Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinerade nukleotid och Protein extraktioner i Caenorhabditis elegans

Published: March 17, 2019 doi: 10.3791/59178
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för isolering av RNA, DNA och protein från samma prov, i ett försök att minska variationen, förbättra reproducerbarhet och underlätta tolkningar.

Abstract

Ett enda biologiska prov rymmer en uppsjö av information, och det är nu vanligt att samtidigt undersöka flera makromolekyler för att fånga en fullständig bild av flera nivåer av molekylär bearbetning och förändringar mellan olika förhållanden. Detta protokoll presenterar metoden att isolera DNA, RNA, och protein från samma prov av Nematoden Caenorhabditis elegans ta bort variationen introducerades när dessa biomolekyler är isolerade från replikat av behandlats på liknande sätt men i slutändan olika prover. Nukleinsyror och proteiner extraheras från Nematoden med syra guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform utvinning metod, med efterföljande nederbörd, tvätt och lösbarhet av varje. Vi visar den framgångsrika isoleringen av RNA, DNA och protein från ett enda prov från tre stammar av Nematoden och HeLa celler, med bättre protein isolering resultat hos vuxna djur. Dessutom förbättrar guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform-extraherade protein från nematoder upplösningen på större proteiner, med förbättrad detekterbara halter såsom immunoblotting, jämfört med traditionella RIPA utvinning av protein.

Metoden presenteras här är användbart när du undersöker prover med en multiomic metod, speciellt för utforskandet av de proteomet och transkriptom. Tekniker som samtidigt bedöma multiomics är tilltalande eftersom molekylär signalering underliggande komplexa biologiska fenomen är tänkt att ske på kompletterande nivåer. Det har dock blivit allt vanligare att se att förändringar i mRNA nivåer inte alltid återspeglar samma förändring i proteinnivåer och att tiden för samling är relevant i samband med dygnsrytm förordningar. Denna metod tar bort någon intersample variant när testmetoder olika innehåll inom samma prov (intrasample.)

Introduction

Multiomics, den analytiska metod som använder en kombination av omics, såsom genomet, proteomet, transkriptom, epigenomet, mikrobiomet eller lipidome, har blivit allt populärare vid bearbetning av stora datamängder för sjukdom karakterisering1, 2. Montering bevis har visat att begränsa förhållningssätt till en enda ”ome” ger en ofullständig molekylär analys (granskas av Rotroff och Motsinger-Reif1). Stora datamängder skapas, särskilt när du utför skärmar med hög genomströmning tekniker, men för att måla en komplett bild eller för att identifiera de mest relevanta mål, multiomic tillvägagångssätt är att föredra. Med användningen av multiomics metoder finns det dock frekvent observationen av avvikelser mellan mRNA och protein nivåer3,4,5,6. Särskilt, som mRNA och protein används för side-by-side transcriptomic och proteomiska analyser med RNA-sekvensering (RNAseq) och flytande kromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS), respektive, ofta erhålls från likaså behandlade prover från olika replikat, potentiellt införa variation mellan samma villkor3,4,5,6. Harvald et al. utförde en elegant C. elegans svält tidsförlopp studie som jämförde den transkriptom och proteomet av vildtyp (WT) maskar med hlh-30 mutant maskar som saknar en viktig transkriptionsfaktor i livslängd 7. notera den RNA och protein skördades från replikerar den samma skick, så inte från samma prov. Deras resultat visar en låg korrelation mellan mRNA nivåer och proteinnivåer vid varje tidpunkt (r = 0.559 till 0.628). I själva verket deras heatmap bildade fyra kluster: klustret hade jag en stor minskning av mRNA nivåer men liten eller ingen minskning motsvarande proteinnivåer, Cluster II hade liten eller ingen ökning i mRNA nivåer men en ökning av proteinnivåer, kluster III hade en ökning av mRNA nivåer men en minskning av proteinnivåer och kluster IV hade en ökning av mRNA nivåer men endast en subtil förändring i protein nivåer4. Denna intersample variation kan dessutom införas i fall där proverna på samma skick inte samlas in vid exakt samma tidpunkt. Till exempel varierar mRNA och proteiner regleras av dygnsrytm cykeln beroende på tidpunkten för dag8,9, eller, mer specifikt, C. elegans exponering för ljus9. uttryck av dessa dygnsrytm proteiner kan fördröjas upp till 8 h efter gen uttryck induktion10. Dock betyder prevalensen av denna observation inte nödvändigtvis det som är fel; i själva verket kan detta visa sig vara informativ. Protein och mRNA är i ett konstant dynamisk tillstånd mellan bildning och nedbrytning. Dessutom modifieras proteiner ofta posttranslationally att öka stabilitet eller framkalla deras nedbrytning11. Exempelvis kan deras ubikvitinering status antingen leda till aktivering eller inriktning till proteasom eller Lysosomen för nedbrytning12. Dessutom spela icke-kodande RNAs en viktig roll i reglering av genuttryck vid transkriptionell och postttransskriptionell steg13. Alltså, frågan är hur du begränsar variablerna för att bekräfta att de avvikelser som vi observerar i dessa nematoder studier är verkliga.

