Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Morfologiske og funktionelle evaluering af bånd synapser på specifikke frekvensområder af musen cochlea

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59189
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otology, Shengjing Hospital of China Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskript beskriver en eksperimentel protokol til evaluering af de morfologiske egenskaber og funktionel status af bånd synapser i normale mus. Den nuværende model er også velegnet til støj-induceret og aldersrelaterede cochlear synaptopathy-begrænsede modeller. De korrelative resultater af tidligere mus undersøgelser er også drøftet.

Abstract

Cochlear indre hårceller (IHCs) sender akustiske signaler til spiral ganglion neuroner (SGNs) gennem bånd synapser. Flere eksperimentelle undersøgelser har vist, at hårcelle synapser kan være de oprindelige mål i sensorineuralt høretab (SNHL). Sådanne undersøgelser har foreslået begrebet cochlear "synaptopathy", som refererer til ændringer i bånd synapse nummer, struktur, eller funktion, der resulterer i unormal synaptisk transmission mellem IHCs og SGNs. Mens cochlear synaptopathy er irreversibel, påvirker det ikke høretærsklen. I støj-induceret eksperimentelle modeller, begrænset skade på IHC synapser i udvalgte frekvensområder er ansat til at identificere de miljømæssige faktorer, der specifikt forårsager synaptopati, samt de fysiologiske konsekvenser af at forstyrre dette indre øre Kredsløb. Her præsenterer vi en protokol til analyse af cochlear synaptisk morfologi og funktion i en bestemt frekvens region i voksne mus. I denne protokol udføres cochlear lokalisering af specifikke frekvensområder ved hjælp af sted-frekvens kort i forbindelse med cochleogram-data, hvorefter de morfologiske egenskaber ved bånd synapser evalueres via synaptisk immun. Den funktionelle status af bånd synapser bestemmes derefter baseret på amplituder af auditive Brain EM Response (ABR) Wave I. Den foreliggende rapport viser, at denne fremgangsmåde kan bruges til at uddybe vores forståelse af patogenesen og mekanismerne i den synaptiske dysfunktion i cochlea, som kan støtte i udviklingen af nye terapeutiske interventioner.

Introduction

Frekvenser i intervallet ca. 20 \ u201220, 000 Hz kan opfattes som auditive stimuli af mennesker. Menneskelig hørelse er normalt mest følsom i nærheden af 1.000 Hz, hvor det gennemsnitlige lydtrykniveau er 20 μPa hos unge voksne (dvs. 0 decibel lydtryksniveau [dB SPL]). Under visse patologiske forhold er høretab begrænset til bestemte frekvenser. For eksempel, i de tidlige stadier af støj-induceret høretab (NIHL), en "hak" (dvs., hørelse tærskelhøjde) kan observeres i audiogram ved 4 kHz1. Langs pattedyr cochlear-partitionen producerer dens gradueringer af stivhed og masse et eksponentielt frekvens kort med højfrekvent lyddetektering ved foden af cochlea og lavfrekvens detektering ved Apex2. Faktisk er der et cochlear sted-frekvens kort langs basilær membranen, hvilket fører til, hvad der er kendt som tonotopic Organization2,3. Hvert givet sted på basilær membranen har den højeste følsomhed for kun en bestemt lydfrekvens, som normalt betegnes som den karakteristiske frekvens3,4, selv om responser på andre frekvenser også kan observeres.

Til dato, forskellige musemodeller har været ansat til at undersøge normal funktion, patologiske processer, og terapeutisk virkning i auditive system. Præcis viden om fysiologiske parametre i mus cochlea er en forudsætning for sådanne undersøgelser af høretab. Musens cochlea er anatomisk inddelt i apical, midterste og basal sving, som svarer til forskellige frekvensområder. Ved at beskrive Auditive nerve afferenter på cochlear Nucleus for at analysere deres tilsvarende perifere innervations steder i cochlea lykkedes det Müller et al. at etablere cochlear Place-frekvens kortet i den normale mus in vivo5. I intervallet 7,2 – 61.8 kHz, som svarer til positioner mellem 90% og 10% af den fulde længde af basilær membranen, kan musens cochlear-sted-frekvens kort beskrives ved en simpel lineær regressions funktion, hvilket tyder på en relation mellem normaliseret afstand fra cochlear base og logaritmen af den karakteristiske frekvens5. I laboratorie mus kan sted-frekvens kortet bruges til at udforske forholdet mellem høre tærskler inden for bestemte frekvensområder og cochleograms, der viser antallet af manglende hårceller i relative regioner langs basilær membranen6. Vigtigere er det sted-frekvens kort giver et positioneringssystem til undersøgelse af minimal strukturel skade, såsom beskadigelse af båndet synapser af hårceller på specifikke cochlear frekvens steder i mus med perifer auditiv traume7 ,8.

