Summary
Este protocolo trata de caracterizaciones de valvas auriculoventriculares con fuerza controlada, control de desplazamiento, y procedimientos de prueba mecánica biaxial de relajación de la tensión. Resultados con este protocolo se pueden utilizar para el desarrollo de modelos constitutivos para simular el comportamiento mecánico de las válvulas de funcionamiento bajo un entorno de simulación de elementos finitos.
Abstract
Ensayos mecánicos biaxial extensa de valvas de la válvula auriculoventricular del corazón pueden ser utilizados para derivar los parámetros óptimos en modelos constitutivos, que proporcionan una representación matemática de la función mecánica de las estructuras. Este presentó protocolo de pruebas mecánica biaxial consiste en tejido (i) adquisición, (ii) la preparación de muestras de tejido, pruebas de mecánica (iii) biaxial y (iv) post-procesado de los datos adquiridos. En primer lugar, adquisición del tejido requiere obtener corazones ovina o porcina de un local de alimentos y mataderos aprobados por la FDA para la disección posterior para recuperar las valvas. En segundo lugar, preparación de tejido requiere el uso de cortadores de muestras de tejido en el tejido de las valvas para extraer una clara zona de pruebas. Ensayos mecánicos en tercer lugar, biaxial de la muestra folleto requiere el uso de un probador mecánico biaxial comercial, que consiste en fuerza controlada, control de desplazamiento, y relajación de la tensión de prueba protocolos para caracterizar el tejido de la valva propiedades mecánicas. Finalmente, post-procesado requiere el uso de técnicas de correlación de la imagen de los datos y las lecturas de fuerza y desplazamiento para resumir el comportamiento mecánico del tejido en respuesta a una carga externa. En general, los resultados de la prueba biaxial demuestran que los tejidos del folleto dan una respuesta mecánica no lineal, anisotrópica. El procedimiento de prueba biaxial presentado es ventajoso a otros métodos ya que el método presentado aquí permite una caracterización más completa del tejido de las valvas de la válvula bajo un esquema prueba unificado, a diferencia de protocolos de pruebas separados en muestras de tejido diferentes. El método de prueba propuesto tiene sus limitaciones en ese esfuerzo cortante está potencialmente presente en la muestra de tejido. Sin embargo, cualquier posible corte se supone despreciable.
Introduction
Función cardiaca adecuada se basa en comportamientos mecánicos apropiados de valvas de la válvula del corazón. En situaciones donde están comprometidos los mecánicos de prospecto de la válvula de corazón, enfermedad de válvula cardíaca se produce, que puede conducir a otros problemas relacionados con el corazón. Comprensión valvulopatía cardíaca requiere una profunda comprensión de comportamientos mecánicos adecuados los folletos para el uso de modelos computacionales y desarrollo terapéutico, y como tal, debe desarrollarse un plan de pruebas para recuperar exactamente la sana propiedades mecánicas de folletos. En literatura anterior, esta caracterización mecánica se ha realizado utilizando procedimientos de prueba mecánicos biaxiales.
Biaxiales procedimientos de pruebas mecánicos de los tejidos blandos varían a lo largo de la literatura, con diferentes marcos de prueba utilizados para recuperar diversas características1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. métodos de prueba se han ampliado para las investigaciones de las características mecánicas de las valvas de la válvula de corazón. En general, biaxial ensayos mecánicos implica el tejido de la válvula de corazón con fuerzas simultánea en las dos direcciones principales de carga, pero cómo se realiza esta prueba varía basado en las propiedades biomecánicas que se observarán. Algunos de estos protocolos de prueba incluyen (i) el grado de deformación, fluencia (ii), (iii)-relajación de la tensión y (iv) control de fuerza de prueba.
En primer lugar, prueba el grado de deformación se ha utilizado para determinar el comportamiento dependiente del tiempo del tejido folletos18,20. En este protocolo de pruebas, folletos se cargan a una tensión máxima de la membrana en diferentes momentos del ciclo de media (es decir, 1, 0.5, 0.1 y 0.05 s) para determinar si existe una diferencia significativa en el tramo de pico o histéresis entre tiempos de carga. Sin embargo, estas pruebas han demostrado una diferencia insignificante en el tramo observado con diferentes tipos de tensión. En segundo lugar, en ensayos de fluencia, el tejido es cargado a la tensión de la membrana del pico y en tensión de la membrana del pico. Esta prueba permite una demostración de cómo el desplazamiento del tejido se arrastra para mantener la tensión de la membrana del pico. Sin embargo, se ha demostrado que la fluencia es insignificante para las valvas de la válvula del corazón en funcionamiento fisiológico3,20. En tercer lugar, en relajación de la tensión de prueba, el tejido es cargado a la tensión de la membrana del pico y el desplazamiento asociado se mantiene constante durante un período prolongado de tiempo3,21,22. En este tipo de pruebas, la tensión del tejido tiene una notable reducción de la tensión de la membrana del pico. Por último, en la prueba de fuerza controlado, los tejidos se cargan cíclicamente en diversos cocientes de la tensión de la membrana del pico en cada dirección17,23. Estas pruebas revelan anisotropía y respuesta tensión-deformación no lineal del material, y por la carga de los tejidos en diferentes proporciones, las deformaciones fisiológicas potenciales pueden ser entendidas mejor. Estas investigaciones recientes hacen evidente esa relajación de la tensión y protocolos controlados por fuerza ser más beneficiosos para realizar una caracterización mecánica de valvas de la válvula de corazón. A pesar de estos avances en la Caracterización biomecánica de la válvula de corazón, la prueba no se ha realizado bajo un unificado esquema de la prueba, y hay métodos limitados para investigar el acoplamiento entre direcciones.
