Summary
Detta manuskript beskriver ett experimentellt protokoll för att utvärdera morfologiska egenskaper och funktionell status för band synapser i normala möss. Den nuvarande modellen är också lämplig för buller-inducerad och åldersrelaterade Cochlear synaptopati-begränsade modeller. De relativa resultaten av tidigare mus studier diskuteras också.
Abstract
Cochlear inre hårceller (IHCs) överföra akustiska signaler till spiral ganglion neuroner (SGNs) genom band synapser. Flera experimentella studier har indikerat att hår cells synapser kan vara de initiala målen i sensorineural nedsättning hörselnedsättning (SNHL). Sådana studier har föreslagit begreppet Cochlear "synaptopati", som hänvisar till förändringar i band synaps antal, struktur, eller funktion som resulterar i onormal synaptisk transmission mellan ihcs och Sgns. Medan Cochlear synaptopati är oåterkallelig, det påverkar inte hörsel tröskeln. I bullerinducerade experimentella modeller används begränsade skador på IHC-synapser i utvalda frekvensområden för att identifiera de miljöfaktorer som specifikt orsakar synaptopati, samt de fysiologiska konsekvenserna av att störa detta inneröra Krets. Här presenterar vi ett protokoll för att analysera cochleaimsynaptisk morfologi och funktion vid ett specifikt frekvensområde hos vuxna möss. I detta protokoll utförs Cochlear lokalisering av specifika frekvensområden med hjälp av plats frekvens kartor tillsammans med cochleogramdata, varefter de morfologiska egenskaperna hos band synapser utvärderas via synaptiska immun. Den funktionella status av band synapser bestäms sedan baserat på amplituderna av auditiva hjärnstammen svar (ABR) Wave I. Den nuvarande rapporten visar att detta tillvägagångssätt kan användas för att fördjupa vår förståelse av patogenesen och mekanismerna för synaptisk dysfunktion i cochlea, som kan hjälpa till att utveckla nya terapeutiska interventioner.
Introduction
Frekvenser i intervallet cirka 20 u201220 000 Hz kan uppfattas som auditiva stimuli av människor. Mänsklig hörsel är normalt mest känslig nära 1 000 Hz, där den genomsnittliga ljudtrycksnivån är 20 μPa hos unga vuxna (dvs 0 decibel av ljudtrycksnivå [dB SPL]). Vid vissa sjukdomstillstånd är hörselnedsättning begränsad till specifika frekvenser. Till exempel, i de tidiga stadierna av Bullerorsakad hörselnedsättning (NIHL), kan ett "snäpp" (dvs. hörsel tröskel höjning) observeras i audiogrammet vid 4 kHz1. Längs med Cochlears däggdjurs-partition, ger dess graderingar av styvhet och massa en exponentiell frekvens karta, med högfrekvent ljuddetektering vid basen av snäckan och lågfrekventa detektering vid Apex2. Det finns faktiskt en Cochlear plats-frekvenskarta längs basilaris membran, vilket leder till vad som kallas tonotopic organisation2,3. Varje given förlägger på det basilaris membranen har den högsta känsligheten till endast en bestämd solid frekvens, som kallas vanligt den karakteristiska frekvensen3,4, även om svar till andra frekvenser kan också observeras.
Hittills har olika musmodeller använts för att undersöka normal funktion, patologiska processer och terapeutisk effekt i hörselsystemet. Exakt kunskap om fysiologiska parametrar i musen snäckan är en förutsättning för sådana studier av hörselnedsättning. Musen snäckan är anatomiskt uppdelad i apikala, mellersta, och basal varv, som motsvarar olika frekvensområden. Genom att märka hörselnerven afferenter vid Cochlear Nucleus för att analysera deras motsvarande perifera innervation platser i cochlea, Müller et al. lyckades etablera Cochlear plats-frekvenskarta i den normala musen in vivo5. I intervallet 7.2 – 61.8 kHz, vilket motsvarar positionerna mellan 90% och 10% av den fulla längden av basilaris membran, kan mus Cochlear plats-frekvenskarta beskrivas med en enkel linjär Regressions funktion, vilket tyder på en relation mellan normaliserat avstånd från cochleaimbasen och logaritmen av den karakteristiska frekvensen5. I laboratoriemöss kan plats-frekvenskartan användas för att undersöka sambandet mellan hörsel trösklar inom specifika frekvensområden och cochleogram som visar antalet saknade hårceller i relativa regioner längs basilaris membran6. Viktigt, plats-frekvenskartan ger ett positioneringssystem för utredning av minimal strukturell skada, såsom skador på bandet synapser av hårceller vid specifika Cochlear frekvens platser i möss med perifera hörseltrauma7 ,8.
I däggdjur cochlea, band synapser består av ett presynaptiskt band, en elektron-tät projektion som tjusar en Gloria av release-Ready synaptiska blåsor som innehåller glutamat inom IHC, och en postsynaptisk densitet på nerven terminalen i SGN med glutamatreceptorer9. Under Cochlears ljudtransduktion leder avböjning av hår cells paketet till IHC depolarisering, vilket leder till att glutamat frigörs från IHCs till postsynaptiska afferenta terminaler, vilket aktiverar hörselgången. Aktiveringen av denna väg leder till omvandlingen av ljudinducerade mekaniska signaler till en tariff kod i SGN10. Faktum är att IHC Ribbon synaps är mycket specialiserade för Indefatigable ljudöverföring till priser av hundratals Hertz med hög temporal precision, och är av avgörande betydelse för presynaptiska mekanismer för ljudkodning. Tidigare studier har visat att band synapser varierar kraftigt i storlek och antal i olika frekvensområden i den vuxna musen snäckan11,12, sannolikt återspeglar strukturell anpassning till särskilda ljudkodning för överlevnadsbehov. Nyligen har experimentella djurstudier visat att cochleaimsynaptopati bidrar till flera former av hörselskador, inklusive Bullerorsakad hörselnedsättning, åldersrelaterade hörselnedsättning, och ärftlig hörselnedsättning13, 14. metoder för att identifiera korrelerade förändringar i synaptiska tal, struktur och funktion vid specifika frekvensområden har därför blivit alltmer sysselsatta i studier av hörsel utveckling och inre öronsjukdomar, med hjälp av modeller som genererats via experimentell manipulation av genetiska eller miljövariabler15,16,17.
I den aktuella rapporten presenterar vi ett protokoll för analys av synaptiska tal, struktur och funktion vid en specifik frekvens region i basilaris membran hos vuxna möss. Cochlears frekvens lokalisering utförs med en given plats-frekvenskarta i kombination med ett cochleogram. De normala morfologiska egenskaperna hos Cochlear Ribbon synapser utvärderas via presynaptiska och postsynaptiska immunofärgning. Den funktionella statusen för Cochlear Ribbon synapser bestäms baserat på suprathreshold amplituder av ABR Wave I. Med smärre förändringar, detta protokoll kan användas för att undersöka fysiologiska eller patologiska tillstånd i andra djurmodeller, inklusive råttor, marsvin, och gerbils.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes i enlighet med NRC/ILAR guide för vård och användning av försöksdjur (8: e upplagan). Studieprotokollet godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommitté av Capital Medical University, Peking, Kina.
1. Val av djur
- För alla experiment, Använd vuxna C57BL/6J hanmöss (8 veckor gamla) som djurmodell.
Anmärkning: C57BL/6j möss som transporterar en skarvning variant av Cdh23 uppvisar accelererad åldras i hörselsystemet, reflekteras som en 40% förlust av band synapser vid basal vändning av snäckan och en 10% förlust i mitten tur av 6 månaders ålder, följt av en snabb förhöjning av denna förlust i den hela snäckan med ålder18,19. Sålunda, vi råda försiktighet när du använder C57BL/6J möss äldre än 6 månader för auditiv forskning. Andra möss stammar kan användas beroende på specifika experimentella mål. - Inspektera möss med hjälp av en professionell diagnostiska Pocket otoskop att utesluta yttre eller mellanörat patologier före hörsel bedömningar. Potentiella tecken kan innefatta vätska eller pus i den yttre hörselgången, rodnad och svullnad i lokal vävnad, och tympanic membran perforation.
Anmärkning: Även om detta är sällan påträffas, en gång identifierats, möss med yttre eller mellanörat sjukdomar bör uteslutas.
2. bedömning av hörsel
- Anesthetize möss med en intraperitoneal injektion av en blandning av ketaminhydroklorid (100 mg/kg) och xylazolhydroklorid (10 mg/kg). Bedöma anestesidjupet via smärtsamma stimuli (t. ex. tå-nypa reflex).
Anmärkning: När tå-nypa reflex är helt frånvarande, djuret har nått ett adekvat djup av anestesi för auditiv testning. Om mer tid krävs för bilaterala ABR-inspelningar, administrera en lägre dos (en femtedel av den ursprungliga doseringen) av anestetika för att återställa det ursprungliga bedövnings planet. Var noga med att undvika bedövningsmedel överdosering, eftersom detta kan leda till döden hos möss. - Behåll det sövda djurets kroppstemperatur vid 37,5 ° c med en termoreglerande värmedyna. Placera det sövda djuret i ett elektriskt och akustiskt avskärmat rum för att undvika störningar under hela hörsel provet.
Anmärkning: Bibehålla den fysiologiska temperaturen under hela proceduren tills djuret är helt vaken, för att förhindra döden orsakad av efter anestesi hypotermi. - Placera subdermala nål elektroder (20 mm, 28 G) vid spetsen av skallen (inspelning elektrod), i ipsilaterala parotis regionen under Pinna av uppmätt öra (referenselektrod), och i kontralaterala parotidområdet (Ground elektrod), med ett djup av 3 mm under huden på mus huvudet, respektive20.
- Använd en sluten-fält högtalare för att utföra akustisk stimulering via en 2 cm plaströr med en konformad spets. Montera spetsen i den yttre hörselgången21.
Anmärkning: Se till att den elektriska impedansen i inspelningen och referenselektroder är mindre än 3 kOhm (vanligtvis 1 kOhm). Om impedansen är hög, ändra insättningsstället för elektroden, rengör elektroden med alkohol, eller Byt ut elektroden för att undvika förändringar i ABR vågamplitud. - För ABR inspelning, generera Tone pips (3 MS varaktighet, 1 MS Rise/fall gånger, med en hastighet av 21,1/s, frekvens: 4-48 kHz) och presentera dem på fallande SPLs från 90 till 10 dB i 5 \ u201210 dB SPL steg20. Under detta steg amplifieras svaren (10 000 gånger), filtreras (0,1-3 kHz), och i genomsnitt (1 024 prover/stimulus nivå).
Anmärkning: ABR samlas in för varje stimulus nivå i 10 dB steg, med ytterligare 5 dB steg nära tröskeln. - Bestäm vid varje frekvens ABR-tröskeln, som hänvisar till minimal SPL, vilket resulterar i en tillförlitlig ABR-inspelning med en eller flera urskiljbara vågor som tydligt kan identifieras genom visuell inspektion (figur 1).
Anmärkning: Det är vanligtvis nödvändigt att upprepa processen för låga SPLs runt tröskeln för att säkerställa konsekvensen av vågformerna. Svars tröskeln är den lägsta stimulansnivå vid vilken vågformen kan observeras, när en minskning med 5 dB skulle leda till att vågformen försvinner.
3. behandling av Cochlear Tissue
- Efter ABR inspelning, euthanize de sövda möss via cervikal dislokation, halshugga dem, utsätta Bulla från den ventrala sidan, och öppna med vassa saxar för att få tillgång till cochlea.
- Med hjälp av en fin tång, ta bort temporala ben, bryta stigbygeln artär, ta bort stigbygeln från ovala fönstret, och bristning den runda fönster membranet. Gör ett litet hål i snäckan genom att försiktigt vrida spetsen på en nål (13 mm, 27 G).
- Fixera de isolerade benen med 4% (WT/VOL) PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) över natten vid 4 ° c. Använd en finskuren pipett för att försiktigt spola fixativ genom perilymfatiska utrymmen via applicering till ovala eller runda fönster (som ett inlopp) och öppningen vid spetsen (som ett utlopp).
Anmärkning: Vissa proteiner kräver en kort varaktighet fixering för att undvika förstörelse av deras epitoper för immunolabeling. I sådana fall, inkubera benen i 4% PARAFORMALDEHYD vid rumstemperatur (RT) för 2 h, beroende på tillverkarens instruktioner för immunohistokemi. Fixering kan också utföras via hjärt perfusion för att ta bort cochleaimplantat, undvika bakgrundsljud på grund av icke-specifik färgning i senare stadier, särskilt i musmodeller av Cochlear synaptopati. - Skölj benen tre gånger för 5 min med 0,1 M kallt PBS för att ta bort kvarvarande PARAFORMALDEHYD. DECALCIFY benen med 10% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) antingen vid RT för 4 h eller vid 4 ° c för 24 h via mild skakning i en horisontell shaker vid 20 RPM. EDTA kan uppdateras halvvägs.
Anmärkning: Dealcifikationstider är föremål för koncentrationen av EDTA och användarnas preferenser. Dealcified vävnad bör bibehålla en viss grad av seghet, vilket underlättar manipulering av isolera Cochlears hela fästen vid senare steg. Temporala ben kan urkalkade permanenta i 10% EDTA med rotation, gör det möjligt för forskare att lämna laboratoriet efter ABR tester och fixering experiment. Urkalkning tiden är flexibel inom intervallet 20 till 30 h vid 4 ° c. - Överför en urkalkade permanenta temporala benet från EDTA till 0,1 M PBS. Använd #3, #5 Dumont pincett och 27 G nål för att dissekera apikala, mellersta och basal Cochlear regioner i sin tur och dissekera snäckan ur benet under en stereo dissektion Mikroskop (som tidigare beskrivits22). Gör en serie små nedskärningar längs spiral ligament med hjälp av ett rakblad, och ta bort den tectorial membran och Reissners membran (figur 2).
Anmärkning: Så länge den dissekerade snäckan är intakt kan denna process ändras enligt den enskilda operatörens vanliga protokoll. - Ytterligare dissekera den återstående auditiva epitelet inklusive spiral limbus i enskilda Cochlear varv (Apex, mitten, och bas med krok region) för hel-Mount preparat.
- Under en 40x olje mål av ett ljusmikroskop, mäta basilaris membran längd med en 250 μm skala placeras i okularet, som kan justeras längs sinnes av ihcs.
- Beräkna längden på varje Cochlear tur genom att lägga till alla segment längder (250 μm per segment), och samtidigt få den totala längden av basilaris membranet genom att summera längderna på varje sväng.
- Omvandla den totala längden av basilaris membran inklusive krok regionen till en procentsats baserad på avstånd från Cochlear Apex (0% avser Cochlear Apex, 100% till cochleaimbasen).
- Omvandla detta avstånd till Cochlears karakteristiska frekvens med hjälp av en logaritmisk funktion (d (%) = 1-156,5 + 82,5 × log (f), med en lutning på 1,25 mm/oktav frekvens, där d är det normaliserade avståndet från Cochlear Apex i procent, f är frekvensen i kHz), som tidigare beskrivits5,6. Således frekvens spänner i ett motsvarande område av basilaris membran på varje Cochlear vänd kan fås.
4. färgning av immunofluorescensteknik
- Efter dissektion, placera varje Cochlear tur i en separat 2,5 mL Centrifugera röret och inkubera Cochlear vänder i 10% get serum/PBS/0,1% Triton X-100 för 1 h vid RT på en rotator.
- Avlägsna ovanstående blockerande/permeabiliseringslösning från varje tub med hjälp av en 200 μL pipettspets under ett dissektion Mikroskop och inkubera proverna med primära antikroppar spädda i 5% get serum/PBS/0,1% Triton X-100 över natten vid 4 ° c på en rotator.
Anmärkning: För immunolabeling av cochleaimsynaptiska band, använda presynaptiska markör mus anti-karboxyl-Terminal bindande protein 2 IgG1 (CtBP2, märkning B-området för RIBEYE byggnadsställningar protein, 1:400) och postsynaptiska markör mus anti-glutamatreceptorn 2 IgG2a (GluR2, märkning en subenhet av AMPA-receptorn, 1:200)23. - Skölj tre gånger i 5 min med 0,1 M kallt PBS för att ta bort kvarvarande primära antikroppar och inkubera proverna med sekundära antikroppar utspädda i 5% get serum/PBS/0,1% Triton X-100 vid RT för 2 \ u20123 h i mörker på en rotator.
Anmärkning: Förbered lämpliga sekundära antikropps blandningar med Goat anti-Mouse Alexa fluor 568 (IgG1, 1:500) och Goat anti-Mouse Alexa fluor 488 (IgG2a, 1:500), som kompletterar de primära antikropparna som används i steg 4,2. För att förbättra märkning effektivitet för synaptic band, rekommenderar vi att välja specifika sekundära antikroppar. Vissa laboratorier förlänga inkubering med sekundära antikroppar för att öka GluR2 immunolabeling24. - Skölj tre gånger i 5 minuter med 0,1 M PBS för att avlägsna kvarvarande sekundära antikroppar och överför proverna från 2,5 mL centrifugrör till 35 mm plattor som innehåller 0,1 M PBS.
- Placera en droppe monteringsmedel som innehåller 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) på bilden och överför proverna från PBS till monterings mediet. Placera en kant av en täckglas på bilden och släpp för att låta täckglaset falla försiktigt.
Anmärkning: För att säkerställa att hårcellerna står uppåt och att ingen vikning eller vridning av cochleaimprover uppstår under ingreppet, montera cochleaimplantat under en stereo dissekera Mikroskop. - Placera bilderna i en bildruta vid 4 ° c över natten för att låta bilderna torka och sedan bild under ett Laser konfokala Mikroskop.
5. morfologisk utvärdering av Cochlear Ribbon synapser
- Bild bilder med hjälp av ett konfokala Mikroskop med tre lasrar-en 405 nm UV-diod, en 488 nm argon laser, och en 561 nm diode-pumpad solid-state (DPSS) laser för att excitera DAPI (excitation Spectrum 409-464 nm), Alexa fluor 488 (excitation spektrum 496-549 nm) och Alexa fluor 568 ((Excitationsspektrum 573 – 631 nm).
- Förvärva konfokalmikroskopi z-stackar över ett avstånd av 8 μm från varje Cochlear tur med en 63x högupplöst olja nedsänkning lins.
Anmärkning: När de har definierats bör alla parametrar för digitalisering av mikrofotografier sparas och tillämpas enhetligt på alla bilder. - För synaptiska Punctum räknas, ställa z-stackar (0,3 μm steg storlek) att spänna över hela längden av ihcs, vilket säkerställer att alla synaptiska Auktor kan avbildas.
- Sammanfoga bilderna som innehåller Auktor i en z-stack för att få z-axelprojektion, och importera till bildbehandlings program.
-
Dividera synaptiska totala antalet i varje z-stack vid specifika frekvensområden med antalet ihcs (lika med DAPI nukleära manuella räkningar) för att beräkna antalet synaptiska Auktor för varje IHC. Vid varje specifik frekvens region, genomsnitt alla synaptiska Auktor i tre bilder av olika mikroskopiska fält som innehåller 9 – 11 ihcs.
- Skissera intresseregionen (ROIs) inklusive basolaterala regioner i varje IHC med hjälp av FreeHand valknappen. Använd Mät funktionen för automatisk kvantifiering av puncta, och funktionen vattendelare för att skilja mellan nära intilliggande fläckar.
- Efter varje automatiserad inventering, utföra visuella inspektioner med manuella korrigeringar för att säkerställa Auktor räkna tillförlitlig.
Anmärkning: Försöksledaren bör förbli förblindad om huruvida bilden är från Apex, mitten, eller basal vändning av cochlea.
- Visuellt bedöma synaptisk struktur och distribution, för att manuellt isolera enskilda ihcs från sina grannar med pennverktyget (M) för att bättre visualisera cytoskelett arkitektur och synaptisk lokalisering.
- För att inspektera den sammanställning av presynaptiska band (CtBP2) och postsynaptiska receptor patchar (GluR2), extrahera Voxel utrymmet runt bandet av den Rektangulära Marquee Tool och isolera enskilda band med gröda. Genom att klicka på bilden > Bildstorlek, förvärva en miniatyrbild array av dessa miniatyr projektioner, som sedan kan användas för att identifiera Parade synapser (verkade så nära bredvid par av CtBP2-positiva och GluR2-positiva puncta) kontra föräldralös (saknas postsynaptiska glutamatreceptorplåster) (figur 3).
Anmärkning: Normala Cochlear synapser visas som kombinerade immunolabeling av presynaptiska band inom hår cellen (anti-CtBP2) och postsynaptiska glutamatreceptorn patch på hörselnerven terminalen (anti-GluR2)25. Vissa laboratorier använder konfokalprojektioner i samband med 3D-modellering för att kvantifiera Synaptic patch storlek eller volym26,27. Före betydande förlust av band synapser, band uppvisar förändringar i storlek eller utan Parade glutamat receptor fläckar sannolikt tyder på synaptisk dysfunktion27,28.
6. funktionell utvärdering av Cochlear Ribbon synapser
- Samla alla ABR vågor för varje frekvens stimulus presenteras på en SPL på 90 dB för analys av suprathreshold ABR Wave I amplituder.
Anmärkning: Neurofysiologiska och morfologiska studier har visat att låg spontan-Rate, hög tröskel fibrer är särskilt utsatta för åldrande och bullerexponering29,30. Även om den enkla förlusten av band synapser inte kan påverka ABR trösklar, det leder ofta till betydande minskningar i ABR Wave jag amplituder, eftersom dessa afferenter inklusive låg spontan hastighet, hög tröskel fibrer och hög spontan-Rate, låg tröskel fibrer bidrar starkt till de sammanfattade aktiviteterna av Cochlear nerve-fibrer28,29,31. En suprathreshold intensitet av 90 dB SPL väljs här. - Bestäm Peak-to-Peak Wave I amplitud med hjälp av ett offlineanalyprogram (figur 4). Varje våg i i ABR-provet består av en start positiv (p) avböjning och efterföljande negativ (n) omböjning. ABR Wave I amplitud definieras som skillnaden i spänning mellan IP (den positiva toppen av Wave I) och i (den negativa toppen av Wave I)29.
Anmärkning: Vid sjukdomstillstånd kan Cochlear synaptopati bestämmas baserat på suprathreshold amplituder av ABR Wave I, som återspeglar den sammanfattade uppkomsten svar av SGNs framkallat av ljud. Dock är Cochlears känslighet som inte äventyras på grund av OHC-dysfunktion en förutsättning för denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR hörseltest utfördes för 10 C57BL/6J möss (8 veckors ålder) under anestesi. ABRs uppnåddes med hjälp av Tone burst stimuli vid 4, 8, 16, 32 och 48 kHz. Hörseln tröskeln för varje djur upptäcktes visuellt genom att skilja minst en klar vågform i ABR. Alla möss uppvisade ABR trösklar som svar på tonen skurar, som sträcker sig mellan 25 och 70 dB SPL beroende på frekvensen av stimulans. Våra resultat indikerade att hörsel tröskeln var lägst vid 16 kHz (figur 1), motsvarande cirka 43% avstånd från Cochlear Apex (figur 2), vilket tyder på att akustisk känslighet reduceras signifikant i andra Cochlear- Regioner.
Cochlears hel-fästen isolerades från temporala ben hos vuxna möss under en stereo dissektion Mikroskop (figur 2a). Hela-fästen av hörsel epitel dissekeras i tre stycken, vars längder mättes och så småningom omvandlas till procent avstånd från Cochlear Apex. Frekvensen plats på basilaris membranet av varje Cochlear tur beräknades med hjälp av en logaritmisk funktion, som tidigare beskrivits5,6 (figur 2B).
För att utvärdera de morfologiska egenskaperna hos Cochlear Ribbon synapser, var antikroppar mot CtBP2 och GluR2 används för att märka presynaptiska och postsynaptiska strukturer, respektive. I normala öron av vuxna möss, immunofärgning visade bredvid par av synaptiska band och glutamat receptor fläckar broddning ytan av basolaterala membranet i ihcs, med 8 – 20 par per IHC (figur 3a). Även om de allra flesta Auktor dök upp som bredvid par i normala öron, föräldralösa band kunde observeras sällan vid hög förstoring (figur 3B). Räkningar av IHC Ribbon synapser (immunopositiva fläckar för både CtBP2 och GluR2) var störst vid 16 kHz regionen, signifikant minskar när avståndet från denna plats ökade (figur 3C). Den synaptiska räknas bestäms baserat på konfokalprojektioner ger en uppskattning av det maximala antalet auditiva nervfibrer som överför information från snäckan till hjärnan29.
Funktionell status för Cochlear Ribbon synapser undersöktes hos alla vuxna möss baserat på ABR Wave i amplituder, som ger information om den funktionella integriteten av hörsel nervfibrer29,31. ABR Wave I amplituder vid varje frekvens av stimulans som presenteras vid en ljudtrycksnivå på 90 dB mättes från topp till följande tråg, som visas i figur 4a. ABR Wave I amplitud var störst vid en frekvens av 16 kHz, motsvarande den lägsta hörsel tröskeln, och amplitud värden minskade signifikant som avstånd från denna plats ökade (figur 4B). Detta resultat är förenligt med de observerade förändringarna i Ribbon synaps räknas, vilket indikerar att synapser inom detta Cochlear regionen kan uppvisa den mest levande Synaptic funktion. Vidare, i tidigare mus studier av bullerinducerad och åldersrelaterade Cochlear neurodegeneration, suprathreshold amplituder av ABR Wave jag minskade i proportion till band förlust, vilket indikerar att ABR Wave I amplitud är starkt korrelerad med graden av Cochlear synaptopati29,31.
Figur 1 : Hörsel bedömning. ABR tröskel jämförelser mellan olika frekvenser av tonen burst stimuli visade att hörsel tröskeln var lägst vid 16 kHz i 10 vuxna C57BL/6J möss. ABR-responsen var signifikant förhöjd vid andra frekvensområden (enkelriktad ANOVA med Dunnetts multipla jämförelse post hoc -test; *: P < 0,01, n = 20 öron). Data uttrycks som medelvärdet ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Cochlears frekvens lokalisering hos möss. Aen representativ bild av den fullständiga explanterad cochlea, som har dissekerats ur tinningbenet under en stereo dissektion Mikroskop. (B) mus snäckan är uppdelad i apikala, mellersta och basala svängar, där Cochlears laterala vägg avlägsnas. Röda cirklar på fragment av snäckan basilaris membran indikerar frekvensen platser och deras motsvarande normaliserade positioner i snäckan (0% hänvisar till Cochlear Apex, 100% till Cochlear Base). Skalstapel = 250 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Confocal analys av Cochlear Ribbon synapser hos möss. (A) representativa bilder av band synapser för 4, 8, 16, 32 och 48 kHz regioner, immunostained för presynaptiska band (CtBP2, röd) och postsynaptiska strukturer (GluR2, grön). Vita streckade linjer används för att beskriva inre hårceller som referens. Skalstapel = 10 μm. (B) hög effekt miniatyrer från konfokalmikroskopi z-stackar visar att dessa band synapser verkade så nära bredvid par av CtBP2-positiva (röd) och GluR2-positiva (grön) Auktor (vänster och mitten), medan föräldralösa band (höger) saknar postsynaptiska glutamatreceptorplåster var mycket sällsynta. Skalstapel = 0,5 μm. (C) kvantitativ analys av Parade band Auktor med alla presynaptiska och postsynaptiska element visade att antalet synaptiska Auktor per inre hår cell var signifikant högre i 16 kHz-regionen än i andra frekvensområden (enkelriktad ANOVA med Dunnetts multipla jämförelse post hoc -test; *: P < 0,01, n = 6 öron). Data uttrycks som medelvärdet ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Analys av ABR Wave I amplituder hos möss . (A) representativ ABR-vågform från en 8 veckor gammal C57BL/6j-mus som utsätts för en 16 kHz ren ton stimulans med en intensitet på 90 dB (stimulus debut vid 0 MS). Romerska siffror markerar topparna av ABR-vågorna. Prickade linjer Markera vågen jag topp och tråg, vilket indikerar amplituden. (B) kvantitativ analys av genomsnittliga våg i amplituder som svar på stimuli av 4, 8, 16, 32 och 48 kHz som presenteras vid en ljudtrycksnivå på 90 dB. ABR Wave I amplituder var störst vid frekvensen 16 kHz och betydligt lägre vid andra frekvenser (enkelriktad ANOVA med Dunnetts multipeljämförelse post hoc -test; *: P < 0,01, n = 20 öron). Data uttrycks som medelvärdet ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom Cochlear synaptopati först karakteriserades hos vuxna möss med en tillfällig tröskel förskjutning (TTS) inducerad av 8 \ u201216 kHz oktavband brus vid 100 dB SPL för 2 h31, forskare har alltmer undersökt effekterna av synaptopati i olika däggdjur, inklusive apor och människor32,33. Förutom bullerexponering, flera andra villkor har förknippats med Cochlear synaptopati (t. ex., åldrande, användning av Ototoxiska läkemedel, och genetiska mutationer), vilket leder till kortsiktiga störningar av suprathreshold Audition, följt av irreversibel degeneration av hörselnerven. I den tidiga fasen av Cochlear förolämpning, synaptopati förekommer ofta vid en viss frekvens plats, särskilt i experimentella modeller där skador på IHC synapser är begränsad till välja frekvens regioner24,31. Därför är vårt protokoll betydelsefullt genom att det möjliggör utredning av synaptisk morfologi och funktion vid en specifik frekvens region.
Cochlear plats-frekvenskartan kan användas för att diskriminera normal och onormal hörselfunktion, vilket ytterligare återspeglar normala och onormala områden i innerörat. Eftersom ytprepareringstekniker först användes för att kartlägga intakt och saknade hårceller i de olika cochleaimvändna, har cochleogrammet blivit en rutinmetod för att kvantifiera hår cells förlust6. Därför, för att korrelera morfologiska förolämpningar i hörselsnäckan till relevanta fysiologiska förändringar, är det rimligt att inkludera en plats-frekvenskarta på cochleogrammet. Denna metod gör det möjligt att bestämma antal och struktur av synapser baserat på deras positioner längs Cochlear basilaris membran i förhållande till etablerade Cochlear plats-frekvens kartor, och därigenom ge tillräcklig information för detaljerade jämförelser histologiska och fysiologiska utfall. Emellertid, vissa studier bedöma synaptopati baserat på Cochlear segment eller avstånd längs cochleaimplantat, som inte tillåter direkta jämförelser mellan enskilda cochlea på grund av Intra-Art variationer i basilaris membran längd. Därför är det särskilt viktigt att standardisera cochleogrammet genom att omvandla individuella Cochlears längder från millimeter till en relativ procentsats.
Synaptopati kan bekräftas via visualisering av immunofärgning för CtBP2 protein (den synaptiska isoformen "Ribeye") i de basolaterala regionerna IHCs. Dessa CtBP2-positiva fläckar kan fungera som en strukturell markör för kvantifiering av presynaptiska band, och närvaron av färre fläckar vanligtvis indikerar presynaptisk förlust. Även om tidigare studier har rapporterat att 98% av presynaptiska band paras ihop med post-synaptiska terminaler i det normala örat30, det enkla antalet CtBP2-positiva fläckar kan inte vara korrekt för kvantitativ analys av kompletta synapser, eftersom detta kan leda till överskattning av synaps räknas i det skadade örat genom att involvera "föräldralösa" (presynaptiska band unparade med postsynaptiska terminaler). För att förbättra noggrannheten för uppskattning synaps nummer, ytterligare antikroppar mot postsynaptiska struktur såsom GluA2, GluA2/3, eller PSD-95 används. Den postsynaptiska densitetens protein PSD-95, en membran-associerad stimulerare Kinas (Maguk) byggnadsställningar protein, kan märkas med hjälp av en antikropp mot PSD-95, som främst observeras vid kontakterna mellan hårceller och SGN fiber ändar34, 35. Emellertid, antikroppen mot GluR2 är mer specifik för AMPA-typ ionotropa glutamatreceptorer i postsynaptiska membranet, som mer tillförlitligt kan identifiera band synapser (juxtaposed par av Immunofluorescerande Auktor av presynaptiska CtBP2 och postsynaptiska GluR2)15. Förutom Morfologisk analys kan histologisk analys av kompletta synapser användas som en funktionell indikator för synaptopati. Hos vuxna möss med Cochlear synaptopati, minskningar av ABR Wave i amplitud efter presentationen av måttlig till hög nivå ton stimuli förekommer vid frekvenser tonotopically relaterade till regioner av synaptisk förlust26,29. Synapse räknas som erhålls med denna metod är begränsade i att det tar cirka 10 minuter att skanna en plats på basilaris membranet. Dessutom, för att utvärdera rumsliga variationer i synaptiska tal och morfologi baserat på IHC plats, är det nödvändigt att exakt identifiera gränsen för ICH kroppen (t. ex. via myosin VIIa färgning) och att utföra särskilda bild-bearbetning steg26 . Med hjälp av sådana metoder, tidigare studier har bekräftat att synaptisk förlust är större på modiolar sidan av IHC än på pelarsidan i djurmodeller av buller-inducerad degeneration26.
Tidigare studier har visat att låg spontan-Rate, hög tröskel fibrer är mer mottagliga för bullerskador än hög spontan hastighet, låg tröskel fibrer i djurmodeller av begränsad synaptopati26,30. Dessa studier ger den logiska grunden för att använda suprathreshold amplituder av ABR Wave I (mätt med måttlig till hög nivå ton stimuli) för att bedöma synaptisk funktion i djurmodeller med normal ABR tröskel och snedvridning produkt otoakustiska utsläpp ( DPOAEs). Eftersom våg I av ABR återspeglar sammanfattade neurala reaktioner av hörsel nervfibrer, när synaptopati bedöms via ABR Wave I amplitud, DPOAE testning bör också utföras för att utesluta OHC skador, som också kan minska ABR amplituder på grund av störningar av mechanoelektrisk transduktion. Även om den första vågen av den sammansatta åtgärden potential (CAP), som mäts från runda fönster elektroder, också representerar summerad aktivitet cochleaimnerven, denna metod är mer invasiv och komplex än ABR mätningar. Om DPOAE-svar återgår till det normala efter tillfälliga tröskel förändringar i bullerexponerade möss31 eller de har ännu inte försämrats i åldrande möss29, den suprathreshold AMPLITUD av ABR våg jag kan starkt förutsäga graden av Cochlear synaptopati , eftersom drabbade nervceller tystas när deras synaptiska anslutningar till IHCs störs. Emellertid, om Cochlears känslighet reduceras på grund av olika faktorer (t. ex., OHC dysfunktion), minskningar av ABR Wave i amplitud kan inte längre tillskrivas enbart synaptisk förlust eftersom de kommer att återspegla kombinationen av alla Cochlear skador. Därför är kontrollerade Försöksförhållanden för synaptopati-begränsad modell beredning krävs för att säkerställa att Cochlears känslighet inte äventyras av andra faktorer. Tyvärr, även om ABR Wave I amplitud ger ett objektivt mått av hörsel nerv fiber förlust hos djur, det är svårt att mäta hos människor. Dessutom, blandade patologier som involverar synaptopati, förlust av hårceller, och närvaron av andra avvikelser i snäckan kan Co-förekomma hos människor, begränsa användningen av ABR Wave i amplitud mätningar i kliniska inställningar. ABR Wave latens beräknas som tiden i millisekunder från uppkomsten av stimulansen till den positiva toppen av varje våg, ger insikt i överföringstider längs hörselgången vägen. Inga signifikanta förändringar i Wave i latens har observerats i musmodeller av bullerinducerad eller åldersrelaterade Cochlear synaptopathy36. Emellertid, vissa belägg tyder på att effekterna av maskering buller på ABR Wave V latens kan användas för att diagnostisera Cochlear synaptopati hos människor37.
Flera nyare studier har stött uppfattningen att Cochlear synaptopati är den primära initiala händelsen i samband med dold hörselnedsättning, tinnitus, och hyperacusis. Även om begreppet Cochlear synaptopati i innerörat sjukdomar har nu fast etablerad, dess detaljerade inverkan på hörselförmågan är fortfarande okänd. Det protokoll som presenteras i den aktuella studien möjliggör utredning av morfologi och funktion i Cochlear Ribbon synapser inom ett specifikt frekvensområde. Detta protokoll kan därför användas för att undersöka cochleaimsynaptopati, dess bakomliggande mekanismer och effekten av potentiella terapeutiska ingrepp i olika experimentella djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81770997, 81771016, 81830030); det gemensamma finansierings projektet för Beijing Natural Science Foundation och Pekings utbildningskommitté (KZ201810025040); Naturvetenskaps stiftelsen i Peking (7174291); och China postdoc Science Foundation (2016M601067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100 mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10 mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 |
References
- Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
- Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
- Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
- Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
- Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
- Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
- Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
- Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
- Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
- Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
- Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
- Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
- Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).
