Summary
Klinisk översättning av exovissa härledda bio markörer för sjuka och maligna celler hindras av bristen på snabba och noggranna kvantifieringsmetoder. Denna rapport beskriver användningen av mörka fält bilder med låg förstoring för att kvantifiera specifika exovissa subtyper i små volym serum-eller plasmaprover.
Abstract
Infekterade eller maligna celler utsöndrar ofta mer exosomer, vilket leder till förhöjda nivåer av sjukdomsassocierade exosomer i cirkulationen. Dessa exosomer har potential att fungera som bio markörer för sjukdoms diagnos och för att övervaka sjukdomsprogression och behandlings svar. Men de flesta exosome analys förfaranden kräver exosome isolering och renings steg, som vanligt vis är tids krävande och arbets intensiva, och därmed av begränsad nytta i kliniska miljöer. Denna rapport beskriver ett snabbt förfarande för att analysera specifika bio markörer på exosomer yttre membran utan att kräva separata isolerings-och renings steg. Med denna metod fångas exosomer på ytan av en bild av exospecifika anti kroppar och hybridiseras sedan med nanopartikelkonjugerade anti kropps prober som är specifika för en sjukdom. Efter hybridisering, är överflödet av målet exosome befolkningen bestäms genom att analysera låg förstoring mörkt fält Mikroskop (LMDFM) bilder av de bundna nanopartiklarna. Detta tillvägagångs sätt kan lätt antas för forskning och klinisk användning för att analysera membran-associerade exosome bio markörer kopplade till sjukdomen.
Introduction
Exosomer frigörs från de flesta cell typer och spelar en nyckel roll i cell-till-cell kommunikation, inklusive patofysiologiska processer i samband med olika sjukdomar, eftersom de kan vara hem för specifika vävnader eller cell typer, och innehåller en mängd olika nukleinsyror , proteiner och lipider som återspeglar deras ursprungs cell och kan utöva reglerande effekter på mottagar cellerna1,2,3,4. Exosomer utsöndras ofta vid förhöjda nivåer i sjukdoms tillstånd, kan interagera med både angränsande och avlägsna celler, och finns på relativt hög koncentration i cirkulationen samt de flesta andra kropps vätskor, inklusive saliv, urin, buk spott körtel och galla juice och bronkoalveolär lavagevätska5,6,7,8,9,10,11. Detta överflöd och stabilitet av exosomer i mänskliga kropps vätskor, tillsammans med deras informations rika natur, gör dem idealiska bio markörer för sjukdoms diagnos och behandling övervakning.
Detta inkluderar tumörhärledda exosomer (TDEs), som innehåller tumörspecifika eller selektiva faktorer, som kan fungera som sjukdoms bio markörer, inklusive tumörassocierade muterade alleler. TDEs kan delta i ombyggnad av tumören mikromiljö för att under lätta tumör utveckling och metastaser, och reglera anti-tumör svar12. Ökad TDE sekretion är en vanlig fenotyp av de flesta cancer former och flera funktioner i tumören mikromiljö, inklusive hypoxi, sura pH, och inflammation, är kända för att främja exosome sekretion. Överraskande, med tanke på antalet celler som utsöndrar exosomer, en ökning av den totala exosome nivån kan, i sig, fungera som en cancer bio markör. Till exempel, en nyligen studie fann att den totala EV koncentrationen i galla juice diskriminerar maligna och nonmaligna i vanliga Gall kanalen stenos patienter med 100% noggrannhet7. Liknande resultat har hittats med studier med andra kropps vätskor, inklusive plasma. På grund av risken för att ämnet variationerna, och andra faktorer som är störande, har dock de flesta studier som undersöker exosomer som sjukdoms bio markörer fokuserat på detektion av bio markörer som är selektivt förknippade med TDEs istället för total exosome Nummer.