El propósito de este método es facilitar una caracterización completa de material de las valvas del corazón por un esquema prueba mecánico biaxial unificado. Un esquema Unificado de prueba se considera como uno donde se prueba cada folleto bajo todos los protocolos de pruebas en una sola sesión. Esto es una ventaja, como tejido de propiedades son inherentemente variables entre los folíolos, por lo que una caracterización completa de cada folleto de la prueba más precisa como un descriptor que realizar cada protocolo independientemente en varios folletos. El esquema de pruebas consta de tres componentes principales, a saber, (i) un protocolo de pruebas biaxial de fuerza controlado, (ii) un protocolo de pruebas biaxial de desplazamiento controlado y (iii) un protocolo de pruebas de relajación de tensión biaxial. Todos los regímenes de prueba utilizan una velocidad de carga de 4.42 N/min., y 10 ciclos de carga y descarga para asegurar la tensión curvan replicabilidad por el ciclo (como en trabajos anteriores) 1023. Todos los protocolos se construyen también basado en la asunción de la tensión de la membrana, que requiere que el espesor sea inferior al 10% de la longitud de la muestra efectiva.
El protocolo controlado por fuerza utilizado en este método presentado consta de 10 carga y descarga de ciclos con tensiones de membrana máxima de 100 N/m y 75 N/m de la válvula mitral (VM) y tricúspide (TV), respectivamente de15,17. Cinco ratios de carga se consideran en este protocolo de pruebas controlado por fuerza, a saber: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 y 1:0. 5. Estos ratios de cinco carga ser útiles en la descripción de la tensiones y el correspondiente a todas las deformaciones fisiológicas potenciales del prospecto en vivo.
El protocolo de control de desplazamiento presentado en este método consiste en dos escenarios de deformación, es decir, () limitada (ii) puro corte y estiramiento uniaxial. En el estiramiento uniaxial con restricciones, una dirección del tejido es desplazada a la tensión de la membrana de pico mientras que la otra dirección de fijación. En la configuración de corte puro, el tejido es estirado en una dirección y juiciosamente acortado en la otra dirección, por lo que el área del tejido permanece constante bajo deformación. Cada uno de estos procedimientos de prueba controlados por desplazamiento se realiza para cada una de las direcciones de dos tejidos (direcciones radial y circunferenciales).
El protocolo de relajación de la tensión utilizado en el método presentado se logra cargando el tejido a la tensión pico de la membrana en ambas direcciones y el mantenimiento del tejido a los correspondientes desplazamientos durante 15 min monitorear el comportamiento de relajación de tensión del tejido. Los procedimientos experimentales se discuten a continuación.
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Protocol
Todos los métodos descritos fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Oklahoma. Todos los tejidos animales fueron adquiridos de un Estados Unidos Departamento de agricultura USDA aprobó matadero (país Inicio carne Co., Edmond, OK).
1. tejido adquisición y limpieza
- Recuperar los corazones animales el mismo día que el animal es sacrificado y guarde los corazones en un pecho de hielo para asegurar la frescura de tejido. Transporte los corazones en el espacio de laboratorio.
- A su llegada al laboratorio, sumerja el corazón en un cubo de tampón fosfato (PBS) una solución salina para aclarar apagado cualquier exceso de sangre. Recuperar un mantel, una cuchilla quirúrgica, fórceps, una cubeta con solución de PBS, el blanqueador y una bolsa de plástico. Preparar el mantel individual poniendo en el mostrador de disección, lo que permite una limpieza más fácil de desastre relacionados con la sangre. Después de que el corazón ha sido suficientemente aclarado, poner el corazón en el mantel individual (Figura 1a).
- Usando las pinzas, localizar la línea divisoria entre la aurícula y el ventrículo de cada lado del corazón. Cuidadosamente usando una cuchilla de afeitar, hacer una incisión a lo largo de esta línea divisoria y revelan las válvulas del corazón y los ventrículos (Figura 1b). Hacer la incisión a lo largo de toda la circunferencia externa del corazón, que pueden eliminarse todo corazón material superior a los ventrículos y las aurículas.
- Con las pinzas, saque con cuidado cualquier coágulos de sangre observados en los ventrículos (figura 1C). Si se realiza un intento retirar un coágulo de sangre pero no mueve, asegurar las cuerdas tendinosas o folletos no han sido agarrados. Coloque los coágulos de sangre en la bolsa de riesgo biológico para la eliminación de residuos.