I pattedyrs cochlea består bånd synapserne af et præsynaptisk bånd, en elektron-tæt projektion, der gør en Halo af Release-Ready synaptiske vesikler indeholdende glutamat i IHC, og en postsynaptisk tæthed på nerve terminalen i SGN med glutamat-receptorer9. Under cochlear Sound transduction resulterer udbøjning af hårcelle bundtet i IHC depolarisering, hvilket fører til glutamat frigivelse fra IHCs på de postsynaptiske afferent terminaler, hvorved den auditive vej aktiveres. Aktivering af denne vej fører til omdannelsen af lyd-induceret mekaniske signaler til en sats kode i SGN10. Faktisk IHC Ribbon synapse er højt specialiseret til utrættelige lyd transmission på satser på hundredvis af Hertz med høj tidsmæssig præcision, og er af afgørende betydning for præsynaptiske mekanismer lydkodning. Tidligere undersøgelser har afsløret, at bånd synapser varierer meget i størrelse og antal på forskellige frekvensområder i den voksne mus cochlea11,12, sandsynligvis afspejler strukturel tilpasning til den særlige lyd kodning for overlevelses behov. Eksperimentelle dyreforsøg har for nylig vist, at cochlear synaptopathy bidrager til flere former for hørenedsættelse, herunder høretab, der er forårsaget af støj, aldersrelateret høretab og arvelig høretab13, 14. metoderne til identificering af korrelerede ændringer i det synaptiske antal, struktur og funktion på bestemte frekvensområder er således i stigende grad blevet anvendt i studier af auditiv udvikling og indre øre-sygdom ved hjælp af modeller genereret via Eksperimentel manipulation af genetiske eller miljømæssige variabler15,16,17.

I den aktuelle rapport præsenterer vi en protokol til analyse af det synaptiske tal, strukturen og funktionen i en bestemt frekvens region i basilær-membranen i voksne mus. Lokalisering af cochlear-frekvens udføres ved hjælp af et givet sted-frekvens kort i kombination med et cochleogram. De normale morfologiske egenskaber ved cochlear-bånd synapser evalueres via præsynaptisk og postsynaptisk immun farvning. Den funktionelle status for cochlear-bånd synapser bestemmes ud fra de suprathreshold-amplituder af ABR Wave I. Med mindre ændringer kan denne protokol anvendes til at undersøge fysiologiske eller patologiske tilstande i andre dyremodeller, herunder rotter, marsvin og gerbils.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med NRC/ILAR guide til pleje og brug af forsøgsdyr (8. udgave). Studieprotokollen blev godkendt af den institutionelle dyrepleje-og anvendelses Komité for Capital Medical University, Beijing, Kina.

1. udvælgelse af dyr

  1. For alle eksperimenter, brug voksne C57BL/6J hanmus (8 uger gammel) som dyremodel.
    Bemærk: C57BL/6J mus med en Splice variant af Cdh23 udviser accelereret senescens i auditiv systemet, afspejlet som en 40% tab af bånd synapser ved basal drejning af cochlea og et 10% tab ved midterdrejning af 6 måneders alderen, efterfulgt af en hurtig forøgelse af dette tab i hele sneglen med en alder på18,19. Således, vi rådgive forsigtighed, når du bruger C57BL/6J mus ældre end 6 måneder for auditiv forskning. Andre stammer af mus kan anvendes afhængigt af specifikke eksperimentelle mål.
  2. Undersøg musene ved hjælp af en professionel diagnostisk lomme Otoskop for at udelukke ydre eller mellemøre-patologier før høre vurderinger. Potentielle tegn kan omfatte væske eller Pus i den ydre øregang, rødme og hævelse i lokalt væv, og tympaniske membran perforering.
    Bemærk: Selv om dette er sjældent stødt, når identificeret, mus med ydre eller mellemøre sygdomme bør udelukkes.

2. vurdering af hørelse

  1. Anæstetize mus ved hjælp af en intraperitoneal injektion af en blanding af ketaminhydrochlorid (100 mg/kg) og xylazinhydrochlorid (10 mg/kg). Døm dybden af anæstesi via smertefulde stimuli (f. eks, tå-Knib refleks).
    Bemærk: Når tå-knivspids refleks er helt fraværende, dyret har nået en tilstrækkelig dybde af anæstesi til auditive test. Hvis der kræves mere tid til bilateral ABR optagelser, administrere en lavere dosis (en femtedel den oprindelige dosis) af anæstetika at genoprette den oprindelige anæstesi plan. Vær forsigtig for at undgå bedøvelsesmiddel overdosering, da dette kan føre til døden i mus.
  2. Opretholde det bedøvede dyrs kropstemperatur ved 37,5 °C ved hjælp af en termoregulering varmepude. Anbring det bedøvede dyr i et elektrisk og akustisk afskærmet rum for at undgå interferens under hele høretesten.
    Bemærk: Opretholde den fysiologiske temperatur under hele proceduren, indtil dyret er helt vågen, for at forhindre døden forårsaget af post-anæstesi hypotermi.
  3. De subdermale nåle elektroder (20 mm, 28 G) ved knudepunktet af kraniet (optage elektrode) placeres i den ipsilaterale parotideale-region under Pinna for det målte øre (referenceelektrode) og i den kontralaterale parotideale-region (jordelektrode) med en dybde på 3 mm under huden af muse hovedet, henholdsvis20.
  4. Brug en lukket felt højttaler til at udføre akustisk stimulation via et 2 cm plastrør med en kegleformet spids. Monter spidsen i den eksterne øregang21.
    Bemærk: Sørg for, at den elektriske impedans i optagelsen og reference elektroderne er mindre end 3 kOhm (normalt 1 kOhm). Hvis impedansen er høj, skal du ændre indsættelsesstedet for elektroden, rengøre elektroden med alkohol eller udskifte elektroden for at undgå ændringer i ABR bølge amplitude.
  5. For ABR-optagelse genereres tone pips (3 MS-varighed, 1 MS-Rise/fald-tider med en hastighed på 21,1/s, frekvens: 4 – 48 kHz) og præsenterer dem ved faldende Spl'er fra 90 til 10 dB i 5 \ u201210 dB SPL trin20. I dette trin forstærkes svarene (10.000 gange), filtreres (0,1-3 kHz) og gennemsnit (1.024 prøver/stimulus-niveau).
    Bemærk: ABRs opsamles for hvert stimulus niveau i 10 dB trin, med yderligere 5 dB trin nær tærsklen.
  6. Ved hver frekvens bestemmes ABR-tærsklen, som refererer til den minimale SPL, hvilket resulterer i en pålidelig ABR-optagelse med en eller flere skelne bølger, der tydeligt kan identificeres ved visuel inspektion (figur 1).
    Bemærk: Det er normalt nødvendigt at gentage processen for lave SPLs omkring tærsklen for at sikre konsistensen af bølge formerne. Respons tærsklen er det laveste stimulus-niveau, hvor bølgeformen kan observeres, når et fald på 5 dB ville føre til forsvinden af bølgeform.

3. behandling af cochlear-væv

  1. Efter ABR optagelse, aflive bedøvet mus via livmoderhals dislokation, halshug dem, udsætte Bulla fra den ventrale side, og åbne med skarp saks for at få adgang til cochlea.
  2. Ved hjælp af en fin tang, fjerne de tidsmæssige knogler, afbryde hæfte pulsåren, fjerne hæfte klatter fra det ovale vindue, og ruptur den runde vindues membran. Lav et lille hul i spidsen af sneglen ved forsigtigt at rotere spidsen af nålen (13 mm, 27 G).
  3. De isolerede knogler fastsættes med 4% (WT/vol) PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfat-bufferet saltvand (PBS, pH 7,4) natten over ved 4 °C. Ved hjælp af en spids pipette skal du forsigtigt skylle fikseret gennem de perilymphatiske rum via applikation til de ovale eller runde vinduer (som et indtag) og åbningen ved spidsen (som en stikkontakt).
    Bemærk: Nogle proteiner kræver en kort varighed af fiksering for at undgå ødelæggelse af deres epitoper for immunolabeling. I sådanne tilfælde, inkubere knogler i 4% PARAFORMALDEHYD ved stuetemperatur (RT) for 2 h, afhængigt af producentens anvisninger for immun histokemi. Fiksering kan også udføres via kardiel perfusion for at fjerne cochleært blod, undgå baggrundsstøj på grund af ikke-specifik farvning på senere stadier, især i musemodeller af cochlear synaptopathy.
  4. Skyl knoglerne tre gange i 5 minutter med 0,1 M kold PBS for at fjerne rest-PARAFORMALDEHYD. Afkalk knoglerne med 10% ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) enten ved RT i 4 timer eller ved 4 °C i 24 timer via blid omrystning i en horisontal shaker ved 20 rpm. EDTA kan opdateres midtvejs.
    Bemærk: Afkalknings tiderne er underlagt koncentrationen af EDTA og brugernes præferencer. Decalcificeret væv bør opretholde en vis grad af sejhed, som letter manipulation af isolerende cochlear hele-mounts på senere trin. Temporale knogler kan dekaleres i 10% EDTA med rotation, så forskerne til at forlade laboratoriet efter ABR tests og fiksering eksperimenter. Afkalknings tiden er fleksibel inden for intervallet 20 til 30 timer ved 4 °C.
  5. Overføre en decalcificeret temporale knogle fra EDTA til 0,1 M PBS. Brug #3, #5 Dumont pincet og 27 G nål til at dissekere de apiske, midterste og basale cochlear regioner igen og derefter dissekere cochlea ud af knoglen under en stereo dissektion mikroskop (som tidligere beskrevet22). Lav en række små snit langs spiral ledbånd ved hjælp af et barberblad, og fjern den tektoriale membran og Reissners membran (figur 2).
    Bemærk: Så længe den dissekeret cochlea er intakt, kan denne proces ændres i henhold til den enkelte operatørs sædvanlige protokol.
  6. Yderligere dissekere den resterende auditive epitel herunder spiral limbus i individuelle cochlear drejninger (Apex, Middle, og base med krog region) for hele Mount præparater.
  7. Under en 40x olie mål af et let mikroskop, måle basilær membran længde med en 250 μm skala placeret i okular, som kan justeres langs stereocilia af ihcs.
  8. Beregn længden af hver cochlear-drejning ved at tilføje alle segment længder (250 μm pr. segment) og samtidig opnå den samlede længde af basilær-membranen ved at opsummere længden af hver drejning.
  9. Konverter den samlede længde af basilær-membranen, herunder krog regionen, til en procentdel baseret på afstanden fra cochlear Apex (0% refererer til cochlear Apex, 100% til cochlear base).
  10. Konverter denne afstand til cochlears karakteristiske frekvens ved hjælp af en logaritmisk funktion (d (%) = 1-156,5 + 82,5 × log (f), med en hældning på 1,25 mm/oktav af frekvens, hvor d er den normaliserede afstand fra cochlear Apex i procent, f er frekvensen i kHz), som tidligere beskrevet5,6. Således kan frekvensområdet i et tilsvarende område af basilær membranen på hver cochlear turn erhverves.