Att översätta exovissa bio markörer till klinisk praxis är dock fortfarande utmanande eftersom de flesta rapporterade exovissa analys metoder kräver tids krävande och arbets intensiva isolerings procedurer 13. För närvarande är populära exosome isolerings metoder inkluderar ultracentrifugation, densitet gradienter, storlek-uteslutning, samfällning, affinitet fånga, och mikroflödessystem isolering metoder. Ultracentrifugation är "Gold Standard"-metoden, och används oftast för exovissa isoleringar, men denna procedur är tids krävande och resulterar i exosome skador och exosome membran klustring, och producerar exovissa prover som är förorenade med proteiner, lipoproteiner och andra faktorer som kan påverka efterföljande analyser14. De flesta exovissa isolerings metoder, inklusive ultracentrifugation, kan inte separera exosomer (30 – 150 nm) från mikrovesikler (100 – 1000 Nm) och apoptotiska kroppar (100 – 5000 Nm), som uppstår genom olika mekanismer och har olika funktioner, på grund av storleken överlappar varandra mellan dessa grupper och mångfalden av exovissa populationer15. Nya metoder behövs för att förbättra känsligheten och reproducerbarheten av exovissa analyser genom att förbättra exoviss återhämtning samtidigt minska exosome skador och kontaminering, även om alla analyser baserade på sådana metoder kommer också att behöva optimeras för att göra dem lämplig för översättning till tillämpningar i kliniska miljöer.
Flera nyligen genomförda studier har föreslagit att använda integrerade plattformar för att fånga och analysera exosomer direkt från kropps vätskor. Dessa metoder använder microfluidic, elektrokinetiska, affinitet fånga, och olika andra metoder för exosome isolering, och elektrokemi, yta Plasmon resonans, och andra metoder för att upptäcka fångade exosomer. Det är inte klart hur genomförbart många av dessa metoder kommer att vara i kliniska miljöer, på grund av deras komplexitet, bekostnad, låg genom strömning eller andra frågor.
Vi har utvecklat en snabb och billig analys som kan användas för känslig och specifik kvantifiering av totala exosomer och specifika exovissa subtyper, inklusive sjukdomsassocierade exosomer, såsom TDEs, som kräver endast en liten mängd prov och som använder ett effektiviserat arbets flöde som lämpar sig för kliniska miljöer. I denna analys är en bild belagd med anti kroppar som binder antingen en exospecifik eller sjukdomsspecifik markör som uttrycks på exoytan för att direkt fånga upp mål exosomer i små plasma-eller serumprover som appliceras på brunnar på Bild. Fångade exosomer är sedan hybridiseras med en anti kropp-konjugerad Nanopartikel som erkänner bio markör av intresse på dessa exosomer, som kan vara antingen en allmän exosome markör eller en faktor som är specifik för en exosome subtyp av intresse. Bilder av dessa prov brunnar fångas sedan med hjälp av ett mörkt fält Mikroskop (dfm) och analyseras för att mäta ljuset som sprids från nanopartiklar bundna till exosomer av intresse fångas i varje prov väl6,16,17. Framför allt, Imaging ett helt prov väl genom låg förstoring DFM (LMDFM) undviker en markering bias påträffas med hög förstoring DFM analyser när användare måste direkt välja vilka fält att fånga för efterföljande bild analys. LMDFM bild analys är föremål för ljus spridning artefakter från ytan oegentligheter, inklusive repor och prov skräp, men denna bakgrund kan reduceras med hjälp av en enkel brus reducering algoritm vi utvecklat för att köra på NIH bild analys program, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Den här algoritmen gäller först en ingång kon tur tröskel som används för att identifiera gränserna för provet väl att definiera området för bilden för efterföljande analys. Regionen som definieras av denna konturen regionen delas sedan till separat signal som finns i de röda, blå och gröna kanalerna i bilden och den blå kanalen dras från den röda kanalen för att ta bort signalen från ytan artefakter och ojämn belysning från nanorod Signal.
Denna artikel beskriver hur du använder denna analys för att snabbt kvantifiera antingen totala eller specifika exosome nivåer i plasma eller serum prover.
Protocol
1. beredning av nanopartikelprober
Anmärkning: denna analys använder Functionalized Gold nanorods (AuNRs; 25 nm diameter x 71 nm längd) som är kovalent konjugerade med neutravidin polymerer (AV) och har en yta Plasmon resonans topp som ger en röd (641 nm topp) spridnings signal på DFM Belysning.
- Tvätta 40 μL av AuNR-AV (2,56 x 1011 partiklar) tre gånger med 200 μl PBS (pH 7,0) genom centrifugering och aspiration (8 500 x g vid 4 ° c i 10 minuter), följt av en slutlig centrifugering och Aspirationssteg VAREFTER aunr-av-pelleten är upphängd i 40 μL PBS.
- Blanda denna AuNR-AV-SUS pension med 10 μL biotinylated anti kropp (0,5 mg/mL) specifikt för ett antigen på ytan av exosome subtyp av intresse och 150 μL PBS och blanda sedan vid 4 ° c för 2 h med hjälp av en mixer för att tillåta neutravidin-biotin bindning att nå fullbordan.
- Tvätta de resulterande anti kropps-konjugerade AuNRs (AuNR-IgG) tre gånger genom centrifugering och aspiration (6 500 x g vid 4 ° c i 10 minuter), och sedan suspendera dem i 200 μl PBS och förvara dem vid 4 ° c till användning.
Obs: steril teknik och korta förvarings tider måste användas för att undvika kontaminering och nedbrytning av AuNR-IgG. Det är bäst att använda anti kropp-konjugerade AuNRs inom 24 timmar efter deras konjugering.
2. beredning av EV fånga dia bilder
- Späd ut utvalda exovissa anti kroppar mot 0,025 mg/mL i PBS och tillsätt 1 μL/brunn av denna spädning på en multi-well protein A/G-bild, och inkubera sedan denna glidning vid 37 ° c i 1 h i en fuktad kammare för att möjliggöra avskiljning av anti kroppar mot protein A/G immobiliserat på i bilden.
- Aspirera brunnar för att avlägsna obundna anti kroppar och Tvätta brunnarna tre gånger genom tillsats och aspiration av 1 μL/brunn av PBS, och lasta sedan varje brunn med 1 μL blockeringsbuffert (se material tabell) och inkubera glaset i 2 h vid 37 ° c i en fuktad kammare till b att låsa eventuella kvarvarande proteinbindnings ställen.
- Aspirera brunnar för att avlägsna blockerande buffert, tvätta brunnar tre gånger genom tillsats och aspiration av 1 μL/brunn av PBS, och omedelbart använda de blockerade dia bilder för exosome fånga och analys.
3. förberedelse av standard kurva
- För att exakt kvantifiera den absoluta eller relativa förekomsten av en viss exosome subtyp, måste användaren generera en standard kurva med en ren exoviss population som enhetligt uttrycker exosome yta bio markör av intresse. Denna studie analyserar överflöd av exosomer uttrycker en metastasis-associerade membran protein, ephrin a2-receptorn, som har en rapporterad relation med pankreascancer skede och prognos6,18.
Obs: den mänskliga pankreascancer cellinjen PANC-1 och dess exosomer är kända för att uttrycka detta protein och isolerade exosomer från denna cellinjen användes för att generera en standard kurva för att kvantifiera antalet exosomer som uttrycker detta protein i komplexa exosome Prover. - Kultur celler för 48 timmar vid 37 ° c i serum fria odlings medier för att tillåta exoviss ackumulering i media, isolera sedan cell kulturens supernatanter genom centrifugering av SUS pensions kulturer eller direkt aspiration av odlings medier från anhängare cell kulturer.
- Centrifugera de insamlade medierna på 2000 x g i 30 min för att ta bort skräp och återvinna supernatanten.
- Filtrera den klargjorda kultur supernatanten genom en 0,45 μm låg proteinbindnings filter enhet med lämplig kapacitet (t. ex. en 250 mL polyetersulfon vakuum filtrerings enhet).
- Koncentrera det resulterande filtratet genom centrifugering vid 3200 x g med en 100 000 nominell molekyl vikt gräns filter system till en 250 μl slutlig volym. Samla in den lagrade volymen från filtret och tvätta sedan filtret med 200 μL PBS, och kombinera denna tvätt volym med den insamlade exovissa prov volymen.
- Centrifugera provet vid 21 000 x g i 45 minuter och återhämta försiktigt supernatanten och var noga med att inte samla upp något utfällt material.
- Centrifugera den återvunna supernatanten vid 100 000 x g i 3 timmar för att utlösa exosomer. Aspirera bort supernatanten och samla in exolite pellet i 100 μL PBS.
- Förvara de resulterande exovissa SUS pensionerna vid 4 ° c om de används inom 24 timmar eller vid-80 ° c för långtids förvaring.
Märk: Använd inte exovissa prover för att upprepa frys-tö cykler. - Kvantifiera en alikvot av exoviss SUS pension efter blandning genom direkt mätning av exovissa tal (t. ex. genom analys av Nanopartikel-spårning eller avstämd resistiv puls avkänning eller genom att mäta protein koncentrationen av exovissa lysater med mikro-bicinchoninic syra analys, eller en likvärdig metod, som ett medel för att approximera exoviss mängd)16,19.
- Generera en uppsättning av seriella utspädningar av exosome SUS pensionen för att möjliggöra jämförelse av Nanopartikel signal att mata in exosome antal eller protein innehåll.
- Överför 1 μL av varje exostandard till var och en av dess replikat brunnar på analys plattan.
Anmärkning: standard kurvor kan användas för att beräkna lutningen på korrelations linjen mellan nanopartikelsignal och exoviss koncentration till (1) utvärdera analysens prestanda och (2) bestämma den relativa koncentrationen av målexosomer i experimentella prover.
4. bearbetning av humana plasma-eller serumprover
- Samla in plasma-eller serumprover med standard metoder och förvara vid-80 ° c tills det behövs för exoviss analys. Snabbt Tina prover i en rums temperatur vatten bad. Upprepade gånger blanda de tinade proverna genom inversion för att främja homogen SUS pension.
Anmärkning: resultat från serum-och plasmaprover kan inte vara likvärdiga, eftersom det finns en signifikant frisättning av exosomer under Koagulations reaktionen. - Centrifugera plasma-eller serumprover vid 500 x g i 15 minuter för att utlösa protein aggregat och annat skräp. Överför en alikvot av plasma-eller serum provet till ett nytt rör och tillsätt PBS för att generera en 1:1 utspädning. Blanda det utspädda provet med mild vortexa eller inversion, i förekommande fall. Överför 1 μL av varje plasma eller serum SUS pension till var och en av dess replikat brunnar på analys plattan.
5. exoviss avskiljning och detektering
- Fyll på brunnar i en blockerad EV-infångstbild med 1 μL/brunn av exovissa prov, med 8 replikat per prov, och inkubera glaset över natten vid 4 ° c i en befuktad kammare. Aspirera alla provbrunnar och tillsätt sedan 1 μL/brunn av PBS för att tvätta brunnar och avlägsna obundna exosomer och andra föroreningar från det laddade exovissa provet.
- Fyll på prov brunnar med 1 μL/brunn av en tidigare beredd AuNR-IgG-SUS pension (se avsnitt 1 ovan) och inkubera bilden i 2 h vid 37 ° c i en befuktad kammare. Aspirera nanopartikeln lösningen och tvätta bilden i PBS kompletteras med 0,01% Tween-20 (PBST) för 10 min med en mixer, sedan aspirera och tvätta alla prover brunnar med avjoniserat vatten i 10 min med hjälp av en roterande mixer, och lufttorka för efterföljande LMDFM bilder.
Anmärkning: variationskoefficienterna för Inter-assay (CVs) bedöms från åtta replikat av samma prov. Prover som uppvisar CVs > 20% betraktas som icke-informativa och bör upprepas om det finns tillräckligt med prov.
6. DFM bild insamling
- Fånga bilder för exoviss kvantifiering under konsekvent belysning med hjälp av en digitalkamera ansluten till ett Mikroskop utrustat med en mörk-fältet kondensor (1,2 < NA < 1,4) och en 4x mål som sysselsätter en 1/220 s exponerings tid.
- Öppna bild insamlings programmet.
Obs: vi använder NIS-Elements Mikroskop avbildnings program (se material tabell) för det protokoll som beskrivs nedan, men det är möjligt att använda en annan program vara som kan matcha dess bild fångst parametrar. NIS-Elements Viewer Imaging program vara är ett gratis fristående program för att visa bildfiler och data uppsättningar som innehåller analys, visualisering och arkivering verktyg. Parametrarna nedan är också för ett Mikroskop med autofokus och en automatiserad fas som tillåter flera bilder att automatiskt fångas och sys till en enda bild. - Placera bilden upp och ned på Mikroskop stadiet, justera bild positionen och applicera en liten droppe nedsänkning olja på bak sidan av bilden, där kondensor linsen kontakter bilden.
- Klicka på Live -knappen i mjukvaru gränssnittet, och justera exponerings tiden mot en hög koncentration standard väl för att säkerställa att bilden inte är mättad.
- Öppna fönstret Skanna stor bild från fliken Hämta och ange parametrar för program varu gränssnitt enligt följande: Macro bild optisk conf = ström; Mål: 2:10x, scanning optisk conf = nuvarande, mål: 2:10x; Sömmar överlappning = 20%; Sömnad via = optimal Path.
- Välj skapa stor bild, Stäng aktiv slutare under scenens rörelse, vänta innan varje bild tagning: 20 MS, fokusera manuellt vid startoch Använd steg-för-steg-fokus varje 20 fält. Dessa inställningar kommer att sparas med de skannade bilderna.
- Flytta Mikroskop scenen för att definiera den vänstra övre högra nedre gränsen för mål skannings fältet. Justera fokus för att uppnå en tydlig bild på bildskärmen och justera kondensor inställningar och miljö belysning som behövs för att minimera eventuella avvikelser belysning i den fokuserade bilden.
- Namnge bild utdatafilen i program varan. Klicka på skannings knappen och låt Mikroskop för att skanna och skapa och spara en sydda bild av hela bilden.
- Öppna den sparade bilden med den bild fångst program vara du använder och spara den på 1/8 skala för efterföljande analys på DSM plugin i ImageJ.
7. DFM bild analys
- Hämta ImageJ-programmet (https://imagej.nih.gov/ij/). Installera DSM-algoritmen plugin i ImageJ med hjälp av instruktionerna som anges på https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
- Öppna program varan ImageJ och ställ sedan in följande indataparametrar inom DSM-algoritmen: kon tur tröskel (CT) = 253,020, typ = röd, mittskala (er) = 0,8, låg (lt)/hög (HT) kvantifieringsgräns = 0/62.
- Öppna den sparade bilden från avsnitt 6,8 med ImageJ. Välj DSM Scan -knappen från fliken plugins och definiera sedan antalet kolumner och rader enligt den öppnade bilden. Programmet kan känna igen upptäcka områden och analys scatter intensitet Nanopartikel i enlighet områden automatiskt. Ställ in följande indataparametrar i DSM Scan window : ändra storlek = 25, Spot diameter (i pixlar) = 190 – 200, diameter område = 32, ökning diameter (i pixlar) = 8, DSM konfiguration-låg Limit = 0, hög gräns = 62, angränsande avstånd = 100, subtrahera bias = 0.
Anmärkning: resultaten av scatter intensitet Nanopartikel återspeglar mängden bundna exosomer på bilden.
Representative Results
Multi-well protein A/G belagda dia bilder (figur 1a) funktionaliserades med anti-EphA2 anti kropp och sedan används för att specifikt fånga EphA2-positiva exosomer från serumprover av patienter med och utan pankreascancer (1 μl/brunn) och ruinerade med guld nanorör konjugerade med en anti-CD9 anti kropp (figur 1b). DFM bilder av ljus spridda från dessa nanopartiklar analyserades med hjälp av DSM plugin i ImageJ program vara för att kvantifiera den bundna EphA-2 positiva exosomer i varje brunn. DSM-algoritmen definierar automatiskt gränsen för ett prov brunn, filtrerar bullret från artefakter, beräknar den spridda signalen från varje brunn och matar ut denna information (figur 2). DSM-algoritmen dämpar starkt ljus spridnings artefakter från repor eller skräp som finns i provet och förbättrar känsligheten och reproducerbarheten för detektion av nanopartiklar och kan automatiskt bearbeta en bunt med bild bilder för hög genom strömning Använda. Denna algoritm använder ImageJ kommandon och parametrar indata av användaren att subtrahera bild bakgrund, beräkna spridnings signalen från varje brunn, och utdata en data-och bildfil (figur 3). Regioner av intresse definieras av hög intensiva väl gränser i Capture-bild med hjälp av kon tur tröskel funktionen i ImageJ makro program. Bild analyser använder en fördefinierad kon tur tröskel och bild parametrar för att beräkna intensiteten av nanopartikelspridningen för varje brunn.
Som rapporter ATS i vårt tidigare arbete (tilläggs information om Liang et al.6), exosomer isolerade från Panc-1 cell kulturer som kännetecknas av transmission elektronmikroskopi och Western blot uppvisade storleks intervall, morfologi, och protein markör uttryck som överensstämmer med ett exovisst prov med hög renhet. Den PANC-1 exosomer, som utarbetats med samma förfarande som vårt tidigare arbete, användes här för att validera vår nPES analys för exosome kvantifiering. Denna analys använde en anti-EphA2 anti kropp för att fånga en stor population av exosomer från den totala exosome populationen och en anti kropp mot den allmänna exosome protein CD9 att upptäcka fångade exosomer. Resultat erhållna med hjälp av seriellt utspädda PANC-1 exovissa prover, med proteinkoncentrationer som varierade från 0,24 till 1,2 μg/μL, visade god reproducerbarhet i replikat brunnar (figur 4a) och en stark linjär korrelation mellan spridnings effekt och protein koncentration (figur 4b).
För att påvisa den potentiella tillämpningen av denna metod analyserades serumprover från patienter med och utan pankreascancer för att påvisa förekomsten av exosomer i serum som uttrycker den cancerassocierade bio markör EphA2, med en anti-EphA2-antikropp för att direkt fånga mål exosomer från serum och nanopartiklar konjugerade med en anti-CD9 anti kropp för att upptäcka bundna exosomer. Denna analys visade att serumprover från patienter med pankreascancer hade betydligt högre nivåer av EphA2 + exosomer (figur 5) än deras kontroller.
Figur 1: Exovissa kvantifieringsschema. (A) Schematisk av multi-well protein A/G-dia bilder (192 brunnar) som används i denna analys. (B) Target exosomer fångas direkt från prover, inklusive serum och plasma, genom immobilisering av ytan på den infångstantikropp (t. ex. anti-EphA2-antikropp) som är bunden till bilden, och sedan inkuberas med guld nanorör konjugerade med en detekterings anti-CD9-antikropp) före analys genom DFM-bildanalys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exoviss kvantifiering genom att tillämpa DSM-algoritmen på LMDFM-avbildningar. Bilder med låg förstoring bearbetas med DSM-algoritmen för att eliminera bakgrunds signal och signal artefakter som kan uppstå på grund av repor, blandnings håligheter, skräp och ojämn prov belysning för att möjliggöra robust detektering av guld nanorod signal, som korrelerar med exoviss koncentration. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Sun, D. et al. brus reducering metod för kvantifiera Nanoparticle ljus spridning i low förstoring Dark-fält Mikroskop far-fält bilder. Analytisk kemi. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) amerikanska kemiska föreningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk av DSM-algoritmens kommandon och utgångar. Angivna steg använder inbyggda kommandon från ImageJ och alla indataparametrar väljs enligt kraven för experiment via grafiskt användar gränssnitt. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Sun, D. et al. brus reducering metod för kvantifiera Nanoparticle ljus spridning i low förstoring Dark-fält Mikroskop far-fält bilder. Analytisk kemi. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) amerikanska kemiska föreningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa nPES LMDFM-bilder och DSM-utdata. (A) lmdfm-avbildning av en NPE-analys som analyserar en koncentrations lutning av Panc-1-exosomer och (b) den linjära korrelationen mellan den optiska signalen och exoviss koncentration från denna bild (vänster till höger: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μl respektive kolumn). Data presenteras som medelvärde ± SE, n = 6, med Pearsons korrelationskoefficient R2 = 0,99 och variationskoefficient för replikaten för varje koncentration < 0,2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: LMDFM-signal för EphA2+ exosomer skiljer sig i serum från patienter med och utan pankreascancer. Serumprover som analyserades av NPE med en anti-EphA2 Capture anti kropp (cancerassocierad) och en anti-CD9 detekterings anti kropp (allmän exosome markör) uppvisade en signifikant skillnad i koncentrationen av EphA2 + exosomer i serumprover av patienter med och utan pankreascancer (N = 7/grupp). Resultaten presenteras som medelvärde ± SE. * *p = 0,002 av Mann-Whitney U-test (Dubbels idig). Denna siffra har ändrats från [Sun, D. et al. brus reducerings metod för kvantifiera Nanoparticle ljus spridning i low förstoring Dark-fält Mikroskop far-fält bilder. Analytisk kemi. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Exosomer uppstår från reglerade invaginationer av det yttre endosome membranet som producerar multivesikulära kroppar, en specialiserad delmängd av endosomer som innehåller ett stort antal intraluminala vesikler som genomgår fusion med plasma membranet för att frigöra mogna exosomer i det extracellulära utrymmet. På grund av denna biogenes väg, exosomer kan bära membran-bundna faktorer i samband med membran fraktioner som utgör eller säkring med endosome membranet, liksom flera olika typer av cytosoliskt komponenter, och därmed innehåller laster av proteiner, DNA och olika RNA subtyper (mRNAs, microRNAs, långa icke-kodning RNAs) som kan återspegla fenotypen av deras cell av ursprung20. Eftersom exosomer utsöndras av de flesta om inte alla cell typer, kan uppvisa ökad utsöndring från sjuka eller maligna celler, och ackumuleras i de flesta kropps vätskor, exosomer är föremål för omfattande och systematisk utredning som en lovande minimalt invasiva metoder för att upptäcka specifika sjukdoms tillstånd och övervaka deras svar på behandling21.
Exosome isolering, som krävs för de flesta aktuella exosome analyser, är en lång och arbets intensiva förfarande, begränsa den kliniska översättningen av exosome-associerade bio markörer med potentiell medicinsk relevans. Många vanliga isolerings metoder (ultracentrifugation, storlek-uteslutning, nederbörd, etc.) skiljer sig ofta inte tillräckligt mycket exosomer (30 – 100 Nm) från mikrovesikler (100 – 1000 Nm) och apoptotiska kroppar (100 – 5000 Nm) på grund av överlappningar i deras storleks intervall eller fysikaliska egenskaper eller kan skada exoviss integritet15. Nya metoder är under utveckling som kan möjliggöra snabbare exovissa analyser, men det är inte klart hur genomförbart det kan vara att genomföra många av dessa plattformar i kliniska miljöer på grund.
I denna rapport presenterar vi en ny metod som tillåter Nanopartikel-baserade hög genom strömning exosome kvantifiering med låg förstoring mörka fält Mikroskop bilder. Denna metod kräver inte exoviss rening, dyr dedikerad utrustning, eller ny teknisk expertis och bör därför vara mottagliga för snabb översättning i de flesta forsknings-och kliniska miljöer. Vår analys kan tillämpas för att exakt kvantifiera koncentrationen av ett mål exosome befolkning som bär en specifik bio markör när analysen resultat jämförs med en standard kurva, eftersom våra resultat uppvisar det finns en stark linjär korrelation (R2 = 0,99) mellan optisk respons och exoviss koncentration. För att demonstrera den verkliga potentialen i denna strategi har vi tillhandahållit data där vi använde denna metod för att kvantifiera koncentrationen av en exoviss bio markör associerad med pankreascancer i serumprover som erhållits från patienter med och utan cancer i bukspottskörteln.
I LMDFM avbildas hela provet väl för att undvika markeringen bias finns i hög förstoring DFM analyser, där användarna måste direkt välja exempel fält för att fånga för efterföljande bild analys, men är föremål för ljus spridning artefakter från ytan oriktigheter, inklusive repor och prov skräp. Denna bakgrund kan reduceras för att detektera mål exosome-härledda signalen med hjälp av vår DSM brus reducering algoritm som körs på NIH bild analys program, ImageJ, men försiktighet måste fortfarande vidtas för att undvika att införa sådana artefakter som kan minska det dynamiska omfånget av analysen.
Material som används i denna analys:
Multi-well SuperProtein A/G-glidningar som håller 1 μL/brunn köptes från Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanopartiklar erhölls från Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/ml). DFM bilder fångades med en Nikon DiR2 digitalkamera ansluten till en Nikon ti-Eclipse Mikroskop, med konsekvent belysning och en 1/220 s exponerings tid. Den PANC-1 cellinjen som används i denna studie köptes från American typ Culture Collection.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Arbetet stöddes främst av forsknings medel som tillhandahålls av NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 och R21Al126361-01), Arizona biomedicinska forsknings kommissionen (ABRC) unga utredare Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
| Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
| Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
| NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
| Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
| Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
| TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |
References
- Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Liang, K., et al. Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Severino, V., et al. Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses. Gastroenterology. 153 (2), e498 495-504 (2017).
- Osteikoetxea, X., et al. Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).
- Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).
- Kim, J. E., et al. Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study. Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).
- Boussadia, Z., et al. Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).
- An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum. Journal of Proteome Research. , (2018).
- Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies. Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Sun, D., et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).
- Sun, D., Hu, T. Y. A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies. Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).
- Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer. Cell Death & Disease. 8 (10), e3134 (2017).
- Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes. Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. Exosomes: a cancer theranostics road map. Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).