- Cuando se han eliminado todos los coágulos de sangre de los ventrículos, enjuague el corazón una última vez en un balde con solución de PBS. Coloque el corazón limpio en la bolsa de plástico y almacenar en un congelador.
- Utilizando una solución de cloro 10% y 90% agua y mezcle la sangre con la solución de lejía y remover continuamente durante unos 10 minutos buscar un tratamiento blanqueador con éxito, indicado por la solución de transición del rojo al amarillo. Eliminar de la sangre tratada con lejía por drenaje.
PRECAUCIÓN: La lejía es una sustancia tóxica y puede ser dañino si ingerido.
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
2. disección y examen de la anatomía del corazón
- Recuperar el corazón previamente limpio y deje que se descongele en un baño de agua caliente. Los materiales de disección incluyen fórceps, láminas quirúrgicas, manteles, PBS y pequeños contenedores. El corazón está completamente descongelada, ponerlo en un mantel para absorber la sangre restante.
- Mantenga el corazón para una vista (superior) de arriba hacia abajo observar perfectamente las estructuras de la válvula. Comenzando con el MV en el lado izquierdo del corazón, utilice pinzas cuidadosamente manipular los folletos e identificar una comisura o línea divisoria, entre los prospectos.
- Hacer una incisión a lo largo de la comisura y corte cuidadosamente a través de la pared ventricular, asegurándose de no dañar los folletos. Puede ser necesario cortar los accesorios acordes durante este proceso para abrir completamente el ventrículo. Una vez hecha la incisión completa, abrir el ventrículo (Figura 2a).
- Identificar las valvas anteriores y posteriores de la MV y una cuchilla quirúrgica para cortar los accesorios acordes a los músculos papilares. Con unas pinzas, estirar los folletos tensados y realizar cortes para separar el anillo de los folletos. Colocar los folletos suprimidos en un recipiente debidamente etiquetado con solución de PBS y almacenar en un refrigerador a unos 4 º C.
- Mantenga el corazón para una vista de arriba hacia abajo e identifique la TV en el lado derecho del corazón. Localice las comisuras y haga una incisión a través de una de las comisuras y la pared ventricular (figura 2b).
- Identificar las valvas anteriores, posteriores y septales de la TV y realizar la extracción del folleto como en el paso 2.4. Colocar folletos todo obtenidos en un recipiente etiquetado llenado con solución de PBS y guardar el recipiente en el refrigerador a unos 4 º C.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Sin embargo, pruebas biomecánicas del tejido y el análisis de la histología subsecuente deben ocurrir dentro de 2 días de la disección de corazón.
3. disección del tejido
- Recuperar un folleto de la nevera, la cortadora de tejido para el tamaño especificado de seccionamiento, una pluma quirúrgica, pinzas, hojas de afeitar y una almohadilla de corte.
- Con unas pinzas, retire a la muestra de la solución de PBS y colocar sobre la almohadilla de corte con la dirección radial (R) alineado con la dirección Y y la dirección circunferencial (C) alineado con la dirección X (figura 3a). Del folleto de la región central se identifican como la sección de prueba.
- Alinee la herramienta de corte de tejido por lo que es la región de prueba de tejido deseada dentro de los límites de las cuchillas de la maquinilla de afeitar. Hacer un corte horizontal y otro vertical para formar una región cuadrada de las dimensiones deseadas (figura 3b). Usar el lápiz quirúrgico, etiqueta de dirección radial del tejido (figura 3b).
- Con la hoja de afeitar, ajuste cualquier accesorio acorde estirando las cuerdas desde el folleto con las pinzas y haciendo un corte cuidadoso sin causar ningún daño al prospecto.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si el protocolo está en pausa, guardar el tejido seccionado en un recipiente etiquetado llenado con solución de PBS y almacene el recipiente en un refrigerador a 4 ° C aproximadamente (como se explica en el paso 2.6). Sin embargo, pruebas de tejido deben ocurrir dentro de 2 días de la disección.
4. espesor medida y configuración probador biaxial
- Recuperar la muestra de tejido seccionado, calibradores digitales y una pequeña espátula de metal. Usando los calibradores digitales, mida y registre el espesor de la espátula de metal.
- Utilizando pinzas, coloque la muestra de tejido en la espátula de metal. Usando los calibradores de digitales, medir el grosor del par espátula-tejido (figura 3 c) en tres localidades diferentes del folleto. Reste el espesor de la espátula de cada medición y registrar el espesor promedio.
- Preparar un baño de PBS a 37 ° C, que corresponde a las condiciones fisiológicas del tejido.
5. tejido montaje y colocación de marcadores fiduciales
- Recuperar el fórceps, la muestra de tejido, hardware de montaje, una herramienta de punta fina, perlas de vidrio (con diámetros de 300 a 500 μm) y pegamento.
- Montar el tejido en el sistema de prueba biaxial (Figura 3de). Durante el montaje, asegúrese de que las direcciones radial y circunferencial del tejido están alineadas con la máquina X - y Y-direcciones.