4. immunofluorescens farvning

  1. Efter dissektion placeres hvert cochlear-sving i et separat 2,5 mL centrifugeglas og Inkubér cochlear-omdrejninger i 10% gede serum/PBS/0,1% Triton X-100 i 1 time ved RT på en rotator.
  2. Fjern ovenstående blokerende/permeabiliserings opløsning fra hvert rør ved hjælp af en 200 μl pipettespids under et dissektion-mikroskop, og Inkubér prøverne med primære antistoffer fortyndet i 5% gede serum/PBS/0,1% Triton X-100 natten over ved 4 °c på en rotator.
    Bemærk: For immunolabeling af cochlear synaptisk bånd, bruge den præsynaptiske markør mus anti-carboxyl-Terminal binding protein 2 IgG1 (CtBP2, mærkning B domæne af Ribeye stilladser protein, 1:400) og den postsynaptiske markør mus anti-glutamat receptor 2 IgG2a (GluR2, mærkning af en underenhed af AMPA-receptoren, 1:200)23.
  3. Skyl tre gange i 5 minutter med 0,1 M kold PBS for at fjerne resterende primære antistoffer, og Inkubér prøverne med sekundære antistoffer fortyndet i 5% gede serum/PBS/0,1% Triton X-100 ved RT for 2 \ u20123 h i mørke på en rotator.
    Bemærk: Forbered passende sekundære antistof blandinger ved hjælp af Goat anti-Mouse Alexa fluor 568 (IgG1, 1:500) og Goat anti-Mouse Alexa fluor 488 (IgG2a, 1:500), som supplerer de primære antistoffer, der anvendes i trin 4,2. For at forbedre mærknings effektiviteten for synaptiske bånd anbefaler vi, at du vælger specifikke sekundære antistoffer. Nogle laboratorier udvider inkubation med sekundære antistoffer for at øge GluR2 immunolabeling24.
  4. Skyl tre gange i 5 minutter med 0,1 M PBS for at fjerne resterende sekundære antistoffer, og Overfør prøverne fra 2,5 mL centrifugeglas til 35 mm plader, der indeholder 0,1 M PBS.
  5. Anbring en dråbe af monterings medium, der indeholder 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), på diaset, og Overfør prøverne fra PBS til monterings mediet. Placer den ene kant af en dækseddel på diaset, og slip den for at lade dæksedlen falde forsigtigt.
    Bemærk: For at sikre, at hårcellerne vender opad, og at der ikke opstår folde-eller vrid af cochlear-prøver under proceduren, skal du montere cochlear-prøver under et stereo dissektions mikroskop.
  6. Placer diasene i en slide boks ved 4 °C natten over for at lade slides tørre og derefter billede under et laser Konfokal mikroskop.

