Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinert Nucleotide og Protein utdrag i Caenorhabditis elegans

Published: March 17, 2019 doi: 10.3791/59178
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for isolering av RNA og DNA protein fra samme prøven, i et forsøk på å redusere variasjon, forbedre reproduserbarhet og lette tolkninger.

Abstract

Et enkelt biologiske utvalg har en overflod av informasjon, og det er nå vanlig praksis å samtidig undersøke flere makromolekyler for å fange opp et komplett bilde av flere molekylær behandling og mellom ulike forhold. Denne protokollen presenterer metoden isolere DNA, RNA, og protein fra samme utvalget av Rundormer Caenorhabditis elegans fjerne variasjonen introdusert når disse biomolecules er isolert fra av tilsvarende behandlet men til slutt forskjellige prøver. Nucleic syrer og proteiner er Hentet fra Rundormer hjelp av syre guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform utvinning metoden, med påfølgende nedbør, vask og solubilization av hver. Vi viser vellykket isolering av RNA og DNA protein fra et enkelt utvalg av tre stammer av Rundormer og HeLa celler, med bedre protein isolasjon resultater i voksen dyr. I tillegg oppløsningen guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform-utdraget protein fra nematoder for større proteiner, med forbedret Detektbart nivåer som observert av immunoblotting, sammenlignet med tradisjonelle RIPA utvinning av protein.

Metoden som presenteres her er nyttig når undersøke prøver ved å bruke et multiomic tilnærming, spesielt for utforskning av proteom og transcriptome. Teknikker som samtidig vurdere multiomics er tiltalende fordi molekylær signalnettverk underliggende komplekse biologiske fenomener er antatt å skje på supplerende nivåer; Det har imidlertid blitt stadig vanligere å se at endringer i mRNA nivåer ikke gjenspeiler alltid den samme endringen i protein nivå og at anvist er relevant i forbindelse med circadian forskrifter. Denne metoden fjerner alle intersample varianter når assaying forskjellig innhold innenfor samme prøven (intrasample.)

Introduction

Multiomics, den analytiske tilnærmingen som bruker en kombinasjon av Omika, som genom, proteom, transcriptome, epigenome, microbiome eller lipidome, har blitt stadig mer populært ved behandling av store datasett for sykdom karakterisering1, 2. Montering bevis har vist at begrense tilnærminger til en enkelt "ome" gir en ufullstendig molekylær analyse (anmeldt av Rotroff og Motsinger-Reif1). Store datasett er generert, spesielt når skjermer med høy gjennomstrømming teknikker, men male et fullstendig bilde eller identifisere de viktigste målene, multiomic tilnærminger er å foretrekke. Med bruk av multiomics, men er det hyppige observasjon av avvik mellom mRNA og protein nivåer3,4,5,6. Spesielt er mRNA og protein brukes for side-ved-side transcriptomic og proteomic analyser med RNA sekvensering (RNAseq) og flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), henholdsvis, ofte Hentet fra tilsvarende behandlet prøver fra forskjellige gjentak, potensielt innføre variasjon mellom de samme forhold3,4,5,6. Harvald et al. utført en elegant C. elegans sult tid-kurs studere det sammenlignet den transcriptome og proteom av vill-type (WT) ormer som klart å etablere-30 mutant ormer som mangler en viktig transkripsjon faktor i longevity 7. Legg merke RNA og protein ble høstet fra de samme tilstand gjentak, så ikke fra samme eksempel. Deres funn viser liten sammenheng mellom mRNA nivåer og protein nivå på hvert tidspunkt (r = 0.559 til 0.628). Faktisk, deres heatmap dannet fire klynger: klyngen jeg hadde en stor nedgang i mRNA nivåer men liten eller ingen reduksjon i tilsvarende protein nivå, Cluster II hadde liten eller ingen økning i mRNA nivåer men en økning i protein nivå, Cluster III hadde en økning i mRNA nivåer men en nedgang i protein nivå og klynge IV hadde en økning i mRNA nivåer, men bare en subtil endring i protein nivå4. I tillegg kan denne intersample varianten bli introdusert i tilfeller hvor prøver av samme betingelse ikke er samlet inn nøyaktig samtidig. For eksempel variere mRNA og proteiner regulert av circadian syklusen avhengig av tidspunktet for dag8,9, eller, mer spesifikt, eksponering for C. elegans lys9; uttrykk for disse circadian proteinene kan være forsinket opptil 8 h etter gene expression induksjon10. Likevel betyr utbredelsen av denne observasjonen ikke nødvendigvis det er galt; Faktisk, kan dette vise seg for å være informativ. Protein og mRNA er i en konstant dynamisk tilstand mellom formasjon og fornedrelse. Videre er proteiner ofte posttranslationally endret å øke stabilitet eller å indusere deres fornedrelse11. For eksempel kan ubiquitination status føre til enten aktivisering eller målretting til proteasome eller lysosome for degradering12. I tillegg spiller noncoding RNAs en viktig rolle i å regulere genuttrykk på transcriptional og posttranscriptional trinn13. Dermed er spørsmålet hvordan du kan begrense variablene for å bekrefte at avvik observert i disse Rundormer studier er ekte.