- Para la colocación de marcadores fiduciales, coloque los granos de cristal en un recipiente abierto y una pequeña piscina de pegamento en otro recipiente. Con la herramienta de punta fina, cubra la punta con una pequeña cantidad de pegamento y pegar un grano individual hasta la punta de la herramienta.
- Cuidadosamente, utilice la herramienta para transferir el grano a una esquina del tercio medio de la región de prueba del tejido (figura 3f). Repita este paso hasta que una matriz cuadrada de cuatro granos es formado (figura 3 g).
Nota: Es fundamental que se evite el exceso de pegamento, y que los marcadores fiduciales no pegan como técnicas de correlación (DIC) de la imagen digital más adelante producirá resultados seguimiento inútil. Es importante que la matriz cuadrada debe ser en el tercio medio del tejido prueba región.
6. preacondicionamiento paso y el tiempo de duración
- Para calcular la tensión de la membrana adecuada, obtener pruebas longitud eficaz del tejido del borde y utilice la siguiente ecuación.
(1)
Nota: Aquí, T es la tensión de la membrana en una unidad de fuerza/longitud, f es la fuerza, y L es la longitud de prueba efectiva de la muestra. - Crear un protocolo de preacondicionamiento para que los tejidos se someterán a 10 ciclos de carga y descarga en las fuerzas asociadas con la tensión de la membrana de pico a una velocidad de carga de 4.42 N/min, incluyendo una carga de 2,5% de la fuerza máxima (figura 4).
- Crear un nuevo directorio prueba arbitrario para almacenar temporalmente los datos de preacondicionamiento, ya que no es necesario para los cálculos de futuro. Establecer una velocidad de carga de 4.42 N/min para las pruebas subsecuentes.
- Crear un nuevo conjunto de parámetros de la prueba y establecer el nombre del Protocolo como Preconditioning0 (figura 4a). Para los ejes X y, establecer el modo de control de la fuerza y la función de control de paso. Establecer la magnitud de la carga como la fuerza asociada a dirigido a tensión de la membrana del pico (cf. paso 6.1) (Figura 4b). Establecer la magnitud de carga como el 2,5% de la fuerza máxima para la primera repetición solamente (figura 4C). Establecer la duración del estiramiento y la recuperación duración tanto como 25 s. el número de repeticiones a ser 10 (Figura 4e).
- Cuando termina la etapa de preacondicionamiento, tome nota de la deformación del tejido en las direcciones X y Y. Preparar un protocolo para pasar a la muestra a la fuerza máxima, desde el tamaño registrado.
- Recuperar un cronómetro para propósitos de sincronización. Comenzar la fuerza máxima carga del protocolo y comenzar simultáneamente el cronómetro cuando la máquina de accionamiento (figura 5a). Parar el cronómetro cuando la actuación se detiene. Parada será evidente a través de señales auditivas.
- Registrar la deformación post-preacondicionamiento de tejido pico junto con el tiempo desde el cronómetro que representa tiempo de estiramiento óptimo del tejido (figura 5b).
(1)7. biaxial ensayos mecánicos
- Preparar un protocolo controlado por fuerza a una velocidad de carga de 4.42 N/min.
- Abra un nuevo directorio prueba y nombre de la prueba. Configurar los datos a guardar en una ubicación conocida para el uso en cálculos de tensiones más adelante. Retroceder al espécimen a la configuración original del montaje.
- Crear un conjunto de protocolo titulado FirstImage. Establecer el eje x y eje y en modo control a la fuerza y la función de control de paso. Establecer la magnitud de la carga en mN 0. Establecer la duración del estiramiento y la duración de recuperación cada a 1 segundo. Establece el número de repeticiones en 1. Establecer la frecuencia de salida de datos y la frecuencia de salida de imagen cada a 1 Hz.
- Construir un nuevo conjunto de pruebas, llamado PreconditioningA. Establecer los parámetros de prueba que los tejidos se someterán a 10 repeticiones de carga y descarga cíclica a la fuerza dirigida por la tensión de membrana deseado exactamente como fue preparada en el paso 6.2. Tenga en cuenta que ahora, la hora de estiramiento y recuperación deben ser el tiempo registrado en el paso 6.3.2. No hay imágenes se capturan en el A conjunto de pruebas y datos se capturan a 15 Hz.
- Construir otra prueba de conjunto, llamado PreconditioningB. Todos los parámetros de prueba deben ser idénticos a las mencionadas en el paso anterior, con la excepción eso frecuencia de salida de la imagen se encuentra a 15 Hz, y no se aplica precarga.
- Después del Protocolo de preacondicionamiento, crear protocolos de pruebas para que el tejido se carga a la tensión de la membrana de pico en las siguientes proporciones carga circunferencial radial a una velocidad de carga de 4.42 N/min: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 y 1:0.5 (figura 6 ). Recuperar datos de los dos últimos ciclos de cada relación de carga posterior procesamiento de datos y análisis que se describe en la sección 10. Consulte la tabla 1 para una descripción detallada de los protocolos que se establezcan.
- Preparar un protocolo de pruebas controlados por desplazamiento a una velocidad de carga de 4.42 N/min como sigue. (i) estiramiento Biaxial en la dirección X y la Y-dirección para los desplazamientos asociados a los tramos pico de circunferencial y radial, respectivamente (Figura 7a). (ii) puro del esquileo a lo largo de la dirección de X, que se extiende en la dirección X asociada con el estiramiento circunferencial de pico y acortamiento en la dirección Y, manteniendo la zona punteada constante bajo deformación (figura 7b). (iii) limitado estiramiento uniaxial en la dirección X (figura 7 c). (iv) pura del esquileo a lo largo de la dirección de Y (Figura 7d). (v) estiramiento uniaxial restringida a lo largo de la dirección de Y (figura 7e).
- Entre cada uno de estos pasos, construir un descanso "ciclo" de 1 min que sostiene el tejido en la configuración montada original. Recuperar datos de los dos últimos ciclos de cada relación de carga para el procesamiento de datos y análisis (sección 9). Consulte la tabla 2 para una descripción detallada de los protocolos que se establezcan.
- Preparar un protocolo de relajación de la tensión para que el tejido se carga en cada dirección, a una velocidad de carga de 4.42 N/min, para los desplazamientos asociados a las tensiones de membrana de pico (paso 7.2) y llevó a cabo en ese desplazamiento por 15 min (figura 8 y Figura 9). Después de 15 min, el protocolo debe ajustarse para recuperar el tejido a su configuración original del montaje.
Nota: En el caso de tejido rasgado, abortar la prueba inmediatamente para evitar cualquier daño potencial para el sistema de prueba biaxial.
8. fijación tejido para el análisis de la histología
- Desmontar el tejido del sistema prueba biaxial. Coloque el tejido en un recipiente con formol al 10% y luego coloque el recipiente en un ambiente refrigerado a aproximadamente 4 º C. Fijar el tejido por 24 – 48 h, dependiendo del grosor del tejido.
PRECAUCIÓN: La formalina es un conocido carcinógeno y si inhaló, un exceso puede causar pulmones para convertirse en fijo. Todo trabajo con formalina debe realizarse en una campana de humo con ventilación adecuada. - Después de que el tejido se ha fijado en formol durante 24 – 48 h, transferir el tejido a una solución de etanol de 80% para la histología posterior. El tejido debe ser almacenado en solución en un ambiente refrigerado a 4 ° C.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Una vez que los tejidos están fijados, los especímenes pueden analizarse en cualquier momento. Si el protocolo está en pausa, guardar el tejido en un recipiente rotulado con etanol al 80% y guardar el recipiente en un refrigerador a 4 ° C aproximadamente (como se explica en el paso 8.2). - Preparar el tejido para el análisis de la histología comercial según las instrucciones del proveedor. Si un cierto componente de folleto, como colágeno, elastina, glicosaminoglicanos, etc., es de interés del estudio, asegúrese de que la mancha correspondiente histología se emplea.
Nota: Diapositivas de histología pueden visualizarse con un microscopio para observar a los componentes deseados (figura 10). - Usando el programa ImageJ de procesamiento de imágenes, realizar métodos de deconvolución de color para determinar el porcentaje de cada componente de manchas en el tejido. Para más detalles sobre estos procedimientos, consulte Ruifrok y Johnston24.
9. biaxial prueba informática post-procedimientos
- Realizar seguimiento en DIC en los cuatro marcadores de referencia de las imágenes tomadas durante el mecánico biaxial pruebas (figura 11) para determinar las posiciones de tiempo dependiente de marcador.
(2)- Si se desea realizar el análisis con respecto a la configuración de montaje, sea X las posiciones del marcador del estado exhumó al principio de la prueba biaxial. Si se desea realizar el análisis con respecto a la deformación post-preacondicionamiento, sea X las posiciones de marcador al final del Protocolo de preacondicionamiento.
Nota: Los pasos posteriores se realizará de la misma manera, independientemente de la configuración de referencia elegida.
Nota: Aquí, X y x son respectivamente las posiciones de los marcadores, exhumó y deformadas, y d es el vector de desplazamiento de cada marcador.
- Si se desea realizar el análisis con respecto a la configuración de montaje, sea X las posiciones del marcador del estado exhumó al principio de la prueba biaxial. Si se desea realizar el análisis con respecto a la deformación post-preacondicionamiento, sea X las posiciones de marcador al final del Protocolo de preacondicionamiento.
- Calcular el gradiente de deformación (F) de los marcadores fiduciales mediante elementos finitos bilineal de cuatro nodos2,23,25.
(3)
Nota: Aquí, BxIy ByIson los derivados de función de forma de elementos finitos en las X y Y-direcciones de nodo, respectivamente y u(t) y () v t) es el función del tiempo X - y Y-desplazamientos, respectivamente, determinados previamente en el paso 9.1. Tenga en cuenta que las coordenadas X y Y están alineadas con las direcciones radial y circunferencial del tejido. - Para calcular el derecho tensor deformación de Green-Cauchy (C) y el tensor de tensión verde (E).
(4)
Nota: Aquí, I es el tensor identidad de segundo orden. Determinar que la circunferencial y radial se extiende tomando las raíces cuadradas de los valores de principio de C. - Determinar el tensor de tensión (1-PK) de Piola-Kirchhoff primera (P).
(5)
Nota: Aquí, t es el espesor del espécimen, y TC y TR las tensiones de membrana aplicada en las direcciones radial y circunferenciales, respectivamente. - También, calcular otros tensores de estrés, tales como el tensor tensión de Cauchy (σ) y el tensor de tensión (2-PK) de Piola-Kirchoff segundo (S).
(6)
Nota: Aquí, J es el jacobiano del tensor gradiente de deformación F.
(2)
(3)
(4)
(5)
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Representative Results
Datos de estrés-estiramiento de la controlada fuerza biaxial ensayos mecánicos revelan una curva no lineal con cierto parecido a una curva exponencial (figura 12). Con respecto a la respuesta en cada dirección principal, el comportamiento material es transversalmente isotrópico, con el tramo radial mayor que la deformación circunferencial. En algunos casos, las direcciones de la anisotropía pueden flip, con la dirección circunferencial, exhibiendo una mayor conformidad de la dirección radial. Se observa esta respuesta volteada en la TV más que en el MV.
De pruebas de control de desplazamiento, estiramiento estrés datos sigue una respuesta no lineal para la principal dirección sometidos a tensión (cizalla pura, restringida uniaxial [figura 13]). Cuando el tejido se acorta en la otra dirección principal, se observa una "tensión (compresiva) negativa". En el protocolo de tensión uniaxial con restricciones, también se exhibe una respuesta de estrés-tramo creciente en el sentido restringido, demostrando el acoplamiento del estiramiento aplicado en la otra dirección principal.
De ensayos de relajación de la tensión, normalizó membrana tensión datos sigue una curva decadente no lineal (figura 14a, b). La MV y TV folleto tejidos exhiben una mayor reducción de tensión en la dirección radial comparada con en la dirección circunferencial.
Resultados histológicos representativos del prospecto anterior de la válvula mitral (MVAL) y la válvula tricúspide prospecto anterior (TVAL) tejidos con Masson de trichrome se presentan en la figura 10. Tricrómico de Masson muestra los componentes típicos encontrados en las válvulas auriculoventricular del corazón, como las fibras de colágeno (azul) y células intersticiales valvulares (citoplasma rojo y núcleo negro). Otras manchas pueden utilizarse para visualizar a los componentes como elastina (tinción de Verhoeff-van Gieson) y glicosaminoglicanos (mancha azul de Alcian).
Figura 1: fotos experimentales de corazón porcino Obtenido de un matadero local. (a) A todo corazón es aclarado de la sangre con solución de PBS. (b) un corte se hace entre las aurículas y los ventrículos para revelar las válvulas mitrales y tricúspides. coágulos de sangre (c) entonces se quitan del corazón antes del almacenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: fotos experimentales del abierto corazón porcino revela los cinco auriculoventriculares del corazón valvas y otros componentes de los aparatos de válvula. (un) prospectos de la válvula mitral con la disección del corazón izquierdo a lo largo de la comisura entre los dos, mostrando el folleto anterior (MVAL) y prospecto posterior (MVPL) y (b) la válvula tricúspide con una disección similar en el lado derecho de el corazón, revelando el prospecto anterior (TVAL), prospecto posterior (TVPL) y el prospecto septal (TVSL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: fotos experimentales del prospecto suprimido para ensayos mecánicos biaxial. Prueba de folleto de válvula de corazón requiere (a) el folleto a granel a ser seccionado en (b) un 10 x 10 mm región de prueba (dirección radial por marcadores de pluma quirúrgica). (c) el folleto de grosor se mide. Las muestras se montan en (d) el biaxial sistema de prueba (e) perforación del tejido con púas de metal. Después del montaje, marcadores fiduciales (f) se pegan sobre la superficie del tejido antes de (g) inmersión en solución de PBS a 37 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ejemplo de parámetros de protocolo para la prueba de preacondicionamiento de un prospecto anterior de la válvula mitral de un 7,5 mm x 7,5 mm prueba región. El protocolo de preacondicionamiento se crea estableciendo (a) el protocolo de nombre, (b) la prueba modo de control y fuerza en el eje x, las condiciones (c) la precarga, (d) el eje y los parámetros a ser la misma que en el eje x, y (e. ) los parámetros de ciclo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: ejemplo de parámetros de protocolo para el paso del tiempo para un prospecto anterior de la válvula mitral de un 7,5 mm x 7,5 mm prueba región. El paso del tiempo requiere (a) hacia el tejido de la deformación post-preacondicionamiento el pico membrana tensión (y la correspondiente deformación pico) mientras simultáneamente a partir de un cronómetro para registrar el tiempo de estiramiento. Cuando se alcanza la fuerza del destino, (b) la deformación post-preacondicionamiento se registra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: esquema de la fuerza biaxial prueba procedimiento controlado para pruebas mitral y las valvas de la válvula tricúspide. El protocolo de pruebas consiste en un cargamento de equibiaxial preacondicionamiento paso para ejercitar el tejido a su estado in vivo, seguido por diferentes proporciones de carga de la tensión de la membrana del pico en cada dirección del tejido (Tx:Ty): 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 y 1:0. 5. Cada subdivisión de lo protocolo de pruebas controlados por la fuerza se realiza en 10 ciclos de carga y descarga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: esquema del desplazamiento controlado biaxial procedimiento de prueba para la prueba mitral y las valvas de la válvula tricúspide. El protocolo de pruebas consiste en (a) desplazamientos biaxiales asociados con las tensiones de membrana de pico, corte puro (b) en la dirección X, (c) limitado desplazamiento uniaxial en la dirección X, cizalla pura (d) en el Dirección Y y (e) habían limitado desplazamiento uniaxial en la dirección Y. Cada subdivisión de lo protocolo de pruebas controlados por desplazamiento se realiza en 10 ciclos de carga y descarga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: ejemplo parámetros pruebas de relajación de la tensión para un prospecto anterior de la válvula mitral con una región prueba eficaz de 7,5 mm x 7,5 mm. Pruebas de parámetros establecidos para la relajación de la tensión de prueba para un prospecto anterior de la válvula mitral donde específica el desplazamiento es la deformación del tejido del pico específica a este tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: esquema de los 15 min relajación de la tensión procedimiento de prueba para la prueba mitral y las valvas de la válvula tricúspide. El protocolo de pruebas implica sostener desplazamientos biaxiales asociados con las tensiones de membrana de pico durante 15 min, después de que el tejido vuelve a la configuración de montaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: datos histológicos ejemplo de folletos anterior las válvulas atrioventricular corazón. Imágenes de histología representativa de (un) la válvula mitral anterior folleto y (b) el prospecto posterior de la válvula tricúspide. Ambos son teñidas con Tricrómico de Masson: colágeno en azul, citoplasma y queratina en rojo y núcleo negro. La barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: imágenes representativas que ilustran el seguimiento de las coordenadas de cuatro marcadores de referencia durante la prueba mecánica biaxial usando datos de unas imagen técnica de correlación (DIC). (a) el tejido configuración de montaje. (b) la configuración después del paso de preacondicionamiento. (c) la configuración deformada asociados con la muestra de tejido bajo carga mecánica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: datos representativos de los protocolos de control de fuerza para el prospecto anterior de la válvula mitral (MVAL). Datos representativos demuestran la anisotropía del material y la respuesta no lineal de la tensión de los tejidos bajo carga biaxial en diferentes proporciones de carga de tensión de la membrana del pico en cada dirección del tejido (Tx:Ty): (a) 1:1, (b) 0.75:1, (c) 1:0.75, 0.5:1 (d) y (e) 1:0. 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13: datos representativos de los protocolos de control de desplazamiento para el prospecto anterior de la válvula mitral (MVAL). Datos representativos demuestran la anisotropía del material y la respuesta no lineal de la tensión de los tejidos en (a) desplazamientos biaxial asociado con las tensiones de membrana de pico, corte puro (b) en la dirección X, (c) había restringido desplazamiento uniaxial en la dirección X, cizalla pura (d) en la dirección de Y, y (e) limitado desplazamiento uniaxial en la dirección Y. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14: datos representativos de los protocolos de relajación de la tensión de la mitral y tricúspide válvula folletos anteriores. Datos representativos para (un) el MVAL y (b) lo TVAL, ilustrando la reducción de la tensión exponencial con el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del conjunto de | Eje x | Eje y | Tramo (s) | Retención (s) | Recuperar la (s) | Resto (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Representantes de | Datos (Hz) | Imagen (Hz) | |
| FirstImage | Paso 0.0 (mN) | Paso 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (primera) | 0.0 (primera) | 1 | 1 | 1 | |
| PreconditioningA | Paso F (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (primero) | 0.025*F (primero) | 8 | 15 | 0 | |
| PreconditioningB | Paso F (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 | |
| 1:1A | Paso F (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 | |
| 1:1B | Paso F (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 | |
| 0.75:1A | Paso (0.75*F) (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 | |
| 0.75:1B | Paso (0.75*F) (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.75A | Paso F (mN) | Paso (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.75B | Paso F (mN) | Paso (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 | |
| 0.5:1A | Paso (0.5*F) (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 | |
| 0.5:1B | Paso (0.5*F) (mN) | Paso F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.5A | Paso F (mN) | Paso (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.5B | Paso F (mN) | Paso (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 | |
Tabla 1: completo prueba de parámetros para todos los protocolos del plan de pruebas controlado por fuerza. Fuerzas (en millinewtons) se escriben como F para representar la fuerza asociada a la tensión de membrana específicos pico. Tiempo de estiramiento se escribe t para representar el estiramiento tiempo (en segundos) específico para el tejido sometido a prueba.
| Eje x | Eje y | Tramo (s) | Retención (s) | Recuperar la (s) | Resto (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Representantes de | Datos (Hz) | Imagen (Hz) |
| Paso 0.0 (mN) | Paso 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (primera) | 0.0 (primera) | 1 | 1 | 1 |
| Rampa dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (primero) | 0.025*F (primero) | 10 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 |
| Rampa de 0.0 (%) | Rampa de 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ninguno | Ninguno | 1 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 |
| Rampa de 0.0 (%) | Rampa de 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ninguno | Ninguno | 1 | 15 | 0 |
| Rampa 1 /dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 |
| Rampa 1 /dx (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 |
| Rampa de 0.0 (%) | Rampa de 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ninguno | Ninguno | 1 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa de 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 |
| Rampa dx (%) | Rampa de 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 |
| Rampa de 0.0 (%) | Rampa de 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ninguno | Ninguno | 1 | 15 | 0 |
| Rampa de 0.0 (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 10 | 15 | 0 |
| Rampa de 0.0 (%) | Rampa dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ninguno | Ninguno | 2 | 15 | 15 |
Tabla 2: prueba completa de parámetros para todos los protocolos del plan de pruebas controlados por desplazamiento. Desplazamientos (en porcentajes) se escriben como dx y dy a representan el pico post preacondicionamiento porcentaje de alargamiento en las direcciones X y Y, respectivamente. Tiempo de estiramiento se escribe t para representar el estiramiento tiempo (en segundos) específico para el tejido sometido a prueba. Abreviaturas: PS = esfuerzo cortante puro; CU = limitada uniaxial.
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Discussion
Pasos críticos para esta prueba mecánica biaxial incluyen (i) la orientación correcta del folleto de configuración probador biaxial (ii) adecuada para corte insignificante y (iii) una cuidadosa aplicación de los marcadores fiduciales. La orientación de la hoja es fundamental para la caracterización mecánica obtenida de tejido de las valvas como el material es anisotrópico en la naturaleza. Así, las direcciones radial y circunferenciales necesitan conocerse para alinear correctamente las muestras de tejido con la prueba X - y Y-direcciones. También es esencial que el probador biaxial es calibrado correctamente para que la muestra se monta en el sistema con insignificante esfuerzo cortante introducido. Si se observa una cantidad no despreciable de cizalla, los resultados pueden ser sesgados grandemente en los cálculos de tensión y el estrés posterior tejido. Especial atención se requiere para la aplicación de los cuatro marcadores fiduciales para garantizar que ninguno de los marcadores se pegue a los demás para evitar cálculos inexactos de las cepas de tejido. Con respecto a los cálculos de tensión de tejido, los lectores interesados se refieren a los procedimientos detallados en anteriores estudios2,23,25.
Algunas modificaciones que podrían introducirse a los protocolos actuales incluyen agregar grado de deformación y fluencia de prueba en el marco de la prueba. Estas pruebas permiten conocer propiedades viscoelásticas diferentes del folleto de (AHV) de la válvula aórtica del corazón, pero se ha demostrado en la literatura anterior que el grado de deformación y fluencia son insignificantes para tejidos de prospecto de la válvula de corazón bajo fisiológicamente condiciones de funcionamiento.
Limitaciones de este método incluyen el potencial para la introducción de la corte en los casos de alineación plana incorrecta de la muestra y pegan marcadores fiduciales que invalidan los datos, como ya mencionado. Otras limitaciones de este método incluyen el uso de puntas para muestra de montaje, como la muestra sólo es controlada por cinco puntos en cada borde, en lugar de una completa sujeción a control muestra bordes. El uso de puntas sobre métodos de fijación provoca problemas con protocolos de ensayos uniaxiales que tines pueden permitir deformaciones pequeñas a pesar de la dislocación del diente-final sujeto al sistema de prueba biaxial siendo constante. Sin embargo, esta deformación de movimiento de cada diente puede presumirse insignificante.
Este método es significativo en sus ventajas respecto a otros métodos porque todos los protocolos de prueba (fuerza controlada, control de desplazamiento y relajación de la tensión) se realizan en una muestra de tejido unificado. Alternativas a la metodología presentada sólo pueden realizar un protocolo de pruebas para cada tejido, en lugar de tres combinan con protocolos de pruebas. Esto implica que esas alternativas no pueden ser tan precisas en su descripción de comportamientos del tejido, como propiedades del tejido pueden variar significativamente entre tejidos de diferentes sujetos animales.
Este método se puede extender por aplicación de otros materiales además de valvas de la válvula auriculoventricular del corazón. Por ejemplo, estos métodos pueden ser útiles en la caracterización de otros tejidos blandos, o materiales de polímeros y caucho-tipo. Proporcionado esquema proporcionaría para la caracterización completa de tales materiales compatibles con un dispositivo de prueba biaxial, siempre y cuando que haya una configuración adecuada, tal como una célula de carga adecuada capacidad y tamaño de muestra.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el americano corazón Asociación científico desarrollo Grant 16SDG27760143. Los autores también desean reconocer la beca de investigación en apoyo de la oficina de pregrado investigación de la Universidad de Oklahoma para apoyar Colton Ross y Devin Laurence.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Bufffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope | AmScope | SKU: T120C | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5N Load Cell Capacity | |
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2018b | |
| Phosphate-Buffered Saline | n/a | Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures |
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