Här föreslår vi en metod som tar bort variabeln intersample genom att låta analyser av olika makromolekyler från samma prov. Målet med detta protokoll är att erbjuda en metod för att konsekvent isolera DNA, RNA och protein från ett enda prov av C. elegans (också kallad maskar) i ett försök att minska variationen, förbättra reproducerbarhet och underlätta tolkningar. Ytterligare fördelar med att använda samma prov är besparingen av tid och resurser under provtagning, underlätta tvärsnittsdata analysen av värdefull och begränsad prov, inklusive stammar som är svåra att växa och bibehålla, och få insikter om differentierad reglering av makromolekyler utifrån intrasample variationer i mRNA och protein nivåer.

Denna metod är lämplig för att bedöma genuttryck och proteinnivåer från ett enda prov av maskar, vilket möjliggör en mer omfattande utvärdering av flera nivåer av molekylär bearbetning. Guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform (GTCp) reagens14, en vanligt förekommande kemiska att isolera RNA, används för utvinning av nukleinsyror och proteiner från maskar, med efterföljande nederbörd, tvätt och lösbarhet av varje. Detta protokoll är en sammanställning av olika protokoll15,16 med mindre modifieringar, designad med fokus på C. elegans, men vi har också framgångsrikt isolerat RNA, protein och DNA från en pellet av HeLa cells efter den samma steg. Även inte testas här, är detta protokoll benägna att arbeta på vävnader samt17,18.

Protocol

Obs: Varje makromolekyl nederbörd steg utförs sekventiellt, följt av tvättar gjort samtidigt; Det rekommenderas dock att slutföra RNA isoleringen först eftersom det är oupplösligt instabil.

1. provtagning

  1. Frö 1 000 mask ägg per 10 cm platta med lämpliga tillväxt villkor19. Inkubera vid 20 ° C i 72 h.
    Obs: Bleka ägg-bärande vuxna för att samla ägg som tidigare beskrivits19.
  2. Tvätta plattan med cirka 5 mL M9 buffert och samla 1 000 vuxna maskar i ett rör.
    Obs: M9 buffert består av 35 mM natriumfosfat dibasisk, 102 mM natriumklorid, 22 mM kalium fosfatbuffert monobasiskt och 1 mM magnesiumsulfat i sterilt vatten19.
  3. Centrifugera maskar vid 1 000 x g i 1 min, avlägsna supernatanten och överföra pelleterat maskar med 1 mL av M9 buffert till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  4. Centrifugera igen 845 x g för 1 min och kasta de flesta av supernatanten. Lagra pelleterat maskar vid-80 ° C i minst 4 h.
    Obs: Använda en fryst pellet ger en högre avkastning än en färsk pellet. En rad frysas och tinas cykler med flytande kväve eller 95% etanol på torris för att knäcka mask nagelbanden rekommenderas om du använder en färsk pellet. Lämna en liten mängd M9 på pelleten hjälper bryta nagelbanden när frysning.

2. nukleotid och Protein isolering

  1. Ta bort eventuella supernatanten från den tinade pelleten och tillsätt 1 mL kallt GTCp reagens. Blanda väl genom pipettering upp och ner. Placera provet på is i 10 min och blanda det ibland genom att vrida den upp och ner.
    Varning: Fenol är frätande, neurotoxiska och mycket giftiga och kan orsaka kemiska brännskador och blindhet.
    Obs: Vi använde upp till 5 000 vuxna maskar som utgångsmaterial med de rapportera volymerna; varje volym är baserad på användning av 1 mL GTCp reagens. När du använder ett större urval, kan det vara nödvändigt att skala upp.
  2. Till lösningen av maskar och GTCp, tillsätt 200 µL kallt kloroform. Håll röret mellan fingrar och skaka kraftigt för 15 s. lämna det i rumstemperatur (RT) i 3 min.
    Varning: Kloroform är en irriterande giftigt, kan orsaka hud sår och andra skador på orgel-riktade och är en möjlig cancerframkallande.
  3. Centrifugera röret vid 13.500 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
    Obs: Tre lager bildas efter detta spinn: toppen, tydlig vattenfasen, botten, rosa organiska fasen och liten, grumlig interphasen som innehåller lipider och DNA.
  4. Med hjälp av en mikropipett, flytta det klart översta lagret (vattenfas) till ett nytt RNase-fri 1,5 mL mikrocentrifug rör (rör A) isolera RNA via alkohol nederbörd (som beskrivits i steg 2.5) och flytta det rosa lagret (organiska fasen) från återstående pelleten till en ny tube ( Tube B) och placera den på isen.
    Obs: Den rosa organiska fasen kan frysas vid-80 ° C tills isolering av DNA och proteiner från det här exemplet. Större prover kommer att producera ett tjockt vitt lager mellan vattenfasen och den organiska fasen. Denna fraktion innehåller DNA. Om detta lager kan tas bort utan att störa de andra faserna, gör så och sätta det i ett separat rör (rör B2).
  5. Isolera RNA som följer.
    1. Från klart vattenfasen i röret A, fällningen RNA med 500 µL 100% isopropanol. Inkubera i 10 min vid RT. Sedan Centrifugera röret A vid 13.500 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
      Obs: En liten vit pellet RNA ska vara synliga på botten av röret.
    2. Dekantera majoriteten av supernatanten. Ta bort resten med en 1 mL spruta med en nål och kasta bort supernatanten.
      Obs: Storleken på nålen är inte viktigt; en större nål mätare kan dock ge mer kontroll så att inte störa pelleten. En mikropipett kan användas om nålar inte är tillgängliga.
    3. Tillsätt 1 mL av 75% etanol till röret A att tvätta pelleten. Snurra röret vid 5300 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
    4. Ta bort supernatanten från pelleten genom dekantering och med en 1 mL spruta med en kanyl, som beskrivs i steg 2.5.2 och kassera den.
    5. Låt pelleten lufttorka för 5 – 10 min, men låt inte det overdry. Använd 50 µL RNase-fritt vatten för beredning pelleten RNA innan det blir helt transparent.
      Obs: Detta är en lämplig start volym för 1.000 – 3.000 maskar, men det kan behöva justeras beroende på hur mycket utgångsmaterial användes.
    6. Inkubera pelleten på 55 – 60 ° C i ca 10 min att upplösa.
    7. Mäta koncentrationen och renheten med en spektrofotometer. Spela in absorbanserna vid 260 nm för RNA-koncentrationen och på 230 och 280 nm att identifiera eventuella orenheter.
    8. Ren RNA för att ta bort eventuella föroreningar, exempelvis fenol rester eller DNA, antingen med kolumn rening eller med efterföljande etanol tvättar och DNAS behandling.
      Obs: Vid denna punkt, RNA är redo att skickas för RNAseq analys eller kan användas för att göra cDNA för RT-qPCR (se avsnitt 3.1 för detaljer). RNA kan lagras vid-80 ° C tills vidare användning.
  6. Isolera DNA som följer.
    1. Från den rosa organiska fasen i röret B och provet i tube B2, om någon, fällningen DNA genom att lägga till 300 µL av 100% etanol och blanda genom inversion. Lämna rör vid RT för 2 – 3 min.
    2. Centrifugera rören B och B2 vid 375 x g i 5 minuter vid 4 ° C till pellet DNA.
    3. Flytta supernatanten från rören B och B2 genom att hälla det i en ny 2 mL tub (röret C) och lämna den på is för efterföljande protein isolering. Tvätta DNA pelleten i röret B eller B2 med 1 mL 0,1 M natriumcitrat i 10% etanol för 30 min. Centrifugera rören B och B2 på 375 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
      Obs: Natrium binder till DNA ryggraden, gör DNA fällning lättare i natriumcitrat och etanol, vilket gör att föroreningar avlägsnas genom låg hastighet centrifugering.
    4. Upprepa tvättningen som beskrivs i steg 2.6.3. Återsuspendera pelleten i 1,5 mL 75% etanol och lämna den på RT för 20 min, med enstaka blandning av upending.
    5. Centrifugera röret B och B2 på 375 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
    6. Avlägsna supernatanten och låter det torka för 5 – 10 min.
    7. Lös pelleten i 150 µL av 8 mM natriumhydroxid. Justera till önskat pH med HEPES vid behov. Snurra provet vid 375 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
    8. Med hjälp av en mikropipett, flytta supernatanten (DNA) till en ny tub. Mätning av koncentrationen och bestämma renheten med en spektrofotometer. Spela in absorbanserna vid 260 nm för DNA-koncentration och på 230 och 280 nm att identifiera eventuella orenheter.
  7. Isolera protein enligt följande.
    1. Fäll ut proteinet genom att lägga till upp till 1,5 mL 100% isopropanol i rosa supernatanten i röret C, blanda genom att vända flera gånger, och inkubera vid RT i 10 min.
    2. Centrifugera röret C vid 13.500 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    3. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 2 mL 0,3 M guanidin hydroklorid i 95% etanol i 20 min på RT. centrifugrör C vid 5300 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
    4. Upprepa tvättningen som beskrivs i steg 2.7.3 2 x.
    5. Flytta den protein pelleten till en ny 1,5 mL tub (tub C2) och lägga till upp till 1,5 mL 95% etanol. Vortex och låt det sitta på RT i 20 min.
    6. Centrifugera röret C2 vid 5300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och Låt pelleten torka i 10 min vid RT. lös pelleten i 300 µL av 5% SDS vid 50 ° C i 60 min.
      Obs: En längre inkubationstid kan åläggas att helt upplösa protein pelleten. Pelleten har tidigare varit inkuberas i upp till 6 h utan avkall på kvalitet.
    7. Centrifugera röret C2 vid 13.500 x g i 10 min vid 17 ° C. Flytta supernatanten till en ny tub.
    8. Mätning av koncentrationen som använder en rekommenderad protein kvantifiering analysmetod som är kompatibel med rengöringsmedel.
      Obs: Proteinet är redo att användas i SDS-PAGE och western blotting. Det kan lagras vid-20 ° C för framtida bruk. För andra tekniker, såsom LC-MS/MS, behöver tvättmedel vara dialyseras bort.

3. utvärdera mRNA och proteinnivåer

  1. RT-qPCR
    1. Förbereda cDNA genom omvänd transkription med 1 ng av RNA, med hjälp av följande termocyklern protokollet: priming (5 min vid 25 ° C), omvänd transkription (20 min på 46 ° C) och RT inaktivering (1 min vid 95 ° C).
    2. Göra ett lager plåt av cDNA genom att lägga till 100 µL av 1: 100 utspädningar av varje cDNA prov till enskilda brunnar i en plattan med 96 brunnar. Inkludera lämpliga kontroller, till exempel ingen mall/vatten endast brunnar och seriellt utspädda prover från 1:25 till 1: 400 (ursprung med poolade cDNA från alla prover analyseras) som möjliggör en standardkurva att upprätta primer effektivitet för varje gen analyseras.
      Obs: Detta format kan användas med den 96-väl microdispenser, som gör det möjligt för överföring av alla prover i en platta till en RT-qPCR-plattan och minskning av väl-att-väl pipettering variationer. Lämpliga huvudmixen (t.ex. SYBR + primers) kan läggas till varje väl därefter, med en flerkanalspipett. Sammantaget minskar detta synsätt fel introducerades när hand-pipettering varje prov, vilket ytterligare minskar variabiliteten.
    3. Lägga till 3 µL av cDNA från lager plattan till brunnarna av RT-qPCR plattan.
    4. Gör en master mix för varje uppsättning primers som innehåller 1 x supermix som innehåller en DNA-infoga cyanin dye, 5 µM varje av framåt och bakåt grundfärger, och vatten upp till 7 µL per prov. Tillsätt 7 µL i lämpliga brunnar av en RT-qPCR-platta och gnugga lätt för att blanda.
      Obs: Inkludera prover för att mäta städning gener att använda som referens för att normalisera de results20.
    5. Kör plattan med en RT-qPCR-protokollet som är lämplig för primers som används.
  2. Western blot
    Obs: För detaljerad information om western blotting, hänvisas till Mahmood och Yang21.
    1. Förbereda prover för SDS-PAGE genom att kombinera 20 µg av protein med en lika stor volym 2 x Laemmli prov buffert och koka vid 95 ° C i 10 min.
    2. Ladda proverna på en 4% – 15% Tris-glycin gel och köra dem på 150 V i 1 h eller tills dye framdel når botten av gelen.
    3. Överföra proteiner från gelen till ett nitrocellulosa membran 25 V för 30 min i en semidry överföring apparatur.
    4. Bekräfta rätt överföringen av färgning membranet med Ponceau S fläck.
    5. Tvätta fläcken från membranet med Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) med 0,01% polysorbat 20 (TBS-T).
    6. Blockera membranet med 5% nonfat mjölk i TBS-T för 1 h på RT.
    7. Inkubera membranet i den primär antikroppen med lämplig utspädning enligt leverantörens rekommendationer. Lämna den på navigeringsknappen vid 4 ° C över natten.
    8. Tvätta membranet 3 x, för 5 min varje, med TBS-T.
    9. Inkubera membranet i lämpliga sekundära antikroppen med lämplig utspädning enligt leverantörens rekommendationer. Lämna den på navigeringsknappen för 1 h på RT.
    10. Tvätta membranet 3 x, för 5 min varje, med TBS-T.
    11. Bild och kvantifiera western blot, med rekommenderad metoder.

Representative Results

RNA, DNA och protein proverna analyserades och representativa resultat med hjälp av RNA och protein isolat som presenteras här. Dessutom jämför vi protein provet skördas med hjälp av metoden GTCp till gemensamma RIPA lysis metod22. I vårt experiment används fyra oberoende replikat för varje WT (N2) maskar och två långlivat mutant maskar, äta-2 och rsks-123,24.

RNA och DNA kvantitet och kvalitet

Koncentrationen av RNA när resuspended i 50 µL vatten varierade från 0,2 – 2 µg/µL, med cirka 3 000 vuxna maskar som utgångsmaterial. Absorbansen kvoten som indikerar renhet, varierade från 2.0 till 2.2 för A260/A280 och 1,9 till 2,5 för A260/A230 (tabell 1), som anger framgångsrika utvinning av RNA utan kontaminering med GTCp komponenter, såsom fenol eller guanidin hydroklorid.

De DNA-extraktionen var framgångsrik, men kvaliteten var variabel. DNA koncentrationen när resuspended i 150 µL av NaOH varierade från 0,04 till 1,1 µg/µL. Absorbansen nyckeltalen varierade från 1,8 till 2.1 för A260/A280 och 0,9 – 1,6 för A260/A230 (tabell 1), som anger den framgångsrika extraktionen av DNA; dock var några av proverna förorenade med GTCp komponenter, som fenol eller guanidin hydroklorid. Om DNA isolering är nödvändig, måste du vara försiktig när separera det mellersta lagret från den GTCp fasseparation och fler tvättar kan behövas.

RT-qPCR av valda målen

RNA isoleringen från fyra oberoende prover av varje mask stam var framgångsrik och skickades för RNAseq analys, med efterföljande Rtqpcr utförs med en supermix innehållande ett cyanin färgämne. Mål analyseras av RT-qPCR valdes från en stor RNAseq datamängd baserat på de mest differentially reglerade generna som är vanliga i båda mutanter jämfört med WT maskar. F07C4.1225, en homolog till mänskliga neuroligin 3, isoform b, var målet för valda delade uppreglerad. Vi har även inkluderat en differentially reglerad gen mellan båda mutanter, mrp-126, för ytterligare analys, vilket var uppreglerad i äta-2 maskar men nedreglerade i rsks-1 maskar. Uttryck förändringar av mrp-1 bekräftades via RT-qPCR; den F07C4.12 uppreglering i rsks-1 worms förutspådde den RNAseq analysen sågs dock inte av RT-qPCR (figur 1).

Ytterligare mål med antikroppar valideras för maskar undersöktes också. Dessa inkluderade flera organell markörer kännetecknas i Hadwiger et al.27. Ett antal av dessa markörer uttrycktes differentially på mRNA-nivå i mutant maskar. Som kan ses i figur 1, var lmp-128 och dlg-129 uppreglerad i äta-2 maskar; HSP-4 30, hsp-7030och lmp-1 var uppreglerad i rsks-1 maskar; HSP-60 31 och pas-732 var nedreglerade i äta-2 maskar; HSP-60 och tac-133 var nedreglerade i rsks-1 maskar.

Samtidig vs. RIPA protein förberedelse

För att bejaka effektivitet och kvalitet av protein med GTCp-metoden som beskrivs ovan, jämfört vi det protein som samlas in med den mer traditionella metoden att RIPA lysis22. Använder samma mängd utgångsmaterial, nämligen antingen endast vuxna (cirka 10.000 maskar) eller en blandad befolkning av vuxna, larver och ägg (ca 130.000 maskar), var den totala kvantitet som samlas in med GTCp mindre när resuspended i lika slutet volymer (tabell 1 ); utvinning från en endast vuxna befolkning var dock mer framgångsrika än från en blandad befolkning. Dessutom var kvaliteten på proteinerna liknande, om än GTCp-extraherade proteinet visade en bättre upplösning av större proteiner vid lika lastning av totalprotein, vilket framgår av Coomassie fläcken i figur 2. Faktiskt visade mål utvärderas av western blot i figur 3 liknande nivåer i de flesta fall; proteinerna som är större än 75 kDa visade dock lägre nivåer i RIPA-extraherade proteinet jämfört med GTCp-extraherade proteinet (figur 3A, högerfilen; Figur 3B, gul bar).

Den extraktionen metod presenteras här utvärderades också i en cellinje från HeLa. För referens, mängden protein som extraheras med RIPA från en kompakt pellet av sex miljoner HeLa cells (en ~ 25 µL pellet) var jämförbar med den utvinns ur en 130.000 blandad befolkning av maskar (en ~ 75 µL kompakt pellet), eller ungefär hälften av vad utvinns från 10.000 vuxna maskar (en ~ 100 µL allvar-fast pellet), som ses i tabell 1. Vi visar att effektiviteten i protein utvinning (tabell 1) och resolution av större proteiner (figur 2) minskade i GTCp jämfört med RIPA-extraherade protein i HeLa celler, vilket tyder på denna teknik fungerar bättre i en vuxen befolkning av maskar. Den ofullständiga lösbarhet av den protein pelleten från GTCp-extraherade HeLa protein kan vara en begränsning av denna metod i däggdjursceller.

Immunoblotting mål analyseras av RT-qPCR

Nästa, vi undersökte de Proteinnivåerna gen produkter testas av RT-qPCR att avgöra om de mRNA nivåerna korrelerade med proteinnivåer. Som kan ses i figur 3, genomsnittliga uttryck ändringarna av protein korrelerade med de genomsnittliga mRNA uttryck ändrats för många mål. dock återspeglade vissa proteinnivåer inte förändringarna i mRNA nivåer. Ofta de mRNA nivåerna i äta-2 worms var högre än i de andra stammarna, men proteinnivåer var antingen samma eller lägre än de andra stammarna av samma mål. Den mest framstående observationen var de mycket höga nivåerna av dlg-1 mRNA i äta-2 maskar, som inte översätta till mer protein; i själva verket fanns det lägre dlg-1 proteinnivåer jämfört med de andra stammarna (figur 3).

Slutligen visade nivåerna i proteinet GTCp-extraherade och proteinet RIPA-utvinns en slående skillnad. RNA extraherades på samma sätt för båda. liknande men separat provet samlas in av RIPA Lys visade markant reducerade emellertid proteinnivåer, särskilt för dem som är större än 75 kDa (figur 3A, högerfilen; Figur 3B, gul bar).

Intrasample jämförelse av mRNA och protein nivåer

Ett av målen i protokollet var att avgöra om variationen vi såg på mRNA och proteinnivå var äkta, eller om det kan vara en artefakt av intersample variation. I figur 4jämfördes en delmängd av mål inom de enskilda proverna. Varje enskilt prov visas som samma nyans och färg på punkten, med prov 1 är den mörkaste nyansen och prov 4 som den ljusaste nyansen av grått (WT), blå (äta-2) eller röd (rsks-1). Inom de flesta prover fanns det en låg variabilitet av mRNA nivåer, med större variation på proteinnivå, en potentiell brist av semikvantitativa analysen av western blotting. När man tittar på placeringen av var och en av de färgade punkterna mellan de mRNA och protein par, matchade ordningen på högsta-till-lägsta ofta inte; till exempel i WT, hsp-60 mRNA ordningen var prov 4, 3, 2, 1, men proteinnivåer var 1, 2, 3, 4. Alltså, visst finns skillnader mellan mRNA och protein nivåer inom ett prov, men den presenterade metoden tillåter användare att ta bort tiden för samling som en möjlig källa till den observerade skillnaden.

Table 1
Tabell 1: koncentrationer och absorption nyckeltal. RNA och DNA koncentrationer och renhet nyckeltal mättes på en spektrofotometer. Protein koncentrationer bestämdes med en kolorimetrisk protein kvantifiering analys. Den grå, blå och röd och belysa de prover som används för RT-qPCR och western blot. Gula visar prover som används för att jämföra GTCp RIPA protein utvinning eller mask protein till HeLa protein. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Figure 1
Figur 1: genuttryck av RT-qPCR. RT-qPCR-analys för de mRNA som erhålls med denna metod, bekräftar mål identifieras från RNAseq data och av organell markörgener. Felstaplar representera standardavvikelse; n = 4. Koncentrationen av mRNA definierades mot en standardkurva för varje uppsättning primers. Alla mRNA nivåer var normaliserade till medelvärdet av en uppsättning av sex städning gener används som referens gener, som inkluderar act-1, cdc-42, ama-1, nhr-23, pmp-3och cyn-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: jämförelse av GTCp-kontra RIPA-extraherade protein i maskar och HeLa cells. Totalt protein från vildtyp (WT) maskar eller HeLa celler skördas via GTCp eller RIPA lysis metod, åtskilda av SDS-PAGE, och färgas med Coomassie blå. Varje lane innehåller 25 µg totalt protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: proteinnivåer i worms. (A) Western blot mål utreds av RT-qPCR och (B) densitometry analys av signalintensitet. Varje lane innehåller 20 µg totalt GTCp-extraherade protein från vildtyp (WT), äta-2eller rsks-1 mutant maskar. Bilden är en representation av fyra oberoende replikat per mask stam. Β-aktin (nederst) användes för att kontroll för lika lastning för varje mål; endast en representativ uppsättning visas. Högerfilen innehåller 20 µg totalt RIPA-extraherade protein från rsks-1 mutant maskar. (B) motsvarande signal stödnivåer kvantifierades använder ImageJ. Felstaplar representera standardavvikelse; n = 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Intrasample mRNA och protein nivå jämförelse. De mRNA och protein nivåerna från enskilda prover från en delmängd av mål för varje stam är justerade. Färgen är företrädare för tabell 1. Den grå/svarten är WT, blå är äta-2och röda är rsks-1. mRNA och protein i samma mål är ihop bredvid varandra och åtskilda av nematoder stam. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Metoder för biomolecule isoleringar, såsom DNA, RNA och proteiner, optimeras ofta utan tekniska överlappningen eller kombinationer. Detta missgynnar särskilt när prover är svåra att uppnå, vilket kan leda till skörd prover på samma villkor vid olika tidpunkter. Beroende på den cellulära vägar, kan replikat som samlas in vid olika tidpunkter generera variant. Detta manuskript erbjuder ett förfarande för att kringgå detta hinder genom att aktivera samtidiga isolering och rening av varje biomolecule från samma prov av maskar, minska variationer infördes genom olika isolering tekniker, tidpunkten för provet skörd, eller upptagning av ojämlika. Kontrollera dessa variabler inte bara sparar tid och resurser, men också underlättar reproducerbarhet. Här visar vi en kombinatorisk syn som undviker att kompromissa RNA och proteinkvalitet, dock med varierande resultat med DNA. Preparat kan optimeras ytterligare med hjälp av DNA Rengöringsrutiner. Vi visat metoden använder material från nematoder C. elegans och HeLa cellerna.

Tidigare arbete att utforska transkriptom och proteomet N2 WT djur och äter-2 och rsks-1 mutanter har erbjudit inblick i olika upptagsvägar, inklusive mekanismer som utökar livslängden4,34,35 ,36. I ett försök att undersöka mekanismen av kalori begränsning i förlänga livslängd, har en stabil isotop märkning med aminosyror i Cell (SILAC) kulturanalys fann att äta-2 maskar en övergripande nedreglering av globala proteinsyntes 36. de data som presenteras här är förenligt med detta konstaterande, även som mRNA nivåer samma mål är ökat kraftigt. En annan grupp syftar till att identifiera effektorer av S6K-medierad livslängd och, således, utförs en proteomiska skärm rsks-1 maskar34. Från RNAseq data hittades med den aktuella studien, identifierat vi minst tre gener som styrker med proteiner identifierats från denna skärm; MRP-1 och homologs av CPA och neuroligin (F07C4.12) upptäcktes som Differentiellt uttryckta rsks-1 maskar jämfört med WT N234.

De data som genereras med hjälp av denna metod överensstämmer med tidigare multiomic undersökningar. MRNA nivåer av nio mål användes för att förutsäga proteinnivåer i varje prov. Av dessa mål hade många förutsägbar proteinnivåer baserat på mRNA nivåer. Ändå fanns det anmärkningsvärda avvikelser mellan de mRNA och protein nivåerna. Ännu viktigare, tillåter det protokoll som presenteras här forskare att tryggt utvärdera och tolka dessa skillnader genom att ta bort intersample variation genom att samla mRNA och protein från samma prov. Dessutom jämförde vi mRNA nivåer protein nivåer samlas in från samma prov eller samlas in från ett liknande men olika prov som skördas med RIPA. Vi visade att för ett antal mål, det fanns mycket lägre nivåer av protein i RIPA-extraheras provet. Utan bestämmande för den intersample variationen, skulle det vara omöjligt att veta om denna skillnad berodde på differentierad reglering av mRNA och protein.

Det är viktigt att komma ihåg att det finns protokoll optimerad speciellt för dessa olika makromolekyler, så om en tvärsnitts analys inte är det slutliga målet för experimentet, då skulle det vara relevant att anställa dessa metoder istället. Använda GTCp för att isolera DNA och protein orsakar dem att bli mindre lösligt, som kräver rekonstitution av DNA i en svag bas, exempelvis NaOH, och solubilizing protein i en buffert med en hög koncentration av tvättmedel med värme, med risk för ofullständig lösbarhet. Dessutom GTCp innehåller guanidinium kaliumtiocyanat och sura fenol, som inaktiverar enzymer såsom proteaser, men försämras långsamt protein över tid om inte fryst. Blir det att avgöras av forskaren att besluta om kringgående av dessa begränsningar kommer att vara värt.

Ännu viktigare, när du arbetar med RNA, steril teknik, att hålla provet på is om inget annat anges och användningen av kommersiellt tillgängliga sanera rekommenderas reagens att hålla RNA intakt. Särskilt behöver större prover fler GTCp till att börja med där varje extraktionslösning måste också skalas upp. Detta protokoll kräver inte någon manuell homogenisering av masken eller cell proverna när rätt mängd GTCp används. I samband med DNA isolering är avkastningen starkt beroende av det kunnande att återställa det ekologiska (rosa) lagret. Slutligen, för att förbättra lösbarhet av proteiner under isolering, öka volymen av resolubilization buffert eller lägga till andra rengöringsmedel förutom SDS kan vara nödvändigt. Proteiner från en endast vuxna befolkning av maskar i stället för en blandning av vuxna, larver och ägg är faktiskt mycket lättare att resolubilize.

Sammantaget använder det här protokollet ger en integrerad biomolecule isoleringar och underlättar tolkningen av korrelationer, eller bristen därav, mellan mRNA och protein nivåer som kan uppstå från separat skörd biomolekyler från olika prover. Med den här metoden kan hjälpa forskarna att identifiera korrekt fall där översättningen av mRNA att protein inte är korrelat och kan leda till djupare utredning av postttransskriptionell och posttranslationalen reglerande mekanismer under olika förhållanden.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

L.R.L. har finansierats genom bidrag från den NIH/NIA (R00 AG042494 och R01 AG051810), en Glenn Foundation för medicinsk forskning Award för forskning i biologiska mekanismer av åldrande och Junior Faculty bidrag från det amerikanska förbundet för åldrande forskning. Författarna vill tacka Anita Kumar och Shi Quan Wong för deras användbara synpunkter i författandet av detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels BIORAD 4568084
Antibodies:
CePAS7-s DHSB- U of Iowa
CeTAC1-s DHSB- U of Iowa
DLG1-s DHSB- U of Iowa
GRP78 Novus Bio. NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse Li-Cor 926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit Li-Cor 92680011
HSP60-s DHSB- U of Iowa
LMP1-s DHSB- U of Iowa
MRP-1 Abcam ab24102
Neuroligin 3 Abcam ab172798
β-actin Millipore MAB1501R
ChemiDoc MP Imaging System BIORAD
Chloroform Fisher C298-500 Health hazard, Irritant, Toxic
Coomassie Brilliant Blue ThermoSci 20279
DC Protein assay BIORAD 500-0116
Epoch 2 microplate reader BioTek
Ethanol (200 proof) Fisher 04-355-223 Flammable, health hazard
HeLa cells ATCC CCL-2 BSL2
iScript Reverse Transcription Supermix BIORAD 1708840
Hydra microdispenser: Matrix Hydra Robbins/ThermoFisher
Isopropanol Fisher A516-4 Flammable, health hazard
M9 buffer:
3 g KH2PO4
6 g Na2HPO4
5 g NaCl
Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving.
After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4
Laemmli Sample Buffer (2x) BIORAD 161-0737
NanoDrop One ThermoSci
PAGE apparatus BIORAD
Ponceau S Alfa Aesar J60744
Primers IDT 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA
GGCAGTTGAG-3')
R (5'-CACGTCCGTT
AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT
GTCAACCCAG-3')
R (5'-TCGTCAGGGT
TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA
ACGTGCTAAG-3')
R (5'-GAGCAGTTGA
GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT
CGACGAGCGA-3')
R (5'-CAACACCTCC
TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC
CGGACTCACG-3')
R (5'-ATCGAGCTCC
CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC
AAAGTTCCTC-3')
R (5'-TGAGCACCTT
GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA
AAGGCTGTCG-3')
R (5'-CTGAATCGGC
ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC
GCTTGTTCTG-3')
R (5'-AGTTCCAGTG
CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT
GAAGGACTGT-3')
R (5'-TGGCAATAGC
TCCTCCGTTG-3')
HK Actin: F (5'-CTACGAACTT
CCTGACGGACAAG-3')
R (5'-CCGGCGGACT
CCATACC-3')
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT
GGAGTTGTTC-3')
R (5'-TCCGTAGATT
GATTCACCAC-3')
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT
GAAGAACGCG-3')
R (5'-CGATCTGCAG
TGAATAGCTC-3')
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG
GAGTCACACC-3')
R (5'-CATCCTCCTT
CATTGAACGG-3')
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA
GGAAGATTACG-3')
R (5'-CTCGGACATT
CTCGAATGAAG-3')
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT
TCATCACTCAT-3')
R (5'-ACACCGTCGA
GAAGCTGTAGA-3')
LightCycler 96 qPCR machine Roche
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.2% SDS
140 mM NaCl
1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix BIORAD 1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate ThermoSci 34095
Trans-Blot Transfer apparatus BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIORAD 170-4159
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 Health hazard (skin, eyes)
Worm strains: Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (wild type) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
eat-2 (MAH95) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
rsks-1 (VB633) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. Embracing Integrative Multiomics Approaches. International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).
  2. Chen, R., Snyder, M. Promise of personalized omics to precision medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).
  3. Anderson, L., Seilhamer, J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).
  4. Harvald, E. B., et al. Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans. Cell Systems. 5 (1), (2017).
  5. Griffin, T. J., et al. Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).
  6. Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).
  7. Lapierre, L. R., et al. The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 4, 2267 (2013).
  8. Doherty, C. J., Kay, S. A. Circadian control of global gene expression patterns. Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).
  9. Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).
  10. Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).
  11. Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).
  12. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).
  13. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  14. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  15. Triant, D. A., Whitehead, A. Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples. Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).
  16. Liu, X., Harada, S. RNA Isolation from Mammalian Samples. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  17. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
  18. Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2006).
  20. Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans. BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).
  21. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J. Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer. Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. Kurien, B. T., Scofield, R. H. , Humana Press. 37-47 (2012).
  23. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  24. Pan, K. Z., et al. Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).
  25. Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium. Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).
  26. Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).
  27. Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans. PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).
  28. Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).
  29. Firestein, B. L., Rongo, C. DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation. Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).
  30. Heschl, M. F., Baillie, D. L. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA. 8 (4), 233-243 (1989).
  31. Yoneda, T., et al. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).
  32. Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference. Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).
  33. Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo. Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).
  34. McQuary, P. R., et al. C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension. Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).
  35. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans . Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  36. Yuan, Y., et al. Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).

Tags

Biologi fråga 145 multiomics proteomik transkriptomik RNAseq RT-qPCR western blot DNA RNA protein C. elegans guanidinium kaliumtiocyanat
Kombinerade nukleotid och Protein extraktioner i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, J., McConnell, E.,… More

Mills, J., McConnell, E., Leitão, J. A., Lapierre, L. R. Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59178, doi:10.3791/59178 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter