Summary
여기, 선물이 편차를 줄이기 위해, 재현성, 개선 및 해석을 용이 하 게 하기 위해에서 RNA, DNA, 그리고 동일한 샘플에서 단백질의 격리에 대 한 프로토콜.
Abstract
단일 생물 학적 샘플 보유 정보의 과다 그리고 그것은 지금 분자 처리 및 다른 조건 간의 여러 레벨의 전체 그림을 잡으려고 여러 고분자를 동시에 조사 관행. 이 프로토콜 제공 DNA, RNA, 분리 및 선 충 류가이 쓰이므로 격리의 복제 때 변형 제거를 꼬마 선 충 의 동일한 견본에서 단백질 비슷하게 취급 하지만 궁극적으로 다른 샘플입니다. 핵 산 및 단백질은 후속 강 수, 세척, 그리고 각각의 가용 화와 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 방법을 사용 하 여 선 충 류에서 추출 됩니다. 우리는 RNA, DNA, 그리고 선 충 류 및 성인 동물에 더 나은 단백질 격리 결과 HeLa 세포의 3 개의 긴장에서 단일 샘플에서 단백질의 성공적인 절연을 보여줍니다. 또한, 선 충에서 guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬-추출 단백질 immunoblotting, 단백질의 전통적인 RIPA 추출에 비교 하 여 관찰로 향상 된 감지 수준 가진 더 큰 단백질의 해상도 향상 시킵니다.
여기에 제시 된 방법은 프로테옴 transcriptome의 탐사 특히 multiomic 방법을 사용 하는 샘플을 조사할 때 유용 하다. 기법을 동시에 평가 하는 multiomics는 매력적인 분자 신호 기본 복잡 한 생물학적 현상 보완 수준;에서 발생 하는 것 생각 했기 때문에 그러나, 그것은 점점 더 일반적인 볼 mRNA 수준에서 변경 내용을 항상 단백질 수준에서 동일한 변경 내용을 반영 하지 않습니다 그 컬렉션의 시간 circadian 규정의 맥락에서 관련 되고있다. 이 방법은 제거 intersample 달라진 시 금 같은 샘플 (intrasample.) 내에서 다른 내용
Introduction
Multiomics, omics, 게놈, 프로테옴, transcriptome, epigenome, 미생물, 또는 lipidome, 등의 조합을 사용 하 여 분석 접근은 점점 더 인기가 있다 질병 특성1, 큰 데이터 집합을 처리할 때 2. 장착 증거는 (Rotroff와 Motsinger Reif1검토) 불완전 한 분자 분석을 제공 단일 "오"에 접근을 제한 하는 것을 보이고 있다. 높은 처리 기술을 사용 하 여 화면을 수행 하는 경우에 특히 큰 데이터 집합 생성 됩니다 하지만 완전 한 그림을 페인트 하거나 가장 관련성이 높은 목표를 식별, multiomic 접근 바람직. 그러나 Multiomics 접근의 사용은,, 있다 mRNA와 단백질 수준3,4,,56사이 불일치의 자주 관찰. 특히, mRNA와 단백질--나란히 transcriptomic 및 proteomic 분석 RNA 시퀀싱 (RNAseq)와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS), 각각, 사용 자주에서 가져온에서 마찬가지로 처리 샘플 다른 복제3,4,,56조건 잠재적으로 동일한 사이 변이 소개 합니다. Harvald 외. 수행 우아한 transcriptome 프로테옴 야생-타입 (WT)의 비해 C. 선 충 기아 시간 과정 연구 장 에에서 중요 한 전사 요소 부족 hlh-30 돌연변이 벌레의 벌레 7. 노트, RNA와 단백질 같은 샘플 안에서 동일한 조건 복제에서 수확 했다. 그들의 연구 결과 표시 mRNA 수준 및 각 시간 지점에서 단백질 수준이 낮은 상관관계 (r = 0.559 0.628). 사실, 그들의 히트 맵 4 클러스터 형성: mRNA에 큰 감소 했다 클러스터 해당 단백질 수준에 거의 비슷하게 감소 하지만 레벨, 클러스터 II 단백질 수준의 증가 하지만 mRNA 수준에서 거의 비슷하게 증가 했다, 클러스터 III mRNA에 증가 했다 레벨 단백질 수준과 클러스터 4 감소 했다 mRNA 수준에서 증가 하지만 단백질 레벨4만 미묘한 변화. 또한,이 intersample 변형 같은 조건의 샘플 정확한 동시에 수집 되지 않으며 경우에 도입 수 있습니다. 예를 들어 mRNA와 단백질 circadian 사이클에 의해 규제 하루8,9, 시간 또는 좀 더 구체적으로, 빛9; C. 선 충 의 노출에 따라 변동 식이 circadian 단백질의 유전자 식 유도10후 8 h까지 지연 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 관측의 보급이 반드시 의미 하지 않는다 그것은 잘못 된; 사실,이 유익을 증명할 수 있습니다. 단백질 및 mRNA 형성 저하 사이 일정 한 동적 상태에 있다. 또한, 단백질은 안정성을 증가 하거나 그들의 저하11유도 종종 posttranslationally 수정 됩니다. 예를 들어, 그들의 ubiquitination 상태 활성화 또는 프로테아좀 또는 저하12리소좀을 대상으로 이어질 수 있습니다. 또한, noncoding RNAs는 transcriptional 및 posttranscriptional 단계13에서 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 재생 합니다. 따라서, 문제는 우리가 이러한 선 충 연구 관찰 불일치는 진짜 확인 변수를 제한 하는 방법.
여기, 우리는 동일한 샘플에서 다른 고분자의 분석 함으로써 intersample 변수를 제거 하는 방법을 제안 합니다. 이 프로토콜의 목표는 지속적으로 변화를 줄이기 위해, 재현성, 개선 하기 위해에서 DNA, RNA 및 단백질 C. 선 충 (벌레 라고도 함)의 단일 샘플에서 분리 하는 방법을 제공 하 고 해석을 촉진 하입니다. 같은 예제를 사용 하 여 추가 혜택 포함 샘플 수집, 소중 하 고 제한 된 샘플, 성장 하 고, 유지 하기 어려운 종자를 포함 한 전과의 횡단면 분석을 용이 하 게 하는 동안 시간 및 자원의 절약 intrasample 변형 mRNA와 단백질 수준에서에 따라 고분자의 차동 규칙으로 통찰력.
이 메서드는 진 식과 벌레, 분자 처리의 여러 수준에 대 한 보다 포괄적인 평가 대 한 수의 단일 샘플에서 단백질 수준 평가 적합 합니다. Guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬 (GTCp) 시 약14, RNA를 분리 하는 일반적으로 사용 되 화학 후속 강 수, 세척, 그리고 각각의 가용 화와 벌레에서 핵 산 및 단백질의 추출에 사용 됩니다. 이 프로토콜은 다양 한 프로토콜15,16 C. 선 충에 중점을 두고 설계 된 사소한 수정 편집 이다 하지만 우리는 또한 성공적으로에서 고립 된 RNA, 단백질과 DNA 다음 HeLa 세포의 펠 릿은 동일한 단계를. 테스트 하지 않지만 여기,이 프로토콜 뿐만 아니라 조직에17,18일 것입니다.
Protocol
참고: 각 고분자 강수량 단계는 수행 순차적으로, 뒤에 세척 일을 동시에; 그러나, RNA 격리를 완료 하려면 것이 좋습니다 처음으로 그것은 본질적으로 안정.
1. 샘플 컬렉션
- 적절 한 성장 조건1910 cm 접시 당 1, 000 웜 계란 씨앗 72 h 20 ° C에서 품 어.
참고: 앞에서 설명한19로 달걀을 수집 하기 위해 계란 베어링 성인 표 백제. - M9 버퍼의 약 5 mL와 함께 접시를 세척 하 고 튜브로 1000 성인 벌레를 수집.
참고: M9 버퍼는 35 m m 인산 염기 나트륨, 염화 나트륨 102 m m, 22 mM 칼륨 인산 이수소, 및 살 균 물19에서 1 m m 마그네슘 황산의 구성 됩니다. - 1000 x g 1 분 동안에 벌레를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 M9 버퍼의 1 mL와 수송과 웜 전송.
- 다시 1 분 동안 845 x g 에서 원심 및 삭제는 상쾌한의 대부분. 최소 4 h-80 ° C에서 수송과 벌레를 저장 합니다.
참고: 냉동된 펠 릿을 사용 하 여 신선한 펠 릿 보다 높은 수익률을 생성 합니다. 일련의 동결/동결 해제 사이클 드라이 아이스에 액체 질소 또는 95% 에탄올을 사용 하 여 웜 표 피를 부를 것이 좋습니다 신선한 펠 릿을 사용 하는 경우. 펠 릿에 작은 양의 M9 떠나 얼 때 표 피를 휴식 하는 데 도움이 됩니다.
2. 뉴클레오티드와 단백질 격리
- 해 동된 펠 릿에서 어떤 상쾌한을 제거 하 고 차가운 GTCp 시 약의 1 mL을 추가. 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 10 분 동안 얼음에 샘플을 놓고 가끔 거꾸로 그것을 선회 하 여 그것을 혼합 합니다.
주의: 페 놀 부식성, 신경, 그리고 높은 독성 그리고 화학 화상 실명을 일으킬 수 있습니다.
참고: 우리 보고 볼륨; 시작 물자로 최대 5000 성인 벌레를 이용 각 볼륨의 GTCp 시 약 1 mL의 사용을 기반으로 합니다. 더 큰 샘플을 사용할 때는 최대 규모 필요할 수 있습니다. - 웜 및 GTCp의 솔루션, 감기 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 손가락 사이 튜브를 보유 하 고 적극적으로 악수 15 미 허가 그것 상 온 (RT) 3 분.
주의: 클로 프롬 자극성 독성, 피부 염증 및 다른 기관 대상 해가 발생할 수 있습니다 이며 가능한 발암 물질. - 13500 x g 4 ° c.에 15 분 동안에 관을 원심
참고: 이 회전 후 형성 되는 3 개의 층: 상단, 명확한 수성 단계, 하단, 핑크 유기 단계, 그리고 지질과 DNA를 포함 하는 작은, 흐린 interphase. - micropipette를 사용 하 여 새로운 RNase 무료 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (튜브 A) 알코올 (에 설명된대로 2.5 단계) 강 수를 통해 RNA를 분리 하 고 새 튜브 (핑크 레이어 (유기 단계) 나머지 펠 릿에서 이동 하 이동 분명 상위 레이어 (수성 단계) 튜브 B) 얼음에 놓습니다.
참고: 분홍색 유기 단계 DNA와 단백질이이 예제에서의 분리까지-80 ° C에서 냉동 수 있습니다. 큰 샘플 수성 및 유기 단계 사이의 두꺼운 흰색 레이어를 생성 합니다. 이 분수는 DNA를 포함합니다. 이 레이어는 다른 단계를 방해 하지 않고 제거할 수 있습니다, 만약 그렇게 하 고 별도 관 (관 B2)에 넣어. -
다음과 같이 RNA 격리.
- 튜브 A에에서 명확한 수성 단계에서 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L로 RNA 침전. 실시간에서 10 분 동안 품 어 다음, 4 ° c.에서 10 분 동안 13500 x g 에서 원심 분리기 튜브 A
참고: RNA의 작은 흰색 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 표시 되어야 합니다. - 대부분을 상쾌한의 가만히 따르다. 나머지 1 mL 주사기 바늘으로 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
참고: 바늘의 크기는 중요 하다; 그러나, 더 큰 바늘 게이지는 펠 렛을 방해으로 하지 그래서 더 많은 제어를 제공 합니다. micropipette 바늘 사용할 수 없는 경우 사용할 수 있습니다. - 튜브는 펠 릿을 세척 하는 A 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 5300 x g 에서 튜브를 회전
- 2.5.2, 단계에서 설명한 대로 decanting 바늘, 1 mL 주사기를 사용 하 여는 상쾌한 펠 릿에서 제거 하 고 그것을 폐기.
- 펠 릿을 하자 5-10 분, 건조 하지만 overdry 그것을 두지 마세요. RNase 무료 물 50 µ L를 사용 하 여 완전히 투명 하 게 되기 전에 RNA의 펠 릿을 다시 구성할.
참고: 이것은 1000-3000 벌레에 대 한 적절 한 시작 볼륨 하지만 얼마나 시작 소재 사용에 따라 조정 해야 할 수도 있습니다. - 그것을 해산 하기 위해 10 분 동안 55-60 ° C에 펠 릿을 품 어.
- 농도 및 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 합니다. 기록에서 260 absorbances nm RNA 농도 어떤 불순물을 식별 하기 위해 230, 280 nm에.
- 모든 오염 물질을 제거, 페 놀 잔류물 또는 DNA, 같은 열 정화 또는 후속 에탄올 세척 및 DNase 치료에 RNA를 청소.
참고: 이 시점에서, RNA RNAseq 분석을 위해 보낼 준비가 또는 cDNA 실시간 정량 (자세한 내용은 섹션 3.1 참조)에 사용할 수 있도록 사용할 수 있습니다. RNA-80 ° C에 추가 사용까지 저장할 수 있습니다.
- 튜브 A에에서 명확한 수성 단계에서 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L로 RNA 침전. 실시간에서 10 분 동안 품 어 다음, 4 ° c.에서 10 분 동안 13500 x g 에서 원심 분리기 튜브 A
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다음과 같이 DNA를 격리 합니다.
- 튜브 B 핑크 유기 단계 및 튜브 B2, 샘플에서 있는 경우는 반전에 의해 100% 에탄올과 혼합의 300 µ L을 추가 하 여 DNA를 침전. 2-3 분 RT에는 tube(s)를 둡니다.
- DNA를 펠 렛을 4 ° C에서 5 분 동안 375 x g 에서 B 및 b 2 튜브 원심
- 새로운 2 mL 튜브 (C 관)에 붓는 의해는 상쾌한 B와 b 2 관에서 이동 하 고 후속 단백질 격리에 대 한 얼음에 두고. 375 x g 4 ° c.에 5 분에서 30 분 원심 분리기 튜브 B 및 b 2에 대 한 10% 에탄올에 0.1 M 나트륨 구 연산 염의 1 mL 튜브 B 또는 b 2에서에서 DNA 펠 릿을 세척
참고: 나트륨은 나트륨 시트르산에 에탄올, 불순물 저속 원심 분리에 의해 제거할 수 있도록 DNA 촉진 더 쉽게 만드는 DNA 등뼈에 바인딩합니다. - 2.6.3 단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복 합니다. 75% 에탄올 1.5 mL에 펠 릿을 resuspend 고 구도의 여 가끔 혼합과 20 분, RT에 둡니다.
- 원심 분리기 튜브 4 ° c.에서 5 분 동안 375 x g 에서 B 및 b 2
- 삭제는 상쾌한 고 5-10 분 동안 건조를 허용 합니다.
- 8 m m 수산화 나트륨의 150 µ L에 펠 릿을 디졸브. 필요한 경우 HEPES와 원하는 pH를 조정 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 375 x g 에서 샘플을 회전
- 새로운 튜브는 micropipette를 사용 하 여 상쾌한 (DNA) 이동 합니다. 농도 측정 하 고 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 합니다. 기록에서 260 absorbances nm와 어떤 불순물을 식별 하기 위해 230 및 280 nm에서 DNA 농도 대 한.
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다음과 같이 단백질을 분리.
- 단백질 침전, 하 관 C, 여러 번을 반전 하 여 혼합에에서 분홍색 상쾌한에 100% 소 프로 파 놀의 최대 1.5 mL를 추가 하 고 10 분 RT에서 품 어.
- 원심 관 C에서 4 ° c.에서 10 분 동안 13500 x g
- 삭제는 상쾌한 고 실시간 원심 분리기 튜브 C 5300 x g 4 ° c.에 5 분에서 20 분에 대 한 95% 에탄올에 0.3 M guanidine 염 산 2 mL와 펠 릿을 세척
- 2.7.3 단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복 2 배.
- 새로운 1.5 mL 튜브 (튜브 C2)을 단백질 펠 릿을 이동한 95% 에탄올의 최대 1.5 mL를 추가 합니다. 소용돌이 하자 그것은 20 분 동안 RT에 앉아.
- 원심 관 C2 5300 x g 4 ° c.에 5 분에서 삭제는 상쾌한 고 60 분 동안 50 ° C에서 5 %SDS 300 µ L에서 펠 릿 실시간 디졸브에서 10 분 동안 건조 하는 펠 릿.
참고: 장시간 외피 단백질 펠 릿을 완전히 해산 필요할 수 있습니다. 과거에는, 펠 릿은 되었습니다 incubated 최대 6 h에 대 한 품질을 희생 하지 않고도. - 원심 관 C2 13500 x g 17 ° c.에서 10 분에서 새로운 튜브에는 상쾌한을 이동 합니다.
- 세제와 호환 되는 기본 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 농도 측정 합니다.
참고: 단백질은 SDS-PAGE 그리고 서쪽에 게 더 럽 히기에서 사용 될 준비가 되어 있습니다. 그것은 나중에 사용-20 ° C에 저장할 수 있습니다. LC-MS/MS, 같은 다른 기술에 대 한 세제를 dialyzed 해야 합니다.
3. 평가 mRNA와 단백질 수준
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실시간 정량
- 1 반전 녹음 방송으로 cDNA를 준비 다음 thermocycler 프로토콜을 사용 하 여 RNA의 ng: 리버스 전사 (46 ° C에서 20 분), 및 RT 비활성화 (95 ° C에서 1 분) (25 ° C에서 5 분), 못쓰게.
- CDNA의 주식 접시 96 잘 접시의 개별 우물을 각 cDNA 샘플의 1: 100 희석의 100 µ L을 추가 하 여 확인 합니다. 템플릿/물 전용 웰 스, 그리고 1:400 (분석 하는 샘플의 모든 풀링된 cDNA와 유래)에 1시 25분에서 직렬로 희석된 샘플 등의 적절 한 컨트롤을 포함 설정할 각 유전자 분석에 대 한 입문서 효율 표준 곡선에 대 한 허용.
참고: 이 형식은 실시간 정량 접시에 접시에서 모든 샘플의 전송 및 잘-투-잘 pipetting 변형 완화를 위한 96-잘 microdispenser와 함께 사용할 수 있습니다. 적절 한 마스터 믹스 (예를 들어, SYBR + 뇌관) 다중 채널 피 펫과 각각 잘 그 후 추가할 수 있습니다. 전반적으로,이 접근 손을 pipetting 각 샘플, 따라서 더 가변성을 감소 하는 경우 오류를 줄일 수 있습니다. - 실시간 정량 Pcr 격판덮개의 우물을 주식 판에서 cDNA의 3 µ L를 추가 합니다.
- 앞으로 및 역방향 뇌관, 샘플 당 최대 7 µ L를 물 DNA intercalating cyanine 염료, 5 µ M 각의 포함 하는 1 x supermix를 포함 하는 뇌관의 각 집합에 대 한 마스터 믹스를 확인 합니다. 실시간 정량 Pcr 플레이트의 적절 한 우물을 7 µ L을 추가 하 고 가볍게 섞어 선동.
참고: 측정 결과20정상화에 대 한 참조로 사용 하는 하우스키핑 유전자 샘플을 포함 합니다. - 프라이 머 사용 되 고 있는 실시간 정량 Pcr 프로토콜을 사용 하 여 접시를 실행 합니다.
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서쪽 오 점
참고: 서쪽 오 점에 대 한 자세한 내용은, 마흐무드와 양21를 참조 하십시오.- 2 x Laemmli 샘플 버퍼와 10 분 동안 95 ° C에 종 기의 동일한 양으로 20 µ g 단백질의 결합 하 여 SDS 페이지에 대 한 샘플을 준비 합니다.
- 4%-15% 트리 스-글리신 젤에 샘플을 로드 하 고 150 V 1 h, 또는 염료 전면 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 그들을 실행 합니다.
- 젤에서 25 V semidry 전송 장치에서 30 분에 니트로 막 단백질을 전송.
- 막 Ponceau S 얼룩과 얼룩 여 적절 한 전송을 확인 합니다.
- 철저 하 게 씻어 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 0.01% 폴 20 (TBS-T)와 함께 막에서 얼룩.
- 실시간에서 1 시간에 대 한 TBS T에 5% 탈지 우유와 함께 막 차단
- 공급 업체의 권장 사항에 따라 적합 한 희석에서 1 차적인 항 체에 멤브레인을 품 어. 두고 4 ° C에서 로커에 하룻밤.
- 씻고 막 3 x 5 분 각, TBS.와
- 공급 업체의 권장 사항에 따라 적절 한 희석에 적절 한 이차 항 체에 멤브레인을 품 어. 실시간에서 1 h 로커에 두고
- 씻고 막 3 x 5 분 각, TBS.와
- 이미지 하 고 계량 기본 방법을 사용 하 여 서쪽 오 점.
Representative Results
RNA, DNA, 단백질 샘플 분석 되었다, 그리고 대표적인 결과 RNA 및 단백질 격리를 사용 하 여 여기에 표시 됩니다. 또한, 우리는 일반적인 RIPA 세포의 용 해 방법22에 GTCp 메서드를 사용 하 여 수확 단백질 견본을 비교 합니다. 우리의 실험 각 WT (N2) 웜 및 2 개의 긴 돌연변이 웜, 먹고 2 및 rsks-123,24의 4 개의 독립적인 복제 사용 했습니다.
RNA와 DNA 수량 및 품질
물 50 µ L에 resuspended 때 RNA의 농도 0.2-2에서 240 µ g / µ L로 시작 물자 벌레 약 3000 성인을 사용 하 여. 흡 광도 비율, 순도 나타내는 나타내는 GTCp 등의 구성 요소, 페 놀 또는 guanidine 염 산 염과 오염 없이 RNA의 성공적인 추출 A260/A280에 대 한 2.2와 1.9 ~ 2.5 A260/A230 (표 1)에 대 한 2.0에서 배열 했다.
DNA 추출 성공 했지만 변수 였습니다. DNA 농도 0.04에서 1.1 µ g / µ L에 배열 했다 NaOH의 150 µ L에 resuspended 때. 나타내는 DNA;의 성공적인 추출에서에서 배열 했다 1.8 2.1 A260/A280 및 0.9 1.6 A260/A230 (표 1)에 대 한 흡 광도 비율 그러나, 일부 샘플의 GTCp 구성 요소, 페 놀 또는 guanidine 염 산 염 같은 오염 했다. DNA 격리가 필요한 경우 주의 해야 한다 GTCp 단계 별거에서 중간 계층을 분리 하는 때 그리고 더 세척 할 수 있습니다.
선택한 대상의 실시간 정량
각 웜 스트레인의 4 개의 독립적인 샘플에서 RNA 격리 성공적이 고 후속 실시간 정량 cyanine 염료를 포함 하는 supermix를 사용 하 여 수행 된 RNAseq 분석에 대 한 보냈습니다. 실시간 정량 Pcr 분석 대상 WT 벌레에 비해 두 돌연변이에 일반적인 차동 가장 통제 유전자를 기반으로 대형 RNAseq 데이터 집합에서 선정 됐다. F07C4.1225, 인간의 neuroligin 3, isoform b, 하 체 선택 된 공유 upregulated 대상 이었다. 우리는 또한 두 돌연변이, mrp-126, 먹고 2 벌레에 upregulated 하지만 downregulated rsks-1 웜에서 추가 분석을 위해 사이 차동 규제 유전자 포함. 실시간 정량 Pcr;를 통해 mrp-1 의 식 변화 확인 그러나, rsks-1 웜 RNAseq 분석에 의해 예측에서 F07C4.12 upregulation 하지 RT-정량 (그림 1)에 의해 보였다.
벌레에 대 한 유효성을 검사 하는 항 체와 추가 대상으로 조사 되었다. 이들은 여러 세포 기관이 마커 Hadwiger 외27특징 포함. 이러한 마커 수 차동 돌연변이 벌레에 mRNA 수준에서 표현 되었다. 그림 1에서 보듯이 lmp-128 및 dlg-129 했다 upregulated 먹고 2 웜;에 hsp-4 30, hsp 7030와 lmp-1 rsks-1 웜;에서 upregulated 했다 hsp-60 31 와 파-732 했다 downregulated 먹고 2 웜;에 hsp-60 와 전술-133 downregulated rsks-1 웜에서 했다.
동시 대 RIPA 단백질 준비
GTCp 메서드를 위에서 설명한 대로 단백질의 품질과 효율성을 맹세, 우리 RIPA 세포22의 전통적인 방법을 사용 하 여 수집 하는 단백질에 그것을 비교. 소재, 즉 성인 전용 (약 10000 웜) 또는 성인, 애벌레, 그리고 계란 (약 130000 웜)의 혼합된 인구를 시작 하는 동일한 금액을 사용 하 여 전체 수량 GTCp으로 수집 했다 동등한 끝 볼륨 (표 1에서에서 resuspended 때 덜 ); 그러나, 성인 전용 인구에서 추출 혼합된 인구에서 보다 더 성공적 이었다. 또한, 단백질의 품질 GTCp 추출 단백질 Coomassie 얼룩 그림2에서에서 같이 총 단백질의 동등한 로드를 따라 더 큰 단백질의 더 나은 해상도 보여주었다 이기는 하지만, 비슷 했다. 실제로, 그림 3 에서 서쪽 오 점 하 여 평가 대상 대부분의 경우; 비슷한 수준을 보였다 그러나, 75 kDa 보다 큰 단백질 RIPA 추출 단백질 (그림 3A, 오른쪽 차선; GTCp 추출 단백질에 비해 낮은 수준을 보였다 그림 3B, 노란색 막대).
여기에 제시 된 추출 방법 또한 포유류 세포 라인 헬러에서 평가 되었습니다. 참고로, RIPA 6 백만 HeLa 세포 (25 µ L 펠 릿)의 소형 펠 릿에서 추출 하는 단백질의 양을 벌레 (한 ~ 75 µ L 소형 펠 릿)의 130000 혼합된 인구에서 추출 된 비교 또는 무엇의 약 절반은 10, 000에서 추출 표 1에서 본 성인 벌레 (한 ~ 100 µ L 중력 침전 펠 릿). 우리는 단백질 추출 (표 1)의 효율성과 더 큰 단백질 (그림 2)의 해상도 GTCp RIPA 추출 단백질 HeLa 세포에 비해이 기술은 작동의 성인 인구에서 더 나은 제안에 감소 보여 웜. GTCp 추출 헬러 단백질에서 단백질 펠 릿의 불완전 한 가용 화 포유류 세포에서이 방법의 제한 될 수 있습니다.
실시간 정량 Pcr 분석 Immunoblotting 대상
다음으로, 우리는 mRNA 수준이 단백질 수준 연관 경우 확인 하려면 실시간 정량 Pcr에 의해 시험 하는 유전자 제품의 단백질 수준 조사. 그림 3에서 보듯이 단백질의 평균 식 변화 많은 대상;에 대 한 변경 평균 mRNA 식 연관 그러나, 일부 단백질 수준의 mRNA 수준에서 변화를 반영 하지 않았다. 종종, 먹고 2 벌레에 mRNA 수준 다른 긴장에 그 보다 높은 했지만 단백질 수준을 동일 또는 동일한 대상의 다른 긴장 보다 낮은. 가장 뛰어난 관찰 했다 dlg-1 의 매우 높은 수준의 더 많은 단백질;를 번역 하지 않았다 먹고 2 벌레에 mRNA 사실, 다른 긴장 (그림 3)에 비해 낮은 dlg-1 단백질 수준을 했다.
마지막으로, GTCp 추출 단백질에 RIPA 추출 단백질 수준의 현저한 차이 보였다. RNA; 모두 같은 방식으로 추출 된 그러나, 현저 하 게 나타났다 RIPA 세포에 의해 수집 된 유사 하지만 별도 샘플 (그림 3A, 오른쪽 차선; 75 kDa 보다 큰 사람들을 위해 특히 단백질 수준 감소 그림 3B, 노란색 막대).
MRNA와 단백질 레벨의 intrasample 비교
이 프로토콜의 목표 중 하나는 우리는 mRNA에서 본 변화 단백질 레벨은 진짜, 또는 경우 그것은 intersample 변이의 아티팩트 수를 확인 했다. 그림 4, 대상의 하위 집합은 단일 샘플 내에서 비교 되었다. 각 개별 샘플 같은 그늘과 샘플 1 어두운 그늘과 샘플 4 (식사-2), 회색 (WT), 블루의 가벼운 그늘 또는 빨강 (rsks-1)으로 도트의 색상으로 표시 됩니다. 대부분의 샘플 내 단백질 수준, semiquantitative 서쪽 오 점 분석의 잠재적인 결함이 큰 가변성 mRNA 수준 낮은 변화가 했다. MRNA와 단백질 쌍 사이의 색된 점 들의 각각의 위치에서 볼 때, 가장 높은-낮은 순서 종종 일치 하지 않는; 예를 들어, WT에 hsp 60 mRNA 순서는 샘플 4, 3, 2, 1, 하지만 단백질 레벨 1, 2, 3, 4를 했다. 따라서, 샘플에서 mRNA와 단백질 수준 간의 차이 확실히 존재 하지만 제시 메서드 수 사용자가 관찰 된 차이의 가능한 근원으로 컬렉션의 시간을 제거할 수 있습니다.
표 1: 농도 흡수 비율. RNA와 DNA의 농도 및 순도 비율을 분 광 광도 계에 측정 되었다. 단백질 농도 색도계 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 결정 했다. 회색, 파랑 및 빨강 실시간 정량 및 서쪽 오 점을 위해 사용 하는 샘플을 강조 표시 합니다. 노란색은 RIPA 단백질 추출 또는 웜 헬러 단백질 단백질 GTCp를 비교 하는 데 사용 하는 샘플을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1: 실시간 정량 Pcr에 의해 유전자 발현. RNAseq 데이터에서 그리고 세포 기관이 마커 유전자의 식별 대상 확인이 방법에 의해 얻은 mRNA에 대 한 실시간 정량 분석. 오차 막대를 나타내는 표준 편차; n = 4. MRNA의 농도 뇌관의 각 집합에 대 한 표준 곡선에 대 한 정의 했다. 모든 mRNA 수준 법-1, cdc-42, 의학-1, nhr 23, pmp-3, 그리고 신 시아-1를 포함 하는 참고 유전자로 사용 6 내부 관리 유전자의 세트의 평균에 정상화 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 비교 GTCp-웜 및 HeLa 세포에 RIPA 추출 단백질 대. 야생-타입 (WT) 웜 또는 GTCp 또는 RIPA 세포의 용 해 방법, SDS 페이지 구분 Coomassie blue로 얼룩진 통해 수확 하는 HeLa 세포에서 총 단백질. 각 차선에는 전체 단백질의 25 µ g을 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 벌레에 단백질 수준. (A) 실시간 정량 및 (B) densitometry 분석 신호 강도 의해 조사 대상의 서쪽 오 점. 각 차선에는 야생-타입 (WT), 식사-2, 또는 rsks-1 돌연변이 웜 총 GTCp 추출 단백질의 20 µ g을 포함 되어 있습니다. 표시 된 이미지는 웜 변형 당 4 개의 독립적인 복제의 표현입니다. Β-걸 (아래); 각 대상에 대 한 동일한 로드 제어에 사용 된 대표적인 집합 하나만 표시 됩니다. 오른쪽 차선에서 rsks-1 돌연변이 웜 총 RIPA 추출 단백질의 20 µ g를 포함합니다. (B) 해당 신호 강도 ImageJ를 사용 하 여 계량 했다. 오차 막대를 나타내는 표준 편차; n = 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Intrasample mRNA와 단백질 수준 비교. 각 변형에 대 한 대상의 하위 집합에서 개별 샘플에서 mRNA와 단백질 수준 정렬 됩니다. 색은 표 1의 대표. 회색/검은색 WT, 파란색은 먹을 2이며 빨간색은 rsks-1. mRNA와 단백질 같은 대상의 서로 짝 이며 선 충 변형으로 구분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
DNA, RNA 및 단백질, 같은 biomolecule 격리 방법 자주 기술 중복 또는 조합 없이 최적화 됩니다. 이것은 특히 불리 한 샘플을 하기 어려운 경우는 서로 다른 시간에 동일한 조건 하에서 샘플을 채취 이어질 수 있습니다. 세포 경로 따라 서로 다른 시간에 수집 하는 복제 변화를 생성할 수 있습니다. 이 원고 동시 분리와 각 biomolecule 벌레, 다른 절연 기술에 의해 도입 된 유사 감소의 동일한 샘플 샘플 수확의 타이밍에서에서의 정화 함으로써이 장애물을 우회 하는 절차를 제공 합니다. 또는 부동 한 수확입니다. 이러한 변수를 제어 뿐만 아니라 시간과 리소스를 절약할 수 있지만 또한 재현성을 용이 하 게. 여기, DNA와 가변 결과와 타협 RNA와 단백질 품질을 방지 하는 조합 접근 방식을 설명 합니다. 준비는 DNA 청소 절차를 사용 하 여 추가 최적화 수 있습니다. 우리는 선 충 C. 선 충 및 HeLa 세포에서 자료를 사용 하 여 접근을 설명 했다.
수명4,34,35 확장 하는 메커니즘을 포함 하 여 다양 한 경로에 대 한 통찰력을 제공 하는 이전 작업 transcriptome와 N2 WT 동물과 먹고 2 및 rsks-1 돌연변이의 프로테옴 ,36. 글로벌 단백질 합성의 전반적인 downregulation가지고 안정 동위 원소 라벨 세포 배양 (SILAC) 분석을 먹고 2 웜 발견에서 아미노산에 의해/와 수명 연장에 열 량 제한의 메커니즘을 조사 하기 위해, 36. 여기에 제시 된 데이터는이 찾는 일치도 동일한 표적 mRNA 수준의 크게 증가 했다. 다른 그룹 S6K 중재 하는 장 수의 이펙터를 식별 하는 목적으로 하 고, 따라서, rsks-1 웜34의 proteomic 화면을 수행. RNAseq 데이터는 현재의 연구와 함께,에서 우리는 단백질;이 화면에서 확인을 확증 하는 적어도 3 개의 유전자 확인 MRP-1과와 neuroligin (F07C4.12)의 homologs 차동 rsks-1 웜 WT N234에 비해 표현 되로 발견 되었다.
이 메서드를 사용 하 여 생성 하는 데이터는 이전 multiomic 조사에 일치 합니다. 9 표적 mRNA 수준의 각 샘플의 단백질 수준을 예측 하 사용 되었다. 이러한 목표의 많은 예측 가능한 단백질 수준의 mRNA 수준에 따라 했다. 그럼에도 불구 하 고, mRNA와 단백질 수준 사이 주목할 만한 차이가 있었다. 중요 한 것은, 여기에 제시 된 의정서는 자신 있게 평가 하 고 동일한 샘플에서 mRNA와 단백질을 수집 하 여 intersample 다양성을 제거 하 여 이러한 차이 해석 하는 과학자를 허용 한다. 또한, 우리는 단백질 수준 동일한 샘플에서 수집 또는 수확 RIPA와 비슷하지만 다른 샘플에서 수집 된 mRNA 수준 비교. 우리는 RIPA 추출 샘플에 있는 단백질의 많은 저수준 있었다 그는 대상의 수에 대 한 보였다. Intersample 변형에 대 한 제어 없이 그것 것 수 없습니다 알고이 차이 mRNA와 단백질의 차등 규제 때문 이었다.
특히 이러한 다른 고분자에 맞게 최적화 된 프로토콜 있다는 것을 명심 하는 것이 중요 하다 횡단면 분석 실험의 최종 목표는 아닙니다, 후 그것 것 대신 그 방법을 채택 관련. DNA 및 단백질 분리 GTCp를 사용 하 여 발생 하는 NaOH, 같은 약한 자료에 DNA의 재구성을 요구 하 고 불완전 한 위험 난방, 세제의 높은 농도 가진 버퍼에 단백질 solubilizing 덜 용 해 되도록 가용 화입니다. 또한, GTCp guanidinium 안산은 프로 테아 제 같은 효소, 산 성 페 놀을 포함 하지만 천천히 떨어집니다 단백질 시간이 지남에 고정 하지 않는 한. 그것은 만약 이러한 제한 우회 가치가 될 것입니다 결정 하는 연구원의 판단 될 것입니다.
중요 한 것은, RNA, 메 마른 기술, 별도로 언급 하지 않는 한 얼음 샘플을 유지 하 고 상업적으로 사용할 수 있는 실행의 사용을 작업할 때 시 약은 RNA를 그대로 유지 하 것이 좋습니다. 특히, 큰 샘플 필요 합니다 더 많은 GTCp로 시작 하는 각 추출 용 매는 또한 필요 하기. 이 프로토콜은 GTCp의 정확한 양을 사용 하는 경우 웜 또는 셀 샘플의 어떤 수동 균질을 필요 하지 않습니다. DNA 분리의 맥락에서 수익률 높은 유기 (핑크) 레이어를 복구 하는 능력에 따라 달라 집니다. 마지막으로, 격리 중 단백질의 가용 화를 개선 하기 위해 resolubilization 버퍼의 볼륨을 증가 하거나 다른 세제 외에 SDS 추가 할 수 있습니다. 실제로, 성인, 애벌레, 그리고 계란의 혼합물 대신 벌레의 성인 전용 인구에서 단백질은 resolubilize을 훨씬 더 쉽게.
전반적으로,이 프로토콜을 사용 하 여 biomolecule 격리에 대 한 통합된 접근 하며 별도로 다른 생체 수확에서 발생할 수 있는 mRNA와 단백질 수준 간 상관 관계, 또는 그 부족의 해석 용이 샘플입니다. 이 메서드를 사용 하 여 올바르게 경우 단백질 mRNA의 번역은 상호 다양 한 조건에서 posttranscriptional 및 posttranslational 규제 메커니즘의 더 깊은 조사를 이어질 수 있습니다 식별 하는 과학자를 도울 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
L.r.l. 투자 되었다에 의해 부여 NIH/NIA (AG042494 R00, R01 AG051810)에서 생물 학적 메커니즘의 노화와 미국 연맹에서 주니어 교수 그랜트 연구에 대 한 의료 연구 상 재단법인 글렌 노화 연구에 대 한. 저자 애니 타 쿠마와 시 콴 웡이이 원고 작성에 유용한 피드백에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels | BIORAD | 4568084 | |
| Antibodies: | |||
| CePAS7-s | DHSB- U of Iowa | ||
| CeTAC1-s | DHSB- U of Iowa | ||
| DLG1-s | DHSB- U of Iowa | ||
| GRP78 | Novus Bio. | NBp1-06274 | |
| HRP Goat Anti-Mouse | Li-Cor | 926-80010 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit | Li-Cor | 92680011 | |
| HSP60-s | DHSB- U of Iowa | ||
| LMP1-s | DHSB- U of Iowa | ||
| MRP-1 | Abcam | ab24102 | |
| Neuroligin 3 | Abcam | ab172798 | |
| β-actin | Millipore | MAB1501R | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BIORAD | ||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Health hazard, Irritant, Toxic |
| Coomassie Brilliant Blue | ThermoSci | 20279 | |
| DC Protein assay | BIORAD | 500-0116 | |
| Epoch 2 microplate reader | BioTek | ||
| Ethanol (200 proof) | Fisher | 04-355-223 | Flammable, health hazard |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | BSL2 |
| iScript Reverse Transcription Supermix | BIORAD | 1708840 | |
| Hydra microdispenser: Matrix Hydra | Robbins/ThermoFisher | ||
| Isopropanol | Fisher | A516-4 | Flammable, health hazard |
| M9 buffer: 3 g KH2PO4 6 g Na2HPO4 5 g NaCl Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving. After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4 |
|||
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BIORAD | 161-0737 | |
| NanoDrop One | ThermoSci | ||
| PAGE apparatus | BIORAD | ||
| Ponceau S | Alfa Aesar | J60744 | |
| Primers | IDT | 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting | |
| dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA GGCAGTTGAG-3') R (5'-CACGTCCGTT AACCTCTCCC-3') |
|||
| hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT GTCAACCCAG-3') R (5'-TCGTCAGGGT TGATTCCACG-3') |
|||
| hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA ACGTGCTAAG-3') R (5'-GAGCAGTTGA GGTCCTTCCC-3') |
|||
| hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT CGACGAGCGA-3') R (5'-CAACACCTCC TCCTGGAACG-3') |
|||
| lmp-1: F (5'-ACAACAACAC CGGACTCACG-3') R (5'-ATCGAGCTCC CACTCTTTGG-3') |
|||
| tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC AAAGTTCCTC-3') R (5'-TGAGCACCTT GATCTCGTCG-3') |
|||
| pas-7: F (5'-GTACGCTCAA AAGGCTGTCG-3') R (5'-CTGAATCGGC ATTGGCTCAC-3') |
|||
| mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC GCTTGTTCTG-3') R (5'-AGTTCCAGTG CGGAGCATAC-3') |
|||
| F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT GAAGGACTGT-3') R (5'-TGGCAATAGC TCCTCCGTTG-3') |
|||
| HK Actin: F (5'-CTACGAACTT CCTGACGGACAAG-3') R (5'-CCGGCGGACT CCATACC-3') |
|||
| HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT GGAGTTGTTC-3') R (5'-TCCGTAGATT GATTCACCAC-3') |
|||
| HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT GAAGAACGCG-3') R (5'-CGATCTGCAG TGAATAGCTC-3') |
|||
| HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG GAGTCACACC-3') R (5'-CATCCTCCTT CATTGAACGG-3') |
|||
| HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA GGAAGATTACG-3') R (5'-CTCGGACATT CTCGAATGAAG-3') |
|||
| HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT TCATCACTCAT-3') R (5'-ACACCGTCGA GAAGCTGTAGA-3') |
|||
| LightCycler 96 qPCR machine | Roche | ||
| RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0.2% SDS 140 mM NaCl 1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL |
|||
| SsoAdvanced Universal SYBR Supermix | BIORAD | 1725274 | |
| SuperSignal West Femto Max Sens Substrate | ThermoSci | 34095 | |
| Trans-Blot Transfer apparatus | BIORAD | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIORAD | 170-4159 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | Health hazard (skin, eyes) |
| Worm strains: | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| N2 (wild type) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| eat-2 (MAH95) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| rsks-1 (VB633) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
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