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Neuroscience

Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris

doi: 10.3791/59189 Published: May 10, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Ce manuscrit décrit un protocole expérimental pour évaluer les caractéristiques morphologiques et l'état fonctionnel des synapses de ruban chez les souris normales. Le modèle actuel convient également aux modèles à synaptopathie cochléaire induits par le bruit et liés à l'âge. Les résultats corrélatifs des études précédentes de souris sont également discutés.

Abstract

Les cellules ciliées intérieures cochléaires (IHC) transmettent des signaux acoustiques aux neurones de ganglion en spirale (SGN) par des synapses de ruban. Plusieurs études expérimentales ont indiqué que les synapses de cellules capillaires peuvent être les cibles initiales dans la perte d'audition neuro-sensorielle (SNHL). Ces études ont proposé le concept de « synaptopathie » cochléaire, qui se réfère aux altérations du nombre, de la structure ou de la fonction de synapse de ruban qui ont comme conséquence la transmission synaptique anormale entre iHCs et SGNs. Bien que la synaptopathie cochléaire soit irréversible, elle n'affecte pas le seuil auditif. Dans les modèles expérimentaux induits par le bruit, des dommages limités aux synapses du CSI dans certaines régions de fréquence sont utilisés pour identifier les facteurs environnementaux qui causent spécifiquement la synaptopathie, ainsi que les conséquences physiologiques de déranger cette oreille interne. circuit. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la morphologie synaptique cochléaire et fonctionner à une région de fréquence spécifique chez les souris adultes. Dans ce protocole, la localisation cochléaire des régions de fréquence spécifiques est effectuée à l'aide de cartes de fréquence synaptique en conjonction avec des données de cochléogramme, après quoi les caractéristiques morphologiques des synapses de ruban sont évaluées par l'intermédiaire synaptique Immunomarquage. L'état fonctionnel des synapses de ruban est alors déterminé basé sur les amplitudes de la réponse auditive de tronc cérébral (ABR) vague I. Le présent rapport démontre que cette approche peut être utilisée pour approfondir notre compréhension de la pathogénie et des mécanismes du dysfonctionnement synaptique dans la cochlée, qui peut aider au développement de nouvelles interventions thérapeutiques.

Introduction

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Les fréquences de l'ordre d'environ 20'u201220,000 Hz peuvent être perçues comme des stimuli auditifs par les humains. L'audition humaine est normalement plus sensible près de 1 000 Hz, où le niveau moyen de pression sonore est de 20 degrés Pa chez les jeunes adultes (c.-à-d. 0 décibels de niveau de pression sonore [dB SPL]). Dans certaines conditions pathologiques, la perte auditive est limitée à des fréquences spécifiques. Par exemple, dans les premiers stades de la perte auditive causée par le bruit (NIHL), une « encoche » (c.-à-d. l'élévation du seuil auditif) peut être observée dans l'audiogramme à 4 kHz1. Le long de la partition cochléaire des mammifères, ses gradations de rigidité et de masse produisent une carte de fréquence exponentielle, avec détection sonore à haute fréquence à la base de la cochlée et détection à basse fréquence au sommet2. En effet, il existe une carte cochléaire de la fréquence des lieux le long de la membrane basilaire, menant à ce qu'on appelle l'organisation tonotopic2,3. Chaque endroit donné sur la membrane basilaire a la plus grande sensibilité à une seule fréquence sonore particulière, qui est généralement appelée la fréquence caractéristique3,4, bien que des réponses à d'autres fréquences peuvent également être observées.

À ce jour, divers modèles de souris ont été utilisés pour étudier la fonction normale, les processus pathologiques et l'efficacité thérapeutique dans le système auditif. La connaissance précise des paramètres physiologiques dans la cochlée de souris est une condition préalable à de telles études de la perte auditive. La cochlée de souris est anatomiquement divisée en tours apaïques, moyens et basaux, qui correspondent à différentes régions de fréquence. En étiquetant les afferents de nerf auditif au noyau cochléaire pour analyser leurs emplacements périphériques correspondants d'innervation dans la cochlée,M. et autres ont réussi à établir la carte cochléaire de lieu-fréquence dans la souris normale in vivo 5. Dans l'intervalle de 7,2 à 61,8 kHz, ce qui correspond à des positions comprises entre 90 % et 10 % de la longueur complète de la membrane basilaire, la carte cochléaire de la fréquence cochléaire de la souris peut être décrite par une simple fonction de régression linéaire, suggérant une relation entre les distance normalisée de la base cochléaire et du logarithme de la fréquence caractéristique5. Chez les souris de laboratoire, la carte place-fréquence peut être utilisée pour explorer la relation entre les seuils auditifs dans des plages de fréquences spécifiques et les cochléogrammes montrant le nombre de cellules ciliées manquantes dans les régions relatives le long de la membrane basilaire6. Fait important, la carte place-fréquence fournit un système de positionnement pour l'étude des dommages structurels minimaux, tels que des dommages aux synapses de ruban des cellules de cheveux à des endroits spécifiques de fréquence cochléaire chez les souris avec le trauma auditif périphérique7 ,8.

Dans la cochlée des mammifères, les synapses de ruban sont composées d'un ruban présynaptique, d'une projection dense d'électrons qui attache un halo de vésicules synaptiques prêtes à libérer contenant du glutamate au sein du CSI, et d'une densité postsynaptique sur le terminal nerveux du SGN avec des récepteurs de glutamate9. Pendant la transduction cochléaire de bruit, la déviation du faisceau de cellules de cheveux a comme conséquence la dépolarisation d'IHC, qui mène à la libération de glutamate des IHCs sur les bornes afferents postsynaptic, activant de ce fait la voie auditive. L'activation de cette voie conduit à la transformation des signaux mécaniques induits par le son en un code de taux dans le SGN10. En effet, la synapse ruban IHC est hautement spécialisée pour la transmission sonore infatigable à des taux de centaines de Hertz avec une haute précision temporelle, et est d'une importance critique pour les mécanismes presynaptiques de codage sonore. Des études antérieures ont révélé que les synapses de ruban varient considérablement en taille et en nombre à différentes régions de fréquence dans la cochlée adulte de souris11,12, reflétant probablement l'adaptation structurale au codage sonore particulier pour besoins de survie. Récemment, des études expérimentales sur les animaux ont démontré que la synaptopathie cochléaire contribue à de multiples formes de déficiences auditives, y compris la perte auditive causée par le bruit, la perte auditive liée à l'âge et la perte auditive héréditaire13, 14. Ainsi, les méthodes d'identification des changements corrélés dans le nombre, la structure et la fonction synaptiques à des régions de fréquence spécifiques ont été de plus en plus employées dans les études du développement auditif et de la maladie de l'oreille interne, utilisant des modèles générés par l'intermédiaire manipulation expérimentale des variables génétiques ou environnementales15,16,17.

Dans le rapport actuel, nous présentons un protocole pour analyser le nombre synaptique, la structure, et la fonction à une région spécifique de fréquence de la membrane basilaire chez les souris adultes. La localisation de la fréquence cochléaire est effectuée à l'aide d'une carte de fréquence de lieu donnée en combinaison avec un cochléogramme. Les caractéristiques morphologiques normales des synapses de ruban cochléaire sont évaluées par immunostaining presynaptic et postsynaptic. L'état fonctionnel des synapses de ruban cochléaire est déterminé en fonction des amplitudes supraseuils de l'onde I de l'ABR. Avec des altérations mineures, ce protocole peut être utilisé pour examiner les conditions physiologiques ou pathologiques dans d'autres modèles animaux, y compris les rats, les cobayes et les gerbilles.

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Protocol

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Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide du CNRC/ILAR pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire (8e édition). Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université médicale de la capitale, Beijing, Chine.

1. Sélection des animaux

  1. Pour toutes les expériences, utilisez des souris mâles adultes C57BL/6J (8 semaines) comme modèle animal.
    REMARQUE: Les souris c57BL/6J portant une variante d'épissage du Cdh23 présentent une sénescence accélérée dans le système auditif, reflétée comme une perte de 40% de synapses de ruban au tour basal de la cochlée et une perte de 10% au tour moyen par 6 mois d'âge, suivie d'une perte rapide augmentation de cette perte dans l'ensemble de la cochlée avec l'âgede 18,19. Ainsi, nous conseillons la prudence en utilisant des souris C57BL/6J de plus de 6 mois pour la recherche auditive. D'autres souches de souris peuvent être utilisées en fonction d'objectifs expérimentaux spécifiques.
  2. Inspectez les souris à l'aide d'un otoscope de poche diagnostique professionnel pour éliminer les pathologies de l'oreille externe ou moyenne avant les évaluations auditives. Les signes potentiels peuvent inclure le fluide ou le pus dans le canal auditif externe, la rougeur et l'enflure dans les tissus locaux, et la perforation de membrane tympanique.
    REMARQUE: Bien que cela soit rarement rencontré, une fois identifié, les souris atteintes de maladies de l'oreille externe ou moyenne devraient être exclues.

2. Évaluation auditive

  1. Anesthésiez les souris à l'aide d'une injection intrapéritonéale d'un mélange d'hydrochlorure de kétamine (100 mg/kg) et d'hydrochlorure de xylazine (10 mg/kg). Jugez la profondeur de l'anesthésie par des stimuli douloureux (p. ex., réflexe de pincement des orteils).
    REMARQUE: Lorsque le réflexe de pincement des orteils est complètement absent, l'animal a atteint une profondeur adéquate d'anesthésie pour les tests auditifs. Si plus de temps est nécessaire pour les enregistrements bilatéraux ABR, administrer une dose plus faible (un cinquième de la dose initiale) d'anesthésiques pour restaurer le plan anesthésique d'origine. Prenez soin d'éviter les surdosages anesthésiques, car cela peut conduire à la mort chez les souris.
  2. Maintenir la température corporelle de l'animal anesthésié à 37,5 oC à l'aide d'un coussin chauffant thermorégulateur. Placez l'animal anesthésié dans une pièce électriquement et acoustiquement protégée pour éviter les interférences tout au long de l'essai auditif.
    REMARQUE: Maintenir la température physiologique pendant toute la procédure jusqu'à ce que l'animal soit totalement éveillé, afin d'éviter la mort causée par l'hypothermie post-anesthésie.
  3. Placer les électrodes d'aiguille subdermiques (20 mm, 28 G) au sommet du crâne (électrode d'enregistrement), dans la région parotide ipsilatérale sous la pinna de l'oreille mesurée (électrode de référence), et dans la région parotide contralatérale (électrode souterraine), avec une profondeur de 3 mm sous la peau de la tête de souris, respectivement20.
  4. Utilisez un haut-parleur à champ fermé pour effectuer une stimulation acoustique via un tube en plastique de 2 cm avec une pointe en forme de cône. Ajuster la pointe dans le conduit auditif externe21.
    REMARQUE: Assurez-vous que l'impédance électrique dans les électrodes d'enregistrement et de référence est inférieure à 3 kOhm (habituellement 1 kOhm). Si l'impédance est élevée, modifiez le site d'insertion de l'électrode, nettoyez l'électrode par de l'alcool ou remplacez l'électrode pour éviter les altérations de l'amplitude des ondes ABR.
  5. Pour l'enregistrement ABR, générer des pépins de tonalité (durée de 3 ms, 1 ms de montée/temps de chute, à un taux de 21,1/s, fréquence : 4 à 48 kHz) et les présenter à des SPL décroissants de 90 à 10 dB en 5'u201210 dB SPL étapes20. Au cours de cette étape, les réponses sont amplifiées (10 000 fois), filtrées (0,1 à 3 kHz) et moyennes (1 024 échantillons/niveau de stimulation).
    REMARQUE: Les AAR sont collectés pour chaque niveau de stimulus en 10 étapes dB, avec 5 étapes dB supplémentaires près du seuil.
  6. À chaque fréquence, déterminez le seuil ABR, qui se réfère au SPL minimal résultant en un enregistrement ABR fiable avec une ou plusieurs ondes distinguables qui peuvent être clairement identifiés par l'inspection visuelle (figure 1).
    REMARQUE: Il est généralement nécessaire de répéter le processus pour les sPL faibles autour du seuil pour assurer la cohérence des formes d'onde. Le seuil de réponse est le niveau de stimulus le plus bas auquel la forme d'onde peut être observée, quand une diminution de 5 dB conduirait à la disparition de la forme d'onde.

3. Traitement des tissus cochléaires

  1. Après l'enregistrement ABR, euthanasiez les souris anesthésiées par dislocation cervicale, décapitez-les, exposez les taureaux du côté ventral, et ouvrez avec des ciseaux pointus pour accéder à la cochlée.
  2. À l'aide d'un fine forceps, retirez les os temporels, couper l'artère des stapes, retirer les rubans de la fenêtre ovale et rompre la membrane de la fenêtre ronde. Faire un petit trou au sommet de la cochlée en tournant doucement la pointe d'une aiguille (13 mm, 27 G).
  3. Fixez les os isolés avec 4 % (wt/vol) de paraformaldéhyde dans une saline tamponnée de 0,1 M de phosphate (PBS, pH 7,4) pendant la nuit à 4 oC. À l'aide d'une pipette à pointe fine, rincer doucement le fixatif à travers les espaces périlymphatiques par application aux fenêtres ovales ou rondes (comme une infusion) et l'ouverture à l'apex (comme une prise).
    REMARQUE: Certaines protéines nécessitent une courte durée de fixation pour éviter la destruction de leurs épitopes pour l'immunolabeling. Dans de tels cas, incuber les os dans 4% de paraformaldéhyde à température ambiante (RT) pendant 2 h, selon les instructions du fabricant pour l'immunohistochimie. La fixation peut également être effectuée par perfusion cardiaque pour enlever le sang cochléaire, en évitant le bruit de fond dû à la coloration non spécifique à des stades ultérieurs, en particulier dans les modèles de souris de la synaptopathie cochléaire.
  4. Rincer les os trois fois pendant 5 min avec 0,1 M de PBS froid pour enlever le paraformaldéhyde résiduel. Décalcifier les os avec 10% d'acide éthylènediaminetetratraacetic (EDTA) soit à RT pendant 4 h soit à 4 oC pour 24 h par secousses douces dans un shaker horizontal à 20 tr/min. EDTA peut être actualisé à mi-chemin.
    REMARQUE: Les temps de décalcification sont soumis à la concentration de l'EDTA et aux préférences des utilisateurs. Le tissu décalcifié devrait maintenir un certain degré de dureté, ce qui facilite la manipulation des montures entières cochlaires isolants à des étapes ultérieures. Les os temporels peuvent être décalcifiés en 10% EDTA avec rotation, permettant aux chercheurs de quitter le laboratoire après des tests ABR et des expériences de fixation. Le temps de décalcification est flexible dans la fourchette de 20 à 30 h à 4 oC.
  5. Transférer un os temporel décalcifié de l'EDTA à 0,1 M PBS. Utilisez #3, #5 les forceps Dumont et l'aiguille de 27 G pour disséquer les régions cochléaires apaniques, moyennes et basiques à tour de rôle, puis disséquer la cochlée hors de l'os sous un microscope stéréo de dissection (comme décrit précédemment22). Faire une série de petites coupures le long du ligament spiralé à l'aide d'une lame de rasoir, et enlever la membrane tectoriale et la membrane de Reissner (Figure 2).
    REMARQUE: Tant que la cochlée disséquée est intacte, ce processus peut être modifié selon le protocole habituel de l'opérateur individuel.
  6. Disséquer davantage l'épithélium auditif restant, y compris le limbus spiralé en virages cochléaires individuels (apex, milieu et base avec la région du crochet) pour les préparations de montage entier.
  7. Dans le cadre d'un objectif 40x huile d'un microscope léger, mesurer la longueur de la membrane basilaire avec une échelle de 250 m placé dans l'oculaire, qui peut être ajusté le long des stéréocilia des IHC.
  8. Calculez la longueur de chaque virage cochléaire en ajoutant toutes les longueurs de segment (250 m par segment), et obtenez en même temps la longueur totale de la membrane basilaire en résumant les longueurs de chaque tour.
  9. Convertir la longueur totale de la membrane basilaire, y compris la région du crochet, en un pourcentage basé sur la distance de l'apex cochléaire (0 % se réfère à l'apex cochléaire, 100 % à la base cochléaire).
  10. Convertir cette distance en fréquence caractéristique cochléaire à l'aide d'une fonction logarithmique (d(%) 1 - 156,5 - 82,5 ' log(f), avec une pente de 1,25 mm/octave de fréquence, où d est la distance normalisée de l'apex cochléaire en pour cent, f est la fréquence en kHz), comme décrit précédemment5,6. Ainsi, une portée de fréquence dans une zone correspondante de la membrane basilaire sur chaque tour cochléaire peut être acquise.

4. Staining immunofluorescence

  1. Après la dissection, placez chaque tour cochléaire dans un tube de centrifugeuse séparé de 2,5 ml et incubez les virages cochléaires dans 10 % de sérum de chèvre/PBS/0,1 % Triton X-100 pour 1 h à RT sur un rotateur.
  2. Retirez la solution de blocage/perméabilisation ci-dessus de chaque tube à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l sous un microscope de dissection et incubez les spécimens avec des anticorps primaires dilués dans un sérum de chèvre/PBS/0,1 % Triton X-100 pendant la nuit à 4 oC sur un rotateur.
    REMARQUE: Pour l'immunolabeling des rubans synaptiques cochléaires, utilisez le marqueur présynaptique souris anti-carboxyl-terminal protéine de liaison 2 IgG1 (CtBP2, étiquetant le domaine B de la protéine d'échafaudage RIBEYE, 1:400) et le récepteur anti-glutamate de marqueur postsynaptique de souris 2 IgG2a (GluR2, étiquetage d'une sous-unité du récepteur AMPA, 1:200)23.
  3. Rincer trois fois pendant 5 min avec 0,1 M PBS froid pour enlever les anticorps primaires résiduels et incuber les spécimens avec des anticorps secondaires dilués dans 5% de sérum de chèvre/PBS/0,1% Triton X-100 à RT pour 2'u20123 h dans l'obscurité sur un rotateur.
    REMARQUE : Préparer les mélanges d'anticorps secondaires appropriés à l'aide de la chèvre anti-souris Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) et de l'antisouris de chèvre Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), qui sont complémentaires aux anticorps primaires utilisés à l'étape 4.2. Pour améliorer l'efficacité de l'étiquetage des rubans synaptiques, nous vous recommandons de sélectionner des anticorps secondaires spécifiques. Certains laboratoires prolongent l'incubation avec des anticorps secondaires pour augmenter l'immunoétiquetage GluR224.
  4. Rincer trois fois pendant 5 min avec 0,1 M PBS pour enlever les anticorps secondaires résiduels et transférer les spécimens des tubes centrifugeurs de 2,5 ml à des plaques de 35 mm contenant 0,1 M de PBS.
  5. Placez une goutte de milieu de montage contenant 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) sur la diapositive et transférez les spécimens de PBS au milieu de montage. Placez un bord d'une glissière de couverture sur la glissière et relâchez pour laisser tomber doucement le borderon.
    REMARQUE: Pour s'assurer que les cellules ciliées font face vers le haut et qu'aucun pliage ou torsion des spécimens cochléaires ne se produit pendant la procédure, montez des spécimens cochléaires sous un microscope stéréo de dissection.
  6. Placez les diapositives dans une boîte à glissière à 4 oC pendant la nuit pour laisser sécher les diapositives, puis l'image sous un microscope focal laser.

5. Évaluation morphologique des synapses de ruban cochléaire

  1. Diapositives d'image à l'aide d'un microscope confocal avec trois lasers : une diode UV de 405 nm, un laser argon de 488 nm et un laser à état solide à diode de 561 nm (DPSS) pour exciter DAPI (Spectre d'excitation 409 à 464 nm), Alexa Fluor 488 (spectre d'excitation 496 à 549 nm) et Alexa Fluor 568 nm (Spectre d'excitation 573-631 nm), respectivement.
  2. Acquérir des z-stacks confocals sur une distance de 8 m à partir de chaque virage cochléaire à l'aide d'une lentille d'immersion à haute résolution de 63x.
    REMARQUE: Une fois définis, tous les paramètres de numérisation des photomicrographes doivent être enregistrés et appliqués uniformément sur toutes les diapositives.
  3. Pour les nombres de ponctumes synaptiques, définir les z-stacks (taille de l'étape de 0,3 m) pour couvrir toute la longueur des CSI, assurant ainsi que toutes les ponctuas synaptiques peuvent être représentées.
  4. Fusionner les images contenant puncta dans une z-pile pour obtenir la projection z-axe, et l'importation au logiciel de traitement d'image.
  5. Divisez les nombres totaux synaptiques dans chaque z-pile à des régions de fréquence spécifiques par le nombre de CSI (égal au compte manuel nucléaire DAPI) pour calculer le nombre de ponctuas synaptiques pour chaque IHC. À chaque région de fréquence spécifique, la moyenne de toutes les ponctuas synaptiques en trois images de différents champs microscopiques contenant des IHC 9-11.
    1. Décrivez la région d'intérêt (ROI) y compris les régions basolatérales de chaque CSI à l'aide du bouton de sélection à main levée. Utilisez la fonction de mesure pour la quantification automatique de la poncte, et la fonction de bassin versant pour distinguer entre les taches étroitement adjacentes.
    2. Après chaque comptage automatisé, effectuez des inspections visuelles avec des corrections manuelles pour assurer le comptage des ponctuas fiable.
      REMARQUE: Les expérimentateurs doivent rester aveuglés quant à savoir si la diapositive est de l'apex, milieu, ou tour basal de la cochlée.
  6. Évaluer visuellement la structure et la distribution synaptiques, afin d'isolermanuellement les CSI individuels de leurs voisins par l'outil crayon ( M ) afin de mieux visualiser l'architecture cytosquelettique et la localisation synaptique.
  7. Pour inspecter la juxtaposition des rubans présynaptiques (CtBP2) et des patchs récepteurs postsynaptiques (GluR2), extraire l'espace voxel autour du ruban par l'outil Rectangulaire Marquee et isoler le ruban individuel par Crop. En cliquant sur Image 'gt; Image Size, acquérir un tableau miniature de ces projections miniatures, qui peuvent ensuite être utilisés pour identifier les synapses appariées (apparu comme étroitement juxtaposé paires de CtBP2-positif et GluR2-positif puncta) par rapport à l'orphelin rubans (manquant de patchs récepteurs de glutamate postsynaptiques) (Figure 3).
    REMARQUE: Les synapses cochléaires normales apparaissent comme immunolabeling combiné du ruban presynaptique dans la cellule de cheveux (anti-CtBP2) et le patch de récepteur de glutamate postsynaptique sur le terminal auditif de nerf (anti-GluR2)25. Certains laboratoires utilisent des projections confocales en conjonction avec la modélisation 3D pour quantifier la taille du patch synaptique ou le volume26,27. Avant la perte significative des synapses de ruban, les rubans présentant des changements dans la taille ou sans corrections appariées de récepteur de glutamate sont probablement indicatifs du dysfonctionnement synaptique27,28.

6. Évaluation fonctionnelle des synapses de ruban cochléaire

  1. Recueillir toutes les ondes ABR pour chaque stimulus de fréquence présenté à un SPL de 90 dB pour l'analyse des amplitudes d'onde ABR supraseuil.
    REMARQUE: Des études neurophysiologiques et morphologiques ont démontré que les fibres à faible taux spontané et à seuil élevé sont particulièrement vulnérables au vieillissement et à l'exposition au bruit29,30. Bien que la simple perte de synapses de ruban ne puisse pas affecter les seuils aBR, elle entraîne généralement des réductions significatives des amplitudes d'onde DBR I, parce que ces afférents comprenant des fibres à faible taux spontané et à seuil élevé et à taux spontané élevé, les fibres de bas seuil contribuent fortement aux activités résumées des fibres de nerf cochléaire28,29,31. Une intensité supraseuil de 90 dB SPL est sélectionnée ici.
  2. Déterminer l'amplitude des ondes de pointe à pic à l'amplitude à l'aide d'un programme d'analyse hors ligne (figure 4). Chaque vague I dans le test ABR se compose d'une déviation positive de départ (p) et de la déviation négative (n) subséquente. ABR vague je amplitude est définie comme la différence de tension entre Ip (le pic positif de l'onde I) et Dans (le pic négatif de l'onde I)29.
    REMARQUE: Dans des conditions pathologiques, la synaptopathie cochléaire peut être déterminée en fonction des amplitudes supraseuils de l'onde I de l'ABR, qui reflètent les réponses d'initialité résumées des SGN évoquées par le son. Cependant, la sensibilité cochléaire qui n'est pas compromise en raison du dysfonctionnement d'OHC est une condition préalable à cette méthode.

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Representative Results

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Des essais auditifs d'ABR ont été exécutés pour 10 souris de C57BL/6J (8 semaines d'âge) sous l'anesthésie. Les APR ont été obtenus à l'aide de stimuli de tonalité à 4, 8, 16, 32 et 48 kHz. Le seuil auditif de chaque animal a été détecté visuellement en distinguant au moins une forme d'onde claire dans l'ABR. Toutes les souris ont exhibé des seuils d'ABR en réponse aux éclats de tonalité, s'étendant entre 25 et 70 dB SPL selon la fréquence du stimulus. Nos résultats ont indiqué que le seuil d'audition était le plus bas à 16 kHz (figure 1), ce qui correspond à une distance d'environ 43 % par rapport au sommet cochléaire (figure 2), ce qui suggère que la sensibilité acoustique est considérablement réduite dans d'autres cochléaires Régions.

Des montures entières cochléaires ont été isolées des os temporels chez des souris adultes sous un microscope stéréo de dissection (Figure 2A). Des montures entières de l'épithélium auditif ont été disséquées en trois morceaux, dont les longueurs ont été mesurées et finalement converties en pourcentage de distance de l'apex cochléaire. L'emplacement de la fréquence sur la membrane basilaire de chaque virage cochléaire a été calculé à l'aide d'une fonction logarithmique, comme décrit précédemment5,6 (Figure 2B).

Pour évaluer les caractéristiques morphologiques des synapses de ruban cochléaire, des anticorps contre CtBP2 et GluR2 ont été utilisés pour étiqueter les structures presynaptiques et postsynaptiques, respectivement. Dans les oreilles normales des souris adultes, l'immunostaining a indiqué des paires juxtaposées des rubans synaptiques et des corrections de récepteur de glutamate cloutant la surface de la membrane basolatérale des IHC, avec 8-20 paires par IHC (figure 3A). Bien que la grande majorité des ponctuas apparaissent comme des paires juxtaposées dans les oreilles normales, les rubans orphelins pouvaient être observés rarement à un grossissement élevé (Figure 3B). Le nombre de synapses de ruban synapses du CiPH (taches immunopositives pour CtBP2 et GluR2) était le plus élevé dans la région de 16 kHz, diminuant considérablement à mesure que la distance par rapport à cet endroit augmentait (figure 3C). Les dénombrements synaptiques déterminés sur la base de projections confocales fournissent une estimation du nombre maximum de fibres nerveuses auditives qui transmettent l'information de la cochlée au cerveau29.

L'état fonctionnel des synapses cochléaires de ruban a été étudié dans toutes les souris adultes basées sur l'amplitudes d'onde d'ABR I, qui fournissent l'information concernant l'intégrité fonctionnelle des fibres auditives de nerf29,31. ABR onde I amplitudes à chaque fréquence du stimulus présenté à un niveau de pression sonore de 90 dB ont été mesurées du pic à l'abreuvoir suivant, comme indiqué à la figure 4A. L'amplitude de l'amplitude de l'amplitude de l'amplitude a été la plus élevée à une fréquence de 16 kHz, correspondant au seuil auditif le plus bas, et les valeurs d'amplitude ont considérablement diminué à mesure que la distance par rapport à cet endroit augmentait (figure 4B). Ce résultat est compatible avec les altérations observées dans les dénombrements de synapse de ruban, indiquant que les synapses dans cette région cochléaire peuvent présenter la fonction synaptique la plus vive. En outre, dans les études précédentes de souris de la neurodégénérescence cochléaire induite par le bruit et liée à l'âge, les amplitudes supraseuils de l'onde ABR I ont diminué en proportion de la perte de ruban, indiquant que l'amplitude d'onde d'ABR i est fortement corrélée avec le degré de synaptopathie cochléaire29,31.

Figure 1
Figure 1 : Évaluation auditive. Les comparaisons de seuil d'ABR entre différentes fréquences de stimulus d'éclatement de tonalité ont démontré que le seuil d'audition était plus bas à 16 kHz dans 10 souris adultes de C57BL/6J. La réponse aBR a été significativement élevée à d'autres régions de fréquence (ANOVA à sens unique avec le test post hoc de comparaison multiple de Dunnett ; ' : P 'lt; 0.01, n '20 oreilles). Les données sont exprimées comme la moyenne - SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Localisation des fréquences cochléaires chez les souris. (A) Une image représentative de la cochlée explantée complète, qui a été disséquée hors de l'os temporel sous un microscope stéréo de dissection. (B) La cochlée de souris est divisée en virages apical, moyens et basaux, où la paroi latérale cochléaire est enlevée. Les cercles rouges sur les fragments de la membrane basilaire cochléaire indiquent les emplacements de fréquence et leurs positions normalisées correspondantes dans la cochlée (0% se réfère à l'apex cochléaire, 100% à la base cochléaire). Barre d'échelle de 250 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse Confocale de synapses de ruban cochléaire chez les souris. (A) Images représentatives de synapses de ruban pour les régions de 4, 8, 16, 32 et 48 kHz, immunostained pour les rubans présynaptiques (CtBP2, rouge) et les structures postsynaptiques (GluR2, vert). Des lignes pointillées blanches sont utilisées pour décrire les cellules ciliées intérieures à des fins de référence. Barre d'échelle de 10 m. (B) Les vignettes de haute puissance des z-stacks confocales montrent que ces synapses de ruban sont apparues comme des paires étroitement juxtaposées de Puncta CtBP2-positive (rouge) et gluR2-positive (verte) (gauche et milieu), tandis que les rubans orphelins (droite) manquant de postsynaptic les corrections de récepteur de glutamate étaient très rares. Barre d'échelle de 0,5 m. (C) L'analyse quantitative de la puncta de ruban appariée avec tous les éléments presynaptiques et postsynaptiques a indiqué que le nombre de puncta synaptique par cellule de cheveux interne était sensiblement plus élevé à la région de 16 kHz que dans d'autres régions de fréquence (ANOVA à sens unique avec le test post hoc de comparaison multiple de Dunnett; - P lt; 0,01, n '6 oreilles). Les données sont exprimées comme la moyenne - SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Analyse de ABR vague I amplitudes chez les souris . (A) Forme d'onde ABR représentative d'une souris C57BL/6J de 8 semaines exposée à un stimulus de tonalité pure de 16 kHz à une intensité de 90 dB (début de stimulus à 0 ms). Les chiffres romains marquent les sommets des vagues aBR. Des lignes pointillées marquent la vague I pic et creux, indiquant l'amplitude. (B) Analyse quantitative des amplitudes moyennes d'ondes I en réponse aux stimuli de 4, 8, 16, 32 et 48 kHz présentés à un niveau de pression sonore de 90 dB. Les amplitudes d'amplitudes d'onde d'ABR I étaient les plus élevées à la fréquence de 16 kHz et sensiblement plus basses à d'autres fréquences (ANOVA à sens unique avec le test post hoc de comparaison multiple de Dunnett ; ' : P 'lt ; 0.01, n '20 oreilles). Les données sont exprimées comme la moyenne - SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Depuis la synaptopathie cochléaire a d'abord été caractérisée chez les souris adultes avec un changement de seuil temporaire (TTS) induit par 8-u201216 kHz bruit de bande d'octave à 100 dB SPL pour 2 h31, les chercheurs ont de plus en plus étudié les effets de la synaptopathie dans divers mammifères, y compris les singes et les humains32,33. En plus de l'exposition au bruit, plusieurs autres affections ont été associées à la synaptopathie cochléaire (p. ex., le vieillissement, l'utilisation de médicaments ototoxiques et les mutations génétiques), ce qui a entraîné une interruption à court terme de l'audition supraseuil, suivie d'une dégénérescence du nerf auditif. Dans la phase initiale de l'insulte cochléaire, la synaptopathie se produit souvent à un emplacement de fréquence spécifique, en particulier dans les modèles expérimentaux dans lesquels les dommages aux synapses IHC est limitée à certaines régions de fréquence24,31. Par conséquent, notre protocole est significatif en ce qu'il permet l'étude de la morphologie synaptique et de la fonction à une région de fréquence spécifique.

La carte cochléaire de lieu-fréquence peut être employée pour discriminer la fonction auditive normale et anormale, reflétant davantage la zone normale et anormale dans l'oreille interne. Depuis les techniques de préparation de surface ont d'abord été utilisés pour tracer intactes et manquantes cellules ciliées dans les différents virages cochléaires, le cochléogramme est devenu une méthode courante pour quantifier la perte de cellules capillaires6. Par conséquent, pour corréler les insultes morphologiques dans la cochlée aux changements physiologiques pertinents, il est raisonnable d'inclure une carte de lieu-fréquence sur le cochléogramme. Cette méthode permet de déterminer le nombre et la structure des synapses en fonction de leurs positions le long de la membrane basilaire cochléaire par rapport aux cartes cochléaires établies de place-fréquence, fournissant ainsi suffisamment d'informations pour des comparaisons détaillées entre les résultats histologiques et physiologiques. Cependant, certaines études évaluent la synaptopathie en fonction du segment cochléaire ou de la distance le long du conduit cochléaire, ce qui ne permet pas de comparaisons directes entre cochléae individuelles en raison des variations intra-espèces de la longueur de la membrane basilaire. Ainsi, il est particulièrement important de normaliser le cochléogramme en convertissant des longueurs cochléaires individuelles de millimètres à un pourcentage relatif.

La synaptopathie peut être confirmée par visualisation de l'immunostaining pour la protéine CtBP2 (l'isoforme synaptique "ribeye") dans les régions basolatérales des IHC. Ces corrections CtBP2-positives peuvent servir de marqueur structurel pour la quantification des rubans presynaptiques, et la présence de moins de corrections indique habituellement la perte presynaptic. Bien que des études antérieures aient rapporté que 98 % des rubans présynaptiques sont jumelés à des acsystèmes post-synaptiques dans l'oreille normale30, le nombre simple de patchs positifs CtBP2 peut ne pas être exact pour l'analyse quantitative des synapses complètes, car cette peut entraîner une surestimation du nombre de synapses dans l'oreille blessée en impliquant des « orphelins » (rubans présynaptiques non appariés avec des terminaux postsynaptiques). Pour améliorer la précision de l'estimation du nombre de synapses, des anticorps supplémentaires contre la structure postsynaptique tels que GluA2, GluA2/3, ou PSD-95 sont utilisés. La protéine de densité postsynaptique PSD-95, une protéine d'échafaudage de guanylate membranaire (MAGUK), peut être étiquetée à l'aide d'un anticorps contre PSD-95, qui est principalement observée lors des contacts entre les cellules ciliées et les terminaisons de fibres SGN34, 35. Cependant, l'anticorps contre GluR2 est plus spécifique pour les récepteurs de glutamate ionotropique de type AMPA dans la membrane postsynaptique, qui peut identifier plus fiable ment des synapses de ruban (paires juxtaposées de puncta immunofluorescente de CtBP2 présynaptique et gluR2 postsynaptique)15. En plus de l'analyse morphologique, l'analyse histologique des synapses complètes peut être utilisée comme indicateur fonctionnel pour la synaptopathie. Chez les souris adultes atteintes de synaptopathie cochléaire, les réductions de l'amplitude de l'onde ABR i suite à la présentation de stimuli tonus modérés à élevés se produisent à des fréquences tonotopiques liées aux régions de perte synaptique26,29. Les nombres de synapse obtenus à l'aide de cette méthode sont limités en ce qu'il faut environ 10 minutes pour numériser un site sur la membrane basilaire. De plus, pour évaluer les variations spatiales du nombre et de la morphologie synaptiques en fonction de l'emplacement du CSI, il est nécessaire d'identifier avec précision la limite du corps du PCI (p. ex., par l'intermédiaire de la coloration de la myosine VIIa) et d'effectuer des étapes particulières de traitement d'image26 . En utilisant de telles méthodes, des études antérieures ont confirmé que la perte synaptique est plus grande du côté modiolaire du CSI que du côté des piliers dans les modèles animaux de dégénérescence induite par le bruit26.

Des études antérieures ont démontré que les fibres à faible taux spontané et à seuil élevé sont plus sensibles aux dommages causés par le bruit que les fibres à faible seuil de vitesse spontanée élevées dans les modèles animaux de synaptopathie restreinte26,30. Ces études fournissent la justification de l'utilisation d'amplitudes supraseuils de l'onde I d'ABR (mesurée s'appuyant sur des stimuli tonales modérés à élevés) pour évaluer la fonction synaptique dans les modèles animaux ayant un seuil aBR normal et des émissions otoacoustiques normales du produit de distorsion ( DPOAEs). Parce que l'onde I de l'ABR reflète les réponses neuronales résumées des fibres nerveuses auditives, lorsque la synaptopathie est évaluée par l'amplitude d'onde ABR, d'essai de DPOAE devrait également être exécuté pour exclure des dommages d'OHC, qui peuvent également réduire des amplitudes d'ABR dues à la perturbation de transduction mécanoélectrique. Bien que la première vague du potentiel d'action composé (CAP), qui est mesurée à partir d'électrodes à fenêtre ronde, représente également l'activité résumée du nerf cochléaire, cette méthode est plus invasive et complexe que les mesures ABR. Si les réponses DPOAE reviennent à la normale après des changements de seuil temporaires chez les souris exposées au bruit 31 ou qu'elles ne se sont pas encore détériorées chez les souris vieillissantes29, l'amplitude supraseuil de l'onde ABR, je peux fortement prédire le degré de synaptopathie cochléaire31 , puisque les neurones affectés sont réduits au silence lorsque leurs connexions synaptiques aux IHC sont perturbées. Toutefois, si la sensibilité cochléaire est réduite en raison de divers facteurs (p. ex., dysfonctionnement de la CSO), les diminutions de l'amplitude des ondes ABR I ne peuvent plus être attribuées uniquement à la perte synaptique parce qu'elles refléteront la combinaison de tous les dommages cochléaires. Par conséquent, des conditions expérimentales contrôlées pour la préparation du modèle à synaptopathie sont nécessaires pour s'assurer que la sensibilité cochléaire n'est pas compromise par d'autres facteurs. Malheureusement, bien que l'amplitude d'onde d'ABR je fournisse une mesure objective de la perte auditive de fibre de nerf chez les animaux, il est difficile à mesurer chez l'homme. En outre, les pathologies mélangées impliquant la synaptopathie, la perte des cellules ciliées, et la présence d'autres anomalies dans la cochlée peuvent co-se produire chez l'homme, limitant l'utilisation des mesures d'amplitude d'onde d'ABR i dans les arrangements cliniques. La latence des ondes ABR est calculée comme le temps en millisecondes entre le début du stimulus et le pic positif de chaque vague, ce qui donne un aperçu des temps de transmission le long de la voie auditive. Aucun changement significatif de la latence de l'onde I n'a été observé chezles modèles murins de la synaptopathie cochléaire 36 causée par le bruit ou liée à l'âge. Cependant, certaines preuves suggèrent que les effets du bruit de masquage sur la latence de l'onde V ABR peuvent être utilisés pour diagnostiquer la synaptopathie cochléaire chez l'homme37.

Plusieurs études récentes ont soutenu l'idée que la synaptopathie cochléaire est l'événement initial primaire associé à la perte d'audition cachée, à l'acouphène, et à l'hyperacousie. Bien que le concept de synaptopathie cochléaire dans les maladies de l'oreille interne a maintenant été fermement établi, son impact détaillé sur la capacité auditive reste inconnu. Le protocole présenté dans la présente étude permet l'étude de la morphologie et de la fonction dans les synapses de ruban cochléaire dans une région de fréquence spécifique. Ainsi, ce protocole peut être employé pour étudier la synaptopathie cochléaire, ses mécanismes sous-jacents, et l'efficacité des interventions thérapeutiques potentielles dans divers modèles animaux expérimentaux.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); le projet de financement conjoint de la Fondation des sciences naturelles de Beijing et du Comité de l'éducation de Beijing (KZ201810025040); la Fondation des sciences naturelles de Beijing (7174291); et la China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

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References

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36, (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72, (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94, (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202, (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197, (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35, (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361, (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11, (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138, (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12, (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8, (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7, (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283, (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8, (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6, (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091, (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28, (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69, (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16, (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33, (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33, (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110, (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14, (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49, (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36, (13), 3755-3764 (2016).
Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris
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Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).More

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