Summary
Данная рукопись описывает экспериментальный протокол для оценки морфологических характеристик и функционального состояния ленточных синапсов у обычных мышей. Нынешняя модель также подходит для моделей, вызванных шумом и возрастной кохлеарной синаптопатией. Обсуждаются также коррелятивные результаты предыдущих исследований мышей.
Abstract
Кохлеарные внутренние волосковые клетки (IHCs) передают акустические сигналы спиральным ганглионным нейронам (SGNs) через ленточные синапсы. Несколько экспериментальных исследований показали, что синапсы волосяных клеток могут быть первоначальными целями в сенсорной потере слуха (SNHL). Такие исследования предложили концепцию кохлеарной "синаптопатии", которая относится к изменениям в ленте синапсе номер, структура, или функции, которые приводят к аномальной синаптической передачи между IHCs и SGNs. Хотя кохлеарная синаптопатия необратима, она не влияет на порог слуха. В шумопоминированных экспериментальных моделях для выявления факторов окружающей среды, которые конкретно вызывают синаптопатию, а также физиологические последствия нарушения этого внутреннего уха, используется ограниченный ущерб синапсазам IHC Цепи. Здесь мы представляем протокол для анализа кохлеарной синаптической морфологии и функции в определенной частотной области у взрослых мышей. В этом протоколе кохлеарная локализация конкретных частотных регионов осуществляется с использованием точепериодических карт в сочетании с данными кохлеограммы, после чего морфологические характеристики ленточных синапсов оцениваются с помощью синаптических иммунодефицита. Функциональное состояние лентовых синапсов определяется на основе амплитуд слуховой реакции ствола мозга (ABR) волны I. Настоящий доклад показывает, что этот подход может быть использован для углубления нашего понимания патогенеза и механизмов синаптической дисфункции в улинеи, которые могут помочь в разработке новых терапевтических вмешательств.
Introduction
Частоты в диапазоне примерно 20-2020 000 Гц могут быть восприняты людьми как слуховые стимулы. Слух человека, как правило, наиболее чувствителен около 1000 Гц, где средний уровень звукового давления составляет 20 «Па у молодых людей» (т.е. 0 децибел уровня звукового давления (dB SPL). В некоторых патологических условиях потеря слуха ограничивается определенными частотами. Например, на ранних стадиях шумоизоляции слуха (NIHL) в аудиограмме 4 кГц1можно наблюдать «зазубрины» (т.е. высота порога слуха). Вдоль кохлеарной перегородки млекопитающих, его градации жесткости и массы производят экспоненциальную частотную карту, с высокочастотным обнаружением звука у основания улитки и низкочастотным обнаружением на вершине2. Действительно, есть кохлеарные места-частоты карты вдоль базилярной мембраны, что приводит к тому, что известно как тонотопическая организация2,3. Каждое данное место на базилярной мембране имеет самую высокую чувствительностьтолько к одной конкретной частоте звука, которая обычно называется характерной частотой 3,4,хотя ответы на другие частоты также можно наблюдать.
На сегодняшний день, различные модели мыши были использованы для исследования нормальной функции, патологических процессов и терапевтической эффективности в слуховой системе. Точное знание физиологических параметров в улине мыши является необходимым условием для таких исследований потери слуха. Улишамышь мыши анатомически разделена на апикальные, средние и базальные повороты, которые соответствуют различным частотным регионам. Путем маркировки слуховых нервных афферентов в кохлеарном ядре для анализа их соответствующих периферических иннервационных участков в улитке, Мюллер и др. удалось создать кохлеарную карту места-частоты в нормальной мыши in vivo5. В интервале 7,2-61,8 кГц, что соответствует позициям между 90% и 10% от полной длины базилярной мембраны, кохлеарная карта места мыши может быть описана простой линейной регрессионной функцией, предполагая связь между нормализованное расстояние от кохлеарного основания и logarithm характерной частоты5. В лабораторных мышей, место-частота карта может быть использована для изучения взаимосвязи между порогами слуха в пределах определенных диапазонов частот и cochleograms показаны номера отсутствующих волосковых клеток в относительных регионах вдоль базилярной мембраны6. Важно отметить, что карта частоты места обеспечивает систему позиционирования для исследования минимальных структурных повреждений, таких как повреждение ленточных синапсов волосковых клеток в определенных кохлеарных частотных местах у мышей с периферической слуховой травмой7 ,8.
В улитке млекопитающих, лента синапсы состоят из пресинаптической ленты, электронно-плотная проекция, которая привязывает ореол готовых к выпуску синаптические пузырьки, содержащие глутамат в IHC, и постсинаптическая плотность на нервном терминале SGN с рецепторами глутамата9. Во время кохлеарного звука трансдукции, отклонение расслоения волосяных клеток приводит к деполяризации IHC, что приводит к освобождению глутамата от IHCs на постсинаптических афферентных терминалов, тем самым активируя слуховой путь. Активация этого пути приводит к преобразованию звуковых механических сигналов в тарифный код в SGN10. Действительно, синапс ленты IHC специализируется на неутомимой передаче звука со скоростью сотен Герц с высокой временной точностью, и имеет решающее значение для пресинапических механизмов кодирования звука. Предыдущие исследования показали, что лента синапсы сильно различаются по размеру и количеству в различных регионах частоты в взрослой улитке мыши11,12, вероятно, отражает структурную адаптацию к конкретной звукового кодирования для потребности в выживании. Недавно экспериментальные исследования на животных показали, что кохлеарная синаптопатия способствует множественным формам нарушений слуха, включая шумоизоляцию слуха, возрастную потерю слуха и наследственное снижение слуха13, 14. Таким образом, методы выявления коррелированных изменений в синаптическом числе, структуре и функции в конкретных частотных регионах все чаще используются в исследованиях слухового развития и заболеваний внутреннего уха, используя модели, генерируемые с помощью экспериментальные манипуляции генетическими или экологическими переменными15,16,17.
В текущем отчете мы представляем протокол для анализа синаптического числа, структуры и функции в определенной частотной области базилярной мембраны у взрослых мышей. Локализация кохлеарной частоты осуществляется с использованием данной карты частоты места в сочетании с кохлеограммой. Нормальные морфологические характеристики синапсов кохлеарных лент оцениваются с помощью пресинаптического и постсинаптической иммуностоинга. Функциональное состояние синапсов кохлеарных лент определяется на основе надпороговых амплитуд волны I. При незначительных изменениях, этот протокол может быть использован для изучения физиологических или патологических условий в других животных моделей, в том числе крыс, морских свинок, и песчанки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры проводились в соответствии с Руководством NRC/ILAR по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание). Протокол исследования был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Столичного медицинского университета, Пекин, Китай.
1. Отбор животных
- Для всех экспериментов, использовать взрослых C57BL/6J мышей (8 недель) в качестве модели животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: C57BL/6J мышей проведения сращивания вариант Cdh23 экспонат ускоренного сенесценции в слуховой системе, отражается как 40% потеря ленты синапсы на базальном повороте улитки и 10% потери в среднем повороте на 6 месяцев возраста, а затем быстрое увеличение этой потери во всей улитки с возрастом18,19. Таким образом, мы советуем осторожность при использовании C57BL/6J мышей старше 6 месяцев для слуховых исследований. Другие штаммы мышей могут быть использованы в зависимости от конкретных экспериментальных целей. - Осмотрите мышей с помощью профессионального диагностического карманного отоскопа, чтобы исключить патологии внешнего или среднего уха до оценки слуха. Потенциальные признаки могут включать жидкость или гной во внешнем слуховом канале, покраснение и отек в местной ткани, а также перфорацию тимпанической мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это редко встречается, после выявления, мышей с внешнимили или средними заболеваниями уха должны быть исключены.
2. Оценка слуха
- Анестезия мышей с помощью интраперитонеальной инъекции смеси гидрохлорида кетамина (100 мг/кг) и гидрохлорида ксилазина (10 мг/кг). Судите глубину анестезии с помощью болезненных стимулов (например, рефлекс ат-пинч-щепотку).
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда отсеченный рефлекс ног и щепотки, животное достигло достаточной глубины анестезии для слухового тестирования. Если требуется больше времени для двусторонних записей ABR, вводить более низкую дозировку (пятая часть первоначальной дозы) анестезии, чтобы восстановить оригинальный анестетик плоскости. Позаботьтесь, чтобы избежать передозировки анестезии, так как это может привести к смерти у мышей. - Поддерживайте температуру тела обезвреживаемого животного на уровне 37,5 градусов по Цельсию с помощью терморегулирующей грелки. Поместите обезожнее животное в электрически и акустически защищенной комнате, чтобы избежать помех во время слушания теста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте физиологическую температуру в течение всей процедуры до полного пробуждения животного, чтобы предотвратить смерть, вызванную постанестезии гипотермией. - Поместите электроды кордермальной иглы (20 мм, 28 G) на вершину черепа (запись электрода), в ипсилатеральной околоутиальной области ниже пинны измеренного уха (справочного электрода) и в контралатеральной околоунидной области (земляной электрод), с глубиной 3 мм под кожей головы мыши, соответственно20.
- Используйте динамик закрытого поля для выполнения акустической стимуляции через 2 см пластиковой трубки с конусообразной наконечником. Привмести кончик во внешний ушной канал21.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что электрический импульс в записи и эталонных электродов составляет менее 3 км/ч (обычно 1 км/ ч). Если импеданс высок, измените место вставки электрода, очистите электрод спиртом или замените электрод, чтобы избежать изменений в амплитуда волн ABR. - Для записи ABR, генерировать тон пипсов (3 мс продолжительность, 1 мс рост / падение раз, в размере 21,1 /с, частота: 4-48 кГц) и представить их при снижении SPLs от 90 до 10 дБ в 5'u201210 dPL шаги20. На этом этапе ответы усиливаются (10 000 раз), фильтруются (0,1–3 кГц) и усредняются (1024 образца/уровня стимулов).
ПРИМЕЧАНИЕ: ABRs собираются для каждого уровня стимула в 10 dB шагов, с дополнительными 5 dB шаги вблизи порога. - На каждой частоте, определить порог ABR, который относится к минимальной SPL в результате надежной записи ABR с одной или более различимых волн, которые могут быть четко определены визуального осмотра (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно необходимо повторить процесс для низких СПЛА вокруг порога, чтобы обеспечить последовательность волн. Порог реакции является самым низким уровнем стимула, на котором может наблюдаться волновая форма, когда снижение на 5 дБ приведет к исчезновению формы волны.
3. Обработка кохлеарной ткани
- После записи ABR, эвтаназии анестезируется мышей через шейку вывиха, обезглавить их, разоблачить булла с брюшной стороны, и открыть с острыми ножницами, чтобы получить доступ к улитке.
- Используя тонкие щипцы, удалить височные кости, разорвать stapes артерии, удалить stapes из овального окна, и разрыв круглой мембраны окна. Сделайте небольшое отверстие на вершине улитки, аккуратно вращая кончик иглы (13 мм, 27 G).
- Исправить изолированные кости с 4% (WT/vol) параформальдегида в 0,1 М фосфат-буфера солей (PBS, рН 7.4) на ночь при 4 градусах Цельсия. Используя тонко опрокинутый пипетку, аккуратно промыть фиксатор через perilymphatic пространства через применение к овальным или круглым окнам (как входе) и отверстие на вершине (как выход).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые белки требуют короткой длительности фиксации, чтобы избежать уничтожения их эпитопов для иммуномаркировки. В таких случаях инкубировать кости в 4% параформальдегида при комнатной температуре (RT) по 2 ч, в зависимости от инструкций производителя по иммуногистохимии. Фиксация также может быть выполнена с помощью сердечной перфузии, чтобы удалить кохлеарную кровь, избегая фонового шума из-за неспецифических окрашивания на более поздних стадиях, особенно в мышиных моделях кохлеарной синаптопатии. - Промыть кости три раза в течение 5 мин с 0,1 м холодного PBS для удаления остаточного параформальдегида. Декальцифифицировать кости с 10% этиленедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) либо на RT для 4 ч или при 4 кв с для 24 ч через нежный встряхивания в горизонтальной шейкер на 20 об/ ч. EDTA можно обновить на полпути.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время декальцинации зависит от концентрации EDTA и предпочтений пользователей. Декальцифицированная ткань должна поддерживать определенную степень прочности, что облегчает манипуляцию изоляцией кохлеарных цельных креплений на более поздних этапах. Временные кости могут быть декальцинированы в 10% EDTA с вращением, что позволяет исследователям покинуть лабораторию после тестов ABR и экспериментов по фиксации. Время декальцинации гибко в пределах 20-30 ч при 4 градусах Цельсия. - Перенесите одну декальцифицированную височную кость из ЭДТА в 0,1 М ПБС. Используйте #3, #5 щипцы Dumont и 27 G иглы, чтобы вскрыть апикальные, средние и базальные кохлеарные области в свою очередь, а затем вскрыть улиную из кости под стерео рассеивательный микроскоп (как ранее описано22). Сделайте серию небольших разрезов вдоль спиральной связки с помощью лезвия бритвы, и удалить текториальную мембрану и мембрану Райсснера(рисунок2).
ПРИМЕЧАНИЕ: До тех пор, пока расчлененные улички нетронутыми, этот процесс может быть изменен в соответствии с обычным протоколом отдельного оператора. - Далее вскрыть оставшиеся слуховые эпителия в том числе спиральный лимб в отдельных кохлеарных поворотов (вершина, средний, и базы с крюк области) для целостного монтажа препаратов.
- Под 40x целью масла светлого микроскопа, измерьте длину мембраны базилярной с маштабом 250 мкм помещенным в окуляре, который можно отрегулировать вдоль stereocilia IHCs.
- Рассчитайте длину каждого кохлеарного поворота, добавив все длины сегмента (250 мкм на сегмент), и одновременно получите общую длину базилярной мембраны, суммирующее длину каждого хода.
- Преобразуйте общую длину базилярной мембраны, включая область крючка, в процент, основанный на расстоянии от кохлеарной вершины (0% относится к кохлеарной вершине, 100% к кохлеарной основе).
- Преобразуйте это расстояние в кохлеачную характерную частоту с помощью логарифмической функции (d(%) 1 - 156,5 и 82,5 - журнала (f), с наклоном 1,25 мм/октава частоты, где d является нормализованным расстоянием от кохлеарной вершины в процентах, f частота в кГц), как ранее описано5,6. Таким образом диапазон частоты в соответном участке базилярной мембраны на каждом повороте cochlear можно приобрести.
4. Иммунофлуоресценция окрашивание
- После вскрытия поместите каждый кохлеарный поворот в отдельную кострифугу объемом 2,5 мл и инкубировать кохлеарные повороты в 10% козьей сыворотки/PBS/0,1% Triton X-100 на 1 ч на РТ на ротаторе.
- Удалите выше блокирующий/пермякирастворительный раствор из каждой трубки, используя наконечник пипетки 200 л под микроскопом вскрытия и инкубация образцов с первичными антителами, разбавленными 5% козьей сыворотки /PBS/0.1% Triton X-100 на ночь при 4 кС на ротаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммуномаркировки кохлеарных синаптических лент используйте пресинаптическую маркерную мышь анти-карбоксил-терминальный связывающий белок 2 IgG1 (CtBP2, маркировка b домена белка для строительных лесов RIBEYE, 1:400) и постсинаптическую маркерную мышь IgG2a (GluR2, маркировка субъединицы рецептора АМРА, 1:200)23. - Промыть три раза в течение 5 мин с 0,1 М холодной PBS, чтобы удалить остаточные первичные антитела и инкубировать образцы со вторичными антителами, разбавленными в 5% козьей сыворотки / PBS/0,1% Тритон X-100 на РТ для 2'u20123 ч в темноте на ротаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка соответствующих вторичных смесей антитела с помощью козы анти-мышь Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) и коза анти-мышь Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), которые дополняют основные антитела, используемые в шаге 4.2. Для повышения эффективности маркировки синапических лент мы рекомендуем выбрать конкретные вторичные антитела. Некоторые лаборатории продлить инкубации со вторичными антителами для увеличения GluR2 иммуномаркировки24. - Трижды промыть в течение 5 мин с 0,1 М PBS для удаления остаточных вторичных антител и переноса образцов из 2,5 мл центрифуговых трубок на 35 мм пластин, содержащих 0,1 М ПБС.
- Поместите каплю монтажной среды, содержащей 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) на слайд и перенесите образцы из PBS в монтажную среду. Поместите один край крышки на слайде и отпустите, чтобы coverslip падать мягко.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения того, чтобы волосковые клетки выходят на сторону вверх и что во время процедуры не происходит сворачивания или скручивания кохлеарных образцов, смонтировать кохлеарные образцы под стерео рассеиванием микроскопа. - Поместите слайды в слайд-бокс на 4 кв на ночь, чтобы слайды сухие, а затем изображение под лазерным конфокальный микроскоп.
5. Морфологическая оценка кохлеарных лент синапсов
- Слайды изображения с помощью конфокального микроскопа с тремя лазерами– ультрафиолетовым диодом 405 нм, 488 нм аргонный лазер и 561 нм диод-накачанный твердотельный (DPSS) лазер для возбуждения DAPI (Спектр excitation 409-464 нм), Alexa Fluor 488 (Спектр эксцессов 496-549 нм) и Alexa Fluor 568 (Спектр возбуждения 573-631 нм), соответственно.
- Приобретайте конфокальные z-стеки на расстоянии 8 мкм с каждого кохлеарного поворота с помощью объектива погружения масла высокого разрешения в 63 x с высоким разрешением.
ПРИМЕЧАНИЕ: После определения все параметры оцифровки фотомикрографов должны быть сохранены и равномерно применены ко всем слайдам. - Для синаптических punctum рассчитывает, установить z-стеки (0,3 мкм размер шага), чтобы охватить всю длину IHCs, тем самым гарантируя, что все синаптические пунктуры могут быть изображены.
- Слияние изображений, содержащих пунктуру в z-стеке, чтобы получить проекцию z-оси и импортировать в программное обеспечение для обработки изображений.
-
Разделите синаптические общие подсчеты в каждом z-стеке в определенных частотных регионах на количество IHCs (равно подсчету ядерных ручных DAPI) для расчета количества синаптической пунктки для каждого IHC. В каждой конкретной частотной области в среднем все синаптические пунктки в трех изображениях различных микроскопических полей, содержащих 9-11 IHCs.
- Опишите область интересов (ROIs), включая базолатеральные области каждого IHC с помощью кнопки выбора от руки. Используйте функцию измерения для автоматической количественной оценки puncta, и функцию водораздела, чтобы различать близко прилегающие пятна.
- После каждого автоматизированного подсчета, выполнять визуальные осмотры с ручной коррекции для обеспечения puncta подсчета надежной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментаторы должны оставаться слепыми в том, является ли слайд от вершины, среднего или базального поворота улички.
- Визуально оценить синаптическую структуру и распределение, чтобы вручную изолировать отдельные IHCs от своих соседей с помощью карандашного инструмента (M ), чтобы лучше визуализировать цитоскелетную архитектуру и синаптическую локализацию.
- Для проверки сопоставления пресинаптических лент (CtBP2) и постсинаптических рецепторов патчи (GluR2), извлечь вокселя пространство вокруг ленты по прямоугольной Marquee Tool и изолировать отдельные ленты по культуры. Через нажатие изображения , чтобы размер изображения, приобрести эскиз массив этих миниатюрных проекций, которые затем могут быть использованы для выявления парных синапсов (появился как тесно сопоставленных пар CtBP2-положительных и GluR2-положительных puncta) против сироты ленты (отсутствие постсинаптических патчей рецепторов глутамата)(рисунок3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальные кохлеарные синапсы появляются как комбинированная иммуномаркировка пресинаптической ленты в клетке волоса (анти-CtBP2) и постсинаптического патча рецепторов глутамата на слуховом нервном терминале (анти-GluR2)25. Некоторые лаборатории используют конфокальные проекции в сочетании с 3D-моделированием для количественной оценки размера синаптических патчей или объема26,27. До значительной потери ленты синапсы, ленты, демонстрирующие изменения в размере или без парных патчей рецепторов глутамата, скорее всего, свидетельствует о синаптической дисфункции27,28.
6. Функциональная оценка кохлеарных лент синапсов
- Соберите все волны ABR для каждого частотного стимула, представленного на SPL 90 дБ для анализа suprathreshold aBR волны I амплитуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейрофизиологические и морфологические исследования показали, что низкосовые, высокопороговые волокна особенно уязвимы для старения и воздействия шума29,30. Хотя простая потеря ленты синапсы не могут повлиять на пороговые значения ABR, это обычно приводит к значительному сокращению в амплитудах волны ABR I, потому что эти афференты, включая низкие спонтанно-скоростные волокна и высокие спонтанно-скоростные, низкопороговые волокна вносят значительный вклад в подытожил деятельности кохлеарных нервных волокон28,29,31. Здесь выбрана интенсивность свыше порога 90 дБ SPL. - Определить пик-пик волны я амплитуда с помощью автономной программы анализа(рисунок 4). Каждая волна I в тесте ABR состоит из исходного положительного (p) отклонения и последующего отрицательного (n) отклонения. ABR волна I амплитуда определяется как разница в напряжении между Ip (положительный пик волны I) и в (отрицательный пик волны I)29.
ПРИМЕЧАНИЕ: В патологических условиях кохлеарная синаптопатия может быть определена на основе надпороговых амплитуд волны ABR I, которые отражают подведенные ответы SGNs, вызванные звуком. Тем не менее, кохлеарной чувствительности, которая не скомпрометирована из-за дисфункции OHC является необходимым условием для этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR слуховые тесты были проведены для 10 C57BL/6J мышей (8 недель возраста) под наркозом. ABRs были вызваны с использованием тон взрыв стимулы на 4, 8, 16, 32, и 48 кГц. Порог слуха каждого животного был визуально обнаружен, различая по крайней мере одну четкую форму волны в АБР. Все мыши выставлены ABR пороги в ответ на тон очередей, в диапазоне от 25 до 70 дБ SPL в зависимости от частоты стимула. Наши результаты показали, что порог слуха был самым низким на 16 кГц(рисунок 1), что соответствует примерно 43% расстояние от кохлеарной вершины (рисунок2), предполагая, что акустическая чувствительность значительно снижается в других кохлеарных Регионах.
Кохлеарные цельные крепления были выделены из височных костей у взрослых мышей под стерео рассеиванием микроскопом(рисунок 2А). Целые горы слухового эпителия были расчленены на три части, длина которых была измерена и в конечном итоге преобразована в процентное расстояние от кохлеарной вершины. Расположение частоты на базилярной мембране каждого кохлеарного поворота было рассчитано с использованием логарифмической функции, как описано ранее5,6 (Рисунок2B).
Для оценки морфологических характеристик кохлеарных ленточных синапсов антитела против CtBP2 и GluR2 использовались для обозначения пресинаптических и постсинаптические структуры соответственно. В нормальных ушах взрослых мышей, иммуностоина показали сопоставления пар синаптической ленты и глутамат рецепторпатчи шипованных поверхности базолагоальной мембраны IHCs, с 8-20 пар на IHC(Рисунок 3A). Хотя подавляющее большинство пунктта появились в качестве сопоставленных пар в нормальных ушах, орфанные ленты можно было наблюдать редко при высоком увеличении(рисунок 3B). Графы синапсов ленты IHC (иммунопозитивные пятна как для CtBP2, так и для GluR2) были самыми высокими в области 16 кГц, значительно уменьшаясь по мере увеличения расстояния от этого места(рисунок 3C). Синаптические подсчеты, определяемые на основе конфокальных проекций, дают оценку максимального количества слуховых нервных волокон, которые передают информацию из улики в мозг29.
Функциональное состояние синапсов кохлеарной ленты исследовалось у всех взрослых мышей на основе амплитуд ы волны ABR I, которые предоставляют информацию о функциональной целостности слуховых нервных волокон29,31. ABR волна I амплитуды на каждой частоте стимула, представленного на уровне звукового давления 90 дБ были измерены от пика до следующего корыта, как показано на рисунке 4A. АБР волна I амплитуда была самой высокой с частотой 16 кГц, что соответствует самому низкому порогу слуха, и значения амплитуды значительно уменьшились по мере увеличения расстояния от этого места(рисунок 4B). Этот результат согласуется с наблюдаемыми изменениями в ленточном синапсе, что указывает на то, что синапсы в этом кохлеарном регионе могут проявлять самую яркую синаптической функцию. Кроме того, в предыдущих исследованиях мыши шум-индуцированной и возрастной кохлеарной нейродегенерации, надпорога амплитуды волны ABR я уменьшилась пропорционально потере ленты, указывая, что волна ABR I амплитуда сильно коррелирует со степенью кохлеарная синаптопатия29,31.
Рисунок 1 : Оценка слуха. Сравнения пороговых значений ABR между различными частотами тонального всплеска стимулов показали, что порог слуха был самым низким на уровне 16 кГц у 10 взрослых мышей C57BL/6J. Реакция ABR была значительно повышена в других частотных регионах (одностороннее ANOVA с многократным сравнением Даннетта после специального теста; : P lt; 0.01, n и 20 ушами). Данные выражаются в виде среднего значения - SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Рисунок 2 : Локализация частоты кохлеа у мышей. (A) Репрезентативное изображение полной улиной, которая была расчленена из височной кости под стерео рассеиванием микроскопом. (B) Улишка мыши делится на апикальные, средние и базальные повороты, где кохлеарная боковая стенка удаляется. Красные круги на фрагментах кохлеарной базилярной мембраны указывают на частотные места и их соответствующие нормализованные положения в улине (0% относится к кохлеарной вершине, 100% к кохлеарной основе). Шкала бар 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Конфокальный анализ из Кохлеарные ленточные синапсы у мышей. (A) Репрезентативные изображения лентовых синапсов для 4, 8, 16, 32 и 48 кГц регионов, иммунозапятнанных для пресинапических лент (CtBP2, красный) и постсинаптических структур (GluR2, зеленый). Белые линии пунктирной используются для обосмечю внутренних волосковых клеток для справки. Шкала бар 10 мкм. (B) Высокой мощности эскизы из конфокальных z-стеки показывают, что эти ленты синапсы появились как тесно сопоставленные пары CtBP2-положительных (красный) и GluR2-позитивный (зеленый) puncta (слева и среднего), в то время как сироты ленты (справа) не хватает postsynaptic патчи рецепторов глутамата были очень редки. Шкала бар 0,5 мкм. (C) Количественный анализ парной ленточной пунктки со всеми пресинаптическими и постсинаптические элементами показал, что количество синаптической пунктки на внутреннюю клетку волос был значительно выше в области 16 кГц, чем в других частотных регионах (одностороннее ANOVA с несколько сравнения Даннетт после специального теста; В: П Злт; 0,01, n-6 ушей). Данные выражаются в виде среднего значения - SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Рисунок 4 : Анализ ABR волна I амплитуды у мышей . (A) Представитель ABR волновой формы от 8 недель c57BL/6J мыши подвергаются 16 кГц чистый тон стимула при интенсивности 90 дБ (стимул начала на 0 мс). Римские цифры отмечают вершины волн ABR. Пунктирные линии отмечают волну i пика и корыта, указывая на амплитуду. (B) Количественный анализ средней волны I амплитуды в ответ на 4, 8, 16, 32, и 48 кГц стимулы представлены на уровне звукового давления 90 дБ. ABR волна I амплитуды были самыми высокими на частоте 16 кГц и значительно ниже на других частотах (односторонний ANOVA с несколько сравнения Даннетт после hoc тест;: P lt; 0,01, и 20 ушей). Данные выражаются в виде среднего значения - SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Так как кохлеарная синаптопатия была впервые охарактеризована у взрослых мышей с временным сдвигом порога (TTS), индуцированным 8'u201216 кГц октавный шум полосы на 100 дБ SPL для 2 ч31, исследователи все чаще исследовали последствия синаптопатии в различных млекопитающих, в том числе обезьян и людей32,33. В дополнение к шумоизоляции, ряд других условий были связаны с кохлеарной синаптопатией (например, старение, использование ототоксических препаратов и генетические мутации), что привело к кратковременному нарушению прослушивания надпорога, за которым последовали необратимые дегенерация слухового нерва. На ранней стадии кохлеарного оскорбления, синаптопатия часто происходит в определенном месте частоты, особенно в экспериментальных моделях, в которых повреждение синапсов IHC ограничивается выбором частотных регионов24,31. Таким образом, наш протокол имеет важное значение в том, что он позволяет иссмотреть синаптической морфологии и функции в определенной области частоты.
Кохлеарная карта частоты места может быть использована для дискриминации нормальной и аномальной слуховой функции, что еще больше отражает нормальную и ненормальную область во внутреннем ухе. Так как методы подготовки поверхности были впервые использованы для участка нетронутыми и отсутствующих волосковых клеток в различных кохлеарных поворотах, кохлеограмма стала обычным методом для количественной оценки выпадения волосяных клеток6. Поэтому, чтобы соотнести морфологические оскорбления в улитке с соответствующими физиологическими изменениями, разумно включить на кохлеограмму карту частоты места. Этот метод позволяет определить количество и структуру синапсов на основе их позиций вдоль кохлеарной базилярной мембраны по отношению к установленным кохлеарным картам месточастотных карт, тем самым предоставляя достаточную информацию для детального сравнения между гистологическими и физиологическими исходами. Однако некоторые исследования оценивают синаптопатию на основе кохлеарного сегмента или расстояния вдоль кохлеарного протока, что не позволяет проводить прямые сравнения между отдельными уликами из-за внутривидовых вариаций длины базилярной мембраны. Таким образом, особенно важно стандартизировать кохлеограмму путем преобразования отдельных кохлеарных длин из миллиметров в относительный процент.
Синаптопатия может быть подтверждена с помощью визуализации иммуностоинга для белка CtBP2 (синаптической изоформы "риби") в базолатеральных регионах IHCs. Эти CtBP2-положительные патчи могут служить в качестве структурного маркера для количественной оценки пресинаптических лент, и наличие меньшего количества патчей обычно указывает на пресинаптические потери. Хотя предыдущие исследования сообщили, что 98% пресинаптических лент в паре с пост-синаптические терминалы в нормальном ухе30, простое количество CtBP2-положительных патчей не может быть точным для количественного анализа полных синапсов, так как это может привести к завышению количества синапсов в поврежденном ухе путем привлечения «сирот» (пресинапических лент, не спаренных с постсинаптическими терминалами). Для повышения точности оценки синапса используются дополнительные антитела против постсинаптической структуры, такие как GluA2, GluA2/3 или PSD-95. Postsynaptic плотность белка PSD-95, мембраны связанных гуанилат киназы (MAGUK) леса белка, могут быть помечены с помощью антитела против PSD-95, который в основном наблюдается при контактах между волосковых клеток и SGN волокна окончаний34, 35. Тем не менее, антитела против GluR2 является более конкретным для АМРА типа ионотропных рецепторов глутамата в постсинаптической мембране, которые могут более надежно определить ленты синапсы (сопоставленные пары иммунофлуоресцентных пунктов пресинаптических CtBP2 и postsynaptic GluR2)15. В дополнение к морфологическому анализу, гистологический анализ полных синапсов может быть использован в качестве функционального индикатора для синаптопатии. У взрослых мышей с кохлеарной синаптопатией, сокращения в амплитуда aBR I амплитуда после представления умеренного и высокого уровня тон стимулы происходят на частотах тонотопически связанных с регионами синаптической потери26,29. Количество синапсов, полученных с помощью этого метода, ограничено тем, что сканирование одного участка на базилярной мембране занимает около 10 минут. Кроме того, для оценки пространственных вариаций синаптического числа и морфологии на основе местоположения IHC необходимо точно определить границу тела ICH (например, с помощью окрашивания миозина VIIa) и выполнить определенные шаги обработки изображений26 . Используя такие методы, предыдущие исследования подтвердили, что синаптические потери больше на модололярной стороне IHC, чем на стороне столба в животных моделях вызванной шумом дегенерации26.
Предыдущие исследования показали, что низкой спонтанной скорости, высокий порог волокон более восприимчивы к шуму ущерб, чем высокий спонтанной скорости, низким порогом волокон в животных моделях ограниченной синаптопатии26,30. Эти исследования дают обоснование для использования надпороговых амплитуд ы волны ABR I (измеряется с использованием умеренного до высокого уровня тон стимулов) для оценки синаптической функции в животных моделях с нормальным порогом ABR и искажения продукта отоакустические выбросы ( DPOAES). Потому что волна I ABR отражает суммированные нейронные реакции слуховых нервных волокон, когда синаптопатия оценивается через амплитуду ABR I, DPOAE тестирование также должно быть выполнено, чтобы исключить повреждение OHC, который также может уменьшить амплитуды ABR из-за нарушения механоэлектрической трансдукции. Хотя первая волна потенциала соединения действия (CAP), которая измеряется из электродов круглого окна, также представляет собой подведенную активность кохлеарного нерва, этот метод является более инвазивным и сложным, чем измерения ABR. Если ответы DPOAE вернуться к нормальной после временного порога сдвиги в шум-экспонированных мышей31 или они еще не ухудшились в старении мышей29, супрапорог амплитуда волны ABR я могу сильно предсказать степень кохлеарной синаптопатии , так как пораженные нейроны заглушаются, когда их синаптические связи с IHCs нарушаются. Однако, если кохлеановая чувствительность снижается из-за различных факторов (например, дисфункция OHC), уменьшение амплитуды ABR I больше не может быть отнесено исключительно к синаптической потере, поскольку они будут отражать сочетание всех кохлеарных повреждений. Таким образом, контролируемые экспериментальные условия для синаптопатии ограниченный препарат модели необходимы для обеспечения того, чтобы кохлеарной чувствительности не скомпрометированы другими факторами. К сожалению, хотя амплитуда ABR I обеспечивает объективную меру потери слухового нервного волокна у животных, трудно измерить у человека. Кроме того, смешанные патологии, связанные с синаптопатией, потерей волосковых клеток и наличием других аномалий в улитке, могут со-возникать у людей, ограничивая использование измерений амплитуды волны ABR I в клинических условиях. Задержка волн ABR рассчитывается как время в миллисекундах от начала стимула до положительного пика каждой волны, обеспечивая понимание времени передачи по слуховому пути. Никаких существенных изменений в задержке волны I не наблюдалось в моделях мыши шумо-индуцированной или возрастной кохлеарной синаптопатии36. Тем не менее, некоторые данные свидетельствуют о том, что последствия маскировки шума на ABR волны V задержки могут быть использованы для диагностики кохлеарной синаптопатии у людей37.
Несколько недавних исследований поддержали идею о том, что кохлеарная синаптопатия является основным первоначальным событием, связанным со скрытой потерей слуха, усопорный усос, и hyperacusis. Хотя концепция кохлеарной синаптопатии при заболеваниях внутреннего уха в настоящее время прочно утвердилась, ее подробное воздействие на слуховую способность остается неизвестным. Протокол, представленный в текущем исследовании, позволяет исследует морфологию и функции в кохлеарных ленточных синапсах в пределах определенной частотной области. Таким образом, этот протокол может быть использован для исследования кохлеарной синаптопатии, ее основных механизмов и эффективности потенциальных терапевтических вмешательств в различных экспериментальных моделях животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81770997, 81771016, 81830030); совместный проект финансирования Пекинского фонда естественных наук и Пекинского комитета по образованию (K'201810025040); Пекинский фонд естественных наук (7174291); и Китайский фонд постдокторской науки (2016M601067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100 mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10 mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 |
References
- Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
- Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
- Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
- Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
- Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
- Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
- Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
- Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
- Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
- Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
- Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
- Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
- Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).
