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Biology

कैनोहैबडिटिस एलिगेंस में संयुक्त न्यूक्लियोटाइड और प्रोटीन निष्कर्षण

Published: March 17, 2019 doi: 10.3791/59178
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University

Summary

यहां, हम एक ही नमूने से आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, एक के लिए भिंनता को कम करने के प्रयास में, reproducibility में सुधार, और व्याख्याओं की सुविधा ।

Abstract

एक एकल जैविक नमूना जानकारी की अधिकता रखती है, और यह अब एक साथ कई अणुओं आणविक प्रसंस्करण और विभिन्न स्थितियों के बीच परिवर्तन के कई स्तरों की एक पूरी तस्वीर पर कब्जा करने के लिए जांच करने के लिए आम प्रथा है. यह प्रोटोकाल, डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को आइसोलेट करने की विधि प्रस्तुत करता है, जो निमैटोड केनोहैबडिटिस एलिगेंस के उसी नमूने से होता है जब ये जैव अणु इसी प्रकार के उपचारित की प्रतिकृति से अलग किए जाते हैं, लेकिन अंततः विभिंन नमूनों । नाभिकीय अम्ल और प्रोटीन को अम्ल ग्वानिडीनियम थायोसिनेट-फीनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधि का उपयोग करके सूत्रकृमि से निकाला जाता है, जिसके बाद वर्षण, धुलाई, और प्रत्येक का घुलनकरण होता है । हम एक नमूना से आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन के सफल अलगाव सूत्रकृमि और HeLa कोशिकाओं के तीन उपभेदों से, वयस्क जानवरों में बेहतर प्रोटीन अलगाव परिणाम के साथ दिखा । इसके अतिरिक्त, ग्वानिडिनियम थायोक्यानेट-phenol-chloroform-सूत्रकृमि से निकाले प्रोटीन बड़े प्रोटीन के संकल्प को बेहतर बनाता है, के रूप में बढ़ाया detectable स्तर के साथ immunoblotting द्वारा मनाया, प्रोटीन की पारंपरिक RIPA निष्कर्षण की तुलना में ।

विधि यहां प्रस्तुत उपयोगी है जब एक multiomic दृष्टिकोण का उपयोग कर नमूनों की जांच, विशेष रूप से proteome और transcriptome की खोज के लिए । तकनीक है कि एक साथ मूल्यांकन multiomics अपील कर रहे है क्योंकि आणविक संकेतन जटिल जैविक घटना के लिए पूरक स्तर पर होने लगा है संकेत; हालांकि, यह देखने के लिए तेजी से आम हो गया है कि mRNA के स्तर में परिवर्तन हमेशा प्रोटीन के स्तर में एक ही परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करते और संग्रह के समय circadian विनियमों के संदर्भ में प्रासंगिक है । एक ही नमूना (intrasample.) के भीतर भिन्न सामग्री की असेइंग जब इस विधि किसी भी intersample भिन्नता निकालता है

Introduction

Multiomics, विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण है कि इस तरह के जीनोम, proteome, transcriptome, एपिजीनोम, माइक्रोबायोम, या lipidome के रूप में omics का एक संयोजन का उपयोग करता है, तेजी से लोकप्रिय हो गया है जब रोग लक्षण वर्णन1के लिए बड़े डेटा सेट प्रसंस्करण, 2. बढ़ते सबूत दिखाया गया है कि एक एकल "ome" के लिए सीमित दृष्टिकोण एक अपूर्ण आणविक विश्लेषण प्रदान करता है (Rotroff और Motsinger द्वारा की समीक्षा की-फिर से1) । बड़े डेटा सेट, विशेष रूप से जब उच्च थ्रॉपुट तकनीकों का उपयोग कर स्क्रीन प्रदर्शन उत्पन्न होते हैं, लेकिन एक पूरी तस्वीर पेंट करने के लिए या सबसे प्रासंगिक लक्ष्यों की पहचान करने के लिए, multiomic दृष्टिकोण बेहतर कर रहे हैं. multiomics दृष्टिकोण के उपयोग के साथ, तथापि, वहां mrna और प्रोटीन के स्तर3,4,5,6के बीच विसंगतियों की अक्सर अवलोकन है । विशेष रूप से आरएनए अनुक्रमण (RNAseq) और तरल क्रोमेटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) के साथ साथ-साथ transcriptomic और proteomic विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, एमआरएनए और प्रोटीन अक्सर इसी तरह से इलाज के नमूनों से प्राप्त कर रहे हैं भिन्न replicates, संभावित रूप से एक ही स्थिति3,4,5,6के बीच भिन्नता शुरू । harvald एट अल. एक सुरुचिपूर्ण सी एलिगेंस भुखमरी समय-पाठ्यक्रम का अध्ययन है कि transcriptome और जंगली प्रकार (wt) कीड़े की है कि hlh के लिए-30 उत्परिवर्ती कीड़े की तुलना में है कि लंबी उंर में एक महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर का प्रदर्शन किया 7. नोट की, आरएनए और प्रोटीन से काटी गई एक ही हालत replicates, तो एक ही नमूने से नहीं । उनके निष्कर्षों हर समय बिंदु (r = ०.५५९ से ०.६२८) पर mrna स्तर और प्रोटीन के स्तर के बीच एक कम सहसंबंध दिखा । वास्तव में, उनके हीटमैप चार समूहों का गठन: क्लस्टर मैं mrna स्तरों में एक बड़ी कमी थी, लेकिन इसी प्रोटीन के स्तर में कम या कोई कमी, क्लस्टर द्वितीय था कम या कोई mrna स्तर में वृद्धि लेकिन प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई थी, क्लस्टर III mrna में वृद्धि हुई थी स्तर लेकिन प्रोटीन के स्तर में कमी, और क्लस्टर चतुर्थ mRNA स्तरों में वृद्धि हुई थी, लेकिन केवल प्रोटीन के स्तर4में एक सूक्ष्म परिवर्तन । इसके अलावा, यह intersample भिन्नता मामलों में जहाँ एक ही स्थिति के नमूने ठीक उसी समय एकत्र नहीं हैं में प्रस्तुत किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एमआरएनए और सिरोकाडियन चक्र द्वारा विनियमित प्रोटीन8,9, या, अधिक विशेष रूप से, सी. एलिगेंस के प्रकाश9के लिए जोखिम दिन के समय के आधार पर बदलेंगी; इन circadian प्रोटीन की अभिव्यक्ति जीन अभिव्यक्ति प्रेरण10के बाद 8 एच तक देरी हो सकती है । फिर भी, इस प्रेक्षण की व्यापकता का अर्थ यह नहीं है कि यह गलत है; वास्तव में, यह जानकारीपूर्ण साबित हो सकता है । प्रोटीन और एमआरएनए गठन और क्षरण के बीच एक निरंतर गतिशील अवस्था में हैं । इसके अलावा, प्रोटीन अक्सर posttranslationally को स्थिरता में वृद्धि या उनके11क्षरण प्रेरित संशोधित कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, उनके बैबैरिनेशन स्थिति या तो सक्रियण या12क्षरण के लिए proteasome या लयनकाय को लक्षित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, गैर कोडिंग RNAs transअपंग और posttranscriptional13चरणों में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस प्रकार, प्रश्न यह है कि यह पुष्टि करने के लिए चरों को कैसे सीमित करें कि इन सूत्रकृमि अध्ययनों में हम जिन विसंगतियों का प्रेक्षण करते हैं वे वास्तविक हैं ।

यहां, हम एक विधि है कि एक ही नमूने से अलग अणुओं के विश्लेषण की अनुमति देकर intersample चर निकालता है प्रस्ताव । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक विधि के लिए लगातार अलग डीएनए, आरएनए, और सी एलिगेंस के एक नमूने से प्रोटीन (भी कीड़े के रूप में संदर्भित) के लिए एक के लिए भिंनता को कम करने के प्रयास में, reproducibility में सुधार, और व्याख्याओं की सुविधा की पेशकश है । एक ही नमूने का उपयोग करने के अतिरिक्त लाभ नमूना संग्रह के दौरान समय और संसाधनों की बचत शामिल हैं, मूल्यवान और सीमित नमूनों के क्रॉस-सेक्शनल विश्लेषण को सुविधाजनक बनाना, जो कि बढ़ने और बनाए रखने के लिए कठिन हैं, और प्राप्त करना एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर में intrasample विविधताओं के आधार पर अणुओं के अंतर नियमन में अंतर्दृष्टि ।

इस विधि के कीड़े का एक नमूना से जीन भाव और प्रोटीन के स्तर का आकलन करने के लिए उपयुक्त है, आणविक प्रसंस्करण के कई स्तरों के एक अधिक व्यापक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । ग्वानिडीनियम थायोसायनेट-phenol-chloroform (GTCp) अभिकर्मक14, आरएनए को अलग करने के लिए एक आमतौर पर इस्तेमाल किया रासायनिक, न्यूकोइक एसिड और कीड़े से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए प्रयोग किया जाता है, बाद में वर्षा के साथ, धोने, और प्रत्येक का घुलनकीकरण. इस प्रोटोकॉल के विभिंन प्रोटोकॉल का एक संकलन है15,16 मामूली संशोधनों के साथ, सी एलिगेंसपर ध्यान केंद्रित के साथ बनाया गया है, लेकिन हम भी सफलतापूर्वक rna, प्रोटीन अलग है, और डीएनए के एक गोली से HeLa कोशिकाओं के बाद एक ही कदम । हालांकि यहां परीक्षण नहीं, इस प्रोटोकॉल के ऊतकों पर काम करने के रूप में अच्छी तरह से17,18की संभावना है ।

Protocol

नोट: प्रत्येक मैक्रोमोलेक्यूल अवक्षेपण चरण क्रमिक रूप से किया जाता है, जिसके बाद बहाकर को समवर्ती रूप से किया जाता है; हालांकि, यह आरएनए अलगाव पहले पूरा करने के रूप में यह आंतरिक रूप से अस्थिर है की सिफारिश की है ।

1. नमूना संग्रह

  1. बीज १,००० कृमि अंडे प्रति 10 सेमी प्लेट उपयुक्त विकास की स्थिति के साथ19। ७२ एच के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनसेबेट ।
    नोट: ब्लीच अंडे असर वयस्कों के लिए पहले से वर्णित के रूप में अंडे इकट्ठा करने के लिए19।
  2. लगभग 5 मिलीलीटर M9 बफर के साथ थाली धोने और एक ट्यूब में १,००० वयस्क कीड़े इकट्ठा ।
    नोट: M9 बफर से बना है ३५ एमएम सोडियम फॉस्फेट डाइबेसिक, १०२ एमएम सोडियम क्लोराइड, 22 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबासिक, और बाँझ पानी में 1 एमएम मैग्नीशियम सल्फेट19.
  3. 1 मिनट के लिए १,००० x g पर कीड़े सेंट्रीफ्यूज, supernatant त्यागें, और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए M9 बफर के 1 मिलीलीटर के साथ पेल्टेड कीड़े हस्तांतरण ।
  4. 1 मिनट के लिए ८४५ x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें और अधिनतांत के अधिकांश छोड़ें । 4 ज की न्यूनतम के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर पेल्टेड कीड़े स्टोर ।
    नोट: एक जमे हुए गोली का उपयोग कर एक ताजा गोली से एक उच्च उपज पैदा करता है । सूखी बर्फ पर तरल नाइट्रोजन या ९५% इथेनॉल का उपयोग कर फ्रीज/गल की एक श्रृंखला कीड़ा छल्ली दरार करने के लिए अगर एक ताजा गोली का उपयोग करने की सिफारिश की है । गोली पर M9 की एक छोटी राशि छोड़ने में मदद मिलेगी छल्ली को तोड़ने जब ठंड ।

2. न्यूक्लिओटाइड और प्रोटीन आइसोलेशन

  1. गल गोली से किसी भी supernatant निकालें और कोल्ड gtcp अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें । अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स । 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना प्लेस और इसे उल्टा मोड़ से कभी कभार मिश्रण ।
    चेतावनी: Phenol संक्षारक है, neurotoxic, और अत्यधिक विषाक्त और रासायनिक जलता है और अंधापन का कारण हो सकता है.
    नोट: हम की रिपोर्ट की मात्रा के साथ शुरू सामग्री के रूप में ५,००० वयस्क कीड़े करने के लिए इस्तेमाल किया; प्रत्येक खंड GTCp अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर के उपयोग पर आधारित है । एक बड़ा नमूना का उपयोग करते समय, यह ऊपर स्केल करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  2. कीड़े और GTCp के समाधान के लिए, ठंड chloroform के २०० μL जोड़ें । उंगलियों के बीच ट्यूब पकड़ो और 15 एस के लिए जोरदार हिला । यह 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें ।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म एक विषाक्त अड़चन है, त्वचा घावों और अंय अंग लक्षित नुकसान का कारण हो सकता है, और एक संभव कैंसरजन है ।
  3. सेंट्रीफ्यूज १३,५०० एक्स जी पर ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ।
    नोट: तीन परतों इस स्पिन के बाद गठित कर रहे हैं: शीर्ष, स्पष्ट जलीय चरण, नीचे, गुलाबी कार्बनिक चरण, और छोटे, बादल इंटरफेज कि लिपिड और डीएनए शामिल हैं ।
  4. एक micropipette का प्रयोग, स्पष्ट ऊपर परत (जलीय चरण) एक नया RNase करने के लिए कदम मुक्त १.५ मिलीलीटर microकेंद्रापसारक ट्यूब (ट्यूब एक) शराब वर्षा के माध्यम से आरएनए को अलग करने के लिए (के रूप में कदम २.५ में विस्तृत) और शेष गोली से गुलाबी परत (कार्बनिक चरण) ले जाने के लिए एक नया ट्यूब ( ट्यूब बी) और यह बर्फ पर जगह है ।
    नोट: इस नमूने से डीएनए और प्रोटीन के अलगाव तक गुलाबी कार्बनिक चरण-८० डिग्री सेल्सियस पर जम सकता है । बड़े नमूनों जलीय और कार्बनिक चरण के बीच एक मोटी सफेद परत का उत्पादन होगा । इस अंश में डीएनए होता है. अगर इस लेयर को अन्य चरणों में परेशान किए बिना हटाया जा सकता है तो ऐसा करें और इसे अलग ट्यूब (tube B2) में डाल दें ।
  5. अलग आरएनए के रूप में निंनानुसार है ।
    1. एक ट्यूब में स्पष्ट जलीय चरण से, १००% isopropanol की ५०० μl के साथ आरएनए हाला । आर टी पर 10 मिनट के लिए इनसेबेट । फिर, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १३,५०० एक्स जी पर ।
      नोट: ट्यूब के नीचे आरएनए का एक छोटा सफेद गोली दिखाई देना चाहिए ।
    2. डिसेंट के बहुमत supernatant । एक सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ आराम निकालें और supernatant त्यागने ।
      नोट: सुई का आकार महत्वपूर्ण नहीं है; हालांकि, एक बड़ी सुई गेज अधिक नियंत्रण की पेशकश करेगा ताकि गोली को परेशान न करें । यदि सुई उपलब्ध न हो तो माइक्रोपिपेट का उपयोग किया जा सकता है ।
    3. एक गोली को धोने के लिए ट्यूब ए करने के लिए ७५% इथेनॉल की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 4 ° c पर 5 मिनट के लिए ५,३०० x g पर ट्यूब स्पिन ।
    4. एक सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज, के रूप में 2.5.2 कदम में वर्णित है, और इसे त्यागने के द्वारा गोली से supernatant निकालें ।
    5. 5-10 मिनट के लिए गोली हवा-सूखी चलो, लेकिन यह overdry मत करो । RNA के गुलेल को फिर से बनाने के लिए ५० μL के RNase मुक्त पानी का प्रयोग करें इससे पहले कि यह पूरी तरह से पारदर्शी हो जाता है ।
      नोट: यह 1000 के लिए एक पर्याप्त प्रारंभिक मात्रा-3000 कीड़े है, लेकिन यह कितना शुरू सामग्री का इस्तेमाल किया गया था पर निर्भर करता है समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    6. इसे भंग करने के लिए 10 मिनट के लिए 55-60 ° c पर गोली सेते ।
    7. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर एकाग्रता और शुद्धता को मापने । रिकार्ड अवशोषण आरएनए एकाग्रता के लिए २६० एनएम पर और २३० और २८० एनएम पर किसी भी अशुद्धियों की पहचान करने के लिए ।
    8. किसी भी contaminants, जैसे phenol अवशेषों या डीएनए, या तो स्तंभ शुद्धि के साथ या बाद में इथेनॉल washes और DNase उपचार के साथ हटाने के लिए आरएनए साफ करें ।
      नोट: इस बिंदु पर, आरएनए RNAseq विश्लेषण के लिए भेजा जा करने के लिए तैयार है या आर टी के लिए उपयोग करने के लिए cDNA बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता qPCR (विवरण के लिए अनुभाग ३.१ देखें). RNA-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक आगे का उपयोग करें ।
  6. डीएनए को इस प्रकार अलग करे ।
    1. ट्यूब बी में गुलाबी कार्बनिक चरण से और ट्यूब B2 में नमूना, यदि कोई हो, १००% इथेनॉल के ३०० μl जोड़कर डीएनए हाला और उलटा द्वारा मिश्रण । 2-3 मिनट के लिए RT पर ट्यूब (एस) छोड़ दें ।
    2. सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों B और B2 पर ३७५ x g 4 ° c पर 5 मिनट के लिए गोली डीएनए के लिए ।
    3. एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब (ट्यूब सी) में डालने के लिए और यह बाद में प्रोटीन अलगाव के लिए बर्फ पर छोड़ द्वारा ट्यूब बी और बी 2 से supernatant ले जाएं । 30 मिनट के लिए 10% इथेनॉल में ०.१ मीटर सोडियम साइट्रेट की 1 मिलीलीटर के साथ ट्यूब बी या बी 2 में डीएनए गोली धो लें । सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों बी और B2 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३७५ x g पर ।
      नोट: डीएनए रीढ़ की हड्डी, डीएनए को सोडियम साइट्रेट और इथेनॉल में अधिक आसानी से हाला बनाने, अशुद्धियों को कम गति केंद्रापसारक द्वारा हटाया जा करने के लिए अनुमति देता है ।
    4. चरण 2.6.3 में बताए गए वॉश स्टेप को दोहराएं । ७५% इथेनॉल के १.५ मिलीलीटर में गोली Resuspend और यह 20 मिनट के लिए आरटी पर छोड़, सामयिक मिश्रण के साथ ।
    5. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब बी और B2 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३७५ x g पर ।
    6. supernatant छोड़ें और यह 5-10 मिनट के लिए सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    7. 8 मिमी सोडियम हाइड्रॉक्साइड के १५० μL में गोली भंग । यदि आवश्यक हो तो HEPES के साथ वांछित पीएच को समायोजित करें । 4 ° c पर 5 मिनट के लिए ३७५ x g पर नमूना स्पिन ।
    8. एक micropipette का उपयोग कर, एक नया ट्यूब के लिए supernatant (डीएनए) ले जाएँ. एकाग्रता को मापने और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर शुद्धता का निर्धारण । रिकार्ड अवशोषण २६० एनएम पर डीएनए एकाग्रता के लिए और २३० और २८० एनएम पर किसी भी अशुद्धियों की पहचान करने के लिए ।
  7. इस प्रकार प्रोटीन को अलग ।
    1. प्रोटीन हाला करने के लिए, ट्यूब सी में गुलाबी supernatant करने के लिए १००% isopropanol के १.५ मिलीलीटर को जोड़ने के लिए, कई बार प्रतिलोम द्वारा मिश्रण, और 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते ।
    2. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब १३,५०० x g पर 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ।
    3. सुपरनैटंट छोड़ें और 2 मिलीलीटर के ०.३ मीटर ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड को 20 मिनट के लिए ९५% एथेनॉल में 10 मि. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब सी में 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धो लें ।
    4. चरण 2.7.3 2x में वर्णित के रूप में धोने कदम दोहराएं ।
    5. एक नई १.५ मिलीलीटर ट्यूब (ट्यूब C2) के लिए प्रोटीन गोली ले जाएँ और ९५% इथेनॉल के १.५ मिलीलीटर तक जोड़ें । भंवर और इसे आर टी पर 20 मिनट के लिए बैठते हैं ।
    6. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब C2 पर ५,३०० x g 4 ° c पर 5 मिनट के लिए । supernatant छोड़ें और चलो गोली सूखी आरटी में 10 मिनट के लिए ३०० μL में 5% एसडीएस की गोली को भंग ५० डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए ।
      नोट: एक लंबा ऊष्मायन समय पूरी तरह से प्रोटीन गोली को भंग करने के लिए आवश्यक हो सकता है । पूर्व में, गोली गुणवत्ता का त्याग किए बिना 6 ज तक के लिए इनसेट किया गया है ।
    7. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब C2 पर १३,५०० x g में 10 मिनट के लिए 17 ° c. एक नई ट्यूब के लिए supernatant ले जाएं ।
    8. माप एक पसंदीदा प्रोटीन परिमाणन परख कि डिटर्जेंट के साथ संगत है का उपयोग कर एकाग्रता ।
      नोट: प्रोटीन का उपयोग एसडीएस-पेज और वेस्टर्न सोख्ता में करने के लिए तैयार है । यह भविष्य में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । अंय तकनीकों, जैसे कि LC-MS/MS के लिए, डिटर्जेंट को बंद करने की आवश्यकता होगी ।

3. एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन

  1. आरटी-qPCR
    1. निम्नलिखित thermocycler प्रोटोकॉल का उपयोग करके आरएनए के 1 एनजी के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा cdna तैयार करें: भड़काना (25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट), रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (४६ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट), और आरटी inactivation (९५ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट) ।
    2. ९६-कूप प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के लिए प्रत्येक cDNA नमूने के 1:100 dilutions के १०० μL जोड़कर cDNA की एक स्टॉक प्लेट बनाओ । उचित नियंत्रण शामिल करें, जैसे कोई टेंपलेट/पानी ही कुओं, और 1:25 से 1:400 तक प्रश्नपत्र पतला नमूने (विश्लेषण नमूनों के सभी से परित cdna के साथ उत्पंन) के लिए एक मानक वक्र के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक जीन के लिए प्राइमरी क्षमता की स्थापना का विश्लेषण किया ।
      नोट: इस प्रारूप के साथ इस्तेमाल किया जा सकता ९६-well microडिस्पेंसर, जो एक थाली में सभी नमूनों के हस्तांतरण के लिए एक RT-qPCR थाली के लिए और अच्छी तरह से-अच्छी तरह से पिख्ता विविधताओं के शमन के लिए अनुमति देता है । उपयुक्त मास्टर मिक्स (जैसे, sybr + primers) प्रत्येक के बाद अच्छी तरह से जोड़ा जा सकता है, एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ । कुल मिलाकर, इस दृष्टिकोण से शुरू की त्रुटियों को कम कर देता है जब हाथ से प्रत्येक नमूना, इस प्रकार आगे परिवर्तनशीलता को कम करने ।
    3. भ-qPCR प्लेट के कुंए में स्टॉक प्लेट से cDNA की 3 μL जोड़ें ।
    4. प्राइमरों के प्रत्येक सेट के लिए एक मास्टर मिश्रण है कि 1x supermix शामिल एक डीएनए-intercalating सायनीन डाई, 5 μm प्रत्येक के लिए आगे और रिवर्स प्राइमरों, और पानी प्रति नमूना 7 μl करने के लिए । एक RT-qPCR प्लेट के उपयुक्त कुओं में 7 μL जोड़ें और हल्के से मिश्रण करने के लिए आंदोलन ।
      नोट: नमूनों में हाउसकीपिंग जीन को मापने के लिए एक संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए परिणाम20को सामान्य करने के लिए शामिल हैं ।
    5. एक RT-qpcr प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्लेट भागो कि प्राइमरों के लिए उपयुक्त है इस्तेमाल किया जा रहा है ।
  2. वेस्टर्न ब्लाटर
    नोट: पश्चिमी blots के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, कृपया महमूद और यांग21को देखें ।
    1. SDS के लिए नमूने तैयार-पृष्ठ 2x Laemmli नमूना बफर की एक समान मात्रा के साथ 20 μg प्रोटीन के संयोजन के द्वारा और 10 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर फोड़ा ।
    2. एक 4% पर नमूने लोड-15% Tris-glycine जेल और उंहें 1 एच के लिए १५० वी पर चलाने के लिए, या जब तक डाई सामने जेल के नीचे तक पहुंचता है ।
    3. एक सेमीड्राई ट्रांसफर उपकरण में 30 मिनट के लिए 25 वी पर एक नाइट्रो-सेलुलोज झिल्ली को जेल से प्रोटीन स्थानांतरण ।
    4. Ponceau एस दाग के साथ झिल्ली धुंधला द्वारा उचित हस्तांतरण की पुष्टि करें ।
    5. अच्छी तरह से झिल्ली से दाग धोने Tris-buffered खारा के साथ (टीबीएस) ०.०१% polysorbate 20 (टीबीएस-टी) के साथ ।
    6. आरटी में 1 ज के लिए टीबीएस-टी में 5% नोनफेट दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक ।
    7. आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के अनुसार उचित कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी में झिल्ली को सेते हैं । इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाव पर छोड़ दें ।
    8. 3x झिल्ली धो, 5 मिनट के लिए प्रत्येक, टीबीएस टी के साथ ।
    9. आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के अनुसार उचित कमजोर पड़ने पर उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी में झिल्ली को इनसेबेट करें । यह आर टी पर 1 एच के लिए घुमाव पर छोड़ दें ।
    10. 3x झिल्ली धो, 5 मिनट के लिए प्रत्येक, टीबीएस टी के साथ ।
    11. पसंदीदा तरीकों का उपयोग कर, छवि और पश्चिमी दाग यों तो ।

Representative Results

आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन के नमूनों का विश्लेषण किया गया, और आरएनए और प्रोटीन आइसोलेट्स का उपयोग करके प्रतिनिधि परिणाम यहां प्रस्तुत कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, हम प्रोटीन नमूना GTCp विधि का उपयोग कर सामान्य RIPA lysis विधि22के लिए काटा गया तुलना करें । हमारे प्रयोग के लिए, हम प्रत्येक wt (N2) कीड़े और दो लंबे समय से जीवित उत्परिवर्ती कीड़े, खाओ-2 और rsks-123,24के चार स्वतंत्र प्रतिकृति का इस्तेमाल किया ।

आरएनए और डीएनए मात्रा और गुणवत्ता

आरएनए की सांद्रता जब ५० μL जल में पुनः प्रवाहित होती है, तो यह लगभग ३,००० वयस्क कीड़ों का प्रयोग कर सामग्री के रूप में 0.2-2-ग्राम/ अवशोषण अनुपात, जो शुद्धता का संकेत, २.० से २.२ के लिए A260/A280 और १.९ के लिए २.५ करने के लिए A260/A230 (तालिका 1), इस तरह के phenol या ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड के रूप में gtcp घटकों के साथ संदूषण के बिना आरएनए के सफल निष्कर्षण का संकेत है ।

डीएनए निष्कर्षण सफल रहा, लेकिन गुणवत्ता परिवर्तनशील थी । डीएनए एकाग्रता जब naoh के १५० μl में सस्पेंड ०.०४ से १.१ μg/ अवशोषक अनुपात १.८ से २.१ के लिए A260/A280 और ०.९ से १.६ तक A260/A230 (सारणी 1) के लिए था, जिसमें डीएनए का सफल निष्कर्षण दर्शाया गया है; हालांकि, कुछ नमूनों को GTCp घटकों, जैसे phenol या ग्वानाइडीन हाइड्रोक्लोराइड से दूषित किया गया था । यदि डीएनए अलगाव आवश्यक है, देखभाल जब GTCp चरण जुदाई से मध्य परत अलग है, और अधिक washes आवश्यक हो सकता है लिया जाना चाहिए ।

चयनित लक्ष्यों की भ-qPCR

प्रत्येक कीड़ा तनाव के चार स्वतंत्र नमूनों से आरएनए अलगाव सफल रहा था और rnaseq विश्लेषण के लिए भेजा गया था, बाद RT-qpcr एक सायनीन डाई युक्त एक supermix का उपयोग कर प्रदर्शन के साथ । RT-qPCR द्वारा विश्लेषित लक्ष्यों का चयन एक बड़े RNAseq डेटासेट से किया गया था जो WT वॉर्ंस की तुलना में दोनों म्यूटेंट में सबसे अधिक भिन्न रूप से विनियमित सामान्य जीन पर आधारित है । F07C 4.1225, मानव neuroligin 3 के लिए एक homolog, isoform बी, चयनित साझा upregulated लक्ष्य था । हमने अतिरिक् त विश् लेषण के लिए दोनों म्यूटेंट, एमआरपी-126, के बीच एक अलग विनियमित जीन भी शामिल किया, जिसे खाने-2 वॉर्म में अपचित किया गया था, लेकिन rsks-1 वॉर्म में डाउनविनियमित था । RT-qPCR के माध्यम से एमआरपी-1 के एक्सप्रेशन बदलावों की पुष्टि की गई; हालांकि, rsks-1 कीड़े RNAseq विश्लेषण द्वारा की भविष्यवाणी में f07c 4.12 upregulation आरटी-qpcr (चित्रा 1) द्वारा नहीं देखा गया था ।

कीड़े के लिए मान्य एंटीबॉडी के साथ अतिरिक्त लक्ष्य के रूप में अच्छी तरह से जांच की गई । ये कई अंगक मार्कर शामिल हैडवाइजर एट अल.27में विशेषता । इन मार्करों के एक नंबर उत्परिवर्ती कीड़े में mRNA स्तर पर अलग से व्यक्त किया गया । चित्रा 1में देखा, lmp-128 और dlg-129 खाओ-2 कीड़े में upregulated थे; hsp-4 30, hsp-७०30, और lmp-1 rsks में upregulated-1 कीड़े थे; hsp-६० 31 और pas-7३२ खाने में-2 कीड़े के नीचे विनियमित थे; आरएसकेएस-1 कीडे़ में एचएसपी-६० और टीएसी-1३३ को विनियमित किया गया था ।

एक साथ बनाम RIPA प्रोटीन की तैयारी

दक्षता और GTCp विधि के साथ प्रोटीन की गुणवत्ता की पुष्टि के रूप में ऊपर वर्णित है, हम इसे प्रोटीन की तुलना में रिपा lysis22के और अधिक पारंपरिक विधि का उपयोग कर एकत्र । प्रारंभिक सामग्री का एक ही राशि का उपयोग करना, अर्थात् या तो वयस्कों (लगभग १०,००० कीड़े) या वयस्कों, लार्वा की एक मिश्रित आबादी, और अंडे (लगभग १३०,००० कीड़े), समग्र मात्रा gtcp के साथ एकत्र कम था जब बराबर अंत खंड में सस्पेंड (तालिका 1 ); हालांकि, एक वयस्क केवल आबादी से निष्कर्षण अधिक एक मिश्रित जनसंख्या से अधिक सफल रहा था । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन की गुणवत्ता के समान था, हालांकि GTCp-निकाले प्रोटीन कुल प्रोटीन की बराबर लोडिंग पर बड़ा प्रोटीन का एक बेहतर संकल्प दिखाया, के रूप में Coomassie चित्र 2में दाग द्वारा दिखाया गया है । वास्तव में, चित्रा 3 में पश्चिमी ब्लॉट द्वारा मूल्यांकित लक्ष्यों में अधिकांश मामलों में समान स्तर दिखाई दिया; तथापि, ७५ केडीए से बड़े प्रोटीन ने जीटीसीपी से निकाले गए प्रोटीन की तुलना में रिपा-निकाले गए प्रोटीन में निचले स्तर को दर्शाया (चित्र 3A, सही लेन; चित्रा 3B, पीला बार) ।

यहाँ प्रस्तुत निष्कर्षण पद्धति को स्तनधारी कोशिका रेखा हेला में भी मूल्यांकित किया गया. संदर्भ के लिए, प्रोटीन की मात्रा ६,०००,००० HeLa कोशिकाओं (एक ~ 25 μL गोली) के एक कॉंपैक्ट गोली से RIPA के साथ निकाला कि कीड़े की एक १३०,००० मिश्रित जनसंख्या (एक ~ ७५ μL कॉंपैक्ट गोली), या क्या १०,००० से निकाला जाता है के बारे में आधे से निकाले तुलनीय था वयस्क कीड़े (एक ~ १०० μL गुरुत्वाकर्षण-बसे गोली), के रूप में तालिका 1में देखा । हम बताते है कि प्रोटीन निष्कर्षण की दक्षता (तालिका 1) और बड़े प्रोटीन के संकल्प (चित्रा 2) GTCP में ripa की तुलना में कम किया गया था-HeLa कोशिकाओं में निकाले प्रोटीन, सुझाव इस तकनीक का एक वयस्क आबादी में बेहतर काम करता है कीड़े. GTCp-निकाले हेला प्रोटीन से प्रोटीन गोली के अपूर्ण घुलनकरण स्तनधारी कोशिकाओं में इस विधि की एक सीमा हो सकती है ।

आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा विश्लेषित इमयूनोलॉटिंग लक्ष्य

अगले, हम जीन के द्वारा परीक्षण किया उत्पादों के प्रोटीन के स्तर की जांच आर टी qPCR निर्धारित करने के लिए अगर mRNA स्तर प्रोटीन स्तर के साथ सहसंबद्ध । जैसा कि चित्र 3में देखा गया है, औसत मृणा अभिव्यक्तियों के साथ प्रोटीन के संबंध में औसतन व्यंजक परिवर्तन कई लक्ष्यों के लिए परिवर्तित हो जाते हैं; हालांकि, कुछ प्रोटीन का स्तर mRNA के स्तर में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं किया । प्रायः, खाने में मृना का स्तर -२ कृमि अन्य उपभेदों में उन लोगों की अपेक्षा अधिक होता था, लेकिन प्रोटीन का स्तर या तो एक ही लक्ष्य के अन्य उपभेदों से एक ही या कम होता था. सबसे उत्कृष्ट अवलोकन dlg के बहुत उच्च स्तर-1 mrna में खाओ-2 कीड़े, जो अधिक प्रोटीन के लिए अनुवाद नहीं किया गया था; वास्तव में, वहां थे कम dlg-1 प्रोटीन का स्तर जब अंय उपभेदों की तुलना में (चित्रा 3) ।

अंत में, GTCp में स्तर-निकाले प्रोटीन और RIPA निकाले प्रोटीन एक हड़ताली अंतर दिखाया । आरएनए दोनों के लिए एक ही तरीके से निकाली गई; तथापि, रिपा lysis द्वारा एकत्र समान लेकिन अलग नमूना स्पष्ट रूप से कम प्रोटीन का स्तर दिखाई दिया, विशेष रूप से ७५ केडीए से बड़े लोगों के लिए (चित्रा 3A, सही लेन; चित्रा 3B, पीला बार) ।

अंतर्सस्य मृणा और प्रोटीन के स्तर की तुलना

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्यों में से एक को निर्धारित अगर भिंनता हम mRNA और प्रोटीन के स्तर पर देखा था असली है, या यदि यह intersample भिंनता के एक विरूपण साक्ष्य हो सकता था । चित्रा 4में, लक्ष्यों का एक सबसेट एकल नमूनों के भीतर की तुलना में किया गया था । प्रत्येक व्यक्तिगत नमूना एक ही छाया और डॉट के रंग के रूप में दिखाया गया है, नमूना 1 के साथ अंधेरे छाया और 4 नमूना ग्रे के lightest शेड (WT), नीले (खाओ-2), या लाल (rsks-1) के रूप में किया जा रहा है । सबसे नमूनों के भीतर, वहां mRNA स्तर की एक कम परिवर्तनशीलता, प्रोटीन स्तर पर अधिक से अधिक परिवर्तनशीलता के साथ, पश्चिमी blots के semiquantitative विश्लेषण के एक संभावित दोष था । जब mRNA और प्रोटीन जोड़ों के बीच रंग डॉट्स में से प्रत्येक की स्थिति को देखते हुए, उच्चतम के क्रम से सबसे कम अक्सर मेल नहीं किया; उदाहरण के लिए, डब्ल्यूटी में, hsp-६० एमआरएनए आदेश नमूना 4, 3, 2, 1 था, लेकिन प्रोटीन का स्तर 1, 2, 3, 4 थे । इस प्रकार, एक नमूना के भीतर mRNA और प्रोटीन के स्तर के बीच मतभेद निश्चित रूप से मौजूद हैं, लेकिन प्रस्तुत विधि उपयोगकर्ताओं को मनाया अंतर का एक संभव स्रोत के रूप में संग्रह के समय को दूर करने के लिए अनुमति देता है ।

Table 1
तालिका 1: सांद्रता और अवशोषण अनुपात । आरएनए और डीएनए सांद्रता और शुद्धता अनुपात स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मापा गया । प्रोटीन सांद्रता एक वर्णमितीय प्रोटीन परिमाणन परख का उपयोग कर निर्धारित किया गया । ग्रे, नीले, और लाल आरटी-qPCR और वेस्टर्न ब्लॉट के लिए इस्तेमाल नमूनों पर प्रकाश डाला । पीले रंग की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया नमूने इंगित करता है GTCp RIPA प्रोटीन निष्कर्षण या हेला प्रोटीन को कृमि प्रोटीन । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 1
चित्रा 1: RT-qPCR द्वारा जीन अभिव्यक्ति । इस विधि द्वारा प्राप्त एमआरएनए के लिए RT-qpcr विश्लेषण, rnaseq डेटा से पहचाने गए लक्ष्यों की पुष्टि, और अंगक मार्कर जीन की. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं; n = 4. एमआरएनए की एकाग्रता को primers के प्रत्येक सेट के लिए एक मानक वक्र के खिलाफ परिभाषित किया गया था । सभी एमआरएनए स्तरों में संदर्भ जीन के रूप में प्रयुक्त छह हाउसकीपिंग जीन के एक सेट के औसत को सामांयीकृत किया गया था, जिसमें एक्ट-1, सीडीसी-४२, ama-1, एनआरएचआर-23, पीएमपी-3और सीआईएन-1शामिल हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: GTCp की तुलना-बनाम RIPA-कीड़े और HeLa कोशिकाओं में निकाले प्रोटीन । जंगली प्रकार (WT) कीड़े या HeLa कोशिकाओं से कुल प्रोटीन GTCp या RIPA lysis विधि के माध्यम से काटा, एसडीएस-पृष्ठ से अलग है, और Coomassie नीले रंग के साथ दाग । प्रत्येक लेन में कुल प्रोटीन का 25 μg होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कीड़े में प्रोटीन का स्तर । (क) आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा जांच किए गए लक्ष्यों का पश्चिमी ब्लॉट और (ख) सिग्नल तीव्रता का डेन्सिटोमिति विश्लेषण । प्रत्येक लेन कुल GTCp के 20 μg-जंगली प्रकार (WT), खाओ-2, या rsks-1 उत्परिवर्ती कीड़े से प्रोटीन निकाले शामिल हैं । दिखाया छवि चार स्वतंत्र प्रति कीड़ा तनाव प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व है । β-actin (नीचे) प्रत्येक लक्ष्य के लिए बराबर लदान के लिए नियंत्रण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; केवल एक प्रतिनिधि सेट दिखाया गया है । सही लेन rsks-1 उत्परिवर्ती कीड़े से कुल ripa-निकाले प्रोटीन के 20 μg शामिल हैं । (ख) संगत संकेत तीव्रता imagej का उपयोग कर मात्रा निर्धारित थे । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं; n = 4. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: Intrasample एमआरएनए और प्रोटीन स्तर की तुलना । प्रत्येक विकृति के लिए लक्ष्यों का एक सबसेट से व्यक्तिगत नमूनों से एमआरएनए और प्रोटीन स्तर गठबंधन कर रहे हैं । रंग तालिका 1का प्रतिनिधि है । ग्रे/काले WT है, नीले रंग की है खाओ-2, और लाल rsks है-1। एमआरएनए और एक ही लक्ष्य के प्रोटीन एक दूसरे के बगल में बनती है और सूत्रकृमि तनाव से अलग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

ऐसे डीएनए, आरएनए, और प्रोटीन के रूप में biomolecule आइसोलेशंस के लिए तरीकों, अक्सर तकनीकी ओवरलैप या संयोजन के बिना अनुकूलित कर रहे हैं । यह विशेष रूप से हानिकारक है जब नमूनों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, जो अलग समय पर एक ही शर्तों के तहत फसल के नमूनों को जंम दे सकता है । सेलुलर रास्ते पर निर्भर करता है, विभिंन समय पर एकत्र प्रतिकृति भिंनता उत्पंन कर सकते हैं । इस पांडुलिपि एक प्रक्रिया के लिए समवर्ती अलगाव और कीड़े का एक ही नमूना से प्रत्येक biomolecule के शोधन को सक्षम करने के द्वारा इस बाधा दरकिनार, अलग अलगाव तकनीकों द्वारा शुरू की विविधताओं को कम करने, नमूना फसल के समय, प्रदान करता है या असमान संचयन । इन चर को नियंत्रित न केवल समय और संसाधनों की बचत होती है, लेकिन यह भी reproducibility की सुविधा । यहां, हम एक मिश्रित दृष्टिकोण है कि rna और प्रोटीन की गुणवत्ता समझौता से बचा जाता है, हालांकि डीएनए के साथ चर परिणामों के साथ प्रदर्शन । तैयारी आगे डीएनए सफाई प्रक्रियाओं का उपयोग कर अनुकूलित किया जा सकता है । हम सूत्रकृमि C. एलिगेंस और HeLa कोशिकाओं से सामग्री का उपयोग कर दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया ।

पिछला काम N2 wt पशुओं के transcriptome और proteome की खोज और खाओ-2 और rsks-1 ंयूटेंट तंत्र है कि उंर4,३४,३५ का विस्तार सहित विभिंन मार्ग, में अंतर्दृष्टि की पेशकश की है ,३६. उंर के विस्तार में गरमी प्रतिबंध के तंत्र की जांच करने के प्रयास में, एक स्थिर आइसोटोप सेल संस्कृति (SILAC) विश्लेषण में अमीनो एसिड के साथ लेबलिंग ने पाया कि खाओ-2 कीड़े वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण का एक समग्र downregulation है ३६. यहाँ प्रस्तुत किया गया डाटा इस खोज के अनुरूप है, यहां तक कि समान लक्ष्यों का एमआरएनए स्तर बहुत बढ़ जाता है. एक अन्य समूह S6K-mediated लंबी उंर के effectors की पहचान करने के उद्देश्य से और, इस प्रकार, rsks के एक proteomic स्क्रीन-1 कीड़े३४प्रदर्शन किया । वर्तमान अध्ययन के साथ पाया RNAseq डेटा से, हम कम से तीन जीन है कि इस स्क्रीन से पहचाना प्रोटीन के साथ पुष्टि की पहचान; सीपीए और न्यूरोलिगिन (F07C 4.12) के MRP-1 और homologs के रूप में की खोज की जा रही है अलग से rsks-1 कीड़े में व्यक्त के रूप में Wt N2३४की तुलना में ।

इस विधि का उपयोग कर जनरेट किया गया डेटा पिछले multiomic जांच के साथ संगत है । प्रत्येक नमूने में प्रोटीन के स्तर की भविष्यवाणी करने के लिए नौ लक्ष्यों का एमआरएनए स्तर इस्तेमाल किया गया था । इन लक्ष्यों में से कई ने एमआरएनए स्तरों पर आधारित प्रोटीन के स्तर का पूर्वानुमान लगाया । फिर भी, एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर के बीच उल्लेखनीय विसंगतियां थीं । महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत वैज्ञानिकों आत्मविश्वास से मूल्यांकन करने के लिए और एक ही नमूना से mRNA और प्रोटीन इकट्ठा करके intersample परिवर्तनशीलता को हटाने के द्वारा इन मतभेदों की व्याख्या करने की अनुमति देता है । इसके अलावा, हम एक ही नमूना से एकत्र की है या एक समान लेकिन विभिन्न नमूना RIPA के साथ काटा से एकत्र प्रोटीन के स्तर के लिए mRNA के स्तर की तुलना में । हमें पता चला है कि लक्ष्यों की एक संख्या के लिए, रिपा-निकाले गए नमूने में प्रोटीन के काफी निचले स्तर थे । intersample भिन्नता के लिए नियंत्रित किए बिना, यह अंतर mRNA और प्रोटीन के अंतर नियमन के कारण किया गया था, तो यह जानना असंभव होगा.

यह ध्यान में रखना है कि वहां प्रोटोकॉल इन विभिंन macromolecules के लिए विशेष रूप से अनुकूलित कर रहे है महत्वपूर्ण है, इसलिए यदि एक क्रॉस अनुभागीय विश्लेषण प्रयोग के अंतिम लक्ष्य नहीं है, तो यह उन तरीकों को रोजगार के बजाय उचित होगा । GTCp का उपयोग करने के लिए डीएनए और प्रोटीन को अलग करने का कारण बनता है उंहें कम घुलनशील बनने के लिए, एक कमजोर आधार में डीएनए के पुनर्गठन की आवश्यकता होती है, जैसे NaOH, और एक बफर में प्रोटीन घुलनकारी हीटिंग के साथ डिटर्जेंट की एक उच्च एकाग्रता के साथ, अधूरा के जोखिम पर विलेयीकरण. इसके अतिरिक्त, GTCp गुनिडीनियम थायोजाइनेट और अम्लीय phenol है, जो ऐसे proteases के रूप में एंजाइम को निष्क्रिय करता है, लेकिन धीरे समय पर प्रोटीन नीचा होगा जब तक जमे हुए । यह शोधकर्ता के विवेक को तय करना होगा कि यदि इन सीमाओं का छल सार्थक होगा.

महत्वपूर्ण बात, जब आरएनए, एक तकनीक के साथ काम कर रहे हैं, जब तक अंयथा नोट बर्फ पर नमूना रखते हुए, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विसंदूषण अभिकर्मक के उपयोग के लिए rna बरकरार रखने की सिफारिश की है । विशेष रूप से, बड़े नमूनों के साथ शुरू करने के लिए और अधिक GTCp की आवश्यकता होगी, जिसमें प्रत्येक निष्कर्षण विलायक भी ऊपर बढ़ाया जा करने की आवश्यकता होगी । इस प्रोटोकॉल की आवश्यकता नहीं है किसी भी मैनुअल homogenization के कीड़ा या सेल के नमूने जब सही मात्रा GTCp का उपयोग किया जाता है । डीएनए अलगाव के संदर्भ में, उपज कार्बनिक (गुलाबी) परत को ठीक करने के लिए प्रवीणता पर अत्यधिक निर्भर है । अंत में, अलगाव के दौरान प्रोटीन के घुलनकरण में सुधार करने के लिए, रिज़ॉल्बिलाइजेशन बफर की मात्रा में वृद्धि या एसडीएस के अलावा अन्य डिटर्जेंट जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है । दरअसल, वयस्कों, लार्वा, और अंडों के मिश्रण के बजाय केवल वयस्क-कीड़े की आबादी वाले प्रोटीनों को रिज़ॉल्बिनीज करना बहुत आसान है ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर जैव अणु आइसोलेशंस के लिए एक एकीकृत दृष्टिकोण प्रदान करता है और correlations की व्याख्या की सुविधा, या उसके अभाव, एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर के बीच है कि अलग से विभिन्न जैव अणुओं के संचयन से पैदा कर सकते हैं नमूने. इस पद्धति का उपयोग करने से वैज्ञानिकों को सही ढंग से मामलों की पहचान करने में मदद मिल सकती है, जहां एमएनए का अनुवाद प्रोटीन से संबंधित नहीं है और यह विभिन्न शर्तों के तहत posttransअपंग और posttranscriptional नियामक तंत्र की गहरी जांच करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

L.R.L. NIH/NIA (R00 AG042494 और R01 AG051810) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, उंर बढ़ने के जैविक तंत्र में अनुसंधान के लिए एक ग्लेन फाउंडेशन चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार के लिए और अमेरिकी फेडरेशन से बुढ़ापे अनुसंधान के लिए एक कनिष्ठ संकाय अनुदान । लेखक इस पांडुलिपि के लेखन में अपनी उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए अनीता कुमार और शि क्तान वोंग का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels BIORAD 4568084
Antibodies:
CePAS7-s DHSB- U of Iowa
CeTAC1-s DHSB- U of Iowa
DLG1-s DHSB- U of Iowa
GRP78 Novus Bio. NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse Li-Cor 926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit Li-Cor 92680011
HSP60-s DHSB- U of Iowa
LMP1-s DHSB- U of Iowa
MRP-1 Abcam ab24102
Neuroligin 3 Abcam ab172798
β-actin Millipore MAB1501R
ChemiDoc MP Imaging System BIORAD
Chloroform Fisher C298-500 Health hazard, Irritant, Toxic
Coomassie Brilliant Blue ThermoSci 20279
DC Protein assay BIORAD 500-0116
Epoch 2 microplate reader BioTek
Ethanol (200 proof) Fisher 04-355-223 Flammable, health hazard
HeLa cells ATCC CCL-2 BSL2
iScript Reverse Transcription Supermix BIORAD 1708840
Hydra microdispenser: Matrix Hydra Robbins/ThermoFisher
Isopropanol Fisher A516-4 Flammable, health hazard
M9 buffer:
3 g KH2PO4
6 g Na2HPO4
5 g NaCl
Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving.
After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4
Laemmli Sample Buffer (2x) BIORAD 161-0737
NanoDrop One ThermoSci
PAGE apparatus BIORAD
Ponceau S Alfa Aesar J60744
Primers IDT 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA
GGCAGTTGAG-3')
R (5'-CACGTCCGTT
AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT
GTCAACCCAG-3')
R (5'-TCGTCAGGGT
TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA
ACGTGCTAAG-3')
R (5'-GAGCAGTTGA
GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT
CGACGAGCGA-3')
R (5'-CAACACCTCC
TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC
CGGACTCACG-3')
R (5'-ATCGAGCTCC
CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC
AAAGTTCCTC-3')
R (5'-TGAGCACCTT
GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA
AAGGCTGTCG-3')
R (5'-CTGAATCGGC
ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC
GCTTGTTCTG-3')
R (5'-AGTTCCAGTG
CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT
GAAGGACTGT-3')
R (5'-TGGCAATAGC
TCCTCCGTTG-3')
HK Actin: F (5'-CTACGAACTT
CCTGACGGACAAG-3')
R (5'-CCGGCGGACT
CCATACC-3')
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT
GGAGTTGTTC-3')
R (5'-TCCGTAGATT
GATTCACCAC-3')
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT
GAAGAACGCG-3')
R (5'-CGATCTGCAG
TGAATAGCTC-3')
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG
GAGTCACACC-3')
R (5'-CATCCTCCTT
CATTGAACGG-3')
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA
GGAAGATTACG-3')
R (5'-CTCGGACATT
CTCGAATGAAG-3')
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT
TCATCACTCAT-3')
R (5'-ACACCGTCGA
GAAGCTGTAGA-3')
LightCycler 96 qPCR machine Roche
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.2% SDS
140 mM NaCl
1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix BIORAD 1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate ThermoSci 34095
Trans-Blot Transfer apparatus BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIORAD 170-4159
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 Health hazard (skin, eyes)
Worm strains: Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (wild type) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
eat-2 (MAH95) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
rsks-1 (VB633) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

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References

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जीव विज्ञान मुद्दा १४५ multiomics proteomics transcriptomics RNAseq आर टी-qPCR वेस्टर्न ब्लॉट डीएनए आरएनए प्रोटीन सी. एलिगेंस ग्वानिडीनियम थायोसिनेट
<em>कैनोहैबडिटिस एलिगेंस</em> में संयुक्त न्यूक्लियोटाइड और प्रोटीन निष्कर्षण
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Mills, J., McConnell, E., Leitão, J. A., Lapierre, L. R. Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59178, doi:10.3791/59178 (2019).

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