Her foreslår vi en metode, som fjerner intersample variabelen ved at analyser av ulike makromolekyler fra samme eksempel. Målet med denne protokollen er å tilby en metode for å isolere konsekvent DNA, RNA og protein fra et enkelt utvalg av C. elegans (også referert til som ormer) å redusere variasjon, forbedre reproduserbarhet, og lette tolkninger. Ytterligere fordeler med å bruke samme prøven inkluderer lagring av tid og ressurser under prøvetaking, tilrettelegge cross-sectional analyse av verdifull og begrenset utvalg, inkludert stammer som er vanskelige å vokse og opprettholde, og stadig innsikt i differensial regulering av makromolekyler basert på intrasample variasjoner i mRNA og protein.

Denne metoden er egnet for å vurdere genet uttrykk og protein nivå fra et enkelt utvalg av ormer, muliggjør en mer omfattende evaluering av flere nivåer av molekylære behandling. Guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform (GTCp) reagens14, en brukte kjemiske isolere RNA, brukes for utvinning av nucleic syrer og proteiner fra ormer, med påfølgende nedbør, vask og solubilization av hver. Denne protokollen er en samling av ulike protokoller15,16 med mindre endringer, med fokus på C. elegans, men vi har også lykkes isolert RNA og protein DNA fra pellets HeLa celler etter den samme trinnene. Selv om ikke testet her, er denne protokollen sannsynlig å arbeide på vev17,18.

Protocol

Merk: Hvert Makromolekyl nedbør trinn utføres sekvensielt, etterfulgt av vasker skjer samtidig; Det anbefales imidlertid å fullføre RNA isolasjon først som det er egentlig ustabil.

1. sample samling

  1. Frø 1000 ormen egg per 10 cm plate med passende vekst forhold19. Inkuber ved 20 ° C i 72 h.
    Merk: Bleach egg-bærende voksne for å samle egg som tidligere beskrevet19.
  2. Vaske platen med ca 5 mL av M9 buffer og samle 1000 voksen ormer i et rør.
    Merk: M9 buffer består av 35 mM natrium fosfat dibasic, 102 mM natriumklorid, 22 mM kalium fosfat monobasic og 1 mM Magnesiumsulfat i sterilt vann19.
  3. Sentrifuge ormer 1000 x g for 1 min, forkaste nedbryting og overføre pelleted ormer med 1 mL av M9 buffer til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  4. Sentrifuge igjen 845 x g for 1 min og kast mesteparten av nedbryting. Lagre pelleted ormer ved-80 ° C i minst 4 timer.
    Merk: Bruke frosset pellets gir en høyere avkastning enn friske pellets. En rekke fryse/tine sykluser med flytende nitrogen eller 95% etanol på tørris for å sprekk ormen cuticle anbefales hvis bruker ferske pellets. Avreise en liten mengde M9 pellet vil hjelpe bryte cuticle når fryser.