5. morfologisk evaluering af cochlear Ribbon synapser

  1. Billedrutschebaner med et konfokalt mikroskop med tre lasere — en 405 nm UV diode, en 488 nm argon laser og en 561 nm diode-pumpet Solid State (DPSs) laser til ophidse dapi (excitation Spectrum 409 – 464 nm), Alexa fluor 488 (excitation spektrum 496 – 549 nm) og Alexa fluor 568 (Excitation Spectrum 573 – 631 nm), hhv.
  2. Få konfokale z-stakke over en afstand på 8 μm fra hvert cochlear-sving ved hjælp af en 63x olie Sænknings linse med høj opløsning.
    Bemærk: Når det er defineret, skal alle parametre for digitalisering af photomicrografer gemmes og anvendes ensartet på alle slides.
  3. For synaptisk punktum tæller, indstille z-stakke (0,3 μm trin størrelse) at spænde hele længden af ihcs, og dermed sikre, at alle synaptisk punkta kan imaged.
  4. Flet de billeder, der indeholder punkta, i en z-stak for at opnå z-akse projektion, og Importer til billedbehandlings softwaren.
  5. Dividerer det synaptiske samlede antal i hver z-stak i bestemte frekvensområder med antallet af Ihc'er (svarende til DAPI-kerne tallet) for at beregne antallet af synaptisk punkta for hvert IHC. Ved hver specifik frekvens region, gennemsnitlig alle synaptisk punkta i tre billeder af forskellige mikroskopiske felter indeholdende 9 – 11 ihc'er.
    1. Skitsere interesseområdet (ROIs), herunder de basolaterale områder af hver IHC ved hjælp af knappen valg af frihånds markeringer. Brug måle funktionen til automatisk kvantificering af punkta, og vandskuret funktion til at skelne mellem tæt tilstødende pletter.
    2. Efter hver automatiseret optælling, udføre visuelle inspektioner med manuelle korrektioner for at sikre punkta tælle pålidelig.
      Bemærk: Eksperimentare skal forblive blændet med hensyn til, om diaset er fra Apex, midterste eller basal drejning af cochlea.
  6. Visuelt vurdere synaptisk struktur og distribution, for manuelt at isolere individuelle ihcs fra deres naboer ved blyant værktøj (M) for bedre at visualisere den cytoskeletale arkitektur og synaptisk lokalisering.
  7. For at inspicere sammenstillingen af præsynaptiske bånd (CtBP2) og postsynaptiske receptor patches (GluR2), udtrække voxel rummet omkring båndet ved den rektangulære markeringsrammeværktøj og isolere individuelle bånd ved afgrøde. Ved at klikke på billede > Billedstørrelse, erhverve en miniature matrix af disse miniature projektioner, som derefter kan bruges til at identificere parrede synapser (optrådte som nøje ammen par af CtBP2-positive og GluR2-positive punkta) versus Orphan bånd (mangler postsynaptiske glutamat receptor patches) (figur 3).
    Bemærk: Normale cochlear synapser vises som kombinerede immunolabeling af det præsynaptiske bånd i hårcellen (anti-CtBP2) og den postsynaptiske glutamat-receptor patch på den Auditive nerve Terminal (anti-GluR2)25. Nogle laboratorier bruger confokale projektioner i forbindelse med 3D modellering til at kvantificere synaptisk patch størrelse eller volumen26,27. Forud for betydelige tab af bånd synapser, bånd udstiller ændringer i størrelse eller uden parret glutamat receptor patches er sandsynligvis vejledende for synaptisk dysfunktion27,28.

6. funktionel evaluering af cochlear-bånd synapser

  1. Saml alle ABR bølger for hver frekvens stimulus præsenteret ved en SPL på 90 dB til analyse af suprathreshold ABR bølge I amplituder.
    Bemærk: Neurofysiologiske og morfologiske undersøgelser har vist, at lave spontane-rate, høj-tærskel fibre er særligt sårbare over for aldring og støjeksponering29,30. Selv om det simple tab af bånd synapser ikke kan påvirke ABR tærskler, det almindeligt resulterer i betydelige reduktioner i ABR bølge jeg amplituder, fordi disse afferenter herunder lav spontan-sats, høj-tærskel fibre og høj spontan-rate, lav-tærskel fibre bidrager kraftigt til de opsummerede aktiviteter af cochlear nervefibre28,29,31. Der vælges en suprathreshold-intensitet på 90 dB SPL her.
  2. Fastlæg peak-to-peak Wave I amplitude ved hjælp af et offline analyseprogram (figur 4). Hver bølge i i ABR-testen består af en begyndende positiv (p) afbøjning og den efterfølgende negative (n) afbøjning. ABR bølge I amplitude er defineret som forskellen i spænding mellem IP (den positive top af bølge I) og i (den negative top af bølge I)29.
    Bemærk: I patologiske tilstande kan cochlear synaptopathy bestemmes baseret på de suprathreshold amplituder af ABR Wave I, som afspejler de opsummerede reaktioner af SGNs fremkaldt af lyd. Cochlear-følsomhed, der ikke kompromitteres på grund af OHC-dysfunktion, er imidlertid en forudsætning for denne metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ABR-høre tests blev udført for 10 C57BL/6J mus (8 ugers alderen) under anæstesi. ABRs blev fremkaldt ved hjælp af tone burst stimuli ved 4, 8, 16, 32 og 48 kHz. Høretærsklen for hvert dyr blev visuelt påvist ved at skelne mindst én klar bølgeform i ABR. Alle mus udstillet ABR tærskler som reaktion på tone udbrud, spænder mellem 25 og 70 dB SPL afhængigt af hyppigheden af stimulus. Vores resultater viste, at høretærsklen var lavest ved 16 kHz (figur 1), svarende til ca. 43% afstand fra cochlear Apex (figur 2), hvilket tyder på, at akustisk følsomhed er signifikant reduceret i andre cochlear- Regioner.

Cochlear-hele-mounts blev isoleret fra timelige knogler i voksne mus under et stereo dissektions mikroskop (figur 2a). Hele-mounts af den auditive epitel blev dissekeret i tre stykker, hvis længder blev målt og til sidst konverteret til procent afstand fra cochlear Apex. Frekvens placeringen på basilær-membranen for hver cochlear-drejning blev beregnet ved hjælp af en logaritmisk funktion, som tidligere beskrevet5,6 (figur 2B).

For at evaluere de morfologiske egenskaber ved cochlear-bånd synapser blev antistoffer mod CtBP2 og GluR2 brugt til at mærke henholdsvis præsynaptiske og postsynaptiske strukturer. I normale ører af voksne mus, immunofarvning afsløret ammen par af synaptiske bånd og glutamat receptor patches Studding overfladen af den basolaterale membran af ihcs, med 8 – 20 par per IHC (figur 3A). Selv om langt de fleste af punkta optrådte som ammen par i normale ører, forældreløse bånd kunne observeres sjældent ved høj forstørrelse (figur 3B). Antallet af IHC-bånd synapser (immunopositive pletter for både CtBP2 og GluR2) var højest i 16 kHz-regionen, hvilket var markant faldende, da afstanden fra denne placering steg (figur 3C). De synaptiske tal bestemmes baseret på konfokale projektioner giver et estimat af det maksimale antal auditive nervefibre, der sender oplysninger fra cochlea til hjernen29.

Den funktionelle status for cochlear-bånd synapser blev undersøgt i alle voksne mus baseret på ABR Wave I amplituder, som giver oplysninger om den funktionelle integritet af auditive nervefibre29,31. ABR bølge I amplituder ved hver hyppighed af stimulus præsenteret ved et lydtrykniveau på 90 dB blev målt fra peak til følgende trug, som vist i figur 4a. ABR Wave I amplitude var højest med en frekvens på 16 kHz, svarende til den laveste høretærskel, og amplitude værdier faldt betydeligt, da afstanden fra denne placering steg (figur 4B). Dette resultat er i overensstemmelse med de observerede ændringer i bånd synapse tæller, hvilket indikerer, at synapser i dette cochlear-område kan udvise den mest levende synaptiske funktion. Desuden, i tidligere musestudier af støj-induceret og aldersrelateret cochlear neurodegeneration, suprathreshold amplituder af ABR bølge jeg faldt i forhold til bånd tab, hvilket indikerer, at ABR Wave I amplitude er meget korreleret med graden af cochlear synaptopathy29,31.

Figure 1
Figur 1 : Vurdering af hørelse. ABR-tærskel sammenligninger mellem forskellige frekvenser af tone burst-stimuli viste, at høretærsklen var lavest ved 16 kHz i 10 voksne C57BL/6J-mus. ABR-responsen blev signifikant forhøjet ved andre frekvensområder (envejs-ANOVA med Dunnetts multiple sammenligning af post hoc -test; *: P < 0,01, n = 20 ører). Data udtrykkes som middelværdien ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Lokalisering af cochlear-frekvens i mus. (A) et repræsentativt billede af den fulde forklarende cochlea, som er blevet dissekeret ud af den tidsmæssige knogle under et stereo dissektion mikroskop. (B) musens cochlea er inddelt i apical, midterste og basal sving, hvor cochlear lateral Wall fjernes. Røde cirkler på fragmenter af cochlear basilær-membranen indikerer frekvens positionerne og deres tilsvarende normaliserede positioner i cochlea (0% refererer til cochlear Apex, 100% til cochlear base). Scale bar = 250 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Konfokal analyse af de cochlear-bånd synapser i mus. (A) repræsentative billeder af bånd synapser for 4, 8, 16, 32, og 48 kHz regioner, immunoplettet for præsynaptiske bånd (CtBP2, rød) og postsynaptiske strukturer (GluR2, grøn). Hvide stiplede linjer bruges til at skitsere indvendige hårceller til reference. Skala bjælke = 10 μm. (B) High-Power miniaturer fra konfokale z-stakke viser, at disse bånd synapser optrådte som nøje ammen par af CtBP2-positive (rød) og GluR2-positive (grøn) punkta (venstre og midten), hvorimod forældreløse bånd (højre) mangler postsynaptiske glutamat receptor patches var meget sjældne. Scale bar = 0,5 μm. (C) kvantitativ analyse af parret bånd punkta med alle præsynaptiske og postsynaptiske elementer afslørede, at antallet af synaptisk punkta pr indre hårcelle var signifikant højere i 16 kHz regionen end i andre frekvensområder (envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligning efter hoc -test; *: P < 0,01, n = 6 ører). Data udtrykkes som middelværdien ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Analyse af ABR Wave I amplituder i mus . (A) repræsentativ ABR bølgeform fra en 8 uger gammel C57BL/6j mus eksponeret for en 16 kHz ren tone stimulus med en intensitet på 90 dB (stimulus debut ved 0 MS). Romertal markerer de højeste af ABR Waves. Prikkede linjer markerer bølgen jeg peak og trug, hvilket indikerer amplituden. B) kvantitativ analyse af gennemsnitlige bølge i amplituder som reaktion på de 4, 8, 16, 32 og 48 kHz stimuli præsenteret ved et lydtrykniveau på 90 dB. ABR bølge I amplituder var højest med en hyppighed på 16 kHz og signifikant lavere ved andre frekvenser (envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligning post hoc test; *: P < 0,01, n = 20 ører). Data udtrykkes som middelværdien ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da cochlear synaptopathy først blev karakteriseret i voksne mus med en midlertidig tærskel forskydning (TTS) induceret af 8 \ u201216 kHz oktavbånd støj ved 100 dB SPL for 2 h31, har forskerne i stigende grad undersøgt virkningerne af synaptopati i forskellige pattedyr, herunder aber og mennesker32,33. Ud over støjeksponering har flere andre forhold været forbundet med cochlear synaptopati (f. eks. aldring, brug af ototoksiske lægemidler og genetiske mutationer), hvilket fører til kortvarig forstyrrelse af suprathreshold-audition, efterfulgt af irreversibel degeneration af den Auditive nerve. I den tidlige fase af cochlear fornærmelse, synaptopati ofte opstår på en bestemt frekvens placering, især i eksperimentelle modeller, hvor skader på IHC synapser er begrænset til at vælge frekvensområder24,31. Derfor er vores protokol er signifikant i, at det gør det muligt at efterforske synaptisk morfologi og funktion på en bestemt frekvens region.

Cochlear Place-frekvens kortet kan bruges til at diskriminere normal og unormal auditiv funktion, hvilket yderligere afspejler det normale og unormale område i det indre øre. Da overflade forberedelses teknikker først blev brugt til at afbilde intakte og manglende hårceller i de forskellige cochlear-sving, er cochleogram blevet en rutinemæssig metode til kvantificering af hårtab6. Derfor, at korrelere morfologiske fornærmelser i cochlea til relevante fysiologiske ændringer, er det rimeligt at inkludere en sted-frekvens kort på cochleogram. Denne metode gør det muligt at bestemme antallet og strukturen af synapser baseret på deres positioner langs cochlear basilær membranen i forhold til etablerede cochlear Place-frekvens kort, hvilket giver tilstrækkelige oplysninger til detaljerede sammenligninger mellem histologiske og fysiologiske resultater. Nogle undersøgelser vurderer imidlertid synaptopati baseret på cochlear-segment eller distance langs cochlear kanalen, hvilket ikke giver mulighed for direkte sammenligninger mellem individuelle cochleae på grund af intra-Arts variationer i basilær membran længde. Det er derfor særlig vigtigt at standardisere cochleogram ved at omdanne individuelle cochlear længder fra millimeter til en relativ procentdel.

Synaptopati kan bekræftes via visualisering af immun farvning for CtBP2 protein (den synaptiske isoform "Ribeye") i de basolaterale områder af IHCs. Disse CtBP2-positive patches kan tjene som en strukturel markør for kvantificering af præsynaptiske bånd, og tilstedeværelsen af færre pletter normalt indikerer præsynaptisk tab. Selv om tidligere undersøgelser har rapporteret, at 98% af præsynaptiske bånd er parret med post-Synaptic terminaler i den normale øre30, det simple antal CtBP2-positive patches kan ikke være nøjagtig for kvantitativ analyse af komplette synapser, da dette kan føre til overvurdering af synapse tæller i det skadede øre ved at involvere "forældreløse" (præsynaptiske bånd uparret med postsynaptiske terminaler). For at forbedre nøjagtigheden af estimering af synapse-nummer anvendes der yderligere antistoffer mod postsynaptisk struktur som GluA2, GluA2/3 eller PSD-95. Den postsynaptiske tæthed protein PSD-95, en membran-associeret guanylatkinase (MAGUK) stilladser protein, kan mærkes ved hjælp af et antistof mod PSD-95, som for det meste observeres ved kontakterne mellem hårceller og SGN fiber slutninger34, 35. Men, antistoffet mod GluR2 er mere specifik for AMPA-type ionotropic glutamat receptorer i den postsynaptiske membran, som mere pålideligt kan identificere bånd synapser (juxtaposed par immunfluorescent punkta af præsynaptiske CtBP2 og postsynaptiske GluR2)15. Ud over morfologiske analyse, histologisk analyse af komplette synapser kan bruges som en funktionel indikator for synaptopati. I voksne mus med cochlear synaptopati, reduktioner i ABR bølge i amplitude efter præsentationen af moderat til højt niveau tone stimuli forekomme ved frekvenser tonotopically relateret til regioner af synaptisk tab26,29. Synapse tæller opnået ved hjælp af denne metode er begrænset i, at det tager ca. 10 minutter at scanne et sted på basilær membranen. For at evaluere rumlige variationer i synaptisk tal og morfologi baseret på IHC-placering er det desuden nødvendigt præcist at identificere ICH-organets grænse (f. eks. via myosin VIIa-farvning) og at udføre særlige trin i billedbehandling26 . Ved hjælp af sådanne metoder har tidligere undersøgelser bekræftet, at det synaptiske tab er større på den modiolære side af IHC end på søjle siden i dyremodeller for støj induceret degeneration26.

Tidligere undersøgelser har vist, at lave spontane-rate, høj-tærskel fibre er mere modtagelige for støjskader end høje spontane-rate, lav-tærskel fibre i dyremodeller af begrænset synaptopathy26,30. Disse undersøgelser giver grundlaget for at anvende suprathreshold amplituden af ABR Wave I (målt ved hjælp af moderate-til højniveau-tone stimuli) for at vurdere den synaptiske funktion i dyremodeller med normal ABR-tærskel og forvrængnings produkt otoakustiske emissioner ( DPOAEs). Da bølge I af ABR afspejler de opsummerede neurale reaktioner af auditive nervefibre, når synaptopati vurderes via ABR bølge I amplitude, bør DPOAE test også udføres for at udelukke OHC skader, som også kan reducere ABR amplituder på grund af afbrydelse af mekanisk elektrisk transduktion. Selv om den første bølge af den sammensatte aktionspotentiale (CAP), som måles fra rund vindues elektroder, også repræsenterer sammenfattet aktivitet af cochlear nerven, er denne metode mere invasiv og kompleks end ABR målinger. Hvis DPOAE-responser vender tilbage til normal efter midlertidig tærskel forskydning i støj udsatte mus31 eller de er endnu ikke forværret i aldrende mus29, suprathreshold amplitude af ABR Wave jeg kan stærkt forudsige graden af cochlear synaptopathy , da ramte neuroner er bragt til tavshed, når deres synaptiske forbindelser til IHCs er forstyrret. Men hvis cochlear følsomhed reduceres på grund af forskellige faktorer (f. eks. OHC dysfunktion), kan fald i ABR bølge i amplitude ikke længere tilskrives synaptisk tab, fordi de vil afspejle kombinationen af alle cochlear-skader. Derfor er kontrollerede eksperimentelle betingelser for synaptopathy-begrænset model forberedelse er nødvendige for at sikre, at cochlear følsomhed ikke kompromitteres af andre faktorer. Desværre, selv om ABR Wave i amplitude giver en objektiv måling af Auditive nerve fiber tab hos dyr, er det vanskeligt at måle hos mennesker. Desuden kan blandede patologier, der involverer synaptopati, tab af hårceller og tilstedeværelsen af andre abnormaliteter i cochlea, forekomme hos mennesker, hvilket begrænser brugen af ABR Wave i amplitude målinger i kliniske miljøer. ABR bølge latency beregnes som tiden i millisekunder fra starten af stimulus til den positive top af hver bølge, giver indsigt i transmissions tiderne langs auditive pathway. Ingen væsentlige ændringer i bølge i latency er blevet observeret i musemodeller af støj-induceret eller aldersrelaterede cochlear synaptopathy36. Men, nogle tyder på, at virkningerne af maskering støj på ABR bølge V latency kan bruges til at diagnosticere cochlear synaptopathy i mennesker37.

Flere nylige undersøgelser har støttet forestillingen om, at cochlear synaptopathy er den primære første hændelse forbundet med skjult høretab, tinnitus og hyperacusis. Selv om konceptet for cochlear synaptopathy i indre øre sygdomme nu er blevet fast etableret, dens detaljerede indvirkning på hørelse evne forbliver ukendt. Den protokol, der præsenteres i den nuværende undersøgelse gør det muligt at efterforske morfologi og funktion i cochlear-bånd synapser inden for en bestemt frekvens region. Således kan denne protokol bruges til at undersøge cochlear synaptopathy, dens underliggende mekanismer, og effekten af potentielle terapeutiske interventioner i forskellige eksperimentelle dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Kinas National Natural Science Foundation (81770997, 81771016, 81830030); det fælles finansieringsprojekt i Beijing Natural Science Foundation og Beijing Education Committee (KZ201810025040); Beijing Natural Science Foundation (7174291); og China postdoc Science Foundation (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).

Tags

Neurovidenskab problem 147 Ribbon synapse cochlear Place-frekvens kort cochleogram synaptopathy CtBP2 GluR2 ABR tærskel ABR bølge I amplituer
Morfologiske og funktionelle evaluering af bånd synapser på specifikke frekvensområder af musen cochlea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L.,… More

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter