). Usando a caneta cirúrgica, Rotule o sentido radial do tecido (Figura 3b).
- Utilizando a lâmina de barbear, apare quaisquer acessórios cordal esticando o dever do folheto com a pinça e fazendo um corte cuidadoso sem causar qualquer dano para o folheto.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Se o protocolo é pausado, armazenar o tecido seccionado em um recipiente rotulado com solução de PBS e armazenar o recipiente no frigorífico, a cerca de 4 ° C (conforme explicado no passo 2.6). No entanto, testes de tecido devem ocorrer no prazo de 2 dias a dissecação.
4. espessura medição e instalação de testador biaxial
- Recupere a amostra de tecido seccionado, pinças de Digitas e uma pequena espátula de metal. Usando os compassos de calibre Digitas, medir e registrar a espessura de uma espátula de metal.
- Usando fórceps, colocar a amostra de tecido liso sobre a espátula de metal. Usando as Digitas pinças, medir a espessura do par espátula-tecido (Figura 3C) em três locais diferentes do folheto. Subtrair a espessura da espátula de cada medição e gravar a espessura média.
- Prepare um banho de PBS a 37 ° C, que corresponde às condições fisiológicas do tecido.
5. tecido de montagem e colocação de Marcador fiducial
- Recupere o fórceps, a amostra de tecido, montagem de hardware, uma ferramenta de ponta fina, grânulos de vidro (com diâmetros de 300 – 500 µm) e super cola.
- Monte o tecido para o sistema de teste biaxial (Figura 3de). Durante a montagem, certifique-se de que as direções radial e circunferencial do tecido estão alinhadas com a máquina X - e Y-direções.
- Para a colocação do Marcador fiducial, coloca grânulos de vidro em um pequeno recipiente open-faced e uma pequena piscina de super cola em um outro recipiente. Usando a ferramenta de ponta fina, cubra a ponta com uma pequena quantidade de cola super e enfiar uma pérola individual para a ponta da ferramenta.
- Com cuidado, use a ferramenta para transferir a conta para um canto do terço médio da região de teste do tecido (Figura 3f). Repita este passo até que é uma matriz quadrada de quatro grânulos formados (Figura 3 g).
Nota: É fundamental que o excesso de cola é evitado, e que os marcadores fiduciais não fiquem juntos como técnicas de correlação (DIC) de imagem digital mais tarde irão produzir resultados de rastreamento inútil. É importante que a matriz quadrada deve ser dentro do terço médio do tecido teste região.
6. pré-condicionamento do passo e o tempo de duração
- Para calcular a tensão de membrana apropriado, obter o comprimento de borda do tecido teste eficaz e usar a seguinte equação.
(1)
Nota: Aqui, T é a tensão de membrana em uma unidade de força/comprimento, f é a força, e L é o comprimento de teste eficaz do espécime. - Crie um protocolo de acordo para que o tecido passará por 10 ciclos de carga/descarga com as forças associadas com pico de tensão de membrana em uma taxa de carregamento de 4,42 N/min, incluindo uma pré-carga de 2,5% da força máxima (Figura 4).
- Crie um novo diretório de teste arbitrário para armazenar temporariamente dados de pré-condicionamento, porque não é necessário para cálculos futuros. Estabelece uma taxa de carregamento de 4,42 N/min para testes subsequentes.
- Criar um novo conjunto de parâmetros de teste e defina o nome do protocolo como Preconditioning0 (figura 4a). Para o X e y, defina o modo de controle para ser a força e a função de controle de passo. Definir a magnitude de carga como a força associada com alvo pico de tensão de membrana (cf. etapa 6.1) (figura 4b). Defina a pré-carga magnitude como 2,5% da força máxima para a primeira repetição apenas (Figura 4C). Defina o esticar duração e recuperação duração ambos ser 25 conjunto s. o número de repetições para ser 10 (Figura 4e).
- Quando termina a etapa de pré-condicionamento, tome nota da deformação do tecido em X - e Y-direções. Prepare um protocolo para mover a amostra para a força máxima, começando a partir do tamanho gravado.
- Recupere um cronômetro para fins de cronometragem. Começam a força máxima de protocolo a carregar e iniciar o cronômetro, simultaneamente, quando a máquina começa a atuação (Figura 5a). Pare o cronômetro quando o acionamento parar. Paragem será evidente através de sinais auditivos.
- Grave a deformação de tecido pós-pré-condicionamento pico ao lado a tempo do cronômetro que representa o tempo de alongamento ideal do tecido (Figura 5b).
(1)7. biaxial teste mecânico
- Prepare um protocolo controlado por força a uma taxa de carregamento de 4,42 N/min.
- Abra um novo diretório de teste e o nome do teste. Defina os dados para salvar em um local conhecido para uso em cálculos posteriores de estresse e tensão. Volte a amostra para a configuração original de montagem.
- Crie um conjunto de protocolo intitulado FirstImage. Defina o eixo x e o modo de controle do eixo y para forçar e a função de controle de passo. Defina a carga de magnitude 0MN. Defina o esticar a duração e a duração da recuperação cada 1segundo. Defina o número de repetições para 1. Defina a frequência de saída de dados e a frequência de saída de imagem cada a 1 Hz.
- Construa um novo conjunto de teste chamado PreconditioningA. Estabelecer os parâmetros de teste, tais que o tecido passará por 10 repetições de carga/descarga cíclica à força orientada para a tensão de membrana desejado exatamente como foi elaborado na etapa 6.2. Observe que, agora, o tempo de estiramento e recuperação devem ser o tempo gravado na etapa 6.3.2. Não há imagens são capturadas na A conjunto de teste, mas dados são capturados em 15 Hz.
- Construa outro teste conjunto, denominado PreconditioningB. Todos os parâmetros de teste devem ser idênticos àqueles, como mencionado na etapa anterior, com a exceção que a frequência de saída de imagem é definido como 15 Hze sem pré-carga é aplicada.
- Após o protocolo de pré-condicionamento, criar protocolos de testes para que o tecido é carregado para o pico de tensão de membrana nos seguintes rácios de carregamento circunferencial-para-radial a uma taxa de carregamento de 4,42 N/min: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 e 1:0.5 (Figura 6 ). Recupere dados dos dois últimos ciclos de cada razão de carregamento para posterior processamento de dados e análises descritas na seção 10. Consulte a tabela 1 para obter uma descrição detalhada dos protocolos a estabelecer.
- Prepare um protocolo de teste controlado por deslocamento a uma taxa de carregamento de 4,42 N/min como segue. (i) Biaxial alongamento na direção X e Y-direção para os deslocamentos associados os trechos de radial e circunferencial de pico, respectivamente (Figura 7a). (ii) Pure de cisalhamento ao longo da direção X — alongamento na direção X associada com o trecho de pico circunferencial e encurtamento na direção Y, mantendo a área tracejada constante sob deformação (Figura 7b). (iii) alongamento uniaxial restrita ao longo da direção X (Figura 7C). (iv) Pure de cisalhamento ao longo da direção Y (Figura 7 d). (v) alongamento uniaxial restrita ao longo da direção Y (Figura 7e).
- Entre cada um destes passos, construa um resto "ciclo" de 1 min que mantém o tecido na configuração original montada. Recupere dados nos dois últimos ciclos de cada razão de carregamento para processamento de dados e análises (seção 9). Consulte a tabela 2 para uma descrição detalhada dos protocolos a estabelecer.
- Preparar um protocolo de stress-relaxamento para que o tecido é carregado em cada direção, a uma taxa de carregamento de 4,42 N/min, para os deslocamentos associados com as tensões de membrana de pico (passo 7.2) e realizada nesse deslocamento por 15 min (Figura 8 e Figura 9). Depois de 15 min, o protocolo deve ser definido para recuperar o tecido à sua configuração original de montagem.
Nota: No caso de tecido rasgando, aborte o teste imediatamente para evitar qualquer dano potencial causado ao sistema de ensaio biaxial.
8. fixação de tecidos para análise de histologia
- Desmonte o tecido do sistema de ensaio biaxial. Coloque o tecido em um recipiente com formol a 10% e então coloque o recipiente em um ambiente refrigerado e a aproximadamente 4 ° C. Fixe o tecido por 24 – 48 h, dependendo da espessura do tecido.
Atenção: O formol é um conhecido agente cancerígeno e, se respirava, um excesso pode causar os pulmões tornar-se fixo. Todo trabalho com formol deve ser executado em uma coifa com ventilação adequada. - Depois que o tecido foi fixado em formol para 24 – 48 h, transferi o tecido para uma solução de etanol 80% para a posterior histologia. O tecido deve ser armazenado em solução em um ambiente refrigerado a 4 ° C.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Uma vez que os tecidos são fixas, as amostras podem ser analisadas a qualquer momento. Se o protocolo é pausado, armazenar o tecido em um recipiente rotulado com 80% de etanol e armazenar o recipiente no frigorífico, a cerca de 4 ° C (conforme explicado no passo 8.2). - Prepare o tecido para análise de histologia comercial conforme as instruções do fornecedor. Se um determinado constituinte de folheto, tais como colágeno, elastina, glicosaminoglicanos, etc., é de interesse do estudo, certifique-se de que a mancha de histologia apropriado é empregada.
Nota: Slides de histologia podem ser visualizados utilizando um microscópio para observar constituintes desejados (Figura 10). - Usando a programa ImageJ de processamento de imagem, execute métodos de deconvolução de cores para determinar a porcentagem de cada constituinte manchada no tecido. Para mais detalhes sobre esses procedimentos, por favor consulte Ruifrok e Johnston24.
9. biaxial dados de teste, procedimentos de pós-processamento
- Execute o rastreamento baseado em DIC sobre o quatro marcadores fiducial as imagens tiradas durante a mecânica biaxial (Figura 11) de teste para determinar as posições de marcador de tempo-dependente.
(2)- Se se deseja realizar a análise no que diz respeito a configuração de montagem, seja X,eu as posições de marcador no estado deformado no início do ensaio biaxial. Se se deseja realizar a análise em relação a deformação pós pré-condicionamento, seja X,eu as posições de marcador no final do protocolo de pré-condicionamento.
Nota: As etapas subsequentes serão realizadas da mesma forma, independentemente da configuração de referência escolhida.
Nota: Aqui, Xeu e x, são as posições indeformadas e deformadas dos marcadores, respectivamente, e d, é o vetor de deslocamento de cada marcador.
- Se se deseja realizar a análise no que diz respeito a configuração de montagem, seja X,eu as posições de marcador no estado deformado no início do ensaio biaxial. Se se deseja realizar a análise em relação a deformação pós pré-condicionamento, seja X,eu as posições de marcador no final do protocolo de pré-condicionamento.
- Calcule o gradiente de deformação (F) dos marcadores fiduciais usando um quatro-nó de elemento finito bilinear2,23,25.
(3)
Nota: Aqui, BxIe do ByIsão os derivados de função de forma de elementos finitos nos X - e Y-direções para nó, respectivamente e ueu(t) e veu( t) são dependentes do tempo X - e Y-displacements, respectivamente, como previamente determinado a partir de passo 9.1. Observe que as coordenadas X e Y estão alinhadas às direcções de radial e circunferencial do tecido. - Calcule o direito tensor de deformação de Cauchy-Green (C) e o tensor tensão verde (E).
(4)
Nota: Aqui, é o tensor de segunda ordem identidade. Determine que o circunferencial e radial estende-se, tomando a raiz quadrada dos valores de princípio de C. - Determine o primeiro tensor de stress (1º-PK) de Piola-Kirchhoff (P).
(5)
Nota: Aqui, t é a espessura do espécime, e TC e TR são as tensões de membrana aplicada nas direções radiais e circunferenciais, respectivamente. - Também, calcule outros tensores de estresse, tais como o tensor do stress de Cauchy (σ) e o tensor de stress (2nd-PK) Piola-Kirchoff segundo (S).
(6)
Nota: Aqui, J é o Jacobian do tensor gradiente de deformação F.
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Representative Results
Dados de stress-trecho da força controlada biaxial teste mecânico revelam uma curva não linear com alguma semelhança com uma curva exponencial (Figura 12). Quanto a resposta em cada direção principal, o comportamento do material é transversalmente isotrópico, com o estiramento radial maior que a deformação circunferencial. Em alguns casos, podem virar direções a anisotropia, com a direção circunferencial exibindo conformidade maior do que a direção radial. Esta resposta invertida é observada na TV mais vezes do que em MV.
Por deslocamento controlado ensaios, dados de stress-trecho segue uma resposta não-linear para a direção principal, passando por tensão (puro-tesoura, restrita uniaxial tensão [Figura 13]). Quando o tecido diminui na direção principal, observa-se um "stress negativo (compressão)". No protocolo de tensão uniaxial restrita, lá também exibe uma resposta crescente de stress-trecho no sentido restrito, demonstrando o acoplamento de alongamento aplicada na outra direção principal.
De testes de stress-relaxamento, normalizado membrana tensão-tempo dados segue uma curva decadente não-linear (Figura 14a, b). O MV e TV folheto tecidos apresentam uma maior redução do estresse na direção radial comparada na direção circunferencial.
Corante tricromo de resultados histológicos representativos do folheto anterior de válvula mitral (MVAL) e tecidos de folheto anterior (TVAL) válvula tricúspide usando Masson são apresentados na Figura 10. Tricromo de Masson demonstra constituintes típicos encontrados em válvulas de coração atrioventricular, tais como fibras de colágeno (azul) e células intersticiais valvulares (citoplasma vermelha e pretos núcleos). Outras manchas podem ser usadas para visualizar os componentes tais como a elastina (mancha de Verhoeff-van Gieson) e glicosaminoglicanos (mancha azul de Alcian).
Figura 1: fotos experimentais de corações suínos Obtida de um matadouro local. (um) A todo coração é lavado de sangue com a solução de PBS. (b), A corte é feito entre os átrios e os ventrículos para revelar a ambas as válvulas mitral e tricúspide. coágulos de sangue (c) são então removidas do coração antes do armazenamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fotos experimentais do coração aberto porcina revelando os cinco atrioventricular coração folhetos da válvula e outros componentes do aparelho válvula. (um) a válvula mitral com a dissecação do coração esquerdo ao longo da comissura entre os dois folhetos, mostrando o folheto anterior (MVAL) e folheto posterior (MVPL) e (b) a válvula tricúspide com uma dissecação semelhante no lado direito da o coração, revelando o folheto anterior (TVAL), folheto posterior (TVPL) e folheto septal (TVSL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fotos experimentais do folheto extirpado sendo preparado para testes mecânicos biaxial. Válvula de coração folheto testes requer (um) folheto da granel para ser seccionado em (b) uma 10 x 10 mm região de teste (direção radial observada pelos marcadores de caneta cirúrgica). espessura (c), o folheto é medida. Espécimes são montados (d) o biaxial sistema de testes por (e) perfurando o tecido com dentes de metal. Após a montagem, marcadores fiduciais (f) são coladas sobre a superfície do tecido antes de submersão (g) na solução de PBS a 37 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: parâmetros de protocolo de exemplo para o teste de pré-condicionamento de um folheto anterior da valva mitral de um 7,5 x 7,5 mm teste região. O protocolo de pré-condicionamento é criado, definindo o nome (um) o protocolo, (b) o teste modo de controle e força no eixo x, (c) a pré-carga condições, (d) o eixo y parâmetros para ser o mesmo que no eixo x, e (e... ) os parâmetros do ciclo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: parâmetros de protocolo de exemplo para a etapa de sincronismo para um folheto anterior da valva mitral de um 7,5 x 7,5 mm teste região. A etapa de sincronismo requer (um) movendo o tecido da deformação pós pré-condicionamento para o pico de tensão de membrana (e deformação correspondente de pico) ao iniciar simultaneamente um cronômetro para registrar o tempo de alongamento. Quando chegou-se a força do destino, (b) a deformação pós pré-condicionamento é gravado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: esquemático dos folhetos da valva tricúspide e força controlada biaxial procedimento de teste para teste mitral. Protocolo do teste consiste de um carregamento de equibiaxial pré-condicionamento passo para exercer o tecido para seu estado em vivo, seguido de várias relações de carregamento da tensão de membrana de pico em cada direção de tecido (Tx:Ty): 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 e 1:0. 5. Cada subseção do protocolo do teste controlado por força é realizada por 10 ciclos de carga/descarga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: esquemático do deslocamento controlado biaxial procedimento de teste para teste mitral e folhetos da valva tricúspide. Protocolo do teste consiste em (a) deslocamentos biaxial associados com as tensões de membrana de pico, (b) cisalhamento puro na direção X, (c) restrita uniaxial deslocamento na direção X, (d) cisalhamento puro na Direção Y e (e) restrito uniaxial deslocamento na direção Y. Cada subseção do protocolo do teste controlado por deslocamento é realizada por 10 ciclos de carga/descarga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: parâmetros de teste de stress-relaxamento exemplo para um folheto anterior da valva mitral com uma região de teste eficaz de 7,5 x 7,5 mm. Testando os parâmetros definidos para o stress-relaxamento testes para um folheto anterior da válvula mitral, onde alvo de deslocamento é a deformação do tecido pico específica para este tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: esquemático do 15 min relaxamento stress procedimento de teste para teste mitral e folhetos da valva tricúspide. Protocolo do teste envolve prender biaxial deslocamentos associados com as tensões de membrana de pico durante 15 minutos, após o qual o tecido é retornado para a configuração de montagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: dados histológicos exemplo de folhetos anterior das válvulas do coração atrioventricular. Imagens de histologia representativa de (um) a válvula mitral anterior folheto e (b) o folheto posterior da válvula tricúspide. Ambos estão manchados com tricromo de Masson, um: colágeno em azul, citoplasma e queratina em vermelho e núcleos de preto. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: imagem de imagens representativas, ilustrando o rastreamento das coordenadas dos quatro marcadores fiduciais durante teste mecânico biaxial usando dados de um técnica de correlação (DIC). (um) o tecido configuração de montagem. (b) a configuração após a etapa de pré-condicionamento. (c) a configuração deformada associado com a amostra de tecido sob o carregamento mecânico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: dados representativos de protocolos força controlada para folheto anterior da válvula mitral (MVAL). Dados representativos demonstram a anisotropia do material e a resposta não-linear de tensão dos tecidos sob carregamento biaxial em diferentes proporções de carga de pico de tensão de membrana em cada direção de tecido (Tx:Ty): (a) 1:1, (b) 0.75:1, (c) 1:0.75, 0.5:1 (d) e 1:0. (e) 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: dados representativos de protocolos controlados por deslocamento para o folheto anterior da valva mitral (MVAL). Dados representativos demonstram o material anisotropy e resposta não-linear de tensão dos tecidos durante o (a) deslocamentos biaxial associados com as tensões de membrana de pico, (b) cisalhamento puro na direção X, (c) restrita uniaxial deslocamento na direção X, (d) cisalhamento puro na direção Y, e (e) restrita uniaxial deslocamento na direção Y. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14: dados representativos dos protocolos de stress-relaxamento para a mitral e tricúspide válvula anteriores folhetos. Dados representativos para (um) a MVAL e (b) a TVAL, ilustrando a redução do estresse exponencial ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do conjunto de | Eixo x | Eixo y | Trecho (s) | Mantenha a (s) | Recuperar o (s) | Restante (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Representantes de | Dados (Hz) | Imagem (Hz) | |
| FirstImage | Passo 0.0 (mN) | Passo 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0,0 (primeiro) | 0,0 (primeiro) | 1 | 1 | 1 | |
| PreconditioningA | Passo F (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (primeiro) | 0.025*F (primeiro) | 8 | 15 | 0 | |
| PreconditioningB | Passo F (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 | |
| 1:1A | Passo F (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 | |
| 1:1B | Passo F (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 | |
| 0.75:1A | Passo (0.75*F) (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 | |
| 0.75:1B | Passo (0.75*F) (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.75A | Passo F (mN) | Passo (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.75B | Passo F (mN) | Passo (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 | |
| 0.5:1A | Passo (0.5*F) (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 | |
| 0.5:1B | Passo (0.5*F) (mN) | Passo F (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.5A | Passo F (mN) | Passo (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.5B | Passo F (mN) | Passo (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 | |
Tabela 1: teste completo parâmetros para todos os protocolos do regime de teste controlados por força. Forças (em millinewtons) são escritas como F para representar a força associada com a tensão de membrana alvo de pico. Tempo de estiramento é escrito como t para representar o estiramento tempo (em segundos) específico para o tecido a ser testado.
| Eixo x | Eixo y | Trecho (s) | Mantenha a (s) | Recuperar o (s) | Restante (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Representantes de | Dados (Hz) | Imagem (Hz) |
| Passo 0.0 (mN) | Passo 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0,0 (primeiro) | 0,0 (primeiro) | 1 | 1 | 1 |
| Rampa dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (primeiro) | 0.025*F (primeiro) | 10 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 |
| Rampa 0.0 (%) | Rampa 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Nenhum | Nenhum | 1 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 |
| Rampa 0.0 (%) | Rampa 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Nenhum | Nenhum | 1 | 15 | 0 |
| Rampa 1 /dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 |
| Rampa 1 /dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 |
| Rampa 0.0 (%) | Rampa 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Nenhum | Nenhum | 1 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 |
| Rampa 0.0 (%) | Rampa 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Nenhum | Nenhum | 1 | 15 | 0 |
| Rampa 0.0 (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 10 | 15 | 0 |
| Rampa 0.0 (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Nenhum | Nenhum | 2 | 15 | 15 |
Tabela 2: teste completo parâmetros para todos os protocolos do regime de teste controlados por deslocamento. Deslocamentos (em percentagem) são escritos como dx e dy para representar o pico pós-pré-condicionamento do alongamento percentual nos X - e Y-direções, respectivamente. Tempo de estiramento é escrito como t para representar o estiramento tempo (em segundos) específico para o tecido a ser testado. Abreviaturas: PS = cisalhamento puro; CU = restrita uniaxial.
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Discussion
Passos críticos para este teste mecânico biaxial incluem (i) a orientação correta de folheto da instalação testador biaxial (ii) adequado para a tesoura insignificante e (iii) uma aplicação cuidadosa dos marcadores fiduciais. A orientação do folheto é crucial para a caracterização mecânica Obtida de tecido dos folhetos, como o material é anisotrópico na natureza. Assim, as direções radiais e circunferenciais precisam ser conhecido para alinhar corretamente as amostras de tecido com a teste X - e Y-direções. Também é essencial que o testador biaxial é devidamente calibrado para que a amostra é montada no sistema com tensão de cisalhamento insignificante introduzido. Se for observada uma quantidade não desprezível de cisalhamento, os resultados podem ser enviesados grandemente nos cálculos de pressão e o stress de tecido subsequentes. Atenção especial é necessária para a aplicação dos quatro marcadores fiduciais para garantir que nenhum dos marcadores ficar para os outros para evitar cálculos imprecisos de cepas de tecido. No que se refere os cálculos de tensão de tecido, os leitores interessados são referidos os procedimentos conforme detalhado em estudos anteriores2,23,25.
Algumas modificações que poderiam ser feitas para os protocolos atuais incluem adicionar taxa de deformação e fluência de teste para a estrutura de testes. Estes testes permitem introspecção nas propriedades viscoelásticas diferente do folheto (AHV) de válvula aórtica do coração, mas tem sido demonstrado na literatura anterior que a taxa de deformação e fluência são insignificantes para tecidos de folheto de válvula de coração sob fisiologicamente condições de funcionamento.
Limitações do método incluem a possibilidade de introdução de cisalhamento em casos de alinhamento planar inadequado da amostra e preso fiduciais marcadores que invalidar os dados, como foi mencionado anteriormente. Outras limitações deste método incluem o uso de dentes para amostra de montagem, como a amostra só é controlada por cinco pontos em cada borda, ao invés de um aperto completo para bordas de amostra de controle. O uso dos dentes sobre os métodos de fixação causa problemas com protocolos de ensaio uniaxiais, tal que os dentes podem permitir pequenas deformações apesar do deslocamento da extremidade do dente ligado ao sistema de ensaio biaxial sendo constante. No entanto, esta deformação de movimento do dente individual pode presumir-se insignificante.
Este método é significativo em suas vantagens em comparação com outros métodos, porque todos os protocolos de teste (força controlada, deslocamento controlado e stress-relaxamento) são realizadas em uma amostra de tecido unificado. Alternativas à metodologia apresentada só podem realizar um protocolo de teste para cada tecido, ao invés de três combinados protocolos de testes. Isto implica que essas alternativas podem não ser tão precisas na descrição de comportamentos de tecido, como propriedades do tecido podem variar significativamente entre os tecidos de diferentes assuntos de animais.
Esse método pode ser estendido por aplicação de outros materiais além dos folhetos da válvula atrioventricular coração. Por exemplo, estes métodos podem ser úteis na caracterização de outros tecidos moles, ou materiais polímeros/borracha-tipo. O fornecido o regime que prevê a caracterização completa de qualquer desses materiais compatíveis com um dispositivo de ensaio biaxial, desde que exista uma instalação adequada, como uma capacidade de carga-célula apropriada e o tamanho da amostra.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Associação de coração americano cientista desenvolvimento Grant 16SDG27760143. Os autores também gostaria de reconhecer o mentor de bolsa de pesquisa da escritório de iniciação científica do Universidade de Oklahoma para apoiar tanto Colton Ross e Devin Laurence.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Bufffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope | AmScope | SKU: T120C | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5N Load Cell Capacity | |
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2018b | |
| Phosphate-Buffered Saline | n/a | Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures |
References
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