2. nucleotide og Protein isolasjon

  1. Fjern alle nedbryting fra de tinte pellet og legge 1 mL kaldt GTCp reagens. Bland godt av pipettering opp og ned. Plasser prøven på is 10 min og bland det noen ganger ved å vri det opp ned.
    Forsiktig: Fenol er etsende, nevrotoksisk og svært giftig og kan forårsake kjemiske forbrenninger og blindhet.
    Merk: Vi brukte opp til 5000 voksen ormer som utgangsmaterialet med rapporterte volumer; hvert volum er basert på bruk av 1 mL av GTCp-reagensen. Når du bruker et større utvalg, kan det være nødvendig å utvide.
  2. Løsningen av ormer og GTCp, legger du til 200 µL av kaldt kloroform. Holder røret mellom fingrene og rist kraftig for 15 s. la det ved romtemperatur (RT) for 3 min.
    Forsiktig: Kloroform er en giftig irriterende, kan føre til hud sores og andre målrettede orgel skade, og er et mulig karsinogen.
  3. Sentrifuge røret 13.500 x g i 15 min på 4 ° C.
    Merk: Tre lag er dannet etter dette: toppen, klart vandige fasen, bunnen, rosa organisk fase og den lille, skyet interphase som inneholder lipider og DNA.
  4. Bruker brønnene, Flytt det klart øverste laget (vandige fasen) til en ny RNase uten 1,5 mL microcentrifuge tube (rør A) å isolere RNA via alkohol nedbør (som beskrevet i trinn 2.5) og flytte rosa laget (organisk fase) fra det gjenværende pellet til en ny tube ( rør B) og plassere den på isen.
    Merk: Den rosa organiske fasen kan være frosset om-80 ° C til isolering av DNA og proteiner fra dette eksemplet. Større prøver vil produsere en tykk hvit lag mellom den vandige og organiske fasen. Denne fraksjonen inneholder DNA. Hvis dette laget kan fjernes uten å forstyrre andre faser, gjøre det og sette det i en egen tube (rør B2).
  5. Isolere RNA slik.
    1. Fra den klare vandige fasen i rør A, utløse RNA med 500 µL av 100% isopropanol. Inkuber i 10 min på RT. Deretter sentrifuge tube A på 13.500 x g i 10 min på 4 ° C.
      Merk: Små hvite pellets av skal vises nederst i røret.
    2. Dekanter flertallet av nedbryting. Fjerne resten med en 1 mL sprøyte med en nål og kast nedbryting.
      Merk: Størrelsen på nålen er ikke viktig; imidlertid tilbyr en større nål måler mer kontroll for ikke å forstyrre pellet. Brønnene kan brukes hvis nåler ikke er tilgjengelig.
    3. Legge til 1 mL av 75% etanol tube A for å vaske pellet. Spin røret 5300 x g i 5 min på 4 ° C.
    4. Fjern nedbryting fra pellet ved dekantere vin og bruke en 1 mL sprøyte med en nål, som beskrevet i trinn 2.5.2, og kaste den.
    5. La pellet air-dry for 5-10 minutter, men ikke la det overdry. Bruk 50 µL av RNase-fritt vann for å gjeninnføre pellet av før det blir helt gjennomsiktig.
      Merk: Dette er et tilstrekkelig Start volum for 1000-3000 ormer, men det må justeres avhengig av hvor mye utgangsmaterialet brukte.
    6. Inkuber pellet på 55-60 ° C i 10 min å oppløse den.
    7. Måle konsentrasjonen og renheten bruker et spektrofotometer. Registrere absorbances på 260 nm for RNA konsentrasjon og 230 og 280 nm å identifisere urenheter.
    8. Rengjør RNA for å fjerne eventuelle forurensninger, som fenol rester eller DNA, enten kolonne rensing eller med påfølgende etanol vasker og DNase behandling.
      Merk: På dette punktet, RNA er klar til å sendes til RNAseq analyse eller kan brukes til å lage cDNA bruke RT-qPCR (se avsnitt 3.1 for detaljer). RNA kan lagres ved-80 ° C til fremme bruk.
  6. Isolere DNA som følger.
    1. Fra den rosa organiske fasen i rør B og prøven i rør B2, eventuelt utløse DNA av tilføyer 300 µL av 100% etanol og blanding av inversjon. La lysrør på RT for 2-3 minutter.
    2. Sentrifuge rør B og B2 på 375 x g i 5 min på 4 ° C pellets DNA.
    3. Flytte nedbryting fra rør B og B2 ved å helle den i en ny 2 mL tube (rør C) og la den på is påfølgende protein isolasjon. Vaske DNA pellet i rør B eller B2 med 1 mL av 0.1 M natriumsitrat i 10% etanol for 30 min. sentrifuge rør B og B2 på 375 x g i 5 min på 4 ° C.
      Merk: Natrium binder til DNA ryggraden, gjør DNA bunnfall lettere i natriumsitrat og etanol, slik at urenheter fjernes ved lav hastighet sentrifugering.
    4. Gjenta trinnet vask som beskrevet i trinn 2.6.3. Resuspend pellet i 1,5 mL av 75% etanol og la den på RT for 20 min, med sporadiske blanding av upending.
    5. Sentrifuger rør B og B2 på 375 x g i 5 min på 4 ° C.
    6. Forkast nedbryting og la dem tørke for 5-10 minutter.
    7. Oppløse pellet i 150 µL av 8 mM natriumhydroksid. Juster til ønsket pH med HEPES om nødvendig. Spin prøven på 375 x g i 5 min på 4 ° C.
    8. Bruker brønnene, flytte nedbryting (DNA) til en ny tube. Måle konsentrasjonen og bestemme renheten bruker et spektrofotometer. Registrere absorbances på 260 nm for DNA konsentrasjon og 230 og 280 nm å identifisere urenheter.
  7. Isolere protein som følger.
    1. For å utløse protein, legge til opptil 1,5 mL av 100% isopropanol rosa nedbryting i rør C, blanding ved å snu flere ganger, og ruge på RT i 10 min.
    2. Sentrifuge tube C 13.500 x g i 10 min på 4 ° C.
    3. Forkaste nedbryting og vaske pellets med 2 mL 0,3 M guanidine hydroklorid i 95% etanol etter 20 min på RT. sentrifuge tube C 5300 x g i 5 min på 4 ° C.
    4. Gjenta trinnet vask som beskrevet i trinn 2.7.3 2 x.
    5. Flytte protein pellets til en ny 1,5 mL tube (rør C2) og legge til opptil 1,5 mL 95% etanol. Vortex og la det sitte på RT for 20 min.
    6. Sentrifuge tube C2 5300 x g i 5 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting og la pellet tørke i 10 min på RT. oppløses pellet i 300 µL 5% eksponeringsmåter ved 50 ° C for 60 min.
      Merk: Lengre inkubasjon tid kan pålegges å oppløse fullt protein-pellets. Tidligere har pellet blitt ruget for opptil 6 h uten å ofre kvalitet.
    7. Sentrifuge tube C2 13.500 x g i 10 min på 17 ° C. Flytte nedbryting til en ny tube.
    8. Måle konsentrasjonen med en foretrukket protein kvantifisering analysen som er kompatibel med vaskemiddel.
      Merk: Proteinet er klar til å brukes i SDS side og vestlige blotting. Det kan lagres på 20 ° C for fremtidig bruk. For andre teknikker, for eksempel LC-MS/MS, må vaskemiddel være dialyzed av.

3. evaluere mRNA og Protein nivå

  1. RT-qPCR
    1. Klargjør cDNA ved omvendt transkripsjon med 1 ng av ved hjelp av følgende thermocycler-protokollen: grunning (5 min ved 25 ° C), omvendt transkripsjon (20 min på 46 ° C) og RT inaktivering (1 min på 95 ° C).
    2. Gjøre en lager plate av cDNA ved å legge til 100 µL av 1: 100 fortynninger av hvert cDNA utvalg individuelle brønner av en 96-brønns plate. Inkluderer aktuelle kontroller, for eksempel ingen mal/vann-bare brønner og serielt fortynnede prøver fra 1:25 til 1:400 (stammer med grupperte cDNA fra alle de analyserte prøvene) å ha en standard kurve å etablere primer-effektivitet for hver genet analysert.
      Merk: Dette formatet kan brukes med 96-brønnen microdispenser, som tillater overføring av alle prøvene i en plate til en RT-qPCR plate og reduksjon av godt-å-godt pipettering varianter. Aktuelle master mix (f.eks SYBR + primere) kan legges til hver godt etterpå, med en flerkanals pipette. Alt reduserer dette feilene når hånd-pipettering hver prøve, dermed ytterligere redusere variasjonen.
    3. Legge 3 µL av cDNA fra lager platen fordelt av RT-qPCR plate.
    4. Gjøre en master blanding for hvert sett med primer som inkluderer 1 x supermix som inneholder en DNA-intercalating cyanine fargestoff, 5 µM hver av fremover og reversere primere, og vann opptil 7 µL per prøve. Legg 7 µL riktig fordelt av en RT-qPCR plate og agitere lett for å blande.
      Merk: Inkluder prøver å måle housekeeping gener bruke som referanse til å normalisere resultatene20.
    5. Kjøre platen med en RT-qPCR-protokoll som er egnet for primerne brukes.
  2. Western blot
    Merk: For detaljert informasjon om vestlige blots, se Mahmood og Yang21.
    1. Forberede prøver SDS-side ved å kombinere 20 µg protein med en lik mengde 2 x Laemmli eksempel Buffer og kok til 95 ° C i 10 min.
    2. Last eksemplene på en 4%-15% Tris-glycine gel og kjøre dem på 150 V 1t eller til fargestoff foran når bunnen av gel.
    3. Overføre proteiner fra gel til en nitrocellulose membran på 25 V i 30 min i en semidry overføring apparater.
    4. Bekrefte riktig overføring av farging membranen med Ponceau S flekken.
    5. Grundig vask flekker fra membranen med Tris-bufret saltvann (TB) med 0,01% polysorbat 20 (TBS-T).
    6. Blokkere membranen med 5% nonfat melk i TBS-T 1t på RT.
    7. Inkuber membranen i primære antistoffer på den aktuelle fortynning ifølge leverandørens anbefalinger. La den på rocker på 4 ° C over natten.
    8. Vask membranen 3 x, i 5 minutter hver, med TBS-T.
    9. Inkuber membranen i riktig sekundære antistoffer på den aktuelle fortynning ifølge leverandørens anbefalinger. La den på rocker 1t på RT.
    10. Vask membranen 3 x, i 5 minutter hver, med TBS-T.
    11. Bilde og kvantifisere western blot, bruke foretrukne metodene.

Representative Results

RNA og DNA protein prøvene ble analysert og representant resultater ved hjelp av RNA og protein isolat presenteres her. I tillegg sammenligne vi protein prøven høstet bruke metoden GTCp til det vanlige RIPA lysis metode22. For våre eksperimentet brukte vi fire uavhengige gjentak hver WT (N2) ormer og to varige mutant ormer, spise-2 rsks-123,24.

RNA og DNA kvantitet og kvalitet

Konsentrasjonen av RNA når resuspended i 50 µL vann varierte fra 0,2 – 2 µg/µL, bruker rundt 3000 voksen ormer som utgangsmaterialet. Absorbansen forholdstallene, som indikerer renhet, varierte 2.0 2.2 for A260/A280 og 1,9 til 2,5 for A260/A230 (tabell 1), som indikerer vellykket utvinning av RNA uten forurensning med GTCp komponenter, for eksempel fenol- eller guanidine hydroklorid.

DNA utvinning var vellykket, men kvaliteten var variabel. DNA konsentrasjonen når resuspended i 150 µL av NaOH varierte fra 0,04 til 1.1 µg/µL. Absorbansen forholdstallene varierte fra 1,8 til 2.1 for A260/A280 og 0,9 til 1.6 for A260/A230 (tabell 1), som indikerer vellykket utvinning av DNA; men var noen av prøvene forurenset med GTCp komponenter, som fenol- eller guanidine hydroklorid. Hvis DNA isolasjon er nødvendig, må utvises ved skille det midterste laget fra GTCp fase separasjon og flere vasker kan være nødvendig.

RT-qPCR valgt mål

RNA isolasjon fra fire uavhengige utvalg av hver orm stamme var vellykket, og ble sendt for RNAseq analyse, med påfølgende RT-qPCR utført ved hjelp av en supermix som inneholder en cyanine farge. Mål analysert av RT-qPCR ble valgt fra store RNAseq datasett basert på mest ulikt regulert genene felles i begge mutanter sammenlignet med WT ormer. F07C4.1225, en homolog til menneskelig neuroligin 3, isoformen b, var valgte delte upregulated målet. Vi har også inkludert et ulikt regulert gen mellom begge mutanter, mrp-126, for ytterligere analyse, som var upregulated i spise-2 ormer men downregulated i rsks-1 ormer. Uttrykket endringer av mrp-1 ble bekreftet via RT-qPCR; F07C4.12 oppregulering i rsks-1 ormer spådd av RNAseq analysen var imidlertid ikke sett av RT-qPCR (figur 1).

Ekstra mål med antistoffer godkjent for ormer ble undersøkt også. Disse inkluderte flere organelle markører preget i Hadwiger et al.27. En rekke disse markørene var ulikt uttrykt på mRNA nivå i mutant ormer. Som vist i figur 1, var lmp-128 og dlg-129 upregulated i spise-2 ormer; HSP-4 30og hsp-7030 lmp-1 ble upregulated i rsks-1 ormer; HSP-60 31 og pas-732 var downregulated i spise-2 ormer; HSP-60 og tac-133 var downregulated i rsks-1 ormer.

Samtidige vs RIPA protein forberedelse

For å bekrefte effektiviteten og kvaliteten av protein med metoden GTCp som beskrevet ovenfor, sammenlignet vi den protein samlet med mer tradisjonelle metoden RIPA lysis22. Bruker samme mengde starter materiale, nemlig voksne (10.000 ormer) eller en blandet befolkning av voksne, larver og egg (ca 130 000 ormer), var det totale antallet samlet med GTCp mindre når resuspended i lik slutten bind (tabell 1 ); men var utvinning fra en uegnet befolkning mer vellykket enn fra en blandet befolkning. I tillegg var kvaliteten på proteiner lignende, men GTCp-utpakkede protein viste en bedre oppløsning på større proteiner på lik lasting totale protein, som vist av Coomassie flekk i figur 2. Faktisk viste mål evalueres ved western blot i Figur 3 lignende nivåer i de fleste tilfeller; men proteiner større enn 75 kDa viste lavere nivåer i RIPA-utpakkede protein sammenlignet med GTCp-utpakkede protein (figur 3A, høyre felt; Figur 3B, gule linjen).

Utvinning metoden presenteres her ble også vurdert i pattedyr cellen linje jakten. For referanse, mengden av protein utvunnet med RIPA kompakt pellets seks millioner HeLa celler (et ~ 25 µL pellet) var sammenlignes Hentet fra en 130.000 blandet befolkning av ormer (et ~ 75 µL kompakt pellet), eller halvparten av hva er Hentet fra 10.000 voksen ormer (et ~ 100 µL tyngdekraften oppgjør pellets), sett i tabell 1. Vi viser at effektiviteten av protein utvinning (tabell 1) og oppløsningen for større proteiner (figur 2) ble redusert i GTCp sammenlignet med RIPA-utpakkede protein i HeLa celler, tyder denne teknikken fungerer bedre i en voksne befolkning ormer. Den ufullstendige solubilization av protein pellet fra GTCp-utpakkede HeLa protein kan være en begrensning av denne metoden i pattedyrceller.

Immunoblotting mål analysert av RT-qPCR

Neste, vi undersøkt protein nivåene av genet produktene testet av RT-qPCR til å avgjøre hvis mRNA nivåene korrelert med protein nivåer. Som vist i Figur 3, endres gjennomsnittlig uttrykk protein korrelert med gjennomsnittlig mRNA uttrykkene endret for mange mål; imidlertid noen protein nivå ikke gjenspeiler endringene i mRNA nivåer. Ofte mRNA nivåer i spise-2 ormer var høyere enn i de andre belastninger, men protein nivåene var den samme eller lavere enn de andre stammene med samme mål. Den mest fremragende observasjonen var svært høy grad av dlg-1 mRNA i spise-2 ormer, som ikke oversette til mer protein; faktisk var det lavere dlg-1 protein nivå i forhold til de andre belastninger (Figur 3).

Endelig nivåer i GTCp-utpakkede protein og protein RIPA-utpakkede viste en slående ulikhet. RNA ble pakket ut på samme måte for begge; men redusert lignende men separat prøven samlet av RIPA lysis viste markant protein nivåer, spesielt for de større enn 75 kDa (figur 3A, høyre felt; Figur 3B, gule linjen).

Intrasample sammenligning av mRNA og protein

En av målene for denne protokollen var å avgjøre om variasjonen vi så på mRNA og protein var ekte, eller om det kan være en gjenstand av intersample variasjon. I Figur 4, ble et delsett av mål sammenlignet innen enkelt prøvene. Hver enkelt prøve vises som samme skyggen og fargen på prikken, prøve 1 er den mørkeste skyggen og utvalg 4 som letteste skyggen av grå (WT), blå (spise-2) eller rød (rsks-1). I de fleste prøver var det en lav variasjon mRNA nivåer, med større variasjon på protein nivå, en potensiell feil av semiquantitative analyse av vestlige blots. Når du ser på plasseringen av hver av fargede prikkene mellom mRNA og protein parene, samsvarte rekkefølgen på høyeste til laveste ofte ikke; for eksempel i WT, hsp-60 mRNA ordren var prøve 4, 3, 2, 1, men protein nivåene var 1, 2, 3, 4. Dermed forskjellene mellom mRNA og protein nivåer i et utvalg absolutt eksisterer, men presentert metoden innrømmer brukernes å fjerne anvist som en mulig kilde av observerte forskjellen.

Table 1
Tabell 1: konsentrasjoner og absorpsjon forholdstall. RNA og DNA konsentrasjoner og renhet forholdstall ble målt på et spektrofotometer. Protein konsentrasjoner var fast bestemt på å bruke en kolorimetrisk protein kvantifisering analysen. Den grå, blå og røde markere prøvene RT-qPCR og western blot. Gule angir prøver som brukes til å sammenligne GTCp RIPA protein utvinning eller orm protein HeLa protein. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figure 1
Figur 1: genuttrykk av RT-qPCR. RT-qPCR analyse for mRNA ved denne metoden bekrefter mål identifisert RNAseq data og organelle markør gener. Feilfeltene representerer standardavvik; n = 4. Konsentrasjonen av mRNA ble definert mot en standardkurven for hvert sett med primere. Alle mRNA nivåer var normalisert til gjennomsnittet av et sett av seks housekeeping gener som referanse gener, inkluderer act-1, cdc-42, ama-1, nhr-23, pmp-3og cyn-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: sammenligning av GTCp-kontra RIPA-utpakkede protein i ormer og HeLa celler. Totalt protein fra vill-type (WT) ormer eller HeLa celler høstet via GTCp eller RIPA lysis metoden, atskilt med SDS-side, og farget med Coomassie blå. Hver fil inneholder 25 µg totale protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Protein nivå i worms. (A) Western blot mål etterforsket av RT-qPCR og (B) densitometry analyse av signalet. Hver fil inneholder 20 µg totalt GTCp-utpakkede protein fra vill-type (WT), spise-2eller rsks-1 mutant ormer. Bildet som vises er en representasjon av fire uavhengige replikat per ormen belastning. Β-utgangen (nederst) ble brukt til å kontrollere for lik lasting for hvert mål; eneste representant sett vises. Høyre felt inneholder 20 µg totale RIPA-utpakkede protein fra rsks-1 mutant ormer. (B) tilsvarende signal intensiteter kvantifisert bruker ImageJ. Feilfeltene representerer standardavvik; n = 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Intrasample mRNA og protein nivå sammenligning. MRNA og protein nivåene fra personlige prøver fra et delsett av mål for hver stamme er justert. Fargen er representant i tabell 1. Den grå/svart er WT, blå er spise-2og rødt er rsks-1. mRNA og protein med samme mål er tilkoblet hverandre og adskilt av Rundormer stamme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Metoder for biomolecule isolasjoner, som DNA, RNA og proteiner, er ofte optimalisert uten teknisk overlapping eller kombinasjoner. Dette er spesielt ufordelaktig når prøvene er vanskelig å få, som kan føre til høsting prøvene under de samme forholdene til ulike tider. Avhengig av mobilnettet veier, kan gjentak samlet på forskjellige tider generere variasjon. Dette manuskriptet tilbyr en prosedyre for å omgå dette hinderet ved å aktivere den samtidige isolasjon og rensing av hver biomolecule fra samme eksempel ormer, redusere variasjoner introdusert av forskjellige isolasjon teknikker, tidspunktet for eksempel harvest, eller ulike høsting. Kontrollere disse variablene ikke bare sparer tid og ressurser, men også forenkler reproduserbarhet. Her viser vi en kombinasjon tilnærming som unngår kompromitterende RNA og protein kvalitet, men med variable resultater med DNA. Preparater kan optimaliseres videre med DNA rengjøring prosedyrer. Vi viste tilnærming med materiale fra Rundormer C. elegans og HeLa celler.

Tidligere arbeid transcriptome og proteom N2 WT og spise-2 og rsks-1 mutanter har tilbudt innsikt i ulike veier, inkludert mekanismer som forlenge levetiden4,34,35 ,36. I en anstrengelse å undersøke mekanismen av kalori begrensning i å utvide levetiden, har en stabil isotop merking av/med aminosyrer i celle kultur (SILAC) analyse fant at spise-2 ormer en samlet downregulation av global proteinsyntese 36. dataene som presenteres her er forenlig med dette funnet, selv om mRNA nivåene av samme mål er sterkt økt. En annen gruppe som mål å identifisere effektor av S6K-mediert levetid og dermed utført en proteomic skjerm med rsks-1 ormer34. Fra RNAseq data funnet med denne studien, identifisert vi tre gener som bekrefte med proteiner identifisert fra denne skjermen. MRP-1 og homologs av CPA og neuroligin (F07C4.12) ble oppdaget som ulikt uttrykt i rsks-1 ormer i forhold til WT N234.

Dataene som genereres ved hjelp av denne metoden er konsekvent med tidligere multiomic undersøkelser. MRNA nivåer av ni mål ble brukt til å forutsi protein nivå i hver prøve. Av disse målene hadde mange forutsigbar protein nivå basert på mRNA. Likevel var det kjente avvik mellom mRNA og protein. Viktigere, tillater protokollen presenteres her forskere å trygt evaluere og tolke disse forskjellene ved å fjerne intersample variasjon ved å samle mRNA og protein fra samme eksempel. Videre sammenlignet vi mRNA nivåene til protein nivåer innhentet fra samme utvalget eller innhentet fra et lignende, men ulike utvalg høstet med RIPA. Vi viste at en rekke mål, det var mye lavere nivåer av protein i RIPA-utpakkede prøven. Uten å kontrollere for intersample varianten, ville det være umulig å vite om denne forskjellen var differensial regulering av mRNA og protein.

Det er viktig å huske at det er protokoller som er optimalisert for disse ulike makromolekyler, så hvis en cross-sectional analyse ikke er det endelige målet med forsøket, så det ville være relevant å ansette disse metodene i stedet. Bruke GTCp for å isolere DNA og proteiner forårsaker dem til å bli mindre løselig, krever rekonstituering DNA i en svak base, som NaOH, og solubilizing proteinet i en buffer med høy konsentrasjon av vaskemiddel med oppvarming, risikoen for ufullstendig solubilization. I tillegg GTCp inneholder guanidinium thiocyanate og sure fenol, som deaktiverer enzymer som proteaser, men svekke langsomt protein over tid med mindre frosset. Det vil være å skjønn forskeren å avgjøre hvis omgåelse av disse begrensningene vil være verdt.

Viktigere, når du arbeider med RNA, en steril teknikk, holde prøven på is ikke annet og bruken av kommersielt tilgjengelig decontaminating anbefales reagens å holde RNA intakt. Spesielt, trenger større prøver mer GTCp å begynne med, der hver utvinning løsemiddel må også skaleres. Denne protokollen krever ikke noen manuell homogenisering av ormen eller cellen prøvene når riktig mengde GTCp brukes. I forbindelse med DNA isolasjon er avkastningen svært avhengig av ferdighet å gjenopprette organisk (rosa) laget. Til slutt, for å forbedre solubilization av proteiner under isolasjon, øke volumet av resolubilization buffer eller legge til andre vaskemidler foruten SDS kan være nødvendig. Proteiner fra en uegnet befolkning av ormer i stedet for en blanding av voksne, larver og egg er faktisk mye lettere å resolubilize.

Total, bruker denne protokollen gir en integrert tilnærming til biomolecule isolasjoner og forenkler tolkningen av sammenhenger, eller mangel derav, mellom mRNA og protein som kan oppstå fra separat høsting biomolecules fra forskjellige prøver. Denne metoden kan hjelpe forskere til å identifisere riktig oversettelsen av mRNA protein er ikke correlative og kan føre til dypere etterforskningen av posttranscriptional og posttranslational regelverkets mekanismer under ulike forhold.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

L.R.L. ble finansiert av tilskudd fra NIH/NIA (R00 AG042494 og R01 AG051810), en Glenn Foundation for medisinsk forskning Award biologiske mekanismer av aldring og Junior fakultetet stipend fra American Federation for aldring forskning. Forfatterne vil takke Anita Kumar og Shi Quan Wong for sin nyttig tilbakemelding i skrivingen av dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels BIORAD 4568084
Antibodies:
CePAS7-s DHSB- U of Iowa
CeTAC1-s DHSB- U of Iowa
DLG1-s DHSB- U of Iowa
GRP78 Novus Bio. NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse Li-Cor 926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit Li-Cor 92680011
HSP60-s DHSB- U of Iowa
LMP1-s DHSB- U of Iowa
MRP-1 Abcam ab24102
Neuroligin 3 Abcam ab172798
β-actin Millipore MAB1501R
ChemiDoc MP Imaging System BIORAD
Chloroform Fisher C298-500 Health hazard, Irritant, Toxic
Coomassie Brilliant Blue ThermoSci 20279
DC Protein assay BIORAD 500-0116
Epoch 2 microplate reader BioTek
Ethanol (200 proof) Fisher 04-355-223 Flammable, health hazard
HeLa cells ATCC CCL-2 BSL2
iScript Reverse Transcription Supermix BIORAD 1708840
Hydra microdispenser: Matrix Hydra Robbins/ThermoFisher
Isopropanol Fisher A516-4 Flammable, health hazard
M9 buffer:
3 g KH2PO4
6 g Na2HPO4
5 g NaCl
Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving.
After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4
Laemmli Sample Buffer (2x) BIORAD 161-0737
NanoDrop One ThermoSci
PAGE apparatus BIORAD
Ponceau S Alfa Aesar J60744
Primers IDT 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA
GGCAGTTGAG-3')
R (5'-CACGTCCGTT
AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT
GTCAACCCAG-3')
R (5'-TCGTCAGGGT
TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA
ACGTGCTAAG-3')
R (5'-GAGCAGTTGA
GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT
CGACGAGCGA-3')
R (5'-CAACACCTCC
TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC
CGGACTCACG-3')
R (5'-ATCGAGCTCC
CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC
AAAGTTCCTC-3')
R (5'-TGAGCACCTT
GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA
AAGGCTGTCG-3')
R (5'-CTGAATCGGC
ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC
GCTTGTTCTG-3')
R (5'-AGTTCCAGTG
CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT
GAAGGACTGT-3')
R (5'-TGGCAATAGC
TCCTCCGTTG-3')
HK Actin: F (5'-CTACGAACTT
CCTGACGGACAAG-3')
R (5'-CCGGCGGACT
CCATACC-3')
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT
GGAGTTGTTC-3')
R (5'-TCCGTAGATT
GATTCACCAC-3')
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT
GAAGAACGCG-3')
R (5'-CGATCTGCAG
TGAATAGCTC-3')
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG
GAGTCACACC-3')
R (5'-CATCCTCCTT
CATTGAACGG-3')
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA
GGAAGATTACG-3')
R (5'-CTCGGACATT
CTCGAATGAAG-3')
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT
TCATCACTCAT-3')
R (5'-ACACCGTCGA
GAAGCTGTAGA-3')
LightCycler 96 qPCR machine Roche
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.2% SDS
140 mM NaCl
1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix BIORAD 1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate ThermoSci 34095
Trans-Blot Transfer apparatus BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIORAD 170-4159
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 Health hazard (skin, eyes)
Worm strains: Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (wild type) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
eat-2 (MAH95) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
rsks-1 (VB633) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. Embracing Integrative Multiomics Approaches. International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).
  2. Chen, R., Snyder, M. Promise of personalized omics to precision medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).
  3. Anderson, L., Seilhamer, J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).
  4. Harvald, E. B., et al. Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans. Cell Systems. 5 (1), (2017).
  5. Griffin, T. J., et al. Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).
  6. Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).
  7. Lapierre, L. R., et al. The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 4, 2267 (2013).
  8. Doherty, C. J., Kay, S. A. Circadian control of global gene expression patterns. Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).
  9. Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).
  10. Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).
  11. Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).
  12. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).
  13. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  14. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  15. Triant, D. A., Whitehead, A. Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples. Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).
  16. Liu, X., Harada, S. RNA Isolation from Mammalian Samples. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  17. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
  18. Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2006).
  20. Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans. BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).
  21. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J. Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer. Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. Kurien, B. T., Scofield, R. H. , Humana Press. 37-47 (2012).
  23. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  24. Pan, K. Z., et al. Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).
  25. Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium. Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).
  26. Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).
  27. Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans. PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).
  28. Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).
  29. Firestein, B. L., Rongo, C. DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation. Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).
  30. Heschl, M. F., Baillie, D. L. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA. 8 (4), 233-243 (1989).
  31. Yoneda, T., et al. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).
  32. Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference. Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).
  33. Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo. Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).
  34. McQuary, P. R., et al. C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension. Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).
  35. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans . Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  36. Yuan, Y., et al. Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).

Tags

Biologi problemet 145 multiomics Proteomikk transcriptomics RNAseq RT-qPCR western blot DNA RNA protein C. elegans guanidinium thiocyanate
Kombinert Nucleotide og Protein utdrag i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, J., McConnell, E.,… More

Mills, J., McConnell, E., Leitão, J. A., Lapierre, L. R. Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59178, doi:10.3791/59178